CN112630347B - 一种4-硝基苯乙胺的hplc分析方法 - Google Patents

一种4-硝基苯乙胺的hplc分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种4‑硝基苯乙胺的HPLC分析方法。本发明的分析方法包括选用苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱；采用流动相梯度洗脱，流动相的组成为磷酸二氢钾缓冲液及乙腈；在适当流速和柱温下进行高效液相色谱分析，记录色谱图。本发明能有效的洗脱、分离和定量4‑硝基苯乙胺及其杂质，使杂质峰与主峰完全分离，专属性好，分析速度快，检测效果好。

Description

一种4-硝基苯乙胺的HPLC分析方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及4-硝基苯乙胺及其盐的HPLC分析方法。
背景技术
4-硝基苯乙胺及其盐是用于治疗心血管和尿频等药物的医药中间体，是一种重要的精细化工中间体，在医药行业具有广泛的用途，目前未见相关分析方法的报道。
4-硝基苯乙胺中，常见的杂质有五种，包括苯乙胺、2-硝基苯乙胺、3-硝基苯乙胺、N-乙酰基苯乙胺、N-乙酰基-2-(4-硝基苯)乙胺。
在行业中通常采用滴定法对4-硝基苯乙胺进行含量测定，该类方法无法有效区分其含有的杂质，也会对含量的测定结果产生干扰。部分厂家虽然采用了HPLC方法进行检测，却难以对异构体杂质3-硝基苯乙胺进行有效的分析控制。因此，寻找一种简单可行，能将4-硝基苯乙胺及其存在的五种杂质依次洗脱且分离，并做定量分析的方法势在必行。
发明内容
本发明的目的在于提供一种4-硝基苯乙胺的HPLC分析方法。本发明利用梯度洗脱的高效液相色谱法，实现了有效的洗脱、分离和定量4-硝基苯乙胺及其杂质，使杂质峰与主峰完全分离，分析速度快，检测效果好。
为了达到上述的目的，本发明采取以下技术方案：
一种4-硝基苯乙胺及其盐的HPLC分析方法，包括：
(1)所述4-硝基苯乙胺(Y)及其有关物质(A-E)的化学结构式如下：
Figure BDA0002855852590000011
Figure BDA0002855852590000021
(2)所述HPLC分析方法的主要参数：
a、色谱柱选用苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱；
b、流动相梯度洗脱，其中：
流动相由流动相A和流动相B组成，其中，所述流动相A为磷酸二氢钾缓冲液和乙腈的混合溶液，所述流动相A中磷酸二氢钾缓冲液的浓度为0.005mol/L～0.05mol/L，pH为1.5～3.0，乙腈占比体积百分比为5％～20％；所述流动相B为乙腈；
梯度洗脱时间与流动相比例如下：
时间(min) 流动相A％ 流动相B％
0 100 0
5 100 0
6～17 70～90 30～10
11～22 70～90 30～10
12～23 100 0
19～30 100 0
c、检测波长为215nm；
d、检测方法：
取测试样品适量，精密称定，加10％乙腈水溶解并稀释成一定浓度的样品溶液，摇匀，精密量取10μl注入液相色谱仪，在适当流速和柱温下进行高效液相色谱分析，记录色谱图。
作为优选，本发明4-硝基苯乙胺及其盐的HPLC分析方法中，所述步骤(2)b流动相A中磷酸二氢钾缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为2.0。
作为优选，本发明4-硝基苯乙胺及其盐的HPLC分析方法中，所述步骤(2)b中流动相梯度洗脱中流动相A中的乙腈比例为10％。
作为优选，本发明4-硝基苯乙胺及其盐的HPLC分析方法中，所述步骤(2)b流动相梯度洗脱时间与流动相比例如下：
时间(min) 流动相A％ 流动相B％
0 100 0
5 100 0
10 80 20
15 80 20
16 100 0
23 100 0
作为优选，本发明4-硝基苯乙胺及其盐的HPLC分析方法中，所述步骤(2)d检测方法中的流速为0.7～1.2ml/min。最优选流速为1.0ml/min。
作为优选，本发明4-硝基苯乙胺及其盐的HPLC分析方法中，所述步骤(2)d检测方法中的柱温为20～35℃。
作为优选，本发明4-硝基苯乙胺及其盐的HPLC分析方法中，所述步骤(2)d检测方法中的样品浓度为0.1～1mg/ml；最优选浓度为0.2mg/ml。
本发明的有益效果是：
本发明提供的高效液相色谱分析方法，能有效的洗脱、分离和定量检测4-硝基苯乙胺及其杂质，使杂质峰与主峰完全分离，专属性好，分析速度快，灵敏度和准确度高。本发明提供的高效液相色谱梯度法可对4-硝基苯乙胺及其盐进行快速、简单、可靠的含量测定和杂质控制。
附图说明
图1本发明实施例1中专属性混合溶液色谱图。
图2本发明实施例2中(流动相A中磷酸氢二钾缓冲液浓度为0.005mol/L)专属性混合溶液色谱图。
图3本发明实施例2中(流动相A中磷酸氢二钾缓冲液浓度为0.05mol/L)专属性混合溶液色谱图。
图4本发明实施例3中(流动相A中磷酸氢二钾缓冲液pH为1.5)专属性混合溶液色谱图。
图5本发明实施例3中(流动相A中磷酸氢二钾缓冲液pH为3.0)专属性混合溶液色谱图。
图6本发明实施例4中(流动相A中乙腈比例为5％)专属性混合溶液色谱图。
图7本发明实施例4中(流动相A中乙腈比例为20％)专属性混合溶液色谱图。
图8本发明实施例5中(流动相B最终乙腈比例为10％)专属性混合溶液色谱图。
图9本发明实施例5中(流动相B最终乙腈比例为30％)专属性混合溶液色谱图。
图10本发明实施例6中(梯度洗脱程序1)专属性混合溶液色谱图。
图11本发明实施例6中(梯度洗脱程序2)专属性混合溶液色谱图。
图12本发明实施例7中(流速0.7ml/min)专属性混合溶液色谱图。
图13本发明实施例7中(流速1.2ml/min)专属性混合溶液色谱图。
图14本发明实施例8中(柱温20℃)专属性混合溶液色谱图。
图15本发明实施例8中(柱温35℃)专属性混合溶液色谱图。
图16本发明实施例9中(供试液浓度0.1mg/ml)专属性混合溶液色谱图。
图17本发明实施例9中(供试液浓度1.0mg/ml)专属性混合溶液色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通或改变都属于本发明的保护范围。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
除非另作定义，所有的份，百分比均为体积单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的，本公开所使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内有一般技能的人士所理解的通常意义。
本发明中4-硝基苯乙胺指的4-硝基苯乙胺及其盐酸盐或氢溴酸盐等盐，有关物质指的是测定中的五种常见杂质，4-硝基苯乙胺和五种杂质名称及代号，来源和结构式如表1所示。
表1 4-硝基苯乙胺及有关物质
Figure BDA0002855852590000041
Figure BDA0002855852590000051
除特别指出外，本发明实施例中按以下测定条件：色谱柱：ZORBAX SB-Phenyl，3.5μm，4.6mm×150mm；检测波长：215nm；样品浓度：0.2mg/ml。
实施例1
检测方法：
取4-硝基苯乙胺测试样品适量，精密称定，加10％乙腈溶解并稀释成0.2mg/ml的样品溶液，摇匀，精密量取10μl注入液相色谱仪，在流速1.0ml/min和柱温25℃下进行高效液相色谱分析，记录色谱图。
流动相A中磷酸二氢钾缓冲液浓度为0.01mol/L，pH为2.0，乙腈比例为10％。
按以下梯度洗脱程序分析系统适应性溶液
时间(min) 流动相A％ 流动相B％
0 100 0
5 100 0
10 80 20
15 80 20
16 100 0
23 100 0
色谱图见图1，各杂质与主峰的保留时间及相邻峰之间的分离度见表2。
表2各杂质与主峰的保留时间及相邻峰之间的分离度
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 2.798 /
杂质D 3.321 4.91
杂质E 4.492 9.24
4-硝基苯乙胺 4.792 1.48
杂质B 10.328 27.52
杂质C 11.852 12.35
从表2数据可知：流动相A中磷酸二氢钾缓冲液浓度为0.01mol/L；pH为2.0；乙腈比例为10％；溶剂：10％乙腈；流速1.0ml/min；柱温：25℃时，各杂质与主峰之间以及杂质与杂质之间均分离良好。
实施例2
其他同实施例1，不同之处在于：
流动相A中磷酸二氢钾缓冲液浓度为0.005mol/L或0.05mol/L；
按实施例1中的梯度洗脱程序分析系统适应性溶液，色谱图见图2和3，各杂质与主峰的保留时间及相邻峰之间的分离度见表3和表4。
表3流动相A中磷酸二氢钾缓冲液浓度为0.005mol/L时分离度结果
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 2.672 /
杂质D 3.138 4.2
杂质E 4.159 8.4
4-硝基苯乙胺 4.392 1.2
杂质B 10.131 28.0
杂质C 11.697 12.5
表4流动相A中磷酸二氢钾缓冲液浓度为0.05mol/L时分离度结果
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 2.620 /
杂质D 3.055 4.0
杂质E 4.032 8.0
4-硝基苯乙胺 4.291 1.5
杂质B 9.993 31.2
杂质C 11.579 12.4
从表3和表4的数据可知：流动相A中磷酸二氢钾缓冲液浓度为0.005mol/L或0.05mol/L，各杂质与主峰之间以及杂质与杂质之间均分离良好。
对实施例1及实施例2的色谱图进行比较，选择实施例1的色谱条件为优选条件，即流动相A中磷酸二氢钾缓冲液浓度为0.01mol/L。
实施例3
其他同实施例1，不同之处在于：
流动相A中磷酸二氢钾缓冲液pH为1.5或3.0；
按实施例1中的梯度洗脱程序分析系统适应性溶液，色谱图见图4和5，各杂质与主峰的保留时间及相邻峰之间的分离度见表5和表6。
表5流动相A中磷酸二氢钾缓冲液pH为1.5时分离度结果
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 2.804 /
杂质D 3.335 4.6
杂质E 4.452 8.5
4-硝基苯乙胺 4.742 1.5
杂质B 10.510 30.9
杂质C 11.972 12.3
表6流动相A中磷酸二氢钾缓冲液pH为3.0时分离度结果
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 2.942 /
杂质D 3.535 5.0
杂质E 4.743 9.1
4-硝基苯乙胺 4.991 1.1
杂质B 10.595 24.7
杂质C 12.060 12.2
从表5和表6的数据可知：流动相A中磷酸二氢钾缓冲液pH为1.5或3.0，各杂质与主峰之间以及杂质与杂质之间均分离良好。
对实施例1及实施例3的色谱图进行比较，选择实施例1的色谱条件为优选条件，即流动相A中磷酸二氢钾缓冲液pH为2.0。
实施例4
其他同实施例1，不同之处在于：
流动相A中乙腈比例为5％或20％；
按实施例1中的梯度洗脱程序分析系统适应性溶液，色谱图见图6和7，各杂质与主峰的保留时间及相邻峰之间的分离度见表7和表8。
表7流动相A中乙腈比例为5％时分离度结果
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 2.701 /
杂质D 3.176 4.59
杂质E 4.265 9.03
4-硝基苯乙胺 4.547 1.48
杂质B 10.136 29.04
杂质C 11.716 12.68
表8流动相A中乙腈比例为20％时分离度结果
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 3.161 /
杂质D 3.885 6.01
杂质E 5.337 9.89
4-硝基苯乙胺 5.700 1.51
杂质B 10.975 24.07
杂质C 12.374 12.10
从表7和表8的数据可知：流动相A乙腈比例为5％或20％，各杂质与主峰之间以及杂质与杂质之间均分离良好。
对实施例1及实施例4的色谱图进行比较，选择实施例1的色谱条件为优选条件，即流动相A乙腈比例为10％。
实施例5
其他同实施例1，不同之处在于：
流动相B中最终的乙腈比例为10％或30％；
按以下梯度洗脱程序分析系统适应性溶液
时间(min) 流动相A％ 流动相B％
0 100 0
5 100 0
10 90(或70) 10(或30)
15 90(或70) 10(或30)
16 100 0
23 100 0
色谱图见图8和9，各杂质与主峰的保留时间及相邻峰之间的分离度见表9和表10。
表9流动相B中乙腈比例为10％时分离度结果
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 2.759 /
杂质D 3.266 4.7
杂质E 4.355 8.7
4-硝基苯乙胺 4.626 1.4
杂质B 10.686 29.6
杂质C 12.621 12.8
表10流动相B中乙腈比例为30％时分离度结果
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 2.764 /
杂质D 3.274 4.7
杂质E 4.363 8.7
4-硝基苯乙胺 4.636 1.4
杂质B 10.074 29.6
杂质C 11.325 11.7
从表9和表10的数据可知：流动相B最终比例为10％或30％时，各杂质与主峰之间以及杂质与杂质之间均分离良好。
对实施例1及实施例5的色谱图进行比较，选择实施例1的色谱条件为优选条件，即流动相B中最终的乙腈比例为20％。
实施例6
其他同实施例1，不同之处在于：
梯度洗脱的时间；
分别按以下梯度洗脱程序1和梯度洗脱程序2分析系统适应性溶液，
梯度1：
时间(min) 流动相A％ 流动相B％
0 100 0
5 100 0
6 80 20
11 80 20
12 100 0
19 100 0
梯度2：
时间(min) 流动相A％ 流动相B％
0 100 0
5 100 0
17 80 20
22 80 20
23 100 0
30 100 0
色谱图见图10和11，各杂质与主峰的保留时间及相邻峰之间的分离度见表11和表12。
表11梯度洗脱程序1的分离度结果
Figure BDA0002855852590000111
表12梯度洗脱程序2的分离度结果
Figure BDA0002855852590000112
从表11和表12的数据可知：梯度洗脱程序1或2，各杂质与主峰之间以及杂质与杂质之间均分离良好。
对实施例1及实施例6的色谱图进行比较，选择实施例1的色谱条件为优选条件，即实施例1中的梯度程序。
实施例7
其他同实施例1，不同之处在于：
流速：0.7ml/min或1.2ml/min；
按实施例1中的梯度洗脱程序分析系统适应性溶液，色谱图见图12和13，各杂质与主峰的保留时间及相邻峰之间的分离度见表13和表14。
表13流速为0.7ml/min时分离度结果
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 3.101 /
杂质D 3.682 4.93
杂质E 4.982 9.30
4-硝基苯乙胺 5.316 1.48
杂质B 10.901 25.86
杂质C 12.370 11.67
表14流速为1.2ml/min时分离度结果
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 2.545 /
杂质D 3.023 4.88
杂质E 4.089 9.21
4-硝基苯乙胺 4.362 1.47
杂质B 9.832 28.79
杂质C 11.417 13.02
从表13和表14的数据可知：流速为0.7ml/min或1.2ml/min时，各杂质与主峰之间以及杂质与杂质之间均分离良好。
对实施例1及实施例7的色谱图进行比较，选择实施例1的色谱条件为优选条件，即流速1.0ml/min。
实施例8
其他同实施例1，不同之处在于：
柱温：20℃或35℃；
按实施例1中的梯度洗脱程序分析系统适应性溶液，色谱图见图14和15，各杂质与主峰的保留时间及相邻峰之间的分离度见表15和表16。
表15柱温为20℃时分离度结果
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 2.833 /
杂质D 3.386 5.14
杂质E 4.613 9.61
4-硝基苯乙胺 4.929 1.52
杂质D 10.415 26.64
杂质E 11.945 12.42
表16柱温35℃时分离度结果
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 2.770 /
杂质D 3.269 4.78
杂质E 4.388 9.15
4-硝基苯乙胺 4.671 1.44
杂质D 10.265 28.23
杂质E 11.792 12.30
从表15和表16的数据可知：柱温为20℃或35℃时，各杂质与主峰之间以及杂质与杂质之间均分离良好。
对实施例1及实施例8的色谱图进行比较，选择实施例1的色谱条件为优选条件，即柱温25℃。
实施例9
其他同实施例1，不同之处在于：
样品浓度为0.1mg/ml和1.0mg/ml；
按实施例1中的梯度洗脱程序分析系统适应性溶液，色谱图见图16和17，各杂质与主峰的保留时间及相邻峰之间的分离度见表17和表18。
表17样品浓度为0.1mg/ml时分离度结果
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 2.758 /
杂质D 3.269 4.6
杂质E 4.362 8.5
4-硝基苯乙胺 4.677 1.8
杂质B 10.344 32.7
杂质C 11.854 12.3
表18样品浓度为1.0mg/ml时分离度结果
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 2.767 /
杂质D 3.277 4.3
杂质E 4.373 8.2
4-硝基苯乙胺 4.682 1.7
杂质B 10.342 31.9
杂质C 11.856 12.4
从表17和表18的数据可知：样品浓度为0.1mg/ml或1.0mg/ml时，各杂质与主峰之间以及杂质与杂质之间均分离良好。
对实施例1及实施例9的色谱图进行比较，选择实施例1的色谱条件为优选条件，即样品浓度为0.2mg/ml。
结论：对比以上实施例1-9结果，说明本发明的方法适用于4-硝基苯乙胺含量及有关物质的检测，且专属性好，分析速度快，检测效果好；本发明的方法最终优选条件为：色谱柱：ZORBAX SB-Phenyl，3.5μm，4.6mm×150mm；检测波长：215nm；流速1.0ml/min；柱温25℃；溶剂为10％乙腈；供试液浓度为0.2mg/ml；流动相A中磷酸二氢钾缓冲液浓度为0.01mol/L，pH为2.0，乙腈比例为10％。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。

Claims (10)

1.一种4-硝基苯乙胺及其有关物质的HPLC分析方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）所述的4-硝基苯乙胺结构式如下：
Figure QLYQS_1
所述有关物质包括有关物质A、有关物质B、有关物质C、有关物质D和有关物质E，其结构式如下：
Figure QLYQS_2
Figure QLYQS_3
有关物质A 有关物质B
Figure QLYQS_4
有关物质C
Figure QLYQS_5
Figure QLYQS_6
有关物质D 有关物质E
（2）所述HPLC分析方法的参数：
a、色谱柱选用苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱；
b、流动相梯度洗脱，其中：
流动相由流动相A和流动相B组成，其中，所述流动相 A为磷酸二氢钾缓冲液和乙腈的混合溶液，所述流动相A中磷酸二氢钾缓冲液的摩尔浓度为0.005mol/L~0.05mol/L，pH为1.5~3.0，乙腈占比为体积百分比5%~20%；所述流动相B为乙腈；
梯度洗脱时间与流动相比例如下：
Figure QLYQS_7
c、检测波长为215nm；
d、检测方法：
取测试样品适量，精密称定，加10%乙腈水溶解并稀释成一定浓度的样品溶液，摇匀，精密量取10μl注入液相色谱仪，在适当流速和柱温下进行高效液相色谱分析，记录色谱图。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤（2）b流动相A中磷酸二氢钾缓冲液的浓度为0.01 mol/L，pH为2.0。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤（2）b中流动相梯度洗脱中流动相A中的乙腈比例为10%。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤（2）b流动相梯度洗脱时间与流动相比例如下：
Figure QLYQS_8
。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步骤（2）d检测方法中的流速为0.7~1.2ml/min。
6.根据权利要求5所述的分析方法，其特征在于，所述的步骤（2）d检测方法中的流速为1.0ml/min。
7.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步骤（2）d检测方法中的柱温为20~35℃。
8.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤（2）d检测方法中的样品溶液的浓度为0.1~1.0mg/ml。
9.根据权利要求8所述的分析方法，其特征在于，所述步骤（2）d检测方法中的样品溶液的浓度为0.2mg/ml。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的分析方法，其特征在于，所述分析方法用于4-硝基苯乙胺及其有关物质的分析检测和质量控制。
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