CN108226340B - 一种分离测定双氟米松及其6β双氟米松和16β双氟米松的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种分离测定双氟米松及其6β双氟米松和16β双氟米松的方法。所述方法采用的固定相为辛基硅烷键合硅胶。具体方法：将双氟米松样品溶液注入色谱仪，采用六氟磷酸钾缓冲盐体系和有机溶剂的混合溶液为流动相进行洗脱，进入检测器进行检测。该方法可同时实现双氟米松及其6β双氟米松和16β双氟米松的分离和含量测定，其拖尾因子和理论踏板数均能达到非常好的效果，且有优良的分离性能和耐久性，简便可行，重现性好，高效快速，专属性强。

Description

一种分离测定双氟米松及其6β双氟米松和16β双氟米松的 方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种高效液相色谱法分离测定双氟米松及其6β双氟米松和16β双氟米松的方法及应用。

背景技术

双氟米松(Flumethasone)于1998年在美国上市，为一种中等强度的局部用甾体药物，是合成的二氟糖皮质激素，具有抗炎、血管收缩和抗组织增生等作用。C-21位上三甲基醋酸基团的引入使得双氟米松很难经皮吸收，这导致了双氟米松很低的浓度即可产生药效。对皮质类固醇治疗有效的非感染性炎症性皮肤病，尤其是和角化过度症有关的皮肤病，如：脂溢性皮炎、接触性皮炎、异位性皮炎、局限性神经性皮炎、寻常型银屑病、扁平苔癣以及掌跖角化过度症。

双氟米松适用人群广泛，安全、可靠、临床效果显著。双氟米松化学名6α,9α-二氟-16α-甲基-11β,17α,21-三羟基-1,4-孕甾烷双烯-3,20-二酮，分子式为C₂₂H₂₈F₂O₅。双氟米松结构式为：

6β双氟米松和16β双氟米松的化学名称及结构式如下：

药物合成和制剂过程中需要对双氟米松中6β双氟米松和16β双氟米松杂质含量进行严格控制。而含手性碳原子的对映异构体的分析、分离一直是手性药物合成和制剂过程中质量控制的难点和重点，实现双氟米松中6β双氟米松和16β双氟米松的分离在双氟米松药物的合成和制剂过程的质量控制方面具有非常重要的社会意义和经济效益。

对于制备双氟米松过程中产生的6β双氟米松和16β双氟米松，不论是在原料药还是制剂中均需要进行严格控制。

目前没有相关检测方法的公开报道，因此开发采用高效液相色谱法，以辛基硅烷键合硅胶为填料，经久耐用、环保、毒性小且能快速分离双氟米松及其6β双氟米松和16β双氟米松的分析方法，对于药物分析人员健康及其产品的质量控制和降解途径研究都是十分有意义的工作。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种分离双氟米松及其6β双氟米松和16β双氟米松的方法，能快速分离双氟米松及其6β双氟米松和16β双氟米松。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

采用物质分配的原理完成分离，固定相为辛基硅烷键合硅胶，流动相为六氟磷酸钾缓冲盐体系(流动相A)和有机溶剂(流动相B)的混合溶液，其中六氟磷酸钾缓冲盐体系和有机溶剂的体积比为30-70:30-70。

所述双氟米松结构式为：

6β双氟米松和16β双氟米松的化学名称及结构式如下：

作为优选的方案，上述分离方法采用高效液相色谱法。

作为优选的方案，上述六氟磷酸钾缓冲盐体系中六氟磷酸钾的浓度为0.01mol/L-0.03mol/L。

影响药物杂质分离的因素很多，在确定的固定相条件下，对确定的样品来说，流动相的组成是影响分离的关键因素。六氟磷酸钾浓度高了，与甲醇混合容易析出固体，浓度低了达不到离子对试剂效果，故选择浓度为0.01mol/L-0.03mol/L。

进一步优选地，上述六氟磷酸钾缓冲盐体系中六氟磷酸钾的浓度为0.02mol/L。

流动相的pH和离子强度对辛基硅烷键合硅胶键合相的选择性和效能有很大的影响，在流动相中加入盐，形成缓冲溶液，对保留和效能的影响比对选择性的影响大，由于缓冲剂与分析物竞争占领辛基硅烷键合硅胶空腔，所以随缓冲剂的强度增加，溶质的保留降低，效能增加。流动相pH的变化对离解溶质的有很大的影响。

作为优选的方案，上述六氟磷酸钾缓冲盐体系pH值为2-4。

进一步优选地，上述六氟磷酸钾缓冲盐体系pH值为3.0。

作为优选的方案，上述流动相中六氟磷酸钾缓冲盐体系与有机溶剂的体积比为50：50。

作为优选的方案，上述流动相中的有机溶剂为甲醇。

作为优选的方案，所述流动相流速为0.8-1.2ml/min。

溶质对辛基硅烷键合硅胶的结合常数受温度的影响很大，在低温下结合常数增大，但溶质传递会变差，所以降低柱温可使辛基硅烷键合硅胶键合相的选择性增大，同时也可能会使分离度降低，但增加柱温对强保留的溶质的分离会有所改善。

作为优选的方案，上述分离方法采用的色谱柱的柱箱温度为35-45℃。

作为优选的方案，上述分离方法采用的色谱柱的规格为250×4.6mm，5μm。

作为一种优选，所述的色谱柱选择的是Agilent ZORBAX SB-C8。

作为优选的方案，上述分离方法中待测品经稀释剂稀释，所述稀释剂为甲醇或甲醇的水溶液。

进一步优选地，上述稀释剂为体积含量为50％的甲醇水溶液。

作为优选的方案，上述分离方法中检测器的检测波长为230-250nm。

本发明的目的之二在于提供一种基于目的一的测定双氟米松及其6β双氟米松和16β双氟米松含量的方法，其具有优良的分离性能和耐久性，简便可行，重现性好，专属性强。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

按照目的一的方法，采用物质分配的原理完成分离，固定相为辛基硅烷键合硅胶，流动相为六氟磷酸钾缓冲盐体系和有机溶剂的混合溶液，其中无机盐缓冲体系和有机溶剂的体积比为30-70:30-70。

上述测定方法包括以下步骤：

1)取一定浓度的双氟米松、6β双氟米松和16β双氟米松混合溶液采用高效液相色谱法过色谱柱确定其保留时间；

2)按照目的一方法的任一方案采用高效液相色谱法完成双氟米松及其6β双氟米松和16β双氟米松的完全分离；

3)按照主成分自身对照法计算6β双氟米松和16β双氟米松的含量。

作为优选的方案，上述六氟磷酸钾缓冲盐体系中无机盐的浓度为0.01mol/L-0.03mol/L。

进一步优选地，上述六氟磷酸钾缓冲盐体系中无机盐的浓度为0.02mol/L。

作为优选的方案，上述六氟磷酸钾缓冲盐体系为六氟磷酸钾的缓冲体系。

作为优选的方案，上述六氟磷酸钾缓冲盐体系pH值为2-4。

进一步优选地，上述六氟磷酸钾缓冲盐体系pH值为3.0。

作为优选的方案，上述流动相中六氟磷酸钾缓冲盐体系与有机溶剂的体积比为50：50。

作为优选的方案，上述流动相中的有机溶剂为甲醇。

作为优选的方案，所述流动相流速为0.8-1.2ml/min。

作为优选的方案，上述分离方法采用的色谱柱的柱箱温度为35-45℃。

作为优选的方案，上述分离方法采用的色谱柱的规格为250×4.6mm，5μm。

作为一种优选，所述的色谱柱选择的是Agilent ZORBAX SB-C8。

作为优选的方案，上述测定方法中待测品经稀释剂稀释，所述稀释剂为甲醇或甲醇的水溶液。

进一步优选地，上述稀释剂为体积含量为50％的甲醇水溶液。

作为优选的方案，上述分离方法中检测器的检测波长为230-250nm。

本发明的有益效果在于：

1)本发明提供的的高效液相色谱法分离测定双氟米松及6β双氟米松和16β双氟米松，采用反相高效液相色谱法对双氟米松及其6β双氟米松和16β双氟米松进行分离和检测，可在40分钟内将双氟米松及其6β双氟米松和16β双氟米松完全分离并进行检测，有优良的分离性能和耐久性。

2)本发明以辛基硅烷键合硅胶为填料，该填料经久耐用、环保、毒性小且能快速分离双氟米松及其6β双氟米松和16β双氟米松的分析方法，对于药物分析人员健康及其产品的质量控制和降解途径研究都是十分有意义的工作。

3)本发明解决了双氟米松及其6β双氟米松和16β双氟米松的分离测定问题，该方法分离度好，专属性强，灵敏度高；且操作简单，具有简便、快速的优点，从而确保了双氟米松及其制剂的质量可控，并最终确定产品的安全有效，对于双氟米松的质量控制有重要意义。

附图说明

图1为实施例1空白溶剂的高效液相色谱图。

图2为实施例1混合溶液的高效液相色谱图。

图3为实施例2定量限溶液的高效液相色谱图。

图4为对比实施例1混合溶液的高效液相色谱图。

图5为对比实施例2混合溶液的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下将(参照附图)对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

以下实施例中采用的仪器及色谱条件如下：

高效液相色谱仪：岛津LC-20AT；

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C8(250×4.6mm，5μm)；

检测器检测波长：240nm；

流动相流速：1.0ml/min；

色谱柱柱箱柱温：40℃；

进样量：20μl。

实施例1分离测定双氟米松及其6β双氟米松和16β双氟米松

实施例采用的流动相和稀释剂如下：

流动相：

流动相A：无机盐缓冲体系缓冲盐：称取六氟磷酸钾3.7g(0.02mol/L六氟磷酸钾)于1000ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，用磷酸调节pH值至3.0±0.1；

流动相B：甲醇；

流动相A和流动相B的体积比为50：50。

稀释剂：50％甲醇(甲醇V：水V＝50：50)。

1)样品稀释

6β双氟米松：分别取6β双氟米松对照品约10mg，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得6β双氟米松贮备溶液。

16β双氟米松：分别取16β双氟米松对照品约10mg，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得16β双氟米松贮备溶液。

混合溶液的配制：称取双氟米松约25mg，置50ml量瓶中，精密移取6β双氟米松和16β双氟米松贮备溶液各0.5ml，置上述同一量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2)分别取稀释剂及混合溶液按上述色谱条件进样，记录色谱图，测定结果见表1。结果见图1、图2。

表1试验测定结果

结论：空白稀释剂不干扰样品测定；双氟米松与6β双氟米松和16β双氟米松峰间分离度大于1.5；上述试验证明双氟米松与6β双氟米松和16β双氟米松峰分离良好，专属性强。

实施例2色谱系统对双氟米松及其6β双氟米松和16β双氟米松的检测限、定量限基础研究

定量限溶液：精密称取双氟米松与6β双氟米松和16β双氟米松对照品，配成一定浓度的溶液，并逐级稀释得定量限溶液。

检测限溶液：精密移取定量限溶液7.0ml，置20ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得检测限溶液。

测定方法：

取上述定量限溶液连续进样3次，检测限溶液连续进样2次，计算主峰峰高与噪声的比值(信噪比)。记录色谱图(图3)，试验结果见表2和表3。

表2定量限测定结果

表3检测限测定结果

结论：从上表试验数据可知，本色谱系统下，双氟米松与6β双氟米松和16β双氟米松的检测限、定量限分别符合S/N＝3(10)：1的要求。

对比实施例1

在该对比实施例中，除了采用的流动相A不同，其余条件均与实施例1相同。

流动相A：水。

取混合溶液按上述色谱条件进样，记录色谱图(图4)，测定结果见表4。

表4试验测定结果

结论：在与上述实施例其他条件相同仅为流动相A不同的分离试验中，双氟米松与6β双氟米松和16β双氟米松分离度均小于1.5，不能满足双氟米松与6β双氟米松和16β双氟米松进行有效分离。

对比实施例2

在该对比实施例中，除了采用的流动相A不同，其余条件均与实施例1相同。

流动相A：无机盐缓冲体系缓冲盐：称取磷酸二氢钾2.72g(0.02mol/L磷酸二氢钾)于1000ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，用磷酸调节pH值至3.0±0.1。

取混合溶液按上述色谱条件进样，记录色谱图(图5)，测定结果见表5。

表5试验测定结果

结论：在与上述实施例其他条件相同仅为流动相A不同的分离试验中，双氟米松与6β双氟米松分离度小于1.5，不能满足双氟米松与6β双氟米松进行有效分离。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.一种分离双氟米松及其6β双氟米松和16β双氟米松的方法，其特征在于，采用高效液相色谱法完成分离，固定相为辛基硅烷键合硅胶，流动相A为六氟磷酸钾，其浓度为0.01mol/L-0.03mol/L，pH值为2-4，流动相B为甲醇，流动相A和流动相B的体积比为30-70:30-70。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离方法中待测品经稀释剂稀释，所述稀释剂为甲醇或甲醇的水溶液。

3.基于权利要求1-2任一项方法的测定双氟米松中6β双氟米松和16β双氟米松含量的方法，其特征在于，至少包括以下步骤：

1）按照权利要求1-2任一项的方法用高效液相色谱完成双氟米松及其6β双氟米松和16β双氟米松的完全分离；

2）一定浓度的双氟米松、6β双氟米松和16β双氟米松的混合溶液用步骤1）的方法完成分离，步骤1）产生的色谱图的杂质峰和主成分峰面积比较，按照主成分自身对照法计算6β双氟米松和16β双氟米松的含量。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述流动相流速为0.8-1.2ml/min。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法采用检测器的检测波长为230-250nm。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法采用色谱柱的规格为250×4.6mm，5µm。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法采用色谱柱的柱箱温度为35-45℃。

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