CN117451883A - 分离测定乙磺酸尼达尼布中间体z2及其有关杂质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学分析技术领域，具体涉及一种分离测定乙磺酸尼达尼布中间体Z2及其有关杂质的方法。本发明自建高效液相色谱法，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸盐为流动相A，乙腈为流动相B；通过梯度洗脱依次将杂质Z2a、杂质Z1、杂质Z3、甲苯、杂质Z2e、杂质Z2b、乙磺酸尼达尼布中间体Z2、杂质Z2d和/或杂质Z2c进行分离，然后进入检测波长为225nm的检测器进行检测，并按照加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算各杂质含量。本方法简单，灵敏度高，分析时间短，专属性强，重现性好。
Description
技术领域
本发明属于化学分析技术领域，具体涉及一种分离测定乙磺酸尼达尼布中间体Z2及其有关杂质的方法。
背景技术
乙磺酸尼达尼布是德国勃林格殷格翰公司开发的一种口服三联血管激酶抑制剂,临床上主要用特发性肺纤维化的治疗。乙磺酸尼达尼布中间体Z2(NIN-Z2)为乙磺酸尼达尼布制备过程中的关键中间体，其化学名为(3E)-1-(2-氯乙酰基)-3-[甲氧基(苯基)亚甲基]-2-氧代吲哚啉-6-羧酸甲酯，分子式：C20H16ClNO5，结构式如式Ⅰ所示。
研究发现，乙磺酸尼达尼布中间体Z2中含有杂质Z2a、杂质Z1、杂质Z3、甲苯、杂质Z2e、杂质Z2b、杂质Z2d、杂质Z2c等多种杂质，为了获得高质量的乙磺酸尼达尼布产品，有必要对乙磺酸尼达尼布中间体Z2中的杂质进行含量控制。
现有技术中，公开号为CN115888187A的发明专利公开了一种分离测定乙磺酸尼达尼布起始物料SM2及其杂质的方法，该发明利用高效液相色谱法实现了乙磺酸尼达尼布起始物料SM2中杂质SM2f、杂质SM2g、杂质SM2h、杂质SM2c和杂质SM2b的分离检测。公开号为CN106841495B的发明专利公开了乙磺酸尼达尼布中基因毒性杂质的分析方法，其利用高效液相色谱-质谱联用方法对乙磺酸尼达尼布中基因毒性杂质N-(4-氨基苯基)-N,N’-二甲基-1-哌嗪乙酰胺进行检测。然而这些方法均不适用于乙磺酸尼达尼布中间体Z2中杂质Z2a、杂质Z1、杂质Z3、杂质Z2e、杂质Z2b及其他单个杂质的测定。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种利用高效液相色谱法分离乙磺酸尼达尼布中间体Z2及其杂质的方法，该方法专属性强，重现性好，为后续乙磺酸尼达尼布中间体Z2及其杂质的鉴别和含量检测提供了良好的基础。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
利用高效液相色谱法分离乙磺酸尼达尼布中间体Z2及其杂质的方法,所述杂质包括杂质Z2a、杂质Z1、杂质Z3、甲苯、杂质Z2e、杂质Z2b、杂质Z2d、杂质Z2c中的任一种或多种；所述高效液相色谱法中，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸盐为流动相A，乙腈为流动相B；通过梯度洗脱依次将杂质Z2a、杂质Z1、杂质Z3、甲苯、杂质Z2e、杂质Z2b、乙磺酸尼达尼布中间体Z2、杂质Z2d和/或杂质Z2c进行分离；
所述乙磺酸尼达尼布中间体Z2的结构式如式Ⅰ所示；所述杂质Z2a的结构式如Ⅱ所示，所述杂质Z1的结构式如Ⅲ所示，所述杂质Z3的结构式如Ⅳ所示，所述杂质Z2e的结构式如Ⅴ所示，所述杂质Z2b的结构式如Ⅵ所示，所述杂质Z2d的结构式如Ⅶ所示，所述杂质Z2c的结构式如Ⅷ所示；
可以根据洗脱顺序对各组分进行定性。
进一步，所述流动相A为磷酸二氢钾缓冲液，所述磷酸二氢钾缓冲液的浓度为0.02mol/L，pH值为2.8-3.2。
进一步，所述梯度洗脱程序如下：
0分钟，设置流动相A和流动相B的体积比为64-66:36-34；
5分钟，设置流动相A和流动相B的体积比为64-66:36-34；
35分钟，设置流动相A和流动相B的体积比为35:65；
40分钟，设置流动相A和流动相B的体积比为35:65；
40.5分钟，设置流动相A和流动相B的体积比为64-66:36-34；
48分钟，设置流动相A和流动相B的体积比为64-66:36-34。
优选地，所述梯度洗脱程序如下：
0分钟，设置流动相A和流动相B的体积比为65:35；
5分钟，设置流动相A和流动相B的体积比为65:35；
35分钟，设置流动相A和流动相B的体积比为35:65；
40分钟，设置流动相A和流动相B的体积比为35:65；
40.5分钟，设置流动相A和流动相B的体积比为65:35；
48分钟，设置流动相A和流动相B的体积比为65:35。
进一步，所述流动相的流速为1.1ml/min-1.3ml/min，优选为1.2ml/min；所述色谱柱柱温为13℃-17℃，优选为15℃。
优选地，色谱柱规格为4.6mm×150mm，5μm。
优选地，进样体积为10μl。
本发明的目的之二在于提供一种定性鉴别乙磺酸尼达尼布中间体Z2及其杂质的方法，该方法能够有效鉴别乙磺酸尼达尼布中间体Z2中的杂质Z2a、杂质Z1、杂质Z3、甲苯、杂质Z2e、杂质Z2b、杂质Z2d和杂质Z2c。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
定性鉴别乙磺酸尼达尼布中间体Z2及其杂质的方法，利用前述分离方法分离乙磺酸尼达尼布中间体Z2及其杂质，并进入检测器进行检测；检测波长为225nm。
进一步，各组分保留时间从短到长依次为杂质Z2a、杂质Z1、杂质Z3、甲苯、杂质Z2e、杂质Z2b、乙磺酸尼达尼布中间体Z2、杂质Z2d和/或杂质Z2c。
可以根据保留时间对各组分进行定性。
作为优选的技术方案，所述色谱柱规格为4.6mm×150mm，5μm；所述流动相A为pH3.0、浓度为0.02mol/L的磷酸二氢钾缓冲液，所述流动相B为乙腈；所述流动相的流速为1.2ml/min；所述色谱柱柱温为15℃；检测波长为225nm；采用如下梯度洗脱程序进行分离，并得到色谱图；
0分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为65:35；
5分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为65:35；
35分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为35:65；
40分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为35:65；
40.5分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为65:35；
48分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为65:35。
进一步，保留时间在9.3±0.5min的为所述杂质Z2a，保留时间在13.9±0.5min的为所述杂质Z1，保留时间在15.1±0.5min的为所述杂质Z3，保留时间在20.1±0.5min的为所述甲苯，保留时间在23.1±0.5min的为所述杂质Z2e，保留时间在27.7±0.5min的为所述杂质Z2b，保留时间在31.3±0.5min的为所述乙磺酸尼达尼布中间体Z2，保留时间在35.2±0.5min的为所述杂质Z2d，保留时间在36.7±0.5min的为所述杂质Z2c。
本发明的目的之三在于提供一种检测乙磺酸尼达尼布中间体Z2中杂质的含量的方法，该方法灵敏度高、耐用性好，可以在48min内或大于48min的时间实现乙磺酸尼达尼布中间体Z2中多种杂质的定量。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
检测乙磺酸尼达尼布中间体Z2中杂质的含量的方法，所述杂质包括杂质Z2a、杂质Z1、杂质Z3、杂质Z2e、杂质Z2b中的任一种或多种；所述方法包括如下步骤：
1)分离：利用前述分离方法分离乙磺酸尼达尼布中间体Z2及其杂质；
2)检测：利用前述鉴别方法对乙磺酸尼达尼布中间体Z2及其杂质进行检测，并得到色谱图；
3)含量计算：利用步骤2)得到的色谱图，按照加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算各杂质含量。
进一步，分离前，以乙腈为溶剂配制待测样品。
作为优选的技术方案，所述方法包括如下步骤：
1.配制待测溶液
系统适用性溶液：取甲苯试剂和乙磺酸尼达尼布Z2系统适用性对照品(含尼达尼布中间体Z2、中间体杂质Z1、中间体杂质Z3、杂质Z2a、杂质Z2b、杂质Z2c、杂质Z2d、杂质Z2e)适量，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含Z2系统适用性对照品0.2mg，甲苯1μl的溶液。
样本溶液/供试品溶液：取本品(乙磺酸尼达尼布中间体Z2)适量，用溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.2mg的溶液。
对照溶液：精密量取适量供试品溶液，用溶剂定量稀释制成每1ml中约含0.4μg的溶液。
2.取步骤1制得的系统适用性溶液、样本溶液、对照溶液，如10μl，分别注入液相色谱仪进行检测，得到色谱图，然后按加校正因子的主成分自身对照法计算各杂质含量。
本发明的有益效果在于：
1.本发明构建的高效液相色谱法，可以在48min内实现乙磺酸尼达尼布中间体Z2中杂质Z2a、杂质Z1、杂质Z3、甲苯、杂质Z2e、杂质Z2b、杂质Z2d、杂质Z2c的分离和检测，具有方法简单、灵敏度高，分析时间短，专属性强，重现性好的优点。
2.本发明方法实现乙磺酸尼达尼布中间体Z2中杂质Z2a、杂质Z1、杂质Z3、甲苯、杂质Z2e、杂质Z2b、杂质Z2d、杂质Z2c的分离和定性，以及杂质Z2a、杂质Z1、杂质Z3、杂质Z2e、杂质Z2b的定量，对乙磺酸尼达尼布产品的质量控制具有重要意义。
附图说明
图1为空白溶液的色谱图；
图2为混合溶液的色谱图；
图3为供试品溶液的色谱图；
图4为对照溶液的色谱图；
图5为检测限溶液的色谱图；
图6为定量限溶液的色谱图；
图7为耐用性(混合溶液)-正常条件下的色谱图；
图8为耐用性(混合溶液)-pH3.2条件下的色谱图；
图9为耐用性(混合溶液)-pH2.8条件下的色谱图；
图10为耐用性(混合溶液)-流速1.1ml/min条件下的色谱图；
图11为耐用性(混合溶液)-流速1.3ml/min条件下的色谱图；
图12为耐用性(混合溶液)-柱温13℃条件下的色谱图；
图13为耐用性(混合溶液)-柱温17℃条件下的色谱图；
图14为耐用性(混合溶液)-流动相初始比例A:B＝66：34条件下的色谱图；
图15为耐用性(混合溶液)-流动相初始比例A:B＝64：36条件下的色谱图。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
本发明实施例中，涉及的化合物信息如表1所示。
表1.化合物信息表
本发明实施例中，严格按照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)测定。
本发明实施例中，样品检测方法如下：
(1)配制溶液
本发明实施例中，溶剂/空白溶液为乙腈。
系统适用性溶液：取甲苯试剂和乙磺酸尼达尼布Z2系统适用性对照品(含尼达尼布中间体Z2、中间体杂质Z1、中间体杂质Z3、杂质Z2a、杂质Z2b、杂质Z2c、杂质Z2d、杂质Z2e)适量，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含Z2系统适用性对照品0.2mg，甲苯1μl的溶液。(溶液配制好后，立即放入5℃自动进样器中)
供试品溶液：取本品(乙磺酸尼达尼布中间体Z2)适量，用溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.2mg的溶液。(溶液配制好后，立即放入5℃自动进样器中)
对照溶液：精密量取适量供试品溶液，用溶剂定量稀释制成每1ml中约含0.4μg的溶液。
(2)色谱条件
如表1和表2所示。
表1.色谱条件
表2.梯度洗脱程序表
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 65 | 35 |
| 5 | 65 | 35 |
| 35 | 35 | 65 |
| 40 | 35 | 65 |
| 40.5 | 65 | 35 |
| 48 | 65 | 35 |
其中，0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液的配制方法为：如取磷酸二氢钾2.7g，加水1000ml使溶解，用磷酸调节pH至3.0。
(3)检测
精密量取系统适用性溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序为杂质Z2a、中间体杂质Z1、中间体杂质Z3、甲苯、杂质Z2e、杂质Z2b、尼达尼布中间体Z2、杂质Z2d、杂质Z2c，各杂质间的分离度应不小于1.5。
精密量取对照溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
供试品溶液色谱图中如有杂质峰，除甲苯峰、杂质NIN-Z3峰、溶剂峰和梯度洗脱峰外，按加校正因子的主成分自身对照法计算各杂质含量，杂质NIN-Z2a不得过0.15％，杂质NIN-Z1不得过1.0％，杂质NIN-Z2e不得过5.0％，杂质NIN-Z2b不得过3.0％，其他单个杂质不得过0.5％，总杂质含量应不得过9.5％。
各杂质的相对保留时间、校正因子见下表。
计算公式：
式中：Ax——供试品溶液中杂质峰峰面积；
As——对照溶液中主峰峰面积；
F——杂质校正因子。
表3.各杂质的相对保留时间、校正因子
本发明实施例中，NIN-Z2在制备过程中可能与反应产生的副产物甲醇发生醇解反应，生成NIN-Z3，该杂质为下一步中间体，质量标准不控制该杂质含量，对其进行定位以确定是NIN-Z3。杂质Z2c和杂质Z2d具警示结构，限度0.003％，NIN-Z2为湿品，此三个成分在本系统中仅用于专属性定位。
实施例1.专属性
(1)溶液配制
溶剂：乙腈
杂质Z2a贮备液：精密称取杂质Z2a 5.41mg，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质Z2a定位溶液：精密移取杂质Z2a贮备液1ml，置25ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质Z2b贮备液：精密称取杂质Z2b 5.36mg，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质Z2b定位溶液：精密移取杂质Z2b贮备液1ml，置25ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质Z2c贮备液：精密称取杂质Z2c 5.27mg，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质Z2c定位溶液：精密移取杂质Z2c贮备液1ml，置25ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质Z2d贮备液：精密称取杂质Z2d 5.59mg，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质Z2d定位溶液：精密移取杂质Z2d贮备液1ml，置25ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质Z2e贮备液：精密称取杂质Z2e 5.51mg，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质Z2e定位溶液：精密移取杂质Z2e贮备液1ml，置25ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质Z1贮备液：精密称取杂质Z1 5.61mg，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质Z1定位溶液：精密移取杂质Z1贮备液1ml，置25ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质Z3贮备液：精密称取杂质Z3 5.42mg，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质Z3定位溶液：精密移取杂质Z3贮备液1ml，置25ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
甲苯定位溶液：精密移取甲苯试剂0.1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液：精密称取供试品(NIN-Z2-210802)21.42mg，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
混合溶液：精密称取供试品(NIN-Z2-210802)20.54mg，精密移取杂质Z2a贮备溶液、杂质Z2c贮备溶液、Z2d贮备溶液、杂质Z3贮备溶液各2ml，置同一50ml量瓶中，加入甲苯试剂50μl，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
(2)检测
取空白溶液、系统适用性溶液，以及步骤(1)配制得到的各杂质定位溶液、混合溶液、供试品溶液等，如10μl，分别进样，并记录色谱图。
结果如表4、图1-图4所示，空白溶剂对供试品检测无干扰，各杂质峰间的分离度均大于1.5，主峰与邻近杂质之间分离度为8.13，专属性良好。
表4.专属性测定结果
表5.图2的积分结果表
表6.图3的积分结果表
实施例2.耐用性
耐用性溶液：称取供试品21.20mg，精密移取杂质Z2a贮备溶液、杂质Z2c贮备溶液、Z2d贮备溶液、杂质Z3贮备溶液各2ml，置同一100ml量瓶中，加入甲苯试剂50μl，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
基于表1和表2的色谱条件，分别使用正常流动相色谱条件、调整色谱条件(柱温±2℃、流速±0.1ml/min、缓冲盐pH±0.2、流动相初始比例±1％)进行测试。
结果如表7-表8、图7-图15所示，当流速、柱温、流动相pH、流动相比例有波动时，主峰与邻近杂质峰间分离度均大于1.5，各杂质峰间分离度均大于1.5，表明本发明方法耐用性好。
表7.耐用性检测结果表(分离度)
表8.耐用性检测结果表(保留时间)
实施例3.定量限、检测限
(1)溶液配制
定量限贮备液：精密称取杂质Z2a 12.51mg，杂质Z2b 12.83mg，杂质Z2c 12.32mg，杂质Z2e 12.45mg，杂质Z1 12.71mg，中间体Z2 12.74mg，杂质Z3 12.29mg，置同一100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，再精密移取上述溶液1ml至100ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
定量限溶液：精密移取定量限贮备液1ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
检测限溶液：精密移取定量限溶液3ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
Z2c检测限溶液：精密称取杂质Z2c 10.82mg，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，精密移取2ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1.5ml，置100ml容量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
(2)检测
取步骤(1)配制的定量限溶液、检测限溶液和Z2c检测限溶液，分别注入液相色谱仪，按照表1好表2的色谱条件进行检测，获得色谱图。
结果：如表9-表10、图5-图6所示，各杂质相对于Z2样品中浓度为0.03％时，各杂质峰面积的RSD均小于10％，信噪比大于10，满足有关物质定量限的要求，说明各杂质在0.03％水平时，能被准确定量。各杂质相对于Z2样品中浓度为0.01％时，信噪比大于3，满足有关物质检测限的要求，说明各杂质在0.01％水平时，能被有效检出。
表9.检测限检测结果表
表10.定量限检测结果表
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实施例4.样品检测
分别配制3批乙磺酸尼达尼布中间体Z2的检测溶液(包括系统适用性溶液、对照溶液和供试品溶液)，然后按照表1和表2的色谱条件，分别对不同批次的乙磺酸尼达尼布中间体Z2有关物质进行检测。
结果：如表11所示，本发明方法可以实现乙磺酸尼达尼布中间体Z2有关物质的有效检测。
表11.不同批次乙磺酸尼达尼布中间体Z2有关物质的检测结果表
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Claims (10)
1.利用高效液相色谱法分离乙磺酸尼达尼布中间体Z2及其杂质的方法，其特征在于，所述杂质包括杂质Z2a、杂质Z1、杂质Z3、甲苯、杂质Z2e、杂质Z2b、杂质Z2d、杂质Z2c中的任一种或多种；所述高效液相色谱法中，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸盐为流动相A，乙腈为流动相B；通过梯度洗脱依次将杂质Z2a、杂质Z1、杂质Z3、甲苯、杂质Z2e、杂质Z2b、乙磺酸尼达尼布中间体Z2、杂质Z2d和/或杂质Z2c进行分离；所述乙磺酸尼达尼布中间体Z2的结构式如式Ⅰ所示；所述杂质Z2a的结构式如Ⅱ所示，所述杂质Z1的结构式如Ⅲ所示，所述杂质Z3的结构式如Ⅳ所示，所述杂质Z2e的结构式如Ⅴ所示，所述杂质Z2b的结构式如Ⅵ所示，所述杂质Z2d的结构式如Ⅶ所示，所述杂质Z2c的结构式如Ⅷ所示；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相A为磷酸二氢钾缓冲液，所述磷酸二氢钾缓冲液的浓度为0.02mol/L，pH值为2.8-3.2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序如下：
0分钟，设置流动相A和流动相B的体积比为64-66:36-34；
5分钟，设置流动相A和流动相B的体积比为64-66:36-34；
35分钟，设置流动相A和流动相B的体积比为35:65；
40分钟，设置流动相A和流动相B的体积比为35:65；
40.5分钟，设置流动相A和流动相B的体积比为64-66:36-34；
48分钟，设置流动相A和流动相B的体积比为64-66:36-34。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相的流速为1.1ml/min-1.3ml/min；
所述色谱柱柱温为13℃-17℃。
5.定性鉴别乙磺酸尼达尼布中间体Z2及其杂质的方法，其特征在于，利用权利要求1-4任一项所述的方法分离乙磺酸尼达尼布中间体Z2及其杂质，并进入检测器进行检测；
检测波长为225nm。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，各组分保留时间从短到长依次为杂质Z2a、杂质Z1、杂质Z3、甲苯、杂质Z2e、杂质Z2b、乙磺酸尼达尼布中间体Z2、杂质Z2d和/或杂质Z2c。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述色谱柱规格为4.6mm×150mm，5μm；所述流动相A为pH 3.0、浓度为0.02mol/L的磷酸二氢钾缓冲液，所述流动相B为乙腈；所述流动相的流速为1.2ml/min；所述色谱柱柱温为15℃；检测波长为225nm；采用如下梯度洗脱程序进行分离，并得到色谱图；
0分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为65:35；
5分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为65:35；
35分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为35:65；
40分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为35:65；
40.5分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为65:35；
48分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为65:35。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，保留时间在9.3±0.5min的为所述杂质Z2a，保留时间在13.9±0.5min的为所述杂质Z1，保留时间在15.1±0.5min的为所述杂质Z3，保留时间在20.1±0.5min的为所述甲苯，保留时间在23.1±0.5min的为所述杂质Z2e，保留时间在27.7±0.5min的为所述杂质Z2b，保留时间在31.3±0.5min的为所述乙磺酸尼达尼布中间体Z2，保留时间在35.2±0.5min的为所述杂质Z2d，保留时间在36.7±0.5min的为所述杂质Z2c。
9.检测乙磺酸尼达尼布中间体Z2中杂质的含量的方法，其特征在于，所述杂质包括杂质Z2a、杂质Z1、杂质Z3、杂质Z2e、杂质Z2b中的任一种或多种；所述方法包括如下步骤：
1)分离：利用权利要求1-4任一项所述的方法分离乙磺酸尼达尼布中间体Z2及其杂质；
2)检测：利用权利要求5-8任一项所述的方法对乙磺酸尼达尼布中间体Z2及其杂质进行检测，并得到色谱图；
3)含量计算：利用步骤2)得到的色谱图，按照加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算各杂质含量。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，分离前，以乙腈为溶剂配制待测样品。
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