CN117074578B - 一种2-（甲氨基）-乙醇的lc-ms/ms定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种2‑（甲氨基）‑乙醇的LC‑MS/MS定量检测方法，将样品通过衍生化溶液处理，使得2‑（甲氨基）‑乙醇中仲胺与PITC衍生化反应，提高2‑（甲氨基）‑乙醇在质谱上的响应，将样品经过衍生化溶液处理后，再通过LC‑MS/MS方法对2‑（甲氨基）‑乙醇定性或定量检测。本发明具有的有益效果是：实现使用LC‑MS/MS的方法对2‑（甲氨基）‑乙醇进行检测，能够充分提取样品中的2‑（甲氨基）‑乙醇，由此测得的2‑（甲氨基）‑乙醇含量准确可靠，该检测方法操作简单，检测速度快、分析时间短、检测结果准确性高。
Description
技术领域
本发明属于药物检测领域，尤其是涉及一种2-（甲氨基）-乙醇的LC-MS/MS定量检测方法。
背景技术
乙酰乙酸（N-苄基-N-甲基）氨基乙酯作为尼卡地平的中间体，2-（甲氨基）-乙醇是尼卡地平中间体合成过程中使用到的原料之一，中间体产物中其常含有杂质2-（甲氨基）-乙醇，2-（甲氨基）-乙醇属于基因毒性杂质中的一种。基因毒性杂质是指能直接或者间接损害DNA，导致基因突变或具有致癌倾向的位置。
近年来，EMEA、FDA、ICH等相继发布了针对基因毒性杂质的指导原则。基因毒性杂质限度要求很低，其分析检测的难度较大。液质联用法是药物分子中最常用的分离分析手段，但是对于2-（甲氨基）-乙醇这种质谱响应很弱的杂质，其检测灵敏度较低。对于此类含仲胺物质，通常采用气质联用技术进行测定，但其难以检测试样中较低浓度的检测限。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种2-（甲氨基）-乙醇的LC-MS/MS定量检测方法。
本发明采用的技术方案是：一种2-（甲氨基）-乙醇的LC-MS/MS定量检测方法，将样品通过衍生化溶液处理，使得2-（甲氨基）-乙醇中仲胺与PITC衍生化反应，提高2-（甲氨基）-乙醇在质谱上的响应。
优选地，将样品溶于乙腈中，将衍生化溶液加入并反应后，加入正己烷萃取多余的PITC，取乙腈层用于LC-MS/MS检测。
优选地，具体方法如下：
步骤一：配制衍生化溶液，将PITC、乙腈和0.1M碳酸钠溶液按照体积比1：8：1配制得到衍生化溶液；
步骤二：配制乙酸铵缓冲盐水溶液；
步骤三：配制2-（甲氨基）-乙醇对照品溶液，称定2-（甲氨基）-乙醇，加乙腈配制得到对照品衍生化溶液，将对照品衍生化溶液和衍生化试剂加入到同一容器中，反应后加入乙酸铵溶液和正己烷，混匀萃取并静置后，取中间层作为2-（甲氨基）-乙醇对照品溶液；
步骤四：样品溶液的配制，称定样品，加乙腈配制得到样品衍生化溶液，取与步骤三中对照品衍生化溶液等量的样品衍生化溶液，按照与步骤三相同的实验条件和步骤制备得到样品溶液；
步骤五：将步骤三和四中制备得到的溶液在LC-MS/MS中进样检测；
步骤六：按外标法以峰面积计算2-（甲氨基）-乙醇的含量。
优选地，步骤三具体步骤为：精密称定2-（甲氨基）-乙醇对照品，加乙腈稀释至浓度为 1μg/ml得到对照品衍生化溶液，精密移取0.1ml对照品衍生化溶液、0.5ml衍生化试剂，置同一离心管中，涡旋充分混匀，于室温放置后，加入0.5ml乙酸铵溶液、2ml正己烷，涡旋萃取，静置后取中间层，再用甲醇稀释500倍，得到2-（甲氨基）-乙醇对照品溶液；
步骤四中，精密称定样品，加入乙腈配制1mg/ml的样品衍生化溶液。
优选地，步骤五中色谱条件为：色谱柱：硅烷键合硅胶柱为固定相的高效液相色谱柱，流动相A：甲酸-水，体积比为0.1:100，流动相B：乙腈，流动相流速：0.4-0.5ml/min，色谱柱柱温：29-31℃，进样量为10μl；质谱检测条件为：ESI正离子源，MRM模式扫描，离子源温度550℃，离子源电压5000V，检测离子对:211.1→76.1。
优选地，2-（甲氨基）-乙醇定量限为20.47ng/ml。
优选地，2-（甲氨基）-乙醇检出限为1.05μg/ml。
2-（甲氨基）-乙醇的LC-MS/MS定量检测方法在评价尼卡地平安全性方法中的应用。
本发明具有的优点和积极效果是：实现使用LC-MS/MS的方法对2-（甲氨基）-乙醇进行检测，能够充分提取样品中的2-（甲氨基）-乙醇，2-（甲氨基）-乙醇的提取率可达93.8％，由此测得的2-（甲氨基）-乙醇含量准确可靠，且本检测方法的准确性经专属性、定量限与检出限、精密度等试验验证；本检测方法在降低限度浓度的同时也保证了不会损失待测杂质，使得利用LC-MS/MS法即可完成低浓度2-（甲氨基）-乙醇(0.1%)的检测；
该检测方法操作简单，检测速度快、分析时间短、检测结果准确性高，克服了现有技术不能用LC-MS/MS检测药物中2-（甲氨基）-乙醇含量的难题。
附图说明
图1为实施例2中专属性稀释剂图；
图2为实施例2中专属性对照品溶液图；
图3为实施例2中专属性供试品溶液图；
图4为实施例2中专属性供试品加标溶液图；
图5为实施例4中定量限对照品溶液图；
图6为实施例4中检测限供试品加标溶液图；
图7为实施例5中2-（甲氨基）-乙醇线性图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例做出说明。
本发明涉及一种2-（甲氨基）-乙醇的LC-MS/MS定量检测方法，具体为使用LC-MS/MS测定乙酰乙酸（N-苄基-N-甲基）氨基乙酯中2-（甲氨基）-乙醇的方法。通过对样品进行前处理衍生化，利用LC-MS/MS法即可完成低浓度2-（甲氨基）-乙醇的检测，通过严格控制2-（甲氨基）-乙醇在尼卡地平中间体中的含量，来进一步保证药物的安全性。
利用2-（甲氨基）-乙醇中仲胺与PITC的衍生化反应，首先发生衍生化反应添加官能团提高杂质在质谱上的响应；同时利用PITC与杂质衍生化产物的溶解度差异，将PITC萃取在正己烷中，2-（甲氨基）-乙醇仍溶解在乙腈溶液中，不会影响产品中2-（甲氨基）-乙醇含量的检测。具体检测方法如下：
步骤一：配制衍生化溶液，按照PITC（异硫氰酸苯酯）：乙腈：0.1M碳酸钠溶液=1：8：1（v:v:v）比例关系配制衍生化溶液。
步骤二：配制乙酸铵缓冲盐水溶液（pH=6.0），称取乙酸铵约100g于500ml试剂瓶中，加入300ml水，超声震荡完全溶解，加入7ml乙酸，混匀，即得。
步骤三：2-（甲氨基）-乙醇对照品溶液的配制，取2-（甲氨基）-乙醇对照品适量，精密称定，加乙腈稀释至浓度为 1μg/ml对照品衍生化溶液，精密移取0.1ml对照品衍生化溶液、0.5ml衍生化试剂，置同一5ml离心管中，涡旋30s充分混匀，于室温放置30min，加入0.5ml乙酸铵溶液、2ml正己烷，涡旋30s萃取，静置10min后，取中间层，再用甲醇稀释500倍，即得2-（甲氨基）-乙醇对照品溶液；
其中，2-（甲氨基）-乙醇对照品衍生化溶液的配制过程为：取2-（甲氨基）-乙醇对照品约2mg，精密称定，置20ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
步骤四：样品溶液的配制，精密称定样品，加入乙腈使其完全溶解，配制1mg/ml的样品衍生化溶液，精密移取0.1ml样品衍生化溶液、0.5ml衍生化试剂，置同一5ml离心管中，涡旋30s充分混匀，于室温放置30min，加入0.5ml乙酸铵溶液、2ml正己烷，涡旋30s萃取，静置10min后，取中间层，再用甲醇稀释500倍，即得样品溶液；
其中，样品衍生化溶液的配制过程为：取样品月20mg，精密称定，置20ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
步骤五：将步骤三和四中制备得到的溶液分别在LC-MS/MS中进样检测；
色谱检测条件为：色谱柱：硅烷键合硅胶柱为固定相的高效液相色谱柱，流动相A：甲酸-水，体积比为0.1:100，流动相B：乙腈，流动相流速：0.4-0.5ml/min，色谱柱柱温：29-31℃，进样量为10μl；质谱检测条件为：ESI正离子源，MRM模式扫描，离子源温度550℃，离子源电压5000V，检测离子对:211.1→76.1；
优选为色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18色谱柱，规格为 4.6*100mm，填料粒径3.5μm；流动相流速为：0.45ml/min，色谱柱柱温：30℃；ESI正离子源，MRM模式扫描，离子源温度550℃，离子源电压5000V，检测离子对:211.1→76.1。
步骤六：计算2-（甲氨基）-乙醇的含量，按外标法以峰面积计算2-（甲氨基）-乙醇的含量。
通过上述方法中的衍生化处理，2-（甲氨基）-乙醇的提取率可达93.8％，保证2-（甲氨基）-乙醇的充分提取，可完成低浓度2-（甲氨基）-乙醇(0.1%)的检测。2-（甲氨基）-乙醇定量限为20.47ng/ml，约相当于检测限度浓度的2% ；2-（甲氨基）-乙醇检出限为10.64ng/ml，约相当于样品检测浓度的1%。2-（甲氨基）-乙醇在20.47～2047.0ng/ml的浓度范围内线性关系良好。本检测方法的准确性经专属性、定量限与检出限、精密度等试验验证。
下面以一个色谱条件为例，对本发明方案做出进一步说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。下述实施例中使用的仪器为API-4000 QTrap LC-MS/MS液相色谱质谱联用仪，配置：二元泵，自动进样器，柱温箱，Analyst 1.5.2数据处理系统。
使用的试剂与试药如下：
乙腈：色谱纯；Merk；Lot NO：K54140530209；
超纯水：屈臣氏；
无水碳酸钠:分析纯；西陇化工；Lot：1010101
甲酸：色谱纯；CNW；lot:51780100；
PITC：色谱纯；Sigma；Lot：102407210；
乙酸铵：色谱纯；Fisher;Lot:140675;
杂质A（2-（甲氨基）-乙醇）（杂质A）：含量以100.0%计算，由陕西大生制药科技有限公司；简称ZZA；
乙酰乙酸（N-苄基-N-甲基）氨基乙酯（SM3）：由陕西大生制药科技有限公司提供；简称：SM3。
下述实施例LC-MS/MS分析方法的测试条件如下：
(1) 色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18，4.6*100mm，3.5μm；
(2) 色谱条件：以甲酸-水，(体积比为0.1:100)为流动相A，乙腈为流动相B，流速为每分钟0.45ml，柱温为30℃，照下表进行梯度洗脱：
(3)质谱条件：ESI正离子源，MRM模式扫描，离子源温度550℃，离子源电压5000V，照下表离子对进行扫描，质谱采集时间4.2~5.0min：
实施例1：样品中2-（甲氨基）-乙醇含量的检测
本实施例提供的LC-MS/MS法测定乙酰乙酸（N-苄基-N-甲基）氨基乙酯中2-（甲氨基）-乙醇残留检测方法，包括如下步骤：
衍生化试剂配制：PITC（异硫氰酸苯酯）：乙腈：0.1M碳酸钠溶液=1：8：1（v:v:v）
乙酸铵缓冲盐水溶液（pH=6.0）:称取乙酸铵约100g于500ml试剂瓶中，加入300ml水，超声震荡完全溶解，加入7ml乙酸，混匀，即得；
2-（甲氨基）-乙醇对照品储备液(100μg/ml)的配制：取2-（甲氨基）-乙醇对照品2.078mg，精密称定，置20ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2-（甲氨基）-乙醇对照品溶液的配制：精密量取2-（甲氨基）-乙醇对照品储备液1.0ml，置100ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品衍生化溶液，精密移取0.1ml对照品衍生化溶液、0.5ml衍生化试剂，置同一5ml离心管中，涡旋30s充分混匀，于室温放置30min，加入0.5ml乙酸铵溶液、2ml正己烷，涡旋30s萃取，静置10min后，取中间层，再用甲醇稀释500倍，即得。
样品溶液的配制：精密称定样品21.47mg置于20ml容量瓶中，加入乙腈使其完全溶解，配制1mg/ml的样品衍生化溶液，精密移取0.1ml样品衍生化溶液、0.5ml衍生化试剂，置同一5ml离心管中，涡旋30s充分混匀，于室温放置30min，加入0.5ml乙酸铵溶液、2ml正己烷，涡旋30s萃取，静置10min后，取中间层，再用甲醇稀释500倍，即得；
样品加标溶液的配制：精密称定样品20.88mg置于20ml容量瓶中，加入乙腈使其完全溶解，配制1mg/ml的样品衍生化溶液，精密移取0.1ml样品衍生化溶液、1μl2-（甲氨基）-乙醇对照品储备液、0.5ml衍生化试剂，置同一5ml离心管中，涡旋30s充分混匀，于室温放置30min，加入0.5ml乙酸铵溶液、2ml正己烷，涡旋30s萃取，静置10min后，取中间层，再用甲醇稀释500倍，即得；
样品检测：将步骤(4)、(5)和(6）得到的溶液在LC-MS/MS中进样检测；
其中，色谱检测条件为：色谱柱：硅烷键合硅胶柱为固定相的高效液相色谱柱，流动相A：甲酸-水，体积比为0.1:100，流动相B：乙腈，流动相流速：0.4-0.5ml/min，色谱柱柱温：29-31℃，进样量为10μl；质谱检测条件为：ESI正离子源，MRM模式扫描，离子源温度550℃，离子源电压5000V，检测离子对:211.1→76.1;
2-（甲氨基）-乙醇含量及提取率的计算：按外标法以峰面积计算2-（甲氨基）-乙醇的含量及提取率。
结果表明，样品溶液在2-（甲氨基）-乙醇出峰位置处无干扰。按外标法以峰面积计算样品中2-（甲氨基）-乙醇含量及提取率。样品中2-（甲氨基）-乙醇含量计算公式如下：
A样品为样品溶液中2-（甲氨基）-乙醇的峰面积；
A对照为对照品溶液中2-（甲氨基）-乙醇的峰面积；
C对照为对照品溶液中2-（甲氨基）-乙醇的浓度；
V为样品溶液的配制体积，ml；
m样品为样品称样量，mg。
按照上述方法分别对3批样品进行检测，3批样品中2-（甲氨基）-乙醇含量见表1。
表1 样品检测结果
本方法能够有效检测到样品中2-（甲氨基）-乙醇。
实施例2：专属性实验
考察空白溶剂、样品溶液中其它成分对2-（甲氨基）-乙醇色谱峰是否干扰。
衍生化溶液的配制：PITC（异硫氰酸苯酯）：乙腈：0.1M碳酸钠溶液=1：8：1（v:v:v）；
乙酸铵缓冲盐水溶液（pH=6.0）:称取乙酸铵约100g于500ml试剂瓶中，加入300ml水，超声震荡完全溶解，加入7ml乙酸，混匀，即得；
2-（甲氨基）-乙醇对照品溶液的配制：取2-（甲氨基）-乙醇对照品适量，精密称定，加乙腈稀释至浓度为 1μg/ml对照品衍生化溶液，精密移取0.1ml对照品衍生化溶液、0.5ml衍生化试剂，置同一5ml离心管中，涡旋30s充分混匀，于室温放置30min，加入0.5ml乙酸铵溶液、2ml正己烷，涡旋30s萃取，静置10min后，取中间层，再用甲醇稀释500倍，即得；
样品溶液的配制：精密称定样品，加入乙腈使其完全溶解，配制1mg/ml的样品衍生化溶液，精密移取0.1ml样品衍生化溶液、0.5ml衍生化试剂，置同一5ml离心管中，涡旋30s充分混匀，于室温放置30min，加入0.5ml乙酸铵溶液、2ml正己烷，涡旋30s萃取，静置10min后，取中间层，再用甲醇稀释500倍，即得；
对照品与样品混合工作液：分别精密移取0.1ml 2-（甲氨基）-乙醇衍生化后中间层溶液和样品溶液，置50ml容量瓶，加乙腈稀释并定容至刻线，摇匀，作为对照品与样品混合工作液；
取空白溶剂、2-（甲氨基）-乙醇对照品溶液、样品溶液和对照品与样品混合工作液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，得到的色谱图如图1-图4所示，并将专属性试验结果列于表2。
从图1-图4及表2可以看出，空白溶剂与样品溶液在2-（甲氨基）-乙醇出峰位置处均无色谱峰，样品加标溶液中2-（甲氨基）-乙醇与主成分的相对保留时间差为0.87min，大于0.5min，符合可接受的标准。其中，可接受的标准为：空白溶剂在2-（甲氨基）-乙醇出峰位置处应无干扰；对照品与样品混合工作液中2-（甲氨基）-乙醇色谱峰，与乙酰乙酸（N-苄基-N-甲基）氨基乙酯保留时间差不小于0.5min。
表2专属性试验结果
实施例3：系统精密度实验
取浓度为1μg/ml 2-（甲氨基）-乙醇对照品溶液连续进样6次，记录色谱图，计算2-（甲氨基）-乙醇峰面积RSD。将连续6次进样得2-（甲氨基）-乙醇峰面积RSD列于表3，从表3中可知，2-（甲氨基）-乙醇峰面积RSD 为1.9％，小于10％。因此，本方法系统精密度良好。
表3系统精密度结果
实施例4：检测限和定量限
参考系统精密度中对照品溶液2-（甲氨基）-乙醇色谱峰的信噪比，以及LOD信噪比要求(3～10) 和LOQ信噪比要求(10～20)，配制相应浓度溶液，考察其定量限和检出限。
LOQ溶液配制：精密移取专属性试验中的2-（甲氨基）-乙醇对照品工作液0.2ml于10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀，得到LOQ溶液。
表4 2-（甲氨基）-乙醇定量限试验结果
取LOQ溶液连续进样6次，记录色谱图，如图5所示，2-（甲氨基）-乙醇定量限试验结果见表4，由此可知，峰面积RSD为12.3％小于15％，S/N在14.0～16.2之间。结论：本方法2-（甲氨基）-乙醇定量限为20.47ng/ml，约相当于检测限度浓度的2%。
LOD溶液配制：精密移取2-（甲氨基）-乙醇对照品工作液0.1ml，置于10ml容量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀得到浓度约为10ng/ml的溶液。
取LOD溶液连续进样3次，记录色谱图，如图6所示，2-（甲氨基）-乙醇检出限试验结果见表5，从表中可知，2-（甲氨基）-乙醇信噪比均为3，本方法2-（甲氨基）-乙醇检出限为10.64ng/ml，约相当于样品检测浓度的1%。
表5 2-（甲氨基）-乙醇检出限试验结果
实施例5：线性与范围
配制浓度分别为204.7ng/ml、511.8ng/ml、818.8ng/ml、1023.5ng/ml、1535.3ng/ml和2047.0ng/ ml的2-（甲氨基）-乙醇对照品溶液，将不同浓度的溶液由低到高依次进样，每个浓度水平溶液进样分析2次，线性最低点为LOQ溶液，LOQ峰面积为6针的平均峰面积，以2-（甲氨基）-乙醇浓度为横坐标，平均峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到的2-（甲氨基）-乙醇线性图如图7所示，2-（甲氨基）-乙醇线性浓度和峰面积结果列于表6中，得到的2-（甲氨基）-乙醇线性方程为y＝2762.2x–260.49，相关系数r＝0.99834>0.99。由此可知，2-（甲氨基）-乙醇在20.47～2047.0ng/ml的浓度范围内线性关系良好。
表6 2-（甲氨基）-乙醇线性浓度和峰面积结果
实施例6：准确度实验
分别制备低、中、高3个不同浓度的供试品加标溶液，每种浓度分别制备3份供试品加标溶液考察方法的准确度。
2-（甲氨基）-乙醇对照品储备液：精密称取2-（甲氨基）-乙醇对照品2.047mg，置20ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2-（甲氨基）-乙醇对照品储备液1溶液：精密量取2-（甲氨基）-乙醇对照品储备液1ml，置10ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
分别移取2-（甲氨基）-乙醇对照品储备液1溶液1ml、2ml、3ml，置10ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为低、中、高不同浓度加标储备液。
样品溶液的配制：精密称定样品，加入乙腈使其完全溶解，配制1mg/ml的样品衍生化溶液，精密移取0.1ml样品衍生化溶液、0.5ml衍生化试剂，置同一5ml离心管中，涡旋30s充分混匀，于室温放置30min，加入0.5ml乙酸铵溶液、2ml正己烷，涡旋30s萃取，静置10min后，取中间层，再用甲醇稀释500倍，即得。平行配制2份。
样品加标溶液：取第二份样品衍生化溶液，分别精密移取0.05ml供试品衍生化溶液和低、中、高不同浓度加标储备液，加入0.5ml衍生化试剂，置于同一5ml离心管中，作为加标50%、100% 、150%溶液，衍生化处理方法同“供试品溶液”。加标50%、150%溶液平行配制3份，加标100%溶液平行配制6份。
取2-（甲氨基）-乙醇对照品溶液、样品溶液和样品加标溶液进样分析，按外标法以峰面积计算各水平加标溶液中2-（甲氨基）-乙醇回收率。得到的2-（甲氨基）-乙醇准确度试验结果如表6所示，从表7可知，各加标水平平均回收率在99.4％～109.1％之间，因此本项目的检测方法准确度良好。
表7 2-（甲氨基）-乙醇准确度试验结果
结论：本方法准确性良好。
实施例7：重复性实验
取“准确度实验”配制6份加标100%溶液，按外标法以峰面积计算各水平加标溶液中2-（甲氨基）-乙醇回收率，得到的2-（甲氨基）-乙醇重复性试验结果如表8所示，从表8可知，6份样品溶液中2-（甲氨基）-乙醇回收率RSD（%）为1.8%，小于10%，因此本项目的检测方法重复性良好。
表8 2-（甲氨基）-乙醇重复性试验结果
实施例8：中间精密度实验
由不同实验人员不同日期用已建立的分析方法，制备6份中浓度的供试品加标溶液，考察方法的准确度。
2-（甲氨基）-乙醇对照品储备液：精密称取2-（甲氨基）-乙醇对照品2.127mg、2.111mg，置20ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2-（甲氨基）-乙醇对照品储备液1溶液：精密量取2-（甲氨基）-乙醇对照品储备液1ml，置10ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
加标储备液溶液：精密移取2-（甲氨基）-乙醇对照品储备液1溶液2ml置10ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为加标储备液溶液。
样品溶液的配制：精密称定样品，加入乙腈使其完全溶解，配制1mg/ml的样品衍生化溶液，精密移取0.1ml样品衍生化溶液、0.5ml衍生化试剂，置同一5ml离心管中，涡旋30s充分混匀，于室温放置30min，加入0.5ml乙酸铵溶液、2ml正己烷，涡旋30s萃取，静置10min后，取中间层，再用甲醇稀释500倍，即得。平行配制2份。
样品加标溶液：取第二份样品衍生化溶液，分别精密移取0.05ml供试品衍生化溶液和加标储备液溶液，加入0.5ml衍生化试剂，置于同一5ml离心管中，作为加标溶液，衍生化处理方法同“样品溶液”，平行配制6份。
取2-（甲氨基）-乙醇对照品溶液、样品溶液和样品加标溶液进样分析，记录色谱图，按外标法以峰面积计算回收率。将得到的中间精密度试验结果列于表9，从表9的数据可知，中间精密度和重复性共12份供试品加标回收率RSD为5.9％，说明本项目的检测方法中间精密度良好。
表9中间精密度试验结果
实施例9：耐用性实验
参考2-（甲氨基）-乙醇检测液相色谱方法，适度改变方法，调整柱温±1℃、流速±0.05ml/min情况下，验证本项目的检测方法是否适用。
由于样品中检测出2-（甲氨基）-乙醇含量较低，故选择用样品加标溶液作为耐用性测试溶液，计算2-（甲氨基）-乙醇含量 (相当于样品)，配制2-（甲氨基）-乙醇对照品溶液和样品加标溶液，在不同耐用性条件下，分别进样分析，记录色谱图，按外标法以峰面积计算2-（甲氨基）-乙醇含量。调整柱温±1℃、流速±0.05ml/min 情况下得到的耐用性试验结果分别见表9-10，由表10-11的数据可知，在改变本项目检测方法的柱温(30±1℃)、流速(0.45±0.05ml/min)条件下，2-（甲氨基）-乙醇含量RSD值均小于10％。说明本项目的检测方法耐用性良好。
表10 柱温(30±1℃)耐用性试验结果
表11流速(0.8±0.1ml/min)耐用性试验结果
实施例10：溶液稳定性实验
利用100%限度对照品工作液和供试品加标溶液考察室温、4℃放置稳定性，考察时间为0hr，1hr，2hr，4hr，6hr，8hr。稳定性溶液中2-（甲氨基）-乙醇相应峰面积比值在15%范围内，可视为稳定。得到的2-（甲氨基）-乙醇稳定性结果见表12-15，说明对照品工作液和样品加标溶液室温条件下放置8小时内稳定。对照品工作液和样品加标溶液4℃条件下放置6小时内稳定。
表12 对照品溶液室温放置8hr稳定性结果
表13 对照品溶液4℃放置8hr稳定性结果
表14 样品加标溶液室温放置8hr稳定性结果
表15 样品加标4℃放置8hr稳定性结果
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (5)
1.一种2-（甲氨基）-乙醇的LC-MS/MS定量检测方法，其特征在于：将样品通过衍生化溶液处理，使得2-（甲氨基）-乙醇中仲胺与PITC衍生化反应；将样品溶于乙腈中，将衍生化溶液加入并反应后，加入正己烷萃取多余的PITC，取乙腈层用于LC-MS/MS检测；具体方法如下：
步骤一：配制衍生化溶液，将PITC、乙腈和0.1M碳酸钠溶液按照体积比1：8：1配制得到衍生化溶液；
步骤二：配制乙酸铵溶液；pH=6.0，称取乙酸铵100g，加入300ml水，超声震荡完全溶解，加入7ml乙酸，混匀；
步骤三：配制2-（甲氨基）-乙醇对照品溶液，称定2-（甲氨基）-乙醇，加乙腈配制得到对照品衍生化溶液，将对照品衍生化溶液和衍生化试剂加入到同一容器中，反应后加入乙酸铵溶液和正己烷，混匀萃取并静置后，取中间层作为2-（甲氨基）-乙醇对照品溶液；
步骤四：样品溶液的配制，称定样品，加乙腈配制得到样品衍生化溶液，取与步骤三中对照品衍生化溶液等量的样品衍生化溶液，按照与步骤三相同的实验条件和步骤制备得到样品溶液；
步骤五：将步骤三和四中制备得到的溶液在LC-MS/MS中进样检测；色谱条件为：色谱柱：硅烷键合硅胶柱为固定相的高效液相色谱柱，流动相A：甲酸-水，体积比为0.1:100，流动相B：乙腈，流动相流速：0.4-0.5ml/min，色谱柱柱温：29-31℃，进样量为10μl；质谱检测条件为：ESI正离子源，MRM模式扫描，离子源温度550℃，离子源电压5000V，检测离子对:211.1→76.1；
步骤六：按外标法以峰面积计算2-（甲氨基）-乙醇的含量。
2.根据权利要求1所述的2-（甲氨基）-乙醇的LC-MS/MS定量检测方法，其特征在于：步骤三具体步骤为：精密称定2-（甲氨基）-乙醇对照品，加乙腈稀释至浓度为 1μg/ml得到对照品衍生化溶液，精密移取0.1ml对照品衍生化溶液、0.5ml衍生化试剂，置同一离心管中，涡旋充分混匀，于室温放置后，加入0.5ml乙酸铵溶液、2ml正己烷，涡旋萃取，静置后取中间层，再用甲醇稀释500倍，得到2-（甲氨基）-乙醇对照品溶液；
步骤四中，精密称定样品，加入乙腈配制1mg/ml的样品衍生化溶液。
3.根据权利要求1或2所述的2-（甲氨基）-乙醇的LC-MS/MS定量检测方法，其特征在于：2-（甲氨基）-乙醇定量限为20.47ng/ml。
4.根据权利要求1或2所述的2-（甲氨基）-乙醇的LC-MS/MS定量检测方法，其特征在于：2-（甲氨基）-乙醇检出限为10.64ng/ml。
5.权利要求1-4中任一所述的2-（甲氨基）-乙醇的LC-MS/MS定量检测方法在评价尼卡地平安全性方法中的应用。
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