CN115792033A - 一种1-丙基磷酸酐中丙基磷酸的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种1‑丙基磷酸酐中丙基磷酸的检测方法，采用高效液相色谱法，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为磷酸水溶液或磷酸水溶液‑乙腈体系。本发明首次分离并检测1‑丙基磷酸酐中丙基磷酸，从而有效控制1‑丙基磷酸酐的质量。本发明检测方法专属性强、线性好、灵敏度高、准确度、重复性好、稳定性好、耐用性好，填补了现有技术对1‑丙基磷酸酐中丙基磷酸检测的技术空白，具备实际推广应用价值。

Description

一种1-丙基磷酸酐中丙基磷酸的检测方法

技术领域

本发明属于药物分析检测领域，具体涉及一种1-丙基磷酸酐中丙基磷酸的检测方法。

背景技术

1-丙基磷酸酐(T3P)，别名1-丙基磷酸环酐，为无色或淡黄色的糖浆状液体，是一种新型的缩合剂、脱水剂、偶联剂。作为偶联剂，1-丙基磷酸酐主要用于多肽合成中形成酰胺或酯，其完全可以替代传统的HOBt类的易爆危险的试剂，是一个很有前途的新兴高效偶联剂。相对于传统的多肽合成偶联剂如DCC、DIC、EDC、11BTU、HBTU等，1-丙基磷酸酐所得产品的纯度高，在有机合成中越来越广泛的应用于多肽合成工艺中酸与胺的脱水和耦联反应，有逐渐取代DCC、DIC和EDC的趋势。作为重要的缩合剂，1-丙基磷酸酐具有很高的活性，产率高，同时具有优秀的反应选择性和低差向异构化作用，以及用量少、后处理方便、无致敏性等优点。

目前对于1-丙基磷酸酐的研究，主要集中于合成方法和应用，如CN111635434A公开了一种1-丙基磷酸环酐的合成方法，但还未见有关1-丙基磷酸酐质量检测方法的研究报道。发明人在实验过程中发现，1-丙基磷酸酐在合成和储存过程中易吸水，并进一步水解成丙基磷酸，导致其作为缩合剂使用时反应活性降低，影响缩合反应的收率。然而，现有技术中尚缺乏相应的检测方法，不能对该缩合剂的水解产物进行把控。因此，如何高效便捷、安全、低成本地实现1-丙基磷酸酐中丙基磷酸的检测，成为亟待解决的问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种1-丙基磷酸酐中丙基磷酸的检测方法，采用高效液相色谱法，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为磷酸水溶液或磷酸水溶液-乙腈体系。

上述发明是基于发明人的以下发现完成的：经考察，待测物丙基磷酸的紫外吸收很弱，仅在极低波长下才有较弱的吸收。在此情况下，如果流动相吸收较强将掩盖待测物出峰，甚至出倒峰，因此，流动相的选择不仅要保证待测物的分离度，更需要兼顾紫外吸收，避免干扰待测物出峰。发明人经过筛选，发现磷酸水溶液-乙腈为最适宜的流动相体系，能够同时满足以上两方面的需求，为检测1-丙基磷酸酐中的丙基磷酸提供了可能。

进一步地，所述磷酸水溶液的浓度为0.05％～0.15％v/v，优选为0.08％～0.12％v/v，更优选为0.1％v/v。

进一步地，流动相采用磷酸水溶液或磷酸水溶液-乙腈体系进行等度洗脱，其中磷酸水溶液：乙腈的体积比为(98～100)：(2～0)；或者，流动相采用磷酸水溶液-乙腈体系进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～5min，0％乙腈；5.01～10min，30％乙腈；10.01～25min，0％乙腈。在上述条件下，待测物能够获得最佳的分离度。

进一步地，所述固定相为YMC-Pack ODS-AQ C18或其等效色谱柱；优选地，YMC-Pack ODS-AQ C18的长度为75～300mm，进一步优选为150～250mm，更优选为250mm；优选地，YMC-Pack ODS-AQ C18的内径为1～10mm，进一步优选为2.1～4.6mm，更优选为4.6mm；优选地，YMC-Pack ODS-AQ C18的填充剂粒径为3～10μm，更优选为5μm。

进一步地，所述高效液相色谱法设置柱温为20℃～30℃；优选25℃。

进一步地，所述流动相的流速为每分钟0.8～1.2ml；优选每分钟1ml。

进一步地，所述高效液相色谱法设置检测波长为190～200nm，优选190nm。

进一步地，供试品溶液中1-丙基磷酸酐：稀释剂的质量体积比在50mg：1ml以上，优选为50～400mg：1ml，更优选为100mg：1ml。

进一步地，对照品溶液中丙基磷酸：稀释剂的质量体积比为0.1～1mg：1ml，优选为0.5mg：1ml。

进一步地，进样体积为5～15μl，更优选10μl。

进一步地，所述稀释剂为所述磷酸水溶液。

进一步地，所述检测为定性检测和/或定量检测。

进一步地，所述定量检测是采用外标法以峰面积计算丙基磷酸的含量。

本发明提供的检测方法首次实现了1-丙基磷酸酐中丙基磷酸的分离检测，并定量检测丙基磷酸的含量，从而有效控制1-丙基磷酸酐的质量。方法学验证实验结果表明，本发明检测方法的系统适用性、专属性、线性、灵敏度、准确度、稳定性等均能够达到准确检测1-丙基磷酸酐中丙基磷酸的要求，填补了现有技术对1-丙基磷酸酐中丙基磷酸检测的技术空白，具备实际推广应用价值。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为实施例1中空白溶剂的典型色谱图；

图2为实施例1中对照品溶液的典型色谱图；

图3为实施例1中供试品溶液的典型色谱图；

图4为实施例1中混合溶液的典型色谱图；

图5为实施例3中丙基磷酸溶液的典型色谱图；

图6为实施例4中丙基磷酸溶液的典型色谱图；

图7为对比例1中丙基磷酸溶液的典型色谱图；

图8为对比例2中丙基磷酸溶液的典型色谱图。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过市售购买获得。

以下实验中的供试品1-丙基磷酸酐均为1-丙基磷酸酐(50％乙酸乙酯溶液)。

实验材料准备如下：

岛津LC-2030C PLUS液相色谱仪系统；

Agela Venusil HILIC亲水作用色谱柱(规格：4.6×250mm，5μm)；

YMC-Pack ODS-AQ C18色谱柱(规格：4.6×250mm，5μm)；

十万分之一电子天平(SECURA225D-1CN型，Sartorius)；

丙基磷酸对照品：阿拉丁，批号：B2223619；

1-丙基磷酸酐50％乙酸乙酯溶液样品：北京伊诺凯科技有限公司，批号：KYHBO01；

乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯。

实施例1本发明1-丙基磷酸酐中丙基磷酸的检测

1、色谱条件

色谱柱：采用填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，本实施例中具体选用YMC-Pack ODS-AQ C18色谱柱，规格具体选用4.6×250mm，5μm；

流动相：以0.1％v/v磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱；

检测波长为190nm；

流速为每分钟1.0ml；

柱温为25℃；

进样体积10μl；

空白溶剂/稀释剂：流动相A(0.1％v/v磷酸水溶液)

2、样品制备

1)供试品溶液的制备：取1-丙基磷酸酐，精密称定，加0.1％v/v磷酸水溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含100mg的溶液。

2)对照品溶液的制备：取丙基磷酸对照品，精密称定，加0.1％v/v磷酸水溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含0.5mg的溶液。

3)混合溶液：取1-丙基磷酸酐及丙基磷酸对照品，精密称定，用0.1％v/v磷酸水溶液溶解并定量稀释制成每1ml约含1-丙基磷酸酐100mg，丙基磷酸0.5mg的混合溶液。吸取空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、混合溶液分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，见图1～图4。实验结果显示，对照品溶液色谱图中丙基磷酸峰保留时间为3.214min；理论板数按杂质丙基磷酸峰计算为9747；供试品及空白溶剂不干扰丙基磷酸出峰；丙基磷酸峰与相邻峰(空白溶剂出峰)的分离度为1.9。供试品溶液的色谱图中呈现与对照品溶液色谱图中丙基磷酸保留时间一致的色谱峰，确定供试品中含有丙基磷酸。

实施例2本发明检测方法的方法学验证

色谱条件同实施例1。

1系统适用性

对照品溶液：取丙基磷酸对照品适量，精密称定，加0.1％v/v磷酸水溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液。

精密量取对照品溶液进样，记录色谱图。对照品溶液色谱图见图1，理论板数按杂质丙基磷酸峰计算为9747，表明柱效高，能够达到检测要求。

2专属性

丙基磷酸贮备液：称取杂质丙基磷酸对照品99.92mg置20ml容量瓶中，加0.1％v/v磷酸水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀即可。

丙基磷酸对照品溶液：精密移取丙基磷酸杂质贮备液2ml置20ml容量瓶中，加0.1％v/v磷酸水溶液稀释至刻度，摇匀即可。

供试品溶液：称取1-丙基磷酸酐2004.39mg，置20ml量瓶中，加0.1％v/v磷酸水溶液稀释至刻度，摇匀。

加标供试品溶液：称取1-丙基磷酸酐1998.73mg，置20ml量瓶中，再精密移取丙基磷酸贮备液2ml，置同一20ml量瓶中，加0.1％v/v磷酸水溶液稀释至刻度，摇匀。

精密量取空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液分别进样1针，记录色谱图。色谱图见图1～图4。可以看出，溶剂不干扰丙基磷酸出峰；供试品溶液中其他杂质不干扰丙基磷酸出峰；加标供试品溶液中丙基磷酸与相邻色谱峰的分离度≥1.5；加标供试品溶液中丙基磷酸峰保留时间与对照品溶液中丙基磷酸峰保留时间之差绝对值为0.0min。显示本发明检测方法专属性良好。(注：①本方法中1-丙基磷酸酐不呈现有效的色谱峰；②空白溶剂中3.5～4min左右的两个溶剂峰受进样时压力扰动和连续进样梯度回归平衡细微差异的影响，大小可能有所波动。)

3定量限及检测限

丙基磷酸贮备液：称取杂质丙基磷酸对照品99.66mg置20ml容量瓶中，加0.1％v/v磷酸水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀即可。

定量限溶液：取丙基磷酸贮备液稀释至所需浓度的溶液，使杂质峰的信噪比为10～20。

检测限溶液：取定量限溶液稀释至杂质峰的信噪比为3～7。

精密量取定量限溶液连续进样6针，检测限溶液进样1针，记录色谱图。实验结果表明，丙基磷酸定量限浓度为47.4620μg/ml，检测限浓度为23.7310μg/ml，定量限浓度占供试品浓度的0.047％，显示本发明检测方法灵敏度良好。

4线性和范围

丙基磷酸贮备液:称取杂质丙基磷酸对照品99.66mg置20ml容量瓶中，加0.1％v/v磷酸水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀即可。

定量限溶液：精密移取丙基磷酸贮备液0.2ml置20ml容量瓶中，加0.1％v/v磷酸水溶液稀释至刻度，摇匀即可。

20％线性溶液：精密移取丙基磷酸贮备液0.4ml置20ml容量瓶中，加0.1％v/v磷酸水溶液稀释至刻度，摇匀即可。

50％线性溶液：精密移取丙基磷酸贮备液1ml置20ml容量瓶中，加0.1％v/v磷酸水溶液稀释至刻度，摇匀即可。

100％线性溶液：精密移取丙基磷酸贮备液2ml置20ml容量瓶中，加0.1％v/v磷酸水溶液稀释至刻度，摇匀即可。

150％线性溶液：精密移取丙基磷酸贮备液3ml置20ml容量瓶中，加0.1％v/v磷酸水溶液稀释至刻度，摇匀即可。

200％线性溶液：精密移取丙基磷酸贮备液4ml置20ml容量瓶中，加0.1％v/v磷酸水溶液稀释至刻度，摇匀即可。

精密量取LOQ、20％、50％、100％、150％、200％线性溶液分别进样1针，记录色谱图。实验结果显示，相关系数r为1.000；Y轴截距绝对值与100％线性浓度水平响应值比值为2.0％；响应值RSD为5.2％。

5准确度

丙基磷酸贮备液：称取杂质丙基磷酸对照品99.92mg置20ml容量瓶中，加0.1％v/v磷酸水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀即可。

丙基磷酸对照品溶液：精密移取丙基磷酸杂质贮备液2ml置20ml容量瓶中，加0.1％v/v磷酸水溶液稀释至刻度，摇匀即可。

50％回收率溶液：精密称取1-丙基磷酸酐约2000mg，置20ml量瓶中，移取1ml丙基磷酸贮备液置同一20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。(平行制备3份)

100％回收率溶液：密称取1-丙基磷酸酐约2000mg，置20ml量瓶中，移取2ml丙基磷酸贮备液置同一20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。(平行制备3份)

150％回收率溶液：密称取1-丙基磷酸酐约2000mg，置20ml量瓶中，移取3ml丙基磷酸贮备液置同一20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。(平行制备3份)

精密量取各回收率溶液分别进样1针，记录色谱图。实验结果显示，9份加标供试品溶液中丙基磷酸的回收率在91.0％～95.8％之间，回收率RSD为1.7％。

6溶液稳定性

丙基磷酸贮备液：称取杂质丙基磷酸对照品99.92mg置20ml容量瓶中，加0.1％v/v磷酸水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀即可。

丙基磷酸对照品溶液：精密移取丙基磷酸杂质贮备液2ml置20ml容量瓶中，加0.1％v/v磷酸水溶液稀释至刻度，摇匀即可。

加标供试品溶液：称取1-丙基磷酸酐1998.73mg，置20ml量瓶中，再精密移取丙基磷酸贮备液2ml，置同一20ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。

精密量取对照品溶液、加标供试品溶液分别在不同时间点(0h、5h、9h、16h、24h)分别进样1针，记录色谱图。实验结果显示，对照品溶液在24h内各时间点进样的峰面积与0h峰面积比值在99.2％～99.8％之间；加标供试品溶液在24h内各时间点进样的峰面积与0h峰面积比值在100.2％～100.7％之间。

综合以上实验结果，本发明提供的检测方法系统适用性、专属性、灵敏度、线性、准确度、溶液稳定性良好，能够准确测定1-丙基磷酸酐中的丙基磷酸。

实施例3采用磷酸水溶液-乙腈体系等度洗脱的方式进行检测

1、色谱条件

采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(YMC-Pack ODS-AQ C18，4.6×250mm，5μm或效能相当的色谱柱)；

以0.1％v/v磷酸水溶液-乙腈(98:2，v/v)为流动相；

检测波长为190nm；

流速为每分钟1ml；

柱温为30℃；

进样体积10μl。

2、溶液配制

丙基磷酸溶液：精密称取丙基磷酸19.21mg到20ml容量瓶，加0.1％v/v磷酸水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。

色谱图见图5，从图中可见该方法采用含有更低比例有机相的流动相体系等度洗脱，实验结果表明溶剂峰与丙基磷酸峰之间的分离度为1.6，基本能够达到检测要求，但分离效果不如实施例1。

实施例4采用磷酸水溶液等度洗脱的方式进行检测

1、色谱条件

采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(YMC-Pack ODS-AQ C18，4.6×250mm，5μm或效能相当的色谱柱)；

以0.1％v/v磷酸水溶液为流动相，进行等度洗脱；

检测波长为190nm；

流速为每分钟1.0ml；

柱温为30℃；

进样体积10μl。

2、溶液配制

丙基磷酸溶液：精密称取丙基磷酸20.13mg到20ml容量瓶，加0.1％v/v磷酸水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。

色谱图见图6，从图中可见该方法进行纯水相等度洗脱，能实现丙基磷酸与相邻峰的有效分离，分离度为1.8。但实验发现，在上述条件下，后续组分如1-丙基磷酸酐等没有被完全洗脱，会干扰后面连续进样样品的检测，洗脱效果不如实施例1采用的梯度洗脱法。

对比例1固定相对1-丙基磷酸酐中丙基磷酸检测结果的影响

1、色谱条件

采用亲水作用色谱柱(CAgela Venusil HILIC，4.6×250mm，5μm)；

以0.1％v/v磷酸水溶液-乙腈(20:80，v/v)为流动相等度洗脱；

检测波长为190nm；

流速为每分钟1ml；

柱温为30℃；

进样体积10μl。

2、溶液配制

丙基磷酸溶液：精密称取丙基磷酸19.21mg到20ml容量瓶，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。

色谱图见图7，从图中可见该方法下溶剂干扰丙基磷酸出峰，两者之间分离度仅为0.8，无法有效检测，不适用。

对比例2流动相比例对1-丙基磷酸酐中丙基磷酸检测结果的影响

1、色谱条件

采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(YMC-Pack ODS-AQ C18，4.6×250mm，5μm或效能相当的色谱柱)；

以0.1％v/v磷酸水溶液-乙腈(95:5，v/v)为流动相等度洗脱；

检测波长为190nm；

流速为每分钟1ml；

柱温为30℃；

进样体积10μl。

2、溶液配制

丙基磷酸溶液：精密称取丙基磷酸19.21mg到20ml容量瓶，加0.1％v/v磷酸水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。

色谱图见图8，从图中可见该方法下溶剂峰和丙基磷酸峰之间分离度为1.3。分离度有所改善，但如果要准确进行定量检测，尚需进一步提高分离度。

Claims (10)

1.一种1-丙基磷酸酐中丙基磷酸的检测方法，其特征在于：采用高效液相色谱法，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为磷酸水溶液或磷酸水溶液-乙腈体系。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述磷酸水溶液的浓度为0.05％～0.15％v/v，优选为0.08％～0.12％v/v，更优选为0.1％v/v。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：流动相采用磷酸水溶液或磷酸水溶液-乙腈体系进行等度洗脱，其中磷酸水溶液：乙腈的体积比为(98～100)：(2～0)；或者，流动相采用磷酸水溶液-乙腈体系进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～5min，0％乙腈；5.01～10min，30％乙腈；10.01～25min，0％乙腈。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述固定相为YMC-Pack ODS-AQ C18或其等效色谱柱；优选地，YMC-Pack ODS-AQ C18的长度为75～300mm，进一步优选为150～250mm，更优选为250mm；优选地，YMC-Pack ODS-AQ C18的内径为1～10mm，进一步优选为2.1～4.6mm，更优选为4.6mm；优选地，YMC-Pack ODS-AQ C18的填充剂粒径为3～10μm，更优选为5μm。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述高效液相色谱法设置柱温为20℃～30℃；优选25℃。

6.根据权利要求1所述的分离检测方法，其特征在于：所述流动相的流速为每分钟0.8～1.2ml；优选每分钟1ml。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述高效液相色谱法设置检测波长为190～200nm，优选190nm。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：供试品溶液中1-丙基磷酸酐：稀释剂的质量体积比在50mg：1ml以上，优选为50～400mg：1ml，更优选为100mg：1ml；和/或，对照品溶液中丙基磷酸：稀释剂的质量体积比为0.1～1mg：1ml，优选为0.5mg：1ml；和/或，进样体积为5～15μl，更优选10μl。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述稀释剂为所述磷酸水溶液。

10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述检测为定性检测和/或定量检测。

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