CN114280191B - 一种双半胱氨酸及其制剂中有关物质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种双半胱氨酸及其制剂中有关物质的检测方法，所述检测方法为以氯甲酸‑9‑芴基甲酯为衍生试剂使用柱前衍生‑液相色谱法检测，有关物质包括半胱氨酸和四氢噻唑‑4‑羧酸。本发明以氯甲酸‑9‑芴基甲酯为衍生试剂采用柱前氨基衍生‑液相色谱的方法检测双半胱氨酸中的有关物质半胱氨酸和四氢噻唑‑4‑羧酸，其检测方法简单，检测结果准确性、精密性和稳定性高。本发明所采用的方法具备很高的系统适用性和专属性，其检测限和定量限低。
Description
技术领域
本发明属于医药化学技术领域，具体涉及一种双半胱氨酸及其制剂中有关物质的检测方法。
背景技术
注射用双半胱氨酸及其原料药双半胱氨酸均为国家一类新药，主要用于测定有效肾血浆流量，因此对其药品的质量要求很高。2012年，国家药典委员会下发药品试行标准转正补充资料通知，建议对本品有关物质进行考察，包括稳定性试验，并列入质量标准中。原试行标准中没有“有关物质考察”项。“有关物质考察”项目前是绝大部分药品质量标准中的必要项。在双半胱氨酸中，其主要的有关物质为起始物半胱氨酸(Cys)和中间产物四氢噻唑-4-羧酸(TCA)，这两种有关物质在与高锝酸钠进行标记时也会进行络合反应，若含量过高，会使得制备的锝[99mTc]双半胱氨酸注射液标记率降低，放射化学纯度达不到90％的药典标准。由于这两种物质分子量都不大，且与双半胱氨酸性质相近，存在于双半胱氨酸时在高效液相色谱柱中没有良好保留，无法分离，所以无法用高效液相方法测定，现有技术中并没有对双半胱氨酸中这两种有关物质的检测方法。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于现有技术存在无法准确检测双半胱氨酸中有关物质含量的问题，从而提供一种双半胱氨酸及其制剂中有关物质的检测方法。
为此，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种双半胱氨酸及其制剂中有关物质的检测方法，其特征在于，所述检测方法为以氯甲酸-9-芴基甲酯为衍生试剂使用柱前衍生-液相色谱法检测。
具体地，所述有关物质包括半胱氨酸和四氢噻唑-4-羧酸。
进一步地，所述柱前衍生-液相色谱法包括如下步骤：
S1：预处理步骤：待测样品溶液进行柱前衍生处理得到待检测衍生化样品；
S2：液相色谱法检测步骤：取待检测衍生化样品采用液相色谱法检测，检测过程中，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，含三氟乙酸水溶液-乙腈为流动相，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→20min→30min→35min→40min，流动相中乙腈的体积百分数为40％→95％→95％→40％→40％。
进一步地，步骤S2中三氟乙酸水溶液的体积为0.1vol％；和/或，流速为0.8-1.2mL·min-1；柱温25-35℃，波长为263-267nm；和/或，所述待测样品溶液为含双半胱氨酸的溶液。
步骤S1包括，取待测样品溶液与缓冲液和氯甲酸-9-芴基甲酯溶液混合，进行衍生反应，加入终止液和稀释液进行终止反应，得到待检测衍生化样品。
优选地，所述缓冲液为硼酸盐缓冲液；和/或，稀释液为乙腈水溶液；和/或，所述终止液为乙酸溶液。
进一步优选地，所述缓冲液为0.1mol/L，pH 8.5的硼酸盐缓冲液；和/或，稀释液为50vol％乙腈水溶液；和/或，所述终止液为20vol％乙酸溶液，溶剂为所述稀释液；和/或，待测样品溶液、氯甲酸-9-芴基甲酯、缓冲液的用量比为1:2:1；和/或，待测样品溶液、终止液与稀释液的用量比为1:1:1。
进一步地，还包括取半胱氨酸标准溶液和四氢噻唑-4-羧酸标准溶液分别按照权利要求3-7中任一所述的检测方法中的预处理步骤制备衍生标准溶液的步骤，以及按照权利要求1-4中任一所述的检测方法中的液相色谱法检测衍生标准溶液的步骤。
优选地，所述半胱氨酸标准溶液为一系列浓度的半胱氨酸标准溶液，四氢噻唑-4-羧酸标准溶液为一系列浓度的四氢噻唑-4-羧酸标准溶液，优选地，半胱氨酸标准溶液的浓度在0.6-12.0μg/mL之间；四氢噻唑-4-羧酸标准溶液的浓度为在0.3-6.0μg/mL之间。
进一步优选地，所述标准溶液为一系列浓度的半胱氨酸和四氢噻唑-4-羧酸的标准溶液，浓度分别为0.6、0.9、1.2、1.8、2.4、3.6μg/mL的半胱氨酸标准溶液和浓度分别为0.3、0.45、0.6、0.9、1.2、1.8μg/mL的四氢噻唑-4-羧酸标准溶液。
进一步地，还包括以半胱氨酸的峰面积和标准溶液中半胱氨酸的浓度进行线性回归得到标准曲线并利用标准曲线计算待测样品溶液中半胱氨酸的浓度的步骤；和，以四氢噻唑-4-羧酸的峰面积和标准溶液四氢噻唑-4-羧酸的浓度进行线性回归得到标准曲线并利用标准曲线计算待测样品溶液中四氢噻唑-4-羧酸的浓度的步骤。
本发明针对的待测样品为双半胱氨酸或者双半胱氨酸的药物制剂，例如固体制剂，粉剂、颗粒剂等，也可以是液体制剂，例如注射剂等，待测样溶液为含双半胱氨酸的溶液，例如含双半胱氨酸的水溶液。如果待测样品为双半胱氨酸的固体制剂，可以先加水溶解并稀释得到双半胱氨酸的水溶液。
本发明技术方案，具有如下优点：
(1)本发明以氯甲酸-9-芴基甲酯为衍生试剂采用柱前氨基衍生-液相色谱的方法检测双半胱氨酸中的有关物质半胱氨酸和四氢噻唑-4-羧酸，其检测方法简单，检测结果准确性、精密性和稳定性高。本发明所采用的方法具备很高的系统适用性和专属性，其检测限和定量限低。
(2)本发明优化了液相色谱法中的流动相、梯度洗脱程序，使得衍生产物色谱峰保留适宜，峰形良好，分离度高，基线平稳，噪音干扰较小，检测结果更加准确。
(3)本发明优化了柱前氨基衍生方法使用的试剂、用量比以及反应条件，与使得半胱氨酸和四氢噻唑-4-羧酸与衍生试剂Fmoc-Cl充分反应，与上述优化的色谱条件相配合，使得检测结果更加准确，过量的衍生试剂、API衍生产物，及衍生试剂的水解产物等均不影响有关物质的检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1中待测样品衍生化后的液相色谱图；
图2是实施例1中1.2μg/mL浓度的半胱氨酸衍生化后的液相色谱图；
图3是实施例1中0.6μg/mL浓度的四氢噻唑-4-羧酸衍生化后的液相色谱图；
图4是试验例中半胱氨酸衍生化后色谱及TIC图；
图5是试验例中半胱氨酸衍生产物一级质谱图；
图6是试验例中半胱氨酸衍生产物质荷比566离子二级质谱图；
图7是试验例中四氢噻唑-4-羧酸衍生化后色谱及TIC图；
图8是试验例中四氢噻唑-4-羧酸衍生产物一级质谱图；
图9是试验例中四氢噻唑-4-羧酸衍生产物质荷比566离子二级质谱图；
图10是试验例中专属性实验中的空白溶液衍生化后的液相色谱；
图11是试验例中专属性实验中的空白辅料溶液衍生化后的液相色谱；
图12是试验例中对比实验HILIC方法双半胱氨酸色谱图；
图13是试验例中对比实验HILIC方法半胱氨酸色谱图；
图14是试验例中对比实验HILIC方法四氢噻唑-4-羧酸色谱图；
图15是试验例中对比实验羧基衍生化方法空白溶液色谱图；
图16是试验例中对比实验羧基衍生化方法半胱氨酸衍生化后的色谱图；
图17是试验例中对比实验羧基衍生化方法四氢噻唑-4-羧酸衍生化后的色谱图；
图18是试验例中对比实验羧基衍生化方法调整衍生化方法后的四氢噻唑-4-羧酸衍生化后的色谱图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。
下述实施例中涉及的室温温度范围为10-30℃。
下述实施例中涉及的溶剂均为分析纯。
以下具体实施例是对本发明的进一步说明，所举案例并不能列举出本发明的全部实施方式，仅以其中部分实施方式为例进行说明，具体实施例如下：
实施例1
本实施例提供一种双半胱氨酸中有关物质的检测方法，具体步骤如下：
(1)制备待测样品溶液：取江苏省原子医学研究所江原制药厂生产的注射用双半胱氨酸1瓶(含双半胱氨酸1.5mg)，加1mL水溶解混匀，取400μl，用水稀释至1mL，混匀，得到待测样品溶液；
(2)将待测样品溶液进行氨基衍生化：取待测样品溶液250μL，加入250μL硼酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH 8.5)，混匀后加入500μL FOMC-Cl乙腈溶液(1.25mg/mL)，立即涡旋反应120s；加入500μL 20vol％乙酸水溶液和500μL 50vol％乙腈水溶液，继续涡旋120s，以0.45μm有机膜过滤，得到待检测衍生化样品；
(3)将待检测衍生化样品上机进样，使用液相色谱进行检测，液相色谱条件如下表1所示：
表1液相色谱条件
其检测结果如图1所示。
(4)标准曲线的绘制：
1)制备衍生化标准溶液：
精密称定半胱氨酸10mg，置于50mL容量瓶中，加水溶解并水稀释至刻度，摇匀。精密移取该溶液，用水定量稀释成浓度分别为0.6、0.9、1.2、1.8、2.4、3.6和12.0μg/mL的系列标准溶液；对系列标准溶液采用步骤(2)的氨基衍生化方法，即得衍生化标准溶液。
精密称定四氢噻唑-4-羧酸5mg，置于50mL容量瓶中，加水溶解并水稀释至刻度，摇匀。精密移取该溶液，用水定量稀释成浓度分别为0.3、0.45、0.6、0.9、1.2、1.8和6.0μg/mL的系列标准溶液；对系列标准溶液采用步骤(2)的氨基衍生化方法，即得衍生化标准溶液。
2)使用液相色谱进行测量：
将衍生化标准溶液分别上机进样，使用液相色谱进行检测，液相色谱条件如步骤(3)，其中1.2μg/mL浓度的半胱氨酸的液相色谱如图2所示，0.6μg/mL浓度的四氢噻唑-4-羧酸的液相色谱如图3所示。
3)绘制标准曲线：
对半胱氨酸和四氢噻唑-4-羧酸标准溶液检测结果分别如表2和表3所示
表2半胱氨酸液相色谱测试结果及标准曲线
表3四氢噻唑-4-羧酸液相色谱测试结果及标准曲线
(5)计算样品中双半胱氨酸的有关物质：
将步骤(3)得到的图1中的峰面积代入步骤(4)得到的标准曲线，可得样品中半胱氨酸和四氢噻唑-4-羧酸的浓度分别为0.17％和0.12％。
试验例
1.衍生产物的质谱确认
使用液相质谱法(LC-MS)确认衍生产物，条件如下表4所示：
表4谱图条件
将半胱氨酸和四氢噻唑-4-羧酸，分别加水溶解，配制成10μg/ml水溶液，然后按照实施例2中的方法进行氨基衍生化，将得到的衍生化溶液进样考察。得到的图谱如图4-9所示，其衍生物信息整理如下：
表5衍生物质谱信息整理
根据图谱和上表可知，四氢噻唑-4-羧酸的衍生化反应较为明确，应为仲胺上的单衍生产物，其生成过程及结构如下：
对于半胱氨酸的衍生，理论上-NH2与-SH都能与FMOC-Cl发生反应，实际分子量与推测吻合，为双衍生产物，其生成过程及结构如下：
即上述实验确证了衍生产物，证实半胱氨酸与Fmoc-Cl按1:2发生双衍生反应，四氢噻唑-4-羧酸与Fmoc-Cl按1:1发生单衍生反应。
2.系统适用性实验
分别取浓度分别为1.2μg/mL半胱氨酸溶液和0.6μg/mL的四氢噻唑-4-羧酸溶液，代替待测样品溶液按照实施例1中的氨基衍生化方法进行衍生化，得到系统适用性溶液；
取系统适用性溶液，按照实施例1中的液相色谱条件连续进样6针，记录色谱图，考察主成分峰面积、保留时间、理论塔板数、拖尾因子，结果如表6和表7所示。
表6系统适用性测试结果-半胱氨酸
表7系统适用性测试结果-四氢噻唑-4-羧酸
3.专属性实验
首先分别配置空白溶液及空白辅料溶液：
空白溶液：以250μL水代替待测样品溶液按照实施例1中的氨基衍生化方法进行衍生化，即得空白溶液。
空白辅料溶液：精密称定甘露醇20mg、氢氧化钠40mg，置于10mL容量瓶中，加水溶解并水稀释至刻度，摇匀；取400μl，用水稀释至1mL，摇匀，得到溶液，然后以该溶液代替待测样品溶液按照实施例1中的氨基衍生化方法进行衍生化，即得空白辅料溶液。
然后按照实施例1中的液相色谱条件，分别进样空白溶液和空白辅料溶液，得到的色谱图如图10和图11所示。
将图10和图11与图1、2、3进行比较，可得空白及空白辅料溶液在半胱氨酸和四氢噻唑-4-羧酸衍生物出峰处无干扰，半胱氨酸衍生物分离度为1.97，,四氢噻唑-4-羧酸衍生物分离度为4.33，均大于1.5，满足专属性要求。
4.检测限和定量限实验
取半胱氨酸和四氢噻唑-4-羧酸溶液逐步稀释(这里需要寻找最低浓度，所以是按照配制好的杂质标准溶液最低浓度再进行稀释，看是否符合检测限和定量限的要求，来最终确定检测限和定量限。检测限：信噪比应不小于3；定量限：信噪比应不小于10，6份定量限溶液保留时间的相对标准偏差应不大于2.0％，峰面积的相对标准偏差应不大于5.0％。这里，0.6μg/mL半胱氨酸杂质标准溶液稀释到0.1μg/mL，得到表8值，稀释到0.301μg/mL，得到表9值；0.3μg/mL四氢噻唑-4-羧酸杂质标准溶液稀释到0.1μg/mL，得到表10值，稀释到0.301μg/mL，得到表11值)，按照实施例1中的氨基衍生化方法进行衍生化，然后按照实施例1中的液相色谱条件进样测定，以信噪比S/N≥3计，得到检测限；以信噪比S/N≥10计，得到定量限。
表8半胱氨酸检测限测试结果
表9半胱氨酸定量限测试结果
表10四氢噻唑-4-羧酸检测限测试结果
表11四氢噻唑-4-羧酸定量限测试结果
5.准确性实验
取一组江苏省原子医学研究所江原制药厂生产的注射用双半胱氨酸制备成1.5mg/mL的双半胱氨酸制剂溶液，然后取18份该溶液400μL，分别精密加入半胱氨酸溶液(12μg/mL)和四氢噻唑-4-羧酸溶液(6μg/mL)50μL、100μl、150μL，加水稀释至1mL，配制低、中、高3种浓度的加样溶液，每个浓度平行配制3份，按照实施例1中的氨基衍生化方法进行衍生化，得到准确性供试品溶液。
准确性供试品溶液按照实施例1中的液相色谱条件进样测定进样分析，记录色谱图，按外标法测定半胱氨酸和四氢噻唑-4-羧酸的含量，计算回收率。回收率计算公式如下：
其中C测得为待测物质测得的浓度，C原有为注射用双半胱氨酸中的待测物质的原有浓度，C加入为加入的待测物质的浓度，准确性测试结果如表12和13所示。
表12半胱氨酸准确性测试结果
表13四氢噻唑-4-羧酸准确性测试结果
6.精密性实验
取浓度为1.2μg/mL的半胱氨酸和0.6μg/mL四氢噻唑-4-羧酸溶液，按照实施例1中的氨基衍生化方法进行衍生化后，按照实施例1中的液相色谱条件连续进样6针，记录色谱图，考察保留时间和峰面积变化情况，结果如表14和15所示。
表14半胱氨酸进样精密性测试结果
表15四氢噻唑-4-羧酸进样精密性测试结果
7.重复性实验
取一组江苏省原子医学研究所江原制药厂生产的注射用双半胱氨酸制备成1.5mg/mL的双半胱氨酸制剂溶液，然后取6组该溶液400μl，均加入浓度为1.2μg/mL的半胱氨酸和0.6μg/mL四氢噻唑-4-羧酸溶液100μl，加水稀释至1mL，按照实施例1中的氨基衍生化方法进行衍生化后，制得6组平行重复性实验溶液，然后按照实施例1中的液相色谱条件上机进样，记录色谱图，考察保留时间和峰面积变化情况，测试结果如表16所示：
表16重复性测试结果
8.中间精密度实验
中间精密度考察随机变动因素对精密度的影响，由另一名分析员独立建立系统，按重复性实验方法重新配制6份加杂供试品溶液进行检测，在不同的日期使用不同的仪器进行，测试结果如表17所示。
表17中间精密度测试结果
9.稳定性实验
考察半胱氨酸和四氢噻唑-4-羧酸的衍生物在进样盘内、半胱氨酸及四氢噻唑-4-羧酸溶液在室温和4℃下放置随时间变化的规律，为检测时间提供依据，其中杂质对照溶液为半胱氨酸杂质标准溶液和四氢噻唑-4-羧酸杂质标准溶液，供试品溶液为注射用双半胱氨酸制剂配制的溶液。
表18衍生产物稳定性测试结果-杂质对照溶液
表19衍生产物稳定性测试结果-供试品溶液(这里的供试品溶液指注射用双半胱氨酸制剂配制的溶液)
表20杂质对照溶液稳定性测试结果-室温、4℃
表21供试品溶液稳定性测试结果-4℃
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10.耐用性实验
取一组江苏省原子医学研究所江原制药厂生产的注射用双半胱氨酸制备成1.5mg/mL的双半胱氨酸制剂溶液，然后按照实施例1中的氨基衍生化方法进行衍生化后，按照实施例1中的液相色谱条件上机进样，然后考察柱温变化±5℃、波长变化±2nm、流速相对值变化±20％时半胱氨酸及四氢噻唑-4-羧酸测定情况，每个条件下各测试两次，结果如下表22-24所示。
表22耐用性考察结果——波长变化±2nm
表23耐用性考察结果——柱温变化±5℃
表24耐用性考察结果—流速变化±0.2mL/min
11.对比实验
(1)RP-HPLC方法
首先制备样品溶液：
双半胱氨酸制剂样品溶液(约0.15mg/mL)：取注射用双半胱氨酸1瓶(含双半胱氨酸1.5mg)，加1mL水溶解，混匀。取该溶液0.5mL，加0.5mL水，用乙腈稀释至5mL。
半胱氨酸溶液(约0.1mg/mL)：称取半胱氨酸约2mg，加0.1mol/l氢氧化钠溶液1mL使溶解，加水稀释至2mL，取该溶液0.1mL，用乙腈稀释至2mL。
四氢噻唑-4-羧酸溶液(约0.1mg/mL)：称取四氢噻唑-4-羧酸约2mg，加0.1mol/l氢氧化钠溶液1mL使溶解，加水稀释至2mL，取该溶液0.1mL，用乙腈稀释至2mL。
然后按照如下表25的条件上机进样，结果如表26所示：
表25 RP-HPLC方法条件
表26 RP-HPLC体系下的色谱出峰情况
由上表可知由色谱出峰情况可见，常规的反相色谱体系对双半胱氨酸、半胱氨酸及四氢噻唑-4-羧酸均没有良好的保留，无法对主峰进行定位，不适合本品有关物质分析。
(2)HILIC体系方法
首先制备样品溶液：
双半胱氨酸制剂样品溶液(约0.15mg/mL)：取注射用双半胱氨酸1瓶(含双半胱氨酸1.5mg)，加1mL水溶解，混匀。取该溶液0.5mL，加0.5mL水，用乙腈稀释至5mL。
半胱氨酸溶液(约0.1mg/mL)：称取半胱氨酸约2mg，加0.1mol/l氢氧化钠溶液1mL使溶解，加水稀释至2mL，取该溶液0.1mL，用乙腈稀释至2mL。
四氢噻唑-4-羧酸溶液(约0.1mg/mL)：称取四氢噻唑-4-羧酸约2mg，加0.1mol/l氢氧化钠溶液1mL使溶解，加水稀释至2mL，取该溶液0.1mL，用乙腈稀释至2mL。
然后按照如下表27的条件上机进样：
表27 HILIC方法条件
首先采用梯度洗脱(B:95％-55％，15min)，对双半胱氨酸、半胱氨酸和四氢噻唑-4-羧酸的出峰情况作了考察，结果如图12-14所示：双半胱氨酸原料药除死体积峰外未找到主峰；半胱氨酸、四氢噻唑-4-羧酸分别在21.2min、17.0min处出一小峰，均呈末端吸收；210nm检测波长下基线波动大，梯度洗脱时基线呈现鼓包形态。因此HILIC体系下双半胱氨酸没有良好的保留，紫外检测未见主峰；四氢噻唑-4-羧酸、半胱氨酸虽有出峰，但响应差，无法进行有关物质的测定。
(3)示差检测(RID)
首先制备样品溶液：
双半胱氨酸制剂溶液(约1.5mg/mL)：取注射用双半胱氨酸1瓶(含双半胱氨酸1.5mg)，加1mL水溶解，混匀。
空白辅料溶液和双半胱氨酸制剂溶液的区别在于，具有注射用双半胱氨酸中除主药双半胱氨酸以外的其余辅料。
然后按照如下表28的条件上机进样，结果如表29所示：
表28示差检测条件
表29示差检测下的出峰情况
由上表可知示差检测条件下双半胱氨酸响应太低，不宜用于有关物质的检测。
(4)蒸发光散射检测(ELSD)
首先制备样品溶液：
双半胱氨酸制剂样品溶液：取注射用双半胱氨酸1瓶，用1mL超纯水溶解，取100μL，以稀释溶液稀释5倍。
半胱氨酸溶液：称取半胱氨酸约3mg，加入0.1mol/l氢氧化钠溶液1mL溶解，取100μL，以稀释溶液稀释5倍。
空白辅料溶液和双半胱氨酸制剂样品溶液的区别在于，具有注射用双半胱氨酸中除主药双半胱氨酸以外的其余辅料。
然后按照如下表30的条件上机进样，结果如表31所示：
表30蒸发光散射检测条件
表31蒸发光散射检测下的出峰情况
由上表可知半胱氨酸在ELSD上响应较差；主成分双半胱氨酸的出峰位置未能确定，不宜用于有关物质的检测。
(5)羧基衍生化
以1-(2-嘧啶基)哌嗪(PP)为衍生试剂，DIC/HOBt为缩合试剂，对其四氢噻唑-4-羧酸、半胱氨酸的-COOH端进行衍生，再经HPLC检测。
分别取PP、DIC、HOBt配制成DMF溶液，PP(10mg/mL)、DIC(25mg/mL)、HOBt(25mg/mL)；分别取双半胱氨酸粗品、四氢噻唑-4-羧酸、半胱氨酸配制成DMF溶液，浓度均为1mg/mL。
分别取1mL的双半胱氨酸粗品溶液、1mL的四氢噻唑-4-羧酸溶液、1mL的半胱氨酸溶液，各加PP溶液1mL、DIC溶液0.5mL、HOBt溶液0.5mL，40℃水浴1h；取100uL，乙腈/水(1:1)稀释至5mL，过滤，进样。
同时配制空白溶液进行对比(DMF 1mL，加入PP溶液1mL、DIC溶液0.5mL、HOBt溶液0.5mL，同法配制)。
然后按照如下表32的条件上机进样：
表32羧基衍生化色谱条件
按上述HPLC条件进样考察，结果如下：
如图15-图17所示，与空白样比对，均未找到衍生化后的色谱峰。考虑提高样品浓度、调整缩合体系并尝试不同溶剂再做考察。提高底物浓度和衍生化试剂浓度，在溶液中直接加入缩合试剂HOBt/DIC，如图18所示，双半胱氨酸在该体系下能够发生衍生化反应，衍生化产物在6.6min出峰，但衍生化效率并不高(3h峰面积仅转化7％)，因此羧基端衍生化虽能发生，但衍生效率低，响应差，无法进行定量分析；且由于DIC/HOBt体系为非特异性的反应体系，样品中的羧基、氨基甚至巯基均能参与反应，会导致反应后产物复杂，不宜用于有关物质的检测。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (8)
1.一种双半胱氨酸及其制剂中有关物质的检测方法，其特征在于，所述检测方法为以氯甲酸-9-芴基甲酯为衍生试剂使用柱前衍生-液相色谱法检测，所述有关物质包括半胱氨酸和四氢噻唑-4-羧酸；
所述柱前衍生-液相色谱法包括如下步骤：
S1：预处理步骤：待测样品溶液进行柱前衍生处理得到待检测衍生化样品；
S2：液相色谱法检测步骤：取待检测衍生化样品采用液相色谱法检测，检测过程中，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，含三氟乙酸水溶液-乙腈为流动相，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→20min→30min→35min→40min，流动相中乙腈的体积百分数为40％→95％→95％→40％→40％；
步骤S2中三氟乙酸水溶液的体积浓度为0.1vol％，流速为0.8-1.2mL·min-1；柱温25-35℃，波长为263-267nm；所述待测样品溶液为含双半胱氨酸的溶液。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤S1包括，取待测样品溶液与缓冲液和氯甲酸-9-芴基甲酯溶液混合，进行衍生反应，加入终止液和稀释液进行终止反应，得到待检测衍生化样品。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述缓冲液为硼酸盐缓冲液；和/或，稀释液为乙腈水溶液；和/或，所述终止液为乙酸溶液。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述缓冲液为0.1mol/L，pH 8.5的硼酸盐缓冲液；和/或，稀释液为50vol％乙腈水溶液；和/或，所述终止液为20vol％乙酸溶液，溶剂为所述稀释液；和/或，待测样品溶液、氯甲酸-9-芴基甲酯、缓冲液的用量比为1:2:1；和/或，待测样品溶液、终止液与稀释液的用量比为1:1:1。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，还包括取半胱氨酸标准溶液和四氢噻唑-4-羧酸标准溶液分别按照预处理步骤制备衍生标准溶液的步骤，以及按照液相色谱法检测衍生标准溶液的步骤。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述半胱氨酸标准溶液为一系列浓度的半胱氨酸标准溶液，四氢噻唑-4-羧酸标准溶液为一系列浓度的四氢噻唑-4-羧酸标准溶液。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，半胱氨酸标准溶液的浓度在0.6-12.0μg/mL之间；四氢噻唑-4-羧酸标准溶液的浓度为在0.3-6.0μg/mL之间。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，还包括以半胱氨酸的峰面积和标准溶液中半胱氨酸的浓度进行线性回归得到标准曲线并利用标准曲线计算待测样品溶液中半胱氨酸的浓度的步骤；和，以四氢噻唑-4-羧酸的峰面积和标准溶液四氢噻唑-4-羧酸的浓度进行线性回归得到标准曲线并利用标准曲线计算待测样品溶液中四氢噻唑-4-羧酸的浓度的步骤。
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| 过甲酸氧化柱前衍生HPLC法测定复方氨基酸注射液(18AA-Ⅴ)中盐酸半胱氨酸含量;方方;纪宇;;海峡药学(第12期);全文 * |
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| CN114280191A (zh) | 2022-04-05 |
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