CN102621250A - 一种检测多种常见氨基酸的液相色谱方法 - Google Patents

Abstract

本发明属分析化学领域，涉及一种检测常见氨基酸的液相色谱方法以及其在中药板蓝根中的应用。本发明是将待测样品经过样品预处理后，加入反应溶剂及衍生化试剂进行衍生化反应，然后采用高效液相色谱法测定20种常见氨基酸的浓度。本发明的方法采用通用型的液相色谱柱和紫外检测器对氨基酸进行高效液相色谱测定，并能排除其他物质对氨基酸的干扰。本发明可用于动植物天然提取物、药品、保健食品、饲料以及血浆、尿液、脑脊液、生物组织等生物材料中氨基酸浓度的定量测定，且也可准确测定中药板蓝根中氨基酸的含量。

Description

一种检测多种常见氨基酸的液相色谱方法

技术领域

    本发明属于分析化学领域，涉及常见氨基酸的液相色谱检测方法，具体涉及一种检测多种常见氨基酸的液相色谱方法及用途。

背景技术

已知氨基酸(Amino acid)为含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称，其示生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。现有技术公开了氨基连在α-碳上的为α-氨基酸；天然氨基酸均为α-氨基酸。其中，常见的20种L-α-氨基酸包括：(1)精氨酸，(2)天冬酰胺，(3)谷氨酰胺，(4)丝氨酸，(5)天冬氨酸，(6)谷氨酸，(7)苏氨酸，(8)甘氨酸，(9)丙氨酸，(10)脯氨酸，(11)甲硫氨酸，(12)缬氨酸，(13)苯丙氨酸，(14)色氨酸，(15)异亮氨酸，(16)亮氨酸，(17)组氨酸，(18)半胱氨酸，(19)赖氨酸，(20)酪氨酸，它们的结构通式为：

其中，赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸是人体不能合成的，必需由食物蛋白供给，该些氨基酸称为必需氨基酸；所述的赖氨酸能促进大脑发育，是肝及胆的组成成分，能促进脂肪代谢，调节松果腺、乳腺、黄体及卵巢，防止细胞退化；所述的色氨酸能促进胃液及胰液的产生；所述的苯丙氨酸能参与消除肾及膀胱功能的损耗；所述的甲硫氨酸（又叫蛋氨酸）能参与组成血红蛋白、组织与血清，有促进脾脏、胰脏及淋巴的功能；所述的苏氨酸有转变某些氨基酸达到平衡的功能；所述的异亮氨酸和亮氨酸能参与胸腺、脾脏及脑下腺的调节以及代谢；所述的缬氨酸作用于黄体、乳腺及卵巢。研究证实，人体虽能够合成精氨酸和组氨酸，但合成的量通常不能满足正常的需要，因此，这两种氨基酸又被称为半必需氨基酸，其中精氨酸是一氧化氮、尿素、鸟氨酸及肌丁胺的直接前体，是合成肌肉素的重要原素，且被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酰胺的合成；所述的精氨酸可协助舒张血管，是鸟氨酸循环中的一个组成成分具有极其重要的生理功能，有助于将血液中的氨转变为尿素而排出，对抗高氨血症,肝脏机能障碍等；精氨酸也是精子蛋白的主要成分,有促进精子的质量,提高精子运动能量的作用。所述的组氨酸对于婴幼儿及动物的成长尤其重要，可用于治疗心脏病，贫血，风湿性关节炎等疾病。

已报道的氨基酸的测定方法有如下若干种，但分别仍存在有下述若干不足或缺陷：⑴分光光度法，操作繁琐且专属性差；⑵2, 4-二硝基氯苯衍生化液相色谱法以及2, 4-二硝基氟苯衍生化液相色谱法，其衍生条件复杂苛刻，产物不稳定；⑶丹磺酰氯衍生化液相色谱法，其衍生条件难以控制，对溶液环境pH值敏感，衍生产物不稳定，专属性差；⑷邻苯二甲醛(OPA)衍生化液相色谱法，只能检测伯胺基氨基酸，不能检测脯氨酸类仲胺基氨基酸，且产物极不稳定；⑸9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl) 衍生化液相色谱法，虽有文献报道，但其色谱图谱重现性差或者色谱条件极其复杂，实用性差，且缺乏对上述的20种氨基酸的系统性定量研究，该方法尚未推广应用；⑹邻苯二甲醛/9-氯甲酸芴甲酯(OPA /FMOC-Cl)衍生化液相色谱法，其色谱条件相当复杂，对液相设备性能要求较高，一般研究机构无法开展研究；⑺异硫氢酸苯酯(PITC)衍生化液相色谱法，专属性差，需要排除水的干扰，不适用于水溶性样品的检测。

发明内容

    本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种检测多种常见氨基酸的液相色谱方法。尤其涉及一种检测20种常见氨基酸的液相色谱方法，本发明的液相色谱方法能简便、准确的测定样品中20种氨基酸含量。

具体而言，本发明的检测多种常见氨基酸的液相色谱方法是快速测定氨基酸含量的柱前衍生的液相色谱方法，其特征在于，其包括步骤：将待测样品经过样品预处理后，加入反应溶剂及衍生化试剂进行衍生化反应，然后采用高效液相色谱法测定20种常见氨基酸衍生物的浓度，确定氨基酸的含量；

    本发明中，所述的样品预处理是，取适量待测中性水溶液样品，加入乙腈稀释/沉淀蛋白。

本发明中，所述的样品选自植物天然提取物、药品、保健食品或饲料；或血浆、尿液、脑脊液、生物组织等生物材料。

本发明中，通过下述步骤测定动植物天然提取物氨基酸衍生物的浓度：定量分取动植物天然提取物样品进行预处理(水溶液，已过微孔滤头)，加入定量的反应试剂混匀，再加入硼酸盐缓冲液及过量的衍生化试剂进行反应，涡旋混匀，放置一段时间后，用液相色谱法测定氨基酸衍生物的浓度；

所述的反应试剂为不含有活泼胺基的有机溶剂，选自乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃、甲苯、苯或乙醚；

所述的衍生化试剂为9-氯甲酸芴甲酯，其分子式为FMOC-Cl，结构式如通式(Ⅰ)，

                                                              ；

其按式(Ⅱ)与氨基酸进行衍生的反应，

式(Ⅱ)中，R和R’均表示烷基、芳基、烷基取代芳基或者含杂原子基团。

 

本发明中，采用紫外检测器测定动植物天然提取物样品中20种常见氨基酸衍生物的峰面积，用标准曲线校正方程换算成氨基酸的浓度；其中，液相色谱柱采用通用型，填料选自十八烷基键合相硅胶或辛烷基键合相硅胶；流动相由乙腈和 50 mM   pH值为4.15的乙酸钠缓冲液组成，梯度洗脱，检测波长为UV 263nm。

 

本发明中，通过下述步骤测定血浆、尿液、脑脊液、生物组织等生物材料中20种常见氨基酸浓度：

定量称取待测样品，加入定量的蛋白沉淀试剂，涡旋混匀，高速离心，取上清液，加入硼酸盐缓冲液及过量的衍生化试剂反应，涡旋混匀，放置一段时间后，用液相色谱法测定氨基酸衍生物的浓度；

所述的蛋白沉淀试剂选自乙腈或者甲醇；

所述的高效液相色谱法，是采用紫外检测器测定所述生物材料中20种常见氨基酸衍生物的峰面积，用标准曲线校正方程换算成氨基酸的浓度；其中，液相色谱柱采用通用型，填料选自十八烷基键合相硅胶或辛烷基键合相硅胶；流动相由乙腈和 50 mM乙酸钠缓冲液 (pH 4.15) 组成，梯度洗脱，检测波长为UV 263nm。

本发明中，所述的20种常见氨基酸的线性范围为0.17～98.40 μg/mL。

本发明中，所述的20种常见氨基酸的最低检测限(LOD)为0.05～0.13 μg/mL，其中，进样量为20 μL。

 

本发明的检测多种常见氨基酸的液相色谱方法简便、准确、可靠，能排除其他物质对所述20种常见氨基酸的干扰，采用通用型的液相色谱柱和紫外检测器即可对氨基酸进行高效液相色谱测定。

表1是高效液相色谱法FMOC-Cl柱前衍生的20种常见氨基酸的线性方程和检测限结果。

 

表1  

保留时间 (min)	氨基酸	线性方程	相关系数	浓度范围(μg/mL)	检测限(μg/mL)
						10.0	Arg	y = 176950x + 34.99	0.9995	0.31～62.40	0.078
10.4	Asn	y = 149813x - 4343.5	0.9989	0.34～68.80	0.086
						10.8	Gln	y = 76850x - 5029.4	0.9951	0.20～81.60	0.051
12.0	Ser	y = 357888x - 21999	0.9991	0.36～72.00	0.090
						12.4	Asp	y = 113563x + 6411	0.9997	0.40～80.00	0.100
13.0	Glu	y = 101569x + 2046.4	0.9999	0.38～76.80	0.096
						14.6	Thr	y = 105150x + 6411	0.9997	0.43～86.40	0.108
15.7	Gly	y = 318825x - 2126.1	0.9992	0.37～73.60	0.092
						18.8	Ala	y = 247938x - 9302.3	0.9998	0.38～75.20	0.094
21.6	Pro	y = 202156x - 1346.7	0.9997	0.34～68.80	0.086
						24.4	Met	y = 157131x - 4710.7	0.9999	0.45～89.60	0.112
27.8	Val	y = 320994x + 232533	0.9976	0.17～68.80	0.043
						29.5	Phe	y = 141300x - 9037.3	0.9996	0.49～98.40	0.123
30.0	Trp	y = 141113x - 7516.6	0.9994	0.37～73.60	0.092
						31.9	Ile	y = 177088x + 45650	0.9938	0.24～48.80	0.061
32.6	Leu	y = 192400x - 13501	0.9994	0.35～70.40	0.088
						41.2	His	y = 118356x - 1488.1	0.9994	0.53～105.60	0.132
42.5	Cys	y = 154075x + 165942	0.9939	0.19～78.40	0.049
						43.0	Lys	y = 379331x - 37123	0.9997	0.26～52.80	0.066
45.3	Tyr	y = 229119x + 11021	1.0000	0.34～67.20	0.084

y: 峰面积; x: 氨基酸衍生物浓度 (μg/mL)  。

 

本发明的一个实施例中，测定中药板蓝根中氨基酸含量。

现有技术对中药板蓝根中氨基酸的测定方法包括：分光光度法，2, 4-二硝基氟苯衍生化液相色谱法等，尚存在有不够简便、快速、准确、可靠的缺陷。经本发明方法测定，结果显示，所述的板蓝根药材中，脯氨酸含量最高为10.83～16.39 mg/g，其次是精氨酸为1.78～5.21 mg/g、缬氨酸为0.10～0.39 mg/g和蛋氨酸(甲硫氨酸)为 0.12～0.78 mg/g，结果表明，本方法能排除中药板蓝根中其他物质对有效成分氨基酸的干扰，能准确测定中药板蓝根中氨基酸含量，本发明方法简便、快速、准确、可靠。

附图说明

图1为典型的20种常见氨基酸的FMOC-Cl柱前衍生HPLC-UV对照色谱图，

图2为典型的11个产地板蓝根样品的FMOC-Cl柱前衍生HPLC-UV色谱图和拟合的对照图，

图1和图2中， Arg：精氨酸，Asn：天冬酰胺，Gln：谷氨酰胺，Ser：丝氨酸，Asp：天冬氨酸，Glu：谷氨酸，Thr：苏氨酸，Gly：甘氨酸，Ala：丙氨酸，Pro：脯氨酸，Met：甲硫氨酸，Val：缬氨酸，Phe：苯丙氨酸，Trp：色氨酸，Ile：异亮氨酸，Leu：亮氨酸，His：组氨酸，Cys：半胱氨酸，Lys：赖氨酸，Tyr：酪氨酸。

具体实施方式

实施例1：

色谱条件：日本HITACHI (L-2130泵，L-2400 紫外检测器)高效液相色谱仪；色谱柱：YMC C₁₈ 色谱柱 (5 μm, 250mm×4.6 mm)；柱温：30℃；流动相：乙腈 (A)-50mM 乙酸钠缓冲液(pH 4.15) (B), 梯度洗脱: 0-30 min A:B从(28:72, v/v)到(50:50, v/v), 30-37 min A:B从(50:50, v/v)到(58:42, v/v), 37-38 min A:B从(58:42, v/v)到(68:32, v/v), 38-44 min A:B从(68:32, v/v)到(76:24, v/v), 44-45 min A:B从(76:24, v/v)到(85:15, v/v), 45-54 min A:B (85:15, v/v). 流速: 1.0 mL/min, 检测波长: 263 nm, 进样量: 20 μL. 

样品制备：分别精密量取已过0.45 μm过滤头含氨基酸的动植物天然提取物、药品、保健食品或者饲料水提取液50 μL，加入100 μL乙腈涡旋1 min，混匀，接着加入0.04 M硼酸盐缓冲液(pH9.5) 50 μL，10mM 9-氯甲酸芴甲酯50 μL，涡旋1 min，混匀，放置15 min后，进样20 μL，用液相色谱法测定氨基酸衍生物的浓度。

线性试验：对20种常见氨基酸稀酸溶液(0.1 M盐酸)依次进行稀释，得到6个不同浓度的氨基酸标准品溶液。分别取氨基酸标准品溶液40 μL，加入0.5 M 氢氧化钠溶液10 μL，调节氨基酸溶液为中性溶液，以下按“样品制备”项处理。以衍生物峰面积对各个氨基酸衍生物浓度进行线性回归，其回归方程和氨基酸衍生物浓度范围如表1 (n=6)所示。

   

实施例2：

色谱条件：日本HITACHI (L-2130泵，L-2400 紫外检测器)高效液相色谱仪；色谱柱：YMC C₁₈ 色谱柱 (5 μm, 250mm×4.6 mm)；柱温：30℃；流动相：乙腈 (A)-50mM 乙酸钠缓冲液(pH 4.15) (B), 梯度洗脱: 0-30 min A:B从(28:72, v/v)到(50:50, v/v), 30-37 min A:B从(50:50, v/v)到(58:42, v/v), 37-38 min A:B从(58:42, v/v)到(68:32, v/v), 38-44 min A:B从(68:32, v/v)到(76:24, v/v), 44-45 min A:B从(76:24, v/v)到(85:15, v/v), 45-54 min A:B (85:15, v/v). 流速: 1.0 mL/min, 检测波长: 263 nm, 进样量: 20 μL。

样品制备：分别精密量取含氨基酸的血浆、尿液、脑脊液、生物组织等生物材料50 μL，加入100 μL乙腈涡旋1 min，10000 rmp高速离心10 min，取上清液100 μL，接着加入0.04M硼酸盐缓冲液(pH 9.5) 50 μL，10 mM 9-氯甲酸芴甲酯50 μL，涡旋1 min，混匀，放置15 min后，进样20 μL，用液相色谱法测定氨基酸衍生物的浓度。

线性试验：对20种常见氨基酸稀酸溶液(0.1 M盐酸)依次进行稀释，按5:1 (v/v)加入0.5 M 氢氧化钠溶液，调节氨基酸溶液为中性溶液，得到6个不同浓度的氨基酸标准品溶液。分别取中性氨基酸标准品溶液10 μL，加入空白血浆40 μL，以下按“样品制备”项处理。以衍生物峰面积对各个氨基酸衍生物浓度进行线性回归 (n=6)。

Claims (9)

1.一种检测多种常见氨基酸的液相色谱方法，其特征在于，其包括步骤：将待测样品经过样品预处理后，加入反应溶剂及衍生化试剂进行衍生化反应，然后采用高效液相色谱法测定20种常见氨基酸衍生物的浓度，确定氨基酸的含量。

2.按权利要求1所述的检测多种常见氨基酸的液相色谱方法，其特征在于，所述的反应试剂为不含有活泼胺基的有机溶剂，选自乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃、甲苯、苯或乙醚。

3.按权利要求1所述的检测多种常见氨基酸的液相色谱方法，其特征在于，所述的样品预处理是，取适量待测中性水溶液样品，加入乙腈稀释或沉淀蛋白。

4.按权利要求1所述的检测多种常见氨基酸的液相色谱方法，其特征在于，所述的样品选自植物天然提取物、药品、保健食品或饲料；或血浆、尿液、脑脊液、生物组织材料。

5.按权利要求1所述的检测多种常见氨基酸的液相色谱方法，其特征在于，按下述步骤测定动植物天然提取物、药品、保健食品或饲料中20种常见氨基酸浓度：

定量分取动植物天然提取物样品，加入定量的反应试剂混匀，再加入硼酸盐缓冲液及过量的衍生化试剂进行反应，涡旋混匀，放置一段时间后，用液相色谱法测定氨基酸衍生物的浓度；

所述的衍生化试剂为9-氯甲酸芴甲酯，其分子式为FMOC-Cl，结构式如通式(Ⅰ)，

                                                              ；

其按式(Ⅱ)与氨基酸进行衍生反应，

式(Ⅱ)中，R和R’均表示烷基、芳基、烷基取代芳基或者含杂原子基团；

所述的反应试剂为不含有活泼胺基的有机溶剂，选自乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃、甲苯、苯或乙醚；

所述的高效液相色谱法，是采用紫外检测器测定20种常见氨基酸衍生物的峰面积，用标准曲线校正方程换算成氨基酸的浓度；其中，液相色谱柱采用通用型，填料选自十八烷基键合相硅胶或辛烷基键合相硅胶；流动相由乙腈和 50 mM   pH值为4.15的乙酸钠缓冲液组成，梯度洗脱，检测波长为UV 263nm。

6.按权利要求1所述的检测多种常见氨基酸的液相色谱方法，其特征在于，按下述步骤测定血浆、尿液、脑脊液、生物组织材料中20种常见氨基酸浓度， 

定量称取待测样品，加入定量的蛋白沉淀试剂，涡旋混匀，高速离心，取上清液，加入硼酸盐缓冲液及过量的衍生化试剂反应，涡旋混匀，放置一段时间后，用液相色谱法测定氨基酸衍生物的浓度；

所述的蛋白沉淀试剂选自乙腈或者甲醇；

所述的高效液相色谱法，是采用紫外检测器测定20种常见氨基酸衍生物的峰面积，用标准曲线校正方程换算成氨基酸的浓度；其中，液相色谱柱采用通用型，填料选自十八烷基键合相硅胶或辛烷基键合相硅胶；流动相由乙腈和 50 mM  pH值为4.15的乙酸钠缓冲液组成，梯度洗脱，检测波长为UV 263nm。

7.按权利要求5或6的方法，其特征在于，所述的20种常见氨基酸的线性范围为0.17～98.40 μg/mL。

8.按权利要求5或6的方法，其特征在于，所述的20种常见氨基酸的最低检测限为0.05～0.13 μg/mL，其中，进样量为20 μL。

9.权利要求1的检测多种常见氨基酸的液相色谱方法在测定中药板蓝根中氨基酸浓度中的用途。

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