CN101893611A - 一种利用反相高效液相色谱分析游离氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用反相高效液相色谱仪对样品中游离氨基酸进行定性、定量分析的方法，该方法包括步骤：首先对样品进行预处理，然后对样品中的半胱氨酸的-SH进行保护，然后利用衍生试剂OPA(邻苯二甲醛)和FMOC(氯甲酸芴甲酯)分别对一级、二级氨基酸进行柱前衍生化处理，然后进行反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析。本方法可对样品液中25种游离氨基酸同步检出，特别是对半胱氨酸先采用DTDPA 进行-SH保护后再与其他氨基酸一起进行同步衍生，检测的种类多，效率高。
Description
技术领域
本发明属于仪器分析技术领域，具体地涉及一种利用反相高效液相色谱仪对样品中游离氨基酸进行分析的方法。
背景技术
迄今为止，自然界中已发现180多种氨基酸，其中参与蛋白质合成的氨基酸只有20多种，称为基本氨基酸。由于氨基酸分析在蛋白质化学、生物化学、食品科学、临床医学等领域的研究中起着重要的作用，因此，对氨基酸分析方法的研究与改进得到人们高度重视。1958年，Spackman等首先提出了用阳离子交换色谱与柱后茚三酮衍生结合的方法分析蛋白质中的氨基酸，实现了氨基酸分析的自动化，该方法就是氨基酸分析仪，但传统的氨基酸分析仪结构复杂，价格昂贵，而且一般都不能作其他分析使用。
氨基酸含量检测主要应用氨基酸自动分析仪和高效液相色谱(HPLC)。随着HPLC的发展，使用HPLC技术分析氨基酸获得迅速发展，由于HPLC技术无需特殊反应装置，具有高效、简便、快速、准确和价格低廉等优点，已在许多实验室部分或全部代替了氨基酸自动分析仪，广泛应用于多种生物样品内氨基酸的检测。HPLC测定氨基酸的方法也很多，反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测氨基酸的柱前衍生试剂就有近10种。
吕艳等在《浙江农业科学》2006年第2期的“反相高效液相色谱定量分析多肽中的氨基酸组成”中公开了蛋白质中氨基酸的检测方法，邬安珍在《安徽大学学报(自然科学版)》1991年第3期的“OPA柱前衍生法用于反相高效液相色谱分析氨基酸”公开了细胞色素C酶解产物中氨基酸的检测，上述文献中公开的方法在定量和定性检测氨基酸的时候都具有缺陷，吕艳等的方法不能分析全部的氨基酸，对氨基酸分析的种类具有局限性，而邬安珍的方法同样是不能对所有的氨基酸进行分析，其方法也存在局限性。
本发明为克服现有方法的缺陷，提供了一种新的氨基酸分析方法。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种利用反相高效液相色谱仪对样品中游离氨基酸进行定性、定量分析的方法，该方法包括如下步骤：
首先对样品进行预处理，然后对样品中的半胱氨酸的-SH进行保护，然后利用衍生试剂OPA(邻苯二甲醛)和FMOC(氯甲酸芴甲酯)分别对一级、二级氨基酸进行柱前衍生化处理，然后进行反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析。
其中一级氨基酸是指天门冬氨酸，谷氨酸，天门冬酰胺，丝氨酸，谷氨酰胺，组氨酸，甘氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，瓜氨酸，精氨酸，丙氨酸，酪氨酸，胱氨酸，缬氨酸，蛋氨酸，正缬氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，异亮氨酸，亮氨酸或赖氨酸。二级氨基酸是指羟脯氨酸，肌氨酸或脯氨酸。
上述方法中，对样品进行预处理的步骤为：
对样品溶液进行离心，取上清液加入三氯乙酸，放于低温静置，再离心，取上清液过0.2-0.45um微孔滤膜，得样品处理液；
上述方法中，对半胱氨酸的-SH进行保护的步骤为：
将上述处理液与DTDPA反应，得保护液。更具体地的步骤是：将上述处理液1份加入1-5份的DTDPA溶液，混匀，置60-100℃水浴中加热反应0.5-2小时，得保护液。
上述方法中，柱前衍生化处理步骤为：
用1-5倍保护液的OPA、FMOC对保护液进行衍生，得柱前衍生处理液。
上述方法中，反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析指是指通过流动相梯度洗脱，进行双波长检测柱前衍生处理液，洗脱和检测的条件为：
色谱柱：C18或C8反相色谱柱
流动相A：体积比为92-98∶8-2的0.1mol/L醋酸钠-乙氰溶液
流动相B：体积比为3-6∶2-1的乙氰-水溶液
洗脱液流速：0.5-2ml/min
流动相的洗脱如表1：
| 时间(min) | 0 | 16.0 | 16.1 | 20 | 20.1 | 26.0 |
| A％ | 100 | 62-68 | 0-5 | 0-5 | 100 | 100 |
| B％ | 0 | 32-38 | 95-100 | 95-100 | 0 | 0 |
表1：流动相梯度洗脱表
检测波长：338nm(一级氨基酸)，262nm(二级氨基酸)。
具体地，上述反相高效液相色谱分析的条件是：
检测是利用二极管阵列检测器，OPA是指邻苯二甲醛，其浓度为2.5mg/ml，FMOC是指氯甲酸芴甲酯，其浓度为10mg/ml，DTDPA是指3，3′-2-硫代-2-丙酸，其浓度为0.1g/ml，pH为10.0。
一级氨基酸是指如下表3中的1-22号氨基酸，二级氨基酸是指23-25号氨基酸。
优选地，本发明提供了一种利用反相高效液相色谱仪对样品中游离氨基酸进行定性、定量分析的方法，该方法包括如下步骤：
(1)取样品溶液适量，以4000r/min离心10-30min，取上清液，加入适量三氯乙酸，放于0-10℃静置0.5-2h，再以离心处理，取上清液适量，过0.2um-0.45um微孔滤膜，得样品处理液。
(2)取上述步骤(1)得到的样品处理液1份，加入DTDPA溶液1-3份，混匀，置60-100℃水浴加热0.5-2小时，得保护液。
(3)吸取步骤(2)得到的保护液1份，吸取1-3份OPA，混合，再吸取1-3份FMOC，混合，再吸取50-100份水，混合，得柱前衍生处理液。
(4)梯度洗脱和检测：
洗脱液：流动相A：醋酸钠∶乙氰＝92-98∶8-2，调pH值至6-10；流动相B：乙氰∶水＝3-6∶2-1；
洗脱液流速：0.5-2ml/min
色谱柱：C18或C8反相色谱柱
洗脱时间和浓度如下表2：
| 时间(min) | 0 | 16.0 | 16.1 | 20 | 20.1 | 26.0 |
| A％ | 100 | 62-68 | 0-5 | 0-5 | 100 | 100 |
| B％ | 0 | 32-38 | 95-100 | 95-100 | 0 | 0 |
表2：流动相梯度洗脱表
检测：
采取双波长检测，检测波长为：
检测一级氨基酸的波长为338nm，
检测二级氨基酸的波长为262nm，
定性、定量分析：绘制标准曲线，定性定量分析样品液中的游离氨基酸。
上述方法中，OPA浓度为2.5mg/ml，FMOC浓度为10mg/ml，DTDPA浓度为0.1g/ml，pH为10.0。
有益效果：
本发明的方法使用的系统配置是标准的液相配置，除氨基酸分析外，还可用于其他分析工作，且具有检测灵敏度高、样品处理简单、分析时间短、分析结果稳定、重复性好等特点。
本方法可对样品液中25种游离氨基酸同步检出，特别是对半胱氨酸先采用DTDPA进行-SH保护后再与其他氨基酸一起进行同步衍生，检测的种类多，效率高。
附图简述
图1：25种氨基酸标准品分离色谱图
图1是采用实施例1的方法对25种氨基酸标准品分离色谱图，图1中的1-25个数字代表每种氨基酸的峰号，具体的峰号对应的氨基酸及其缩写如下表3：
| 波峰号 | 氨基酸名称 | 缩写 |
| 1 | 天门冬氨酸 | ASP |
| 2 | 谷氨酸 | GLU |
| 3 | 天门冬酰胺 | ASN |
| 4 | 丝氨酸 | SER |
| 5 | 谷氨酰胺 | GLN |
| 6 | 组氨酸 | HIS |
| 7 | 甘氨酸 | GLY |
| 8 | 苏氨酸 | THR |
| 9 | 半胱氨酸 | CYR |
| 10 | 瓜氨酸 | CIT |
| 11 | 精氨酸 | ARG |
| 12 | 丙氨酸 | ALA |
| 13 | 酪氨酸 | TYR |
| 14 | 胱氨酸 | CY2 |
| 15 | 缬氨酸 | VAL |
| 16 | 蛋氨酸 | MET |
| 17 | 正缬氨酸 | NVA |
| 18 | 色氨酸 | TRP |
| 19 | 苯丙氨酸 | PHE |
| 20 | 异亮氨酸 | ILE |
| 21 | 亮氨酸 | LEU |
| 22 | 赖氨酸 | LYS |
| 23 | 羟脯氨酸 | HYP |
| 24 | 肌氨酸 | SAR |
| 25 | 脯氨酸 | PRO |
表3：峰号、氨基酸和缩写对照表
具体实施方式
取样品溶液50ml，以4000r/min离心10min，取上清液25ml，加入25ml三氯乙酸(质量分数2％)，放于4℃静置2h，再以4000r/min离心10min，取上清液2ml，过0.2um微孔滤膜；取上述处理液0.5ml，加入浓度为0.1g/ml，pH为10.0的DTDPA溶液0.5ml，混匀，置80℃水浴加热1小时；配置流动相A：0.1mol/L醋酸钠∶乙氰＝93∶7，调PH值至6.5；流动相B：乙氰∶水＝4∶1；设置自动进样器进行柱前衍生：吸取样品0.5ul，吸取0.5ul的浓度为2.5mg/ml的OPA，混合，吸取0.5ul的浓度为10mg/ml的FMOC加入混合，再吸取水32ul加入混合，进样；按照如下表4进行梯度洗脱：
| 时间(min) | 0 | 16.0 | 16.1 | 20.0 | 20.1 | 26.0 |
| A％ | 100 | 66 | 0 | 0 | 100 | 100 |
| B％ | 0 | 34 | 100 | 100 | 0 | 0 |
条件为：
色谱柱：C18反相色谱柱
洗脱液流速：2ml/min
检测波长：338nm、262nm
利用本方法分析的氨基酸种类参见说明书附图1和附图1的简述。
本发明的方法已经通过具体的实施例进行了描述。本领域技术人员可以借鉴本发明的内容适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。
Claims (9)
1.一种利用反相高效液相色谱仪对样品中游离氨基酸进行定性、定量分析的方法，该方法包括如下步骤：
首先对样品进行预处理，然后对样品中的半胱氨酸的-SH进行保护，然后利用衍生试剂OPA(邻苯二甲醛)和FMOC(氯甲酸芴甲酯)分别对一级、二级氨基酸进行柱前衍生化处理，然后进行反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其中对样品进行预处理的步骤为：
对样品溶液进行离心，取上清液加入三氯乙酸，放于低温静置，再离心，取上清液过0.2-0.45um微孔滤膜，得样品处理液；
3.根据权利要求1所述的方法，其中对半胱氨酸的-SH进行保护的步骤为：
将上述处理液与DTDPA反应，得保护液。
4.根据根据权利要求1或3所述的方法，其中对半胱氨酸的-SH进行保护的步骤为：将处理液1份加入1-5份的DTDPA溶液，混匀，置60-100℃水浴中加热反应0.5-2小时，得保护液。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中DTDPA是指3，3′-2-硫代-2-丙酸，其浓度为0.1g/ml，pH为10.0。
6.根据权利要求1所述的方法，其中柱前衍生化处理步骤为：
用1-5倍保护液的OPA、FMOC对保护液进行衍生，得柱前衍生处理液。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其中OPA是指邻苯二甲醛，其浓度为2.5mg/ml，FMOC是指氯甲酸芴甲酯，其浓度为10mg/ml。
8.根据权利要求1所述的方法，其中反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析指是指通过流动相梯度洗脱，进行双波长检测柱前衍生处理液，洗脱和检测的条件为：
色谱柱：C18或C8反相色谱柱，
流动相A：体积比为92-98∶8-2的0.1mol/L醋酸钠-乙氰溶液，
流动相B：体积比为3-6∶2-1的乙氰-水溶液，
洗脱液流速：0.5-2ml/min，
检测波长：一级氨基酸检测波长为338nm，二级氨基酸检测波长为262nm。
9.根据权利要求8所述的方法，其中检测是利用二极管阵列检测器。
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