CN111505160A - 一种Fmoc-保护氨基酸纯度及相关物质分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种Fmoc‑保护氨基酸纯度及相关物质分析方法，包括以下步骤：S1、配制Fmoc‑Osu杂质对照溶液，使Fmoc‑Osu与Fmoc‑保护氨基酸之比为0.1‑1.0：100，得到Fmoc‑Osu杂质对照溶液；S2、配制相关杂质对照溶液，使单一相关杂质与Fmoc‑保护氨基酸之比为0.1‑1.0:100,得到多个对照品溶液等步骤，本发明通过对流动相、杂质对照溶液以及梯度洗脱条件进行综合设计和优化，本发明的分析方法在系统运行过程中，基线平稳，空白试验中基本无干扰峰存在，杂质分离效果突出，专属性好，试验数据证明，检出限可达到0.002％，灵敏度极高，检测结果可为产品研发、生产和提纯提供可靠有效的信息，为建立保护氨基酸质控标准打下了坚实基础，为终产品的质量控制起到了积极作用。

Description

一种Fmoc-保护氨基酸纯度及相关物质分析方法
技术领域
本发明涉及Fmoc-保护氨基酸纯度相关物质分析检测技术领域，特别涉及一种Fmoc- 保护氨基酸纯度及相关物质分析方法。
背景技术
随着生物技术的发展，多肽在生物医药的作用越来越大。保护氨基酸是固相合成多肽技术最基本的原料。氨基酸都有α-氨基和羧基，20种氨基酸中有些还含有侧链活泼基团，如：羟基、氨基、胍基和杂环等，氨基和侧链活泼基团在结肽反应中都需要保护起来，合成多肽后再脱去保护基团，否者会发生氨基酸的错接和许多副反应。
在采用N-9-芴甲氧基羰基琥珀酰亚胺(Fmoc-Osu)制备Fmoc-保护氨基酸时，会伴随Fmoc-β-Ala-OH和Fmoc-β-Ala-AA生成。用L-赖氨酸(L-Lys)举例，在制备N-芴甲氧羰基-N'-叔丁氧羰基-L-赖氨酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)时，会伴随产生Fmoc-β-Ala-OH、 Boc-Lys(Boc)-OH、Boc-Lys(Fmoc)-OH、Fmoc-β-Ala-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)- Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Fmoc)-OH，且产物中还会有未反应完全的Fmoc-Osu，又例如以甘氨酸为例，在制备芴甲氧羰基-甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)时，会伴随产生Fmoc-β-Ala-OH、 Fmoc-β-Ala-Gly-OH和Fmoc-Gly-Gly-OH，且产物中也会有未反应完全的Fmoc-Osu。
因此，若对制备的产品不加以纯化，保护氨基酸中的杂质会被引入到终产品中，导致终产品精制困难，难以达到质控标准，生产成本增加。故如果开发出能有效检出各潜在杂质的分析方法，对保护氨基酸的生产和提纯具有重要的指导意义，并建立严格的质控标准，对降低终产品提纯难度、提高产品质量有积极意义。
现有的技术方案或以甲醇作为流动相，或流动相中含有三乙胺、磷酸或者缓冲盐。甲醇在低波长下有紫外吸收，若以甲醇为流动相，会降低分析方法的灵敏度，而且系统压力高。流动相中含三乙胺，会对色谱柱造成不可逆损伤，使色谱柱使用寿命缩短；在梯度运行时，流动相中含磷酸会导致基线严重漂移；流动相中缓冲盐的存在会使系统基线不稳，空白试验中存在较多干扰峰，使方法的灵敏度降低，而且缓冲盐容易析出，会造成系统管路堵塞。另外，现有的技术方案检测存在液相纯度与滴定法测含量的结果相差甚远的情况，导致这种情况出现的原因之一可能就是该方法在检测过程中，对主峰与杂质分离不完全，主峰中包含杂质峰，以至于结果中纯度高，这样的有关物质分析方法是存在缺陷的，所得的结果也不准确，对生产、研发和提纯没有实质性的指导作用。
为了能开发出有效检出各潜在杂质的分析方法，技术人员多年来一直在进行研究实验，但始终没有明显进展，作为近年来具有一定技术突破的分析技术，技术人员开发了一种以乙腈、超纯水、三氟乙酸作为流动相的保护氨基酸检验方法，但是该检验方法在实际应用时，为了保证检测结果的准确性，流动相(三氟乙酸)的浓度要达到2％以上，流动相浓度过大，使流动相酸性过大，样品在该流动相中会发生部分分解，并产生其它杂质，其不仅会导致检测结果不准确，而且流动相腐蚀性强，对仪器伤害大，而如果低于这个浓度，杂质分离效果较差，检测准确性又会下降，因此，该检验方法的准确性和实用性不高。
发明内容
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种Fmoc-保护氨基酸纯度及相关物质分析方法，通过改变流动相成分以及严格控制流动相组分比例，配合杂质对照溶液的设计，设置合理的梯度洗脱条件，在控制杂质浓度的同时，避免因为流动相的酸性大而造成样品分解或仪器被腐蚀的问题出现，基线平稳，杂质分离效果突出，专属性好，检出限可达到0.002％，灵敏度极高，克服了现有技术的不足。
本发明采用的技术方案如下：一种Fmoc-保护氨基酸纯度及相关物质分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、配制Fmoc-Osu杂质对照溶液，精密称取Fmoc-Osu标准品，用稀释剂配置成杂质溶液，摇匀备用；再精密称取Fmoc-保护氨基酸标准品，用稀释剂溶解，加入配制好的杂质溶液，使Fmoc-Osu与Fmoc-保护氨基酸之比为0.1-1.0：100，得到Fmoc-Osu杂质对照溶液；
S2、配制相关杂质对照溶液，精密称取各类相关杂质标准品，分别置于不同容量瓶中，用稀释剂配置成杂质溶液，摇匀备用；再精密称取Fmoc-保护氨基酸标准品，用稀释剂溶解，然后分别加入单一相关杂质配制成的杂质溶液，使单一相关杂质与Fmoc-保护氨基酸之比为 0.1-1.0:100,得到多个对照品溶液；
S3、配制系统适应性溶液，精密称取Fmoc-保护氨基酸标准品，用稀释剂溶解，然后加入Fmoc-Osu杂质溶液和各类相关杂质溶液，比例为：Fmoc-Osu：N1：N2：···Nn：Fmoc-保护氨基酸＝(0.1-1.0)：(0.1-1.0)：(0.1-1.0)：···(0.1-1.0)：100，其中，N1，N2····Nn表示杂质种类，得到系统适应性溶液；
S4、配制测试溶液，精密称取供试品，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，配置成0.1-1.0mg/ml 的样品溶液，摇匀备用；
S5、利用液相色谱法进行检测，其检测条件是：
色谱柱：C18色谱柱；洗脱条件：采用梯度洗脱；
流动相：流动相A：三氟乙酸：水＝0.2-1:1000；流动相B：三氟乙酸：乙腈＝0.2-1：1000；流速：0.5-1.2ml/min；柱温：20-30℃；进样量：5-20ul；
S6、检测实验，采用两针空白溶液、一针系统适应性溶液、一针Fmoc-Osu杂质对照溶液、一针相关杂质N1对照溶液、一针相关杂质N2对照溶液、一针相关杂质Nn对照溶液、三针测试溶液的方式进入色谱系统，然后进行检测实验，再通过面积归一法对主峰纯度和相关物质进行计算，得到各组分的百分含量。
在上述分析方法中，乙腈作为流动相，洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，系统压力要比甲醇低很多，且截止波长比甲醇低20nm，增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性。将流动相中三氟乙酸比例严格控制在一定范围内，使其浓度低于2％以下，浓度仅为0.2-1.0％，进而避免了因为流动相的酸性大而造成样品分解或仪器被腐蚀的问题出现。同时，为了提高杂质分离效果，本发明采用梯度洗脱的方式进行检测，通过设置合理的梯度洗脱条件，提高产品与相关杂质的分离度，实现产品与相关杂质在液相检测中有效分离，避免了主峰与杂质分离不完全，主峰中包含杂质峰，以至于结果中纯度高的问题出现，解决了检测结果存在液相纯度与滴定法测含量的结果相差甚远的问题，另外，本发明配制杂质对照溶液时，将杂质浓度控制在一定范围内，由此避免了因杂质浓度过高或者过低使杂质定位不明确，导致杂质位置误判的问题。综合作用下，通过流动相参数的设置、杂质对照溶液的设置以及梯度洗脱条件的设计，本发明的分析方法在系统运行过程中，基线平稳，空白试验中基本无干扰峰存在，杂质分离效果突出，专属性好，试验数据证明，检出限可达到0.002％，灵敏度极高，检测结果可为产品研发、生产和提纯提供可靠有效的信息，为建立保护氨基酸质控标准打下坚实基础，为终产品的质量控制起到积极作用。
在本发明中，所述Fmoc-保护氨基酸为Fmoc系列保护氨基酸，并用Fmoc-Osu引入Fmoc保护基，Fmoc-保护氨基酸包括Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH(N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸)、Fmoc-Lys(Boc)-OH中的一种。
在本发明中，所述Fmoc-保护氨基酸为Fmoc-Gly-OH时，N1，N2····Nn分别为Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Gly-OH和Fmoc-Gly-Gly-OH；所述Fmoc-保护氨基酸为 Fmoc-Phe-OH时，N1，N2····Nn分别为Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Phe-OH和Fmoc- Phe-Phe-OH；所述Fmoc-保护氨基酸为Fmoc-Lys(Boc)-OH时，N1，N2····Nn分别为Fmoc- β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Fmoc)- OH、Boc-Lys(Boc)-OH和Boc-Lys(Fmoc)-OH。即是说，需要将Fmoc-保护氨基酸的每一个相关副产物设置一组杂质对照溶液，通过该设置方式可以准确定位杂质位置，使检测结果更加有效可靠。
进一步，为了得到更精确的检测结果，需要对每一种Fmoc-保护氨基酸设计合理并最优的梯度洗脱条件，以突出杂质分离效果，防止杂质对检测结果的干扰，例如，当Fmoc-保护氨基酸为Fmoc-Gly-OH时，液相色谱检测的梯度洗脱条件为：
Figure RE-GDA0002534629650000041
以上过程的具体解释为：在前30-40min内，流动相A从占流动相的体积分数的70％到逐渐减少10％，流动相B占流动相的体积分数的30％逐渐增加到90％；接下来的0-10min内，维持用90％流动相B进行洗脱；随后的0.08-0.2min内，逐渐增加流动相A至其占流动相的体积分数的70％，同时减少流动相B至其占流动相的体积分数的30％，最后，在含 70％(v/v)流动相A和30％(v/v)流动相B的条件下继续运行5-40min。
进一步，当Fmoc-保护氨基酸为Fmoc-Phe-OH时，液相色谱检测的梯度洗脱条件为：
Figure RE-GDA0002534629650000042
以上过程的具体解释为：在前30-40min内，流动相A从占流动相的体积分数的60％到逐渐减少0，流动相B占流动相的体积分数的40％逐渐增加到100％；接下来的0-10min内，维持用流动相B进行洗脱；随后的0.08-0.2min内，逐渐增加流动相A至其占流动相的体积分数的60％，同时减少流动相B至其占流动相的体积分数的40％，最后，在含60％ (v/v)流动相A和40％(v/v)流动相B的条件下继续运行5-40min。
进一步，当Fmoc-保护氨基酸为Fmoc-Lys(Boc)-OH时，液相色谱检测的梯度洗脱条件为：
Figure RE-GDA0002534629650000043
Figure RE-GDA0002534629650000051
以上过程的具体解释为：在前30-40分钟内，流动相A从占流动相的体积分数60％到逐渐减少0，流动相B占流动相的体积分数40％逐渐增加到100％；接下来的0-10min 内，维持用流动相B进行洗脱；随后的0.08-0.2min内，逐渐增加流动相A至其占流动相的体积分数60，同时减少流动相B至其占流动相的体积分数40％，最后，在含55％(v/v)流动相A和45％(v/v)流动相B的条件下继续运行5-40min。
由于上述梯度洗脱条件的设置，实现了保护氨基酸与相关杂质在液相分析中有效分离，得到了更精确的检测结果，例如实现了Fmoc-Gly-OH与相关杂质(Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Gly-OH和Fmoc-Gly-Gly-OH)的有效分离，分离效果突出，检测结果的准确性得到明显提高，为Fmoc-Gly-OH质控标准和质量控制起到了积极作用。
在发明中，为了更好地准确定位Fmoc-Osu杂质位置，配制Fmoc-Osu杂质对照溶液时，精密称取Fmoc-Osu标准品，用稀释剂配置成0.5-2.0％的杂质溶液。
在发明中，为了更好地准确定位相关杂质位置，配制相关杂质对照溶液时，精密称取各类相关杂质标准品，分别置于不同容量瓶中，用稀释剂配置成浓度为0.5-2.0％的杂质溶液。
进一步，本发明所述的稀释剂优选为乙腈，当然，其也可以是其他稀释溶剂，只要不影响杂质对照溶液配制即可。
在本发明中，所述色谱柱优选为C18 5μm 4.6×150mm或者为C18 5μm 4.6×250mm，当然，其也可以更换其他型号的C18色谱柱，其他条件不变，亦能实现同样的发明目的。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明采用的流动相是由超纯水、乙腈和三氟乙酸配制而成，乙腈作为流动相，洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，系统压力要比甲醇低很多，且截止波长比甲醇低20nm，增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性，同时，将流动相中三氟乙酸比例严格控制在一定范围内，使其浓度低于2％以下，浓度仅为0.2-1.0％，进而避免了因为流动相的酸性大而造成样品分解或仪器被腐蚀的问题出现；
2、本发明采用梯度洗脱的方式进行检测，通过设置合理的梯度洗脱条件，提高了产品与相关杂质的分离度，实现了产品与相关杂质在液相检测中有效分离，避免了主峰与杂质分离不完全，主峰中包含杂质峰，以至于结果中纯度高的问题出现，解决了检测结果存在液相纯度与滴定法测含量的结果相差甚远的问题；
3、本发明配制杂质对照溶液时，每一个相关副产物设置一组杂质对照溶液，并将相关杂质浓度控制在一定范围内，由此避免了因杂质浓度过高或者过低使杂质定位不明确，导致杂质位置误判的问题，可以准确定位杂质位置，使检测结果更加有效可靠；
4、本发明通过对流动相、杂质对照溶液以及梯度洗脱条件进行综合设计和优化，本发明的分析方法在系统运行过程中，基线平稳，空白试验中基本无干扰峰存在，杂质分离效果突出，专属性好，试验数据证明，检出限可达到0.002％，灵敏度极高，检测结果可为产品研发、生产和提纯提供可靠有效的信息，为建立保护氨基酸质控标准打下了坚实基础，为终产品的质量控制起到了积极作用。
附图说明
图1是实施例1的系统适用性溶液色谱图；
图2是实施例1的测试溶液色谱图；
图3是实施例2的系统适用性溶液色谱图；
图4是实施例2的测试溶液色谱图；
图5是实施例3的系统适用性溶液色谱图；
图6是实施例3的测试溶液色谱图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明作详细的说明。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种Fmoc-Gly-OH纯度及相关物质分析方法，包括以下步骤：
S1、设置色谱条件
仪器：高效液相色谱仪
色谱柱：C18 5μm 4.6×250mm
检测器：UV，220-260nm
流速：0.5-1.0ml/min
柱温：20-30℃
进样量：5-15ul
梯度洗脱条件：
Figure RE-GDA0002534629650000071
S2、准备流动相
流动相A：三氟乙酸：水＝0.2-1：1000；流动相B：三氟乙酸：乙腈＝0.2-1：1000；
S3、准备Fmoc-Osu杂质对照溶液
精密称取相关杂质Fmoc-Osu标准品，置于容量瓶中，用乙腈配制成0.5-2.0％的杂质溶液，摇匀备用，在精密称取Fmoc-Gly-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈溶解，再加入杂质溶液，使Fmoc-Osu与Fmoc-Gly-OH之比为0.1-1.0：100；
S4、准备Fmoc-β-Ala-OH杂质对照溶液
精密称取相关杂质Fmoc-β-Ala-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈配制成0.5-2.0％的杂质溶液，摇匀备用，在精密称取Fmoc-Gly-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈溶解，再加入杂质溶液，使Fmoc-β-Ala-OH与Fmoc-Gly-OH之比为0.1-1.0：100；
S5、准备Fmoc-β-Ala-Gly-OH杂质对照溶液
精密称取相关杂质Fmoc-β-Ala-Gly-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈配制成0.5-2.0％的杂质溶液，摇匀备用，在精密称取Fmoc-Gly-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈溶解，再加入杂质溶液，使Fmoc-β-Ala-Gly-OH与Fmoc-Gly-OH之比为0.1-1.0：100；
S6、准备Fmoc-Gly-Gly-OH杂质对照溶液
精密称取相关杂质Fmoc-Gly-Gly-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈配制成0.5-2.0％的杂质溶液，摇匀备用，在精密称取Fmoc-Gly-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈溶解，再加入杂质溶液，使Fmoc-Gly-Gly-OH与Fmoc-Gly-OH之比为0.1-1.0：100；
S7、准备系统适应性溶液
精密称取Fmoc-Gly-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈溶解，再加Fmoc-Osu杂质溶液，Fmoc-β-Ala-OH杂质溶液、Fmoc-β-Ala-Gly-OH杂质溶液、Fmoc-Gly-Gly-OH杂质溶液，使之比例为：Fmoc-Osu：Fmoc-β-Ala-OH：Fmoc-β-Ala-Gly-OH：Fmoc-Gly-Gly-OH： Fmoc-Gly-OH＝0.1-1.0：0.1-1.0：0.1-1.0：0.1-1.0：100，最后用乙腈稀释至刻度线，摇匀备用，作为系统适应性溶液；
S8、准备测试溶液
精密称取Fmoc-Gly-OH供试品1容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度线，配制成0.1-1mg/ml的样品溶液，摇匀备用；
S9、序列顺序
二针空白、一针系统适应性溶液、一针Fmoc-Osu杂质对照溶液、一针Fmoc-β-Ala-OH杂质对照溶液、一针Fmoc-β-Ala-Gly-OH杂质对照溶液、一针Fmoc-Gly-Gly-OH溶液，三针测试溶液，得到液相色谱图；
S10、计算
通过面积归一法对主峰纯度和相关物质进行计算，得到各组分的百分含量，公式为：
Figure RE-GDA0002534629650000081
计算报告如表1所示：
表1色谱图1的面积百分比计算报告
Figure RE-GDA0002534629650000082
在图1的色谱图中，按照保留时间递增的顺序，分别表示的化合物如表2所示：
表2色谱图中的化合物
保留时间min 化合物
7.214 乙酸乙酯
11.759 Fmoc-Gly-Gly-OH
12.039 Fmoc-β-Ala-Gly-OH
14.808 Fmoc-Gly-OH
15.153 Fmoc-β-Ala-OH
20.891 Fmoc-Osu
从图1的色谱图和表1可以得到，各化合物的分离度均大于1.0，说明本发明能将产品和各相关杂质有效分离。
图2是实施例1的测试溶液色谱图，计算报告如表3所示：
表3色谱图2的面积百分比计算报告
Figure RE-GDA0002534629650000091
在Fmoc-Gly-OH测试溶液色谱图中，可以看出本发明能检测出峰面积百分比为0.001％的杂质峰(例如序号2-4)，说明本发明的灵敏度高。通过方法验证，当化合物的浓度在0.002％时，其信噪比约等于3，故本发明的检出限浓度为0.002％。
实施例2
一种Fmoc-Phe-OH纯度及相关物质分析方法，包括以下步骤：
S1、设置色谱条件
仪器：高效液相色谱仪
色谱柱：C18 5μm 4.6×250mm
检测器：UV，220-260nm
流速：0.5-1.2ml/min
柱温：20-30℃
进样量：5-20ul
梯度洗脱条件：
Figure RE-GDA0002534629650000101
S2、准备流动相
流动相A：三氟乙酸：水＝0.2-1：1000；流动相B：三氟乙酸：乙腈＝0.2-1：1000；
S3、准备Fmoc-Osu杂质对照溶液
精密称取相关杂质Fmoc-Osu标准品，置于容量瓶中，用乙腈配制成0.5-2.0％的杂质溶液，摇匀备用，在精密称取Fmoc-Phe-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈溶解，再加入杂质溶液，使Fmoc-Osu与Fmoc-Phe-OH之比为0.1-1.0：100；
S4、准备Fmoc-β-Ala-OH杂质对照溶液
精密称取相关杂质Fmoc-β-Ala-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈配制成0.5-2.0％的杂质溶液，摇匀备用，再精密称取Fmoc-Phe-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈溶解，再加入杂质溶液，使Fmoc-β-Ala-OH与Fmoc-Phe-OH之比为0.1-1.0：100；
S5、准备Fmoc-β-Ala-Phe-OH杂质对照溶液
精密称取相关杂质Fmoc-β-Ala-Gly-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈配制成0.5-2.0％的杂质溶液，摇匀备用，再精密称取Fmoc-Phe-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈溶解，再加入杂质溶液，使Fmoc-β-Ala-Phe-OH与Fmoc-Phe-OH之比为0.1-1.0：100；
S6、准备Fmoc-Phe-Phe-OH杂质对照溶液
精密称取相关杂质Fmoc-Gly-Gly-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈配制成0.5-2.0％的杂质溶液，摇匀备用，再精密称取Fmoc-Phe-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈溶解，再加入杂质溶液，使Fmoc-Phe-Phe-OH与Fmoc-Phe-OH之比为0.1-1.0：100；
S7、准备系统适应性溶液
精密称取Fmoc-Phe-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈溶解，再加Fmoc-Osu杂质溶液，Fmoc-β-Ala-OH杂质溶液、Fmoc-β-Ala-Phe-OH杂质溶液、Fmoc-Phe-Phe-OH杂质溶液，使之比例为：Fmoc-Osu：Fmoc-β-Ala-OH：Fmoc-β-Ala-Phe-OH：Fmoc-Phe-Phe-OH： Fmoc-Phe-OH＝0.1-1.0：0.1-1.0：0.1-1.0：0.1-1.0：100，最后用乙腈稀释至刻度线，摇匀备用，作为系统适应性溶液；
S8、准备测试溶液
精密称取Fmoc-Phe-OH供试品2容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度线，配制成0.1-1mg/ml的样品溶液，摇匀备用；
S9、序列顺序
二针空白、一针系统适应性溶液、一针Fmoc-Osu杂质对照溶液、一针Fmoc-β-Ala-OH杂质对照溶液、一针Fmoc-β-Ala-Phe-OH杂质对照溶液、一针Fmoc-Phe-Phe-OH溶液，三针测试溶液，得到液相色谱图；
S10、计算
通过面积归一法对主峰纯度和相关物质进行计算，得到各组分的百分含量。
计算报告如表4所示：
表4色谱图3的面积百分比计算报告
Figure RE-GDA0002534629650000121
在图3的色谱图中，按照保留时间递增的顺序，分别表示的化合物如表5所示：
表5色谱图中的化合物
保留时间min 化合物
4.712 乙酸乙酯
9.043 Fmoc-β-Ala-OH
11.743 Fmoc-β-Ala-Phe-OH
14.165 Fmoc-Osu
14.977 Fmoc-Phe-OH
17.123 Fmoc-Phe-Phe-OH
从图3的色谱图和表5可以得到，各化合物的分离度均大于1.0，说明本发明能将产品和各相关杂质有效分离。
图4是实施例2的测试溶液色谱图，计算报告如表6所示：
表6色谱图4的面积百分比计算报告
Figure RE-GDA0002534629650000131
在图4的测试溶液色谱图中可以看出，本发明能检测出峰面积百分比为0.001％的杂质峰 (例如序号1)，说明本发明的灵敏度高。通过方法验证，当化合物的浓度在0.002％时，其信噪比约等于3，故本发明的检出限浓度为0.002％。
实施例3
一种Fmoc-Lys(Boc)-OH纯度及相关物质分析方法，包括以下步骤：
S1、设置色谱条件
仪器：高效液相色谱仪
色谱柱：C18 5μm 4.6×250mm
检测器：UV，220-260nm
流速：0.5-1.2ml/min
柱温：20-30℃
进样量：5-20ul
梯度洗脱条件：
Figure RE-GDA0002534629650000132
Figure RE-GDA0002534629650000141
S2、准备流动相
流动相A：三氟乙酸：水＝0.2-1：1000；流动相B：三氟乙酸：乙腈＝0.2-1：1000；
S3、准备Fmoc-Osu杂质对照溶液
精密称取相关杂质Fmoc-Osu标准品，置于容量瓶中，用乙腈配制成0.5-2.0％的杂质溶液，摇匀备用，在精密称取Fmoc-Lys(Boc)-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈溶解，再加入杂质溶液，使Fmoc-Osu与Fmoc-Lys(Boc)-OH之比为0.1-1.0：100；
S4、准备Fmoc-β-Ala-OH杂质对照溶液
精密称取相关杂质Fmoc-β-Ala-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈配制成0.5-2.0％的杂质溶液，摇匀备用，再精密称取Fmoc-Lys(Boc)-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈溶解，再加入杂质溶液，使Fmoc-β-Ala-OH与Fmoc-Lys(Boc)-OH之比为0.1-1.0：100；
S5、准备Boc-Lys(Boc)-OH杂质对照溶液
精密称取相关杂质Boc-Lys(Boc)-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈配制成0.5-2.0％的杂质溶液，摇匀备用，再精密称取Fmoc-Lys(Boc)-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈溶解，再加入杂质溶液，使Boc-Lys(Boc)-OH与Fmoc-Lys(Boc)-OH之比为0.1-1.0：100；
S6、准备Fmoc-β-Ala-Lys(Boc)-OH杂质对照溶液
精密称取相关杂质Fmoc-β-Ala-Lys(Boc)-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈配制成0.5- 2.0％的杂质溶液，摇匀备用，再精密称取Fmoc-Lys(Boc)-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈溶解，再加入杂质溶液，使Fmoc-β-Ala-Lys(Boc)-OH与Fmoc-Lys(Boc)-OH之比为0.1- 1.0：100；
S7、准备Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH杂质对照溶液
精密称取相关杂质Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈配制成0.5- 2.0％的杂质溶液，摇匀备用，再精密称取Fmoc-Lys(Boc)-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈溶解，再加入杂质溶液，使Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH与Fmoc-Lys(Boc)-OH之比为0.1- 1.0：100；
S8、准备Boc-Lys(Fmoc)-OH杂质对照溶液
精密称取相关杂质Boc-Lys(Fmoc)-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈配制成0.5-2.0％的杂质溶液，摇匀备用，再精密称取Fmoc-Lys(Boc)-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈溶解，再加入杂质溶液，使Boc-Lys(Fmoc)-OH与Fmoc-Lys(Boc)-OH之比为0.1-1.0：100；
S9、准备Fmoc-Lys(Fmoc)-OH杂质对照溶液
精密称取相关杂质Fmoc-Lys(Fmoc)-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈配制成0.5-2.0％的杂质溶液，摇匀备用，再精密称取Fmoc-Lys(Boc)-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈溶解，再加入杂质溶液，使Fmoc-Lys(Fmoc)-OH与Fmoc-Lys(Boc)-OH之比为0.1-1.0：100；
S10、准备系统适应性溶液
精密称取Fmoc-Lys(Boc)-OH标准品，置于容量瓶中，用乙腈溶解，再加Fmoc-Osu杂质溶液，Fmoc-β-Ala-OH杂质溶液、Boc-Lys(Boc)-OH杂质溶液、Fmoc-β-Ala-Lys(Boc)-OH杂质溶液、Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH杂质溶液、Boc-Lys(Fmoc)-OH杂质溶液、Fmoc- Lys(Fmoc)-OH杂质溶液，使之比例为：Fmoc-Osu：Fmoc-β-Ala-OH：Boc-Lys(Boc)-OH： Fmoc-β-Ala-Lys(Boc)-OH：Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH：Boc-Lys(Fmoc)-OH：Fmoc- Lys(Fmoc)-OH：Fmoc-Lys(Boc)-OH＝0.1-1.0：0.1-1.0：0.1-1.0：0.1-1.0：0.1-1.0：0.1-1.0： 0.1-1.0：100，最后用乙腈稀释至刻度线，摇匀备用，作为系统适应性溶液；
S11、准备测试溶液
精密称取Fmoc-Lys(Boc)-OH供试品3容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度线，配制成0.1- 1mg/ml的样品溶液，摇匀备用；
S12、序列顺序
二针空白、一针系统适应性溶液、一针Fmoc-Osu杂质对照溶液、一针Fmoc-β-Ala-OH杂质对照溶液、一针准备Boc-Lys(Boc)-OH杂质对照溶液、一针Fmoc-β-Ala-Lys(Boc)-OH杂质对照溶液，一针Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH杂质对照溶液，一针Boc-Lys(Fmoc)-OH杂质对照溶液，Fmoc-Lys(Fmoc)-OH杂质对照溶液，三针测试溶液，得到液相色谱图；
S13、计算
通过面积归一法对主峰纯度和相关物质进行计算，得到各组分的百分含量。
计算报告如表7所示：
表7色谱图5的面积百分比计算报告
Figure RE-GDA0002534629650000161
在图5的色谱图中，按照保留时间递增的顺序，分别表示的化合物如表8所示：
表8色谱图中的化合物
保留时间min 化合物
4.821 乙酸乙酯
8.861 Boc-Lys(Boc)-OH
9.382 Fmoc-β-Ala-OH
12.394 Fmoc-β-Ala-Lys(Boc)-OH
14.524 Fmoc-Osu
14.915 Boc-Lys(Fmoc)-OH
15.267 Fmoc-Lys(Boc)-OH
17.880 Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH
20.256 Fmoc-Lys(Fmoc)-OH
从图5的色谱图和表7可以得到，各化合物的分离度均大于1.0，说明本发明能将产品和各相关杂质有效分离。
图6是实施例3的测试溶液色谱图，计算报告如表9所示：
表9色谱图6的面积百分比计算报告
Figure RE-GDA0002534629650000171
在图6的测试溶液色谱图中可以看出，本发明能检测出峰面积百分比为0.001％的杂质峰 (例如序号6)，说明本发明的灵敏度高。通过方法验证，当化合物的浓度在0.002％时，其信噪比约等于3，故本发明的检出限浓度为0.002％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种Fmoc-保护氨基酸纯度及相关物质分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、配制Fmoc-Osu杂质对照溶液，精密称取Fmoc-Osu标准品，用稀释剂配置成杂质溶液，摇匀备用；再精密称取Fmoc-保护氨基酸标准品，用稀释剂溶解，加入配制好的杂质溶液，使Fmoc-Osu与Fmoc-保护氨基酸之比为0.1-1.0：100，得到Fmoc-Osu杂质对照溶液；
S2、配制相关杂质对照溶液，精密称取各类相关杂质标准品，分别置于不同容量瓶中，用稀释剂配置成杂质溶液，摇匀备用；再精密称取Fmoc-保护氨基酸标准品，用稀释剂溶解，然后分别加入单一相关杂质配制成的杂质溶液，使单一相关杂质与Fmoc-保护氨基酸之比为0.1-1.0:100,得到多个对照品溶液；
S3、配制系统适应性溶液，精密称取Fmoc-保护氨基酸标准品，用稀释剂溶解，然后加入Fmoc-Osu杂质溶液和各类相关杂质溶液，比例为：Fmoc-Osu：N1：N2：···Nn：Fmoc-保护氨基酸＝(0.1-1.0)：(0.1-1.0)：(0.1-1.0)：···(0.1-1.0)：100，其中，N1，N2····Nn表示杂质种类，得到系统适应性溶液；
S4、配制测试溶液，精密称取供试品，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，配置成0.1-1.0mg/ml的样品溶液，摇匀备用；
S5、利用液相色谱法进行检测，其检测条件是：
色谱柱：C18色谱柱；洗脱条件：采用梯度洗脱；
流动相：流动相A：三氟乙酸：水＝0.2-1:1000；流动相B：三氟乙酸：乙腈＝0.2-1：1000；
流速：0.5-1.2ml/min；柱温：20-30℃；进样量：5-20ul；
S6、检测实验，采用两针空白溶液、一针系统适应性溶液、一针Fmoc-Osu杂质对照溶液、一针相关杂质N1对照溶液、一针相关杂质N2对照溶液、一针相关杂质Nn对照溶液、三针测试溶液的方式进入色谱系统，然后进行检测实验，再通过面积归一法对主峰纯度和相关物质进行计算，得到各组分的百分含量。
2.如权利要求1所述的Fmoc-保护氨基酸纯度及相关物质分析方法，其特征在于，所述Fmoc-保护氨基酸为Fmoc系列保护氨基酸，并用Fmoc-Osu引入Fmoc保护基，Fmoc-保护氨基酸包括Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH中的一种。
3.如权利要求1所述的Fmoc-保护氨基酸纯度及相关物质分析方法，其特征在于，所述Fmoc-保护氨基酸为Fmoc-Gly-OH时，N1，N2····Nn分别为Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Gly-OH和Fmoc-Gly-Gly-OH；所述Fmoc-保护氨基酸为Fmoc-Phe-OH时，N1，N2····Nn分别为Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Phe-OH和Fmoc-Phe-Phe-OH；所述Fmoc-保护氨基酸为Fmoc-Lys(Boc)-OH时，N1，N2····Nn分别为Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Fmoc)-OH、Boc-Lys(Boc)-OH和Boc-Lys(Fmoc)-OH。
4.如权利要求3所述的Fmoc-保护氨基酸纯度及相关物质分析方法，其特征在于，当Fmoc-保护氨基酸为Fmoc-Gly-OH时，液相色谱检测的梯度洗脱条件为：
Figure FDA0002485771770000021
Figure FDA0002485771770000031
5.如权利要求3所述的Fmoc-保护氨基酸纯度及相关物质分析方法，其特征在于，当Fmoc-保护氨基酸为Fmoc-Phe-OH时，液相色谱检测的梯度洗脱条件为：
Figure FDA0002485771770000032
6.如权利要求3所述的Fmoc-保护氨基酸纯度及相关物质分析方法，其特征在于，当Fmoc-保护氨基酸为Fmoc-Lys(Boc)-OH时，液相色谱检测的梯度洗脱条件为：
Figure FDA0002485771770000033
7.如权利要求1-6之一所述的Fmoc-保护氨基酸纯度及相关物质分析方法，其特征在于，配制Fmoc-Osu杂质对照溶液时，精密称取Fmoc-Osu标准品，用稀释剂配置成0.5-2.0％的杂质溶液。
8.如权利要求7所述的Fmoc-保护氨基酸纯度及相关物质分析方法，其特征在于，配制相关杂质对照溶液时，精密称取各类相关杂质标准品，分别置于不同容量瓶中，用稀释剂配置成浓度为0.5-2.0％的杂质溶液。
9.如权利要求8所述的Fmoc-保护氨基酸纯度及相关物质分析方法，其特征在于，所述稀释剂为乙腈。
10.如权利要求9所述的Fmoc-保护氨基酸纯度及相关物质分析方法，其特征在于，所述色谱柱为C18 5μm 4.6×150mm或者为C18 5μm 4.6×250mm。
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