CN104345114A - 一种反相分离衍生化亮氨酸和异亮氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及反相分离含杂质氨基酸的方法，主要解决现有通过柱前衍生对十八种复合氨基酸进行定量测定的方法存在成本高和对设备要求高的技术问题。本发明包括以下步骤：（1）配制分析所需的流动相A和流动相B，流动相A为三氟乙酸水溶液，流动相B为三氟乙酸乙腈溶液，超声波混匀；（2）将配制好的流动相接入色谱系统，检查高效液相色谱的各个系统，确保仪器正常，设置色谱条件，然后按照梯度的起始浓度平衡色谱柱；（3）将N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸、N-(9-芴甲氧羰基)-L-异亮氨酸以及这2物质的混合物用乙腈溶解，过滤后获得单个样品液和混合液待用；（4）色谱系统平衡好后，分别吸取混合溶液和2个样品液进入色谱系统，采集色谱数据并对色谱图进行面积归一法积分。
Description
技术领域
本发明涉及反相分离含杂质氨基酸的方法，特别涉及一种利用C18固定相来分离主链氨基带9-芴甲氧羰基保护的L-亮氨酸（Fmoc-L-Leu-OH）和9-芴甲氧羰基保护的L-异亮氨酸（Fmoc-L-Ile-OH），利用高效液相色谱仪和反相色谱条件，以水/三氟乙酸和乙腈/三氟乙酸为流动相，采用梯度洗脱的方式分离上述2种保护氨基酸，并能准确给出结果。
背景技术
由于多肽药物的诸多优点，越来越多的制药企业投入人力和财力到多肽药物的研发中去，国内的相关产业发展也很迅速，目前国内已有多种上市的多肽药物或者即将上市的多肽药物，这些包括亮丙瑞林，胸腺α1，曲普瑞林，艾塞那肽等等，这些具体治疗效果的多肽几乎都是使用固相合成法来合成的，而固相合成法中使用最多的氨基酸原料是氨基端用9-芴甲氧羰基保护的氨基酸。目前上市的大部分药物多肽序列中都会使用到N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸或N-(9-芴甲氧羰基)-L-异亮氨酸这2种保护氨基酸，如果N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸含有N-(9-芴甲氧羰基)-L-异亮氨酸杂质或者N-(9-芴甲氧羰基)-L-异亮氨酸含有N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸杂质都会影响到多肽的使用效果，因此需要一种快速，简单，经济的测试方法。
目前报道的文献或者专利主要涉及基础氨基酸的分离，主要采用氨基酸经2,4-二硝基氟苯（DNFB）柱前衍生，然后使用醋酸钠为水相，甲醇为有机相，相应的文献为分析生物化学［Morton R. C.;Gerber G. E., Anal. Biochem., 170(1988) 220.］,还有一篇文献是中国化学学报[Shang,Zhen-Hua;Guo,Wei;Jiang,Hui;Zhou,Ling-Mo,Chinese Journal of Chemistry, 13(1995) 163]。这是一篇关于亮氨酸和异亮氨酸通过2，4-二硝基氟苯柱前衍生后使用醋酸缓冲盐-乙腈体系为流动相分离的文献。还有一篇中国专利CN 1053128A公开了十八种复合氨基酸注射液的高效液相色谱分析方法，也是通过柱前衍生对十八种复合氨基酸进行定量测定的，在氨基端用9-芴甲氧羰基衍生的亮氨酸和异亮氨酸的分离方面没有相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种反相分离衍生化亮氨酸和异亮氨酸的方法,主要解决现有通过柱前衍生对十八种复合氨基酸进行定量测定的方法存在成本高和对设备要求高的技术问题。本发明的思路是通过反相高效液相色谱法来分离N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸和N-(9-芴甲氧羰基)-L-异亮氨酸，采用水/三氟乙酸和乙腈/三氟乙酸为流动相，使用普通的C18反相柱，再结合适当的梯度，解决了2种衍生化氨基酸难分离的问题，使用该分析方法重现性好，准确度高，而且不需要添加额外的设备，流动相配制简单，适合一般HPLC实验室使用。
本发明的技术方案如下：
一种反相分离衍生化亮氨酸和异亮氨酸的方法，包括以下步骤：
（1）配制分析所需的流动相A和流动相B，流动相A为三氟乙酸水溶液，流动相B为三氟乙酸乙腈溶液，超声波混匀；
（2）将配制好的流动相接入色谱系统，检查高效液相色谱的各个系统，确保仪器正常，设置色谱条件，然后按照梯度的起始浓度平衡色谱柱；
（3）将N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸、N-(9-芴甲氧羰基)-L-异亮氨酸以及这2物质的混合物用乙腈溶解，过滤后获得单个样品液和混合液待用；
（4）色谱系统平衡好后，分别吸取混合溶液和N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸、N-(9-芴甲氧羰基)-L-异亮氨酸样品液进入色谱系统，采集色谱数据并对色谱图进行面积归一法积分。
流动相A：含体积百分含量0.08%～0.1%三氟乙酸的水溶液，流动相B：含体积百分含量0.08%～0.1%三氟乙酸乙腈溶液。优选流动相A：含体积百分含量0.1%三氟乙酸（后面的0.1%三氟乙酸均指三氟乙酸和溶剂的体积比）的水溶液，流动相B：含体积百分含量0.1%三氟乙酸乙腈溶液。
色谱条件如下：
色谱柱： C18色谱柱, 5μm，4.6×150mm(I.D)
流动相 A:水/0.08～0.1%三氟乙酸； B:乙腈/0.08～0.1%三氟乙酸
时间（min） A B
0．01 64% 36%
35.0 58% 42%
45.0 5% 95%
45.5 64% 36%
50.0 64% 36%
流速：1.0ml/min；波长：220nm～280nm，优选265nm；
进样量：10μl。
按照本发明，所述的反相分离N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸和N-(9-芴甲氧羰基)-L-异亮氨酸使用的色谱柱是以硅胶为基质的，在硅胶基质上化学键合C18烷链的色谱柱。步骤3所述乙腈为100%色谱级乙腈。
本发明所述的样品在4.6mm内径的分析柱上的样品浓度分别为:
9-芴甲氧羰基-L-异亮氨酸 0.5mg/ml；
9-芴甲氧羰基-L-亮氨酸 0.5mg/ml。
本发明的有益效果：本发明所述的分离方法，使用的流动相比较常见，配制简单，而且分离对于温度也没有特殊要求，分离过程中不需要柱温箱，不增加仪器成本，同时具体良好的重现性， N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸和N-(9-芴甲氧羰基)-L-异亮氨酸的分离问题解决后，能很好的控制固相多肽合成中的原料质量，有很好的经济价值。
附图说明
图1为普通线性梯度分离N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸和N-(9-芴甲氧羰基)-L-异亮氨酸混合物的色谱图。
图2为调整后的梯度分离N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸和N-(9-芴甲氧羰基)-L-异亮氨酸混合物的色谱图。
图3 为调整后的梯度分离N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸的色谱图。
图4为调整后的梯度分离N-(9-芴甲氧羰基)-L-异亮氨酸的色谱图。
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明本发明。
1.流动相配制：0.1%三氟乙酸水溶液
量筒量取400毫升的去离子水到溶剂瓶中，然后用移液管精密量取0.4毫升的分析纯三氟乙酸到400毫升去离子水中，溶剂瓶放入超声波震荡以备后用。
0.1%三氟乙酸乙腈溶液：
量筒量取400毫升的色谱级乙腈到溶剂瓶中，然后用移液管精密量取0.4毫升的分析纯三氟乙酸到400毫升乙腈中，溶剂瓶放入超声波震荡以备后用。
2．样品溶液的配制
单个试样的配制：
称取5mg的N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸和5mg的N-(9-芴甲氧羰基)-L-异亮氨酸，分别置于10ml的容量瓶中（即配制0.5mg/ml的浓度），然后用色谱纯乙腈溶解，超声震荡，待样品完全澄清，加乙腈至刻度线，最后用0.45 μm有机相滤头过滤，取滤液待用。
混合试样的配制:
称取5mg的N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸和5mg的N-(9-芴甲氧羰基)-L-异亮氨酸置于10ml的容量瓶中，然后用色谱纯乙腈溶解，超声震荡，待样品完全澄清，加乙腈至刻度线，最后用0.45 μm有机相滤头过滤，取滤液待用。
3.色谱条件
安捷伦1200四元梯度泵，Chemstation色谱工作站，紫外可变波长检测器，手动进样器，安捷伦脱气机，C18反相柱。
3.1普通线性梯度分离N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸和N-(9-芴甲氧羰基)-L-异亮氨酸的混合试样，2个样品没有分离的痕迹，色谱峰完全重叠在一起，不适合分离。
色谱柱： 安捷伦C18, 5μm，4.6×150mm(I.D)
流动相 A:水/0.1%三氟乙酸； B:乙腈/0.1%三氟乙酸
时间（min） A B
0．01 50% 50%
20.0 0% 100%
25.0 0% 100%
流速：1.0ml/min；波长：265nm；
进样量：10μl
分离图见图1。
3.2 调整后的梯度分离N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸和N-(9-芴甲氧羰基)-L-异亮氨酸的混合试样，2个样品能分离。
色谱柱： 安捷伦C18, 5μm，4.6×150mm(I.D)
流动相 A:水/0.1%三氟乙酸； B:乙腈/0.1%三氟乙酸
时间（min） A B
0．01 64% 36%
35.0 58% 42%
45.0 5% 95%
45.5 64% 36%
50.0 64% 36%
流速：1.0ml/min；波长：265nm；
进样量：10μl
分离图见图2。
3.3调整后的梯度分析N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸溶液，在N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸主峰前明显有一个N-(9-芴甲氧羰基)-L-异亮氨酸的峰。
色谱柱： 安捷伦C18, 5μm，4.6×150mm(I.D)
流动相 A:水/0.1%三氟乙酸； B:乙腈/0.1%三氟乙酸
时间（min） A B
0．01 64% 36%
35.0 58% 42%
45.0 5% 95%
45.5 64% 36%
50.0 64% 36%
流速：1.0ml/min；波长：265nm；
进样量：10μl
分离图见图3。
3.4调整后的梯度分析N-(9-芴甲氧羰基)-L-异亮氨酸溶液，在N-(9-芴甲氧羰基)-L-异亮氨酸主峰后明显有一个N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸的峰。
色谱柱： 安捷伦C18, 5μm，4.6×150mm(I.D)
流动相 A:水/0.1%三氟乙酸； B:乙腈/0.1%三氟乙酸
时间（min） A B
0．01 64% 36%
35.0 58% 42%
45.0 5% 95%
45.5 64% 36%
50.0 64% 36%
流速：1.0ml/min；波长：265nm；
进样量：10μl
分离图见图4。
Claims (6)
1.一种反相分离衍生化亮氨酸和异亮氨酸的方法，包括以下步骤：
（1）配制分析所需的流动相A和流动相B，流动相A为三氟乙酸水溶液，流动相B为三氟乙酸乙腈溶液，超声波混匀；
（2）将配制好的流动相接入色谱系统，检查高效液相色谱的各个系统，确保仪器正常，设置色谱条件，然后按照梯度的起始浓度平衡色谱柱；
（3）将N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸、N-(9-芴甲氧羰基)-L-异亮氨酸以及这2物质的混合物用乙腈溶解，过滤后获得单个样品液和混合液待用；
（4）色谱系统平衡好后，分别吸取混合溶液和N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸、N-(9-芴甲氧羰基)-L-异亮氨酸样品液进入色谱系统，采集色谱数据并对色谱图进行面积归一法积分。
2.根据权利要求1所述的一种反相分离衍生化亮氨酸和异亮氨酸的方法，其特征是：流动相A：含体积百分含量0.08%～0.1%三氟乙酸的水溶液，流动相B：含体积百分含量0.08%～0.1%三氟乙酸乙腈溶液。
3.根据权利要求2所述的一种反相分离衍生化亮氨酸和异亮氨酸的方法，其特征是：流动相A：含体积百分含量0.1%三氟乙酸的水溶液，流动相B：含体积百分含量0.1%三氟乙酸乙腈溶液。
4.根据权利要求1所述的一种反相分离衍生化亮氨酸和异亮氨酸的方法，其特征是：所述的色谱条件为：
色谱柱： C18色谱柱, 5μm，4.6×150mm(I.D)
流动相 A:水/0.08～0.1%三氟乙酸； B:乙腈/0.08～0.1%三氟乙酸
时间（min） A B
0．01 64% 36%
35.0 58% 42%
45.0 5% 95%
45.5 64% 36%
50.0 64% 36%
流速：1.0ml/min；波长：220nm～280nm，
进样量：10μl。
5.根据权利要求4所述的一种反相分离衍生化亮氨酸和异亮氨酸的方法，其特征是：所述的流动相：A:水/0.1%三氟乙酸； B:乙腈/0.1%三氟乙酸，所述的波长为265nm。
6.根据权利要求4所述的一种反相分离衍生化亮氨酸和异亮氨酸的方法，其特征是：所述色谱柱是以硅胶为基质的通过化学键合直链C18烷基的色谱柱。
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