CN113092648A - 一种氨基酸的分离提纯方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氨基酸的分离提纯方法，所述方法包括如下步骤：将水和0.1％TFA的离子对溶液按一定比例配置流动相A；将乙腈和0.1％TFA的离子对溶液按一定比例配置流动相B；注入氨基酸溶液，以流动相A和流动相B对色谱柱进行梯度洗脱，洗脱完成后记录色谱图，并采用面积归一化法计算氨基酸的纯度，该方法，检测速度与现有技术相比更加快，结果更准确，方法步骤简单，便于操作，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及氨基酸的提纯技术领域，具体涉及一种氨基酸的分离提纯方法。
背景技术：
L-亮氨酸(L-Leucine)是人体必须的八种氨基酸之一，属于二十种蛋白质氨基酸内的脂肪族类氨基酸，与L-异亮氨酸和L-缬氨酸共称三大支链氨基酸，化学式为C6H13NO2，与D-亮氨酸是对映异构体，室温下为白色有光泽六面体结晶或白色结晶性粉末。无臭，略有苦味。在烃类存在下，在无机酸水溶液中性能稳定。微溶于乙醇(0.07％)，溶于稀盐酸和碱性氢氧化物和碳酸盐溶液。不溶于乙醚。
亮氨酸与异亮氨酸是同系的同分异构体，结构上亮氨酸与异亮氨酸的碳主链相同，前者的γ位有个甲基，后者β位有个甲基。亮氨酸与异亮氨酸是结构差异很小的同分异构体氨基酸。因此Fmoc-Leu-OH的有关物质之一Fmoc-Ile-OH分离难度尤其大。
如中国专利ZL201310325212.2公开了一种反相分离衍生化亮氨酸和异亮氨酸的方法，在该专利中虽然样品能够分离，但Fmoc-Leu-OH与Fmoc-Ile-OH出峰时间均在40分钟左右，色谱分析时间长，且分离度小于1.5。
发明内容
本发明的目的在于提供一种氨基酸的分离提纯方法，以解决现有技术中氨基酸分离时出峰时间长，且分离度低的缺陷。
一种氨基酸的分离提纯方法，所述方法包括如下步骤：
将水和0.1％TFA的离子对溶液按一定比例配置流动相A；
将乙腈和0.1％TFA的离子对溶液按一定比例配置流动相B；
注入氨基酸溶液，以流动相A和流动相B对色谱柱进行梯度洗脱，洗脱条件为：
0min，流动相B的体积变化为40～100；
20min，流动相B的体积变化为40～100；
25min，流动相B的体积变化为80～100；
29min，流动相B的体积变化为80～100；
30min，流动相B的体积变化为40～100；
35min，流动相B的体积为40～100；
记录色谱图，并采用面积归一化法计算氨基酸的纯度。
进一步的，所述氨基酸溶液包括Fmoc-Leu-OH的混合溶液或Fmoc-Ile-OH的混合溶液中的一种或两种混合的溶液。
进一步的，所述0.1％TFA的离子对溶液的体积含量为0.05～1.2％、乙腈的体积含量为20～90％，水的体积含量为体积含量为10～80％。
进一步的，所述色谱柱包括C4色谱柱、C12色谱柱以及C18色谱柱中的一种。
进一步的，洗脱时的色谱柱的柱温为22～45℃。
进一步的，洗脱的进样浓度控制在0.4～1.0mg/min。
进一步的，洗脱时紫外线检测器的检测波长为210～280nm。
进一步的，洗脱时流动相流速为0.6～1.2ml/min。
本发明的优点在于：该种氨基酸的分离提纯方法，本方法结合合成工艺，能够将Fmoc-Leu-OH与Fmoc-Ile-OH从混合溶液中分离出来，并且成功分离了Fmoc-Leu-OH的4个有关物质，Fmoc-Leu-OH与Fmoc-Ile-OH的出峰时间分别为23min和24min，分离度能达到1.56，检测速度与现有技术相比更加快，结果更准确，方法步骤简单，便于操作，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明中Fmoc-Leu-OH的结构示意图。
图2为本发明中对比例1的色谱示意图。
图3为本发明图2中其他4个有关物质的分离数据示意图。
图4为本发明中对比例2的色谱示意图。
图5为本发明图4中其他4个有关物质的分离数据示意图。
图6为本发明中实施例1的色谱示意图。
图7为本发明图6中其他4个有关物质的分离数据示意图。
图8为本发明中实施例2的色谱示意图。
图9为本发明图8中其他4个有关物质的分离数据示意图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
一种氨基酸的分离提纯方法，所述方法包括如下步骤：
步骤一：将水和0.1％TFA的离子对溶液按一定比例配置流动相A；
步骤二：将乙腈和0.1％TFA的离子对溶液按一定比例配置流动相B；
其中，0.1％TFA的离子对溶液的体积含量为0.05～1.2％、乙腈的体积含量为20～90％，水的体积含量为体积含量为10～80％；
步骤三：注入氨基酸溶液，以流动相A和流动相B对色谱柱进行梯度洗脱，洗脱条件为：
0min，流动相B的体积变化为40～100；
20min，流动相B的体积变化为40～100；
25min，流动相B的体积变化为80～100；
29min，流动相B的体积变化为80～100；
30min，流动相B的体积变化为40～100；
35min，流动相B的体积为40～100；
其中，氨基酸溶液包括Fmoc-Leu-OH的混合溶液、Fmoc-Ile-OH的混合溶液中或两种混合的溶液，色谱柱包括C4色谱柱、C12色谱柱以及C18色谱柱；洗脱时的色谱柱的柱温为22～45℃，进样浓度控制在0.4～1.0mg/min，紫外线检测器的检测波长为210～280nm，流动相流速为0.6～1.2ml/min；
优选的柱温为40℃，流动相流速为0.8ml/min，进样浓度控制在0.5mg/min，检测波长为220nm；
步骤四：记录色谱图，并采用面积归一化法计算氨基酸的纯度。
具体实施通过以下对比例和实施例进一步阐述：
选择的仪器及试剂
高效液相色谱仪：赛默飞U3000，四元泵，自动进样器，UV检测器，Chromeleon 7工作站，电子天平BT25S型(赛多利斯，十万分之一)；
C18柱，4.6mm×250mm，5μm；
C12柱，4.6mm×250mm，5μm；
C4柱，4.6mm×250mm，5μm；
Fmoc-Leu-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-Leu-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-Leu-Leu-OH(吉尔生化)，Fmoc-Ile-OH(吉尔生化)；
乙腈(色谱纯，国药)，三氟乙酸(AR，国药)，重蒸馏水(自制)。
杂质列表：
对比例一：
步骤一：将定量KH2PO4溶于蒸馏水按一定比例配置流动相A；
步骤二：色谱乙腈为流动相B；
步骤三：注入待测溶液，以流动相A和流动相B对色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱的柱温为40℃，进样浓度控制在0.5mg/ml，流动相流速为0.8ml/min,所述梯度洗脱时紫外线检测器的检测波长为220nm；
步骤四：记录色谱图，并采用面积归一化法计算Fmoc-Leu-OH的纯度。
色谱条件采用
色谱柱：C18柱，4.6mm×250mm，5μm；
流速：0.8ml/min
检测波长：220nm
柱温：40℃
进样量：10μl
流动相A:20M KH2PO4
流动相B:ACN(乙腈)
洗脱条件如下：
| 时间(min) | A | B |
| 0 | 52 | 48 |
| 20 | 52 | 48 |
| 25 | 10 | 90 |
| 29 | 10 | 90 |
| 30 | 58 | 42 |
| 35 | 58 | 42 |
注入Fmoc-Leu-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-Leu-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-Leu-Leu-OH(吉尔生化)，Fmoc-Ile-OH(吉尔生化)的混合溶液，以及分别单独进样，从图2看，只有4个峰，其中Fmoc-Leu-OH与Fmoc-Ile-OH重叠了。
对比例二：
步骤一：将蒸馏水和H3PO4按一定比例配置流动相A；
步骤二：色谱乙腈做为流动相B；
步骤三：注入待测溶液，以流动相A和流动相B对色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱的柱温为40℃，进样浓度控制在0.5mg/ml，流动相流速为0.7ml/min,所述梯度洗脱时紫外线检测器的检测波长为220nm。
步骤四：记录色谱图，并采用面积归一化法计算Fmoc-Leu-OH的纯度。
色谱条件采用
色谱柱：C12柱，4.6mm×250mm，5μm；
流速：0.7ml/min
检测波长：220nm
柱温：40℃
进样量：10μl
流动相A:100％H2O+0.1％H3PO4
流动相B:ACN
洗脱条件如下：
注入Fmoc-Leu-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-Leu-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-Leu-Leu-OH(吉尔生化)，Fmoc-Ile-OH(吉尔生化)的混合溶液，以及分别单独进样，从图4看，只有4个峰，其中Fmoc-Leu-OH与Fmoc-Ile-OH分离度比较小，未能完全分开。
实施例一：
步骤一：将蒸馏水和0.1％TFA的离子对溶液按一定比例配置流动相A；
步骤二：将乙腈和0.1％TFA的离子对溶液按一定比例配置流动相B；
步骤三：注入待测溶液，以流动相A和流动相B对色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱的柱温为40℃，进样浓度控制在0.5mg/ml，流动相流速为0.8ml/min,所述梯度洗脱时紫外线检测器的检测波长为220nm。
步骤四：记录色谱图，并采用面积归一化法计算Fmoc-Leu-OH的纯度。
色谱条件采用
色谱柱：C4柱，4.6mm×250mm，5μm；
流速：0.8ml/min
检测波长：220nm
柱温：40℃
进样量：10μl
流动相A:100％H2O+0.1％TFA
流动相B:100％ACN+0.1％TFA
洗脱条件如下：
| 时间min | A | B |
| 0 | 50 | 50 |
| 20 | 45 | 55 |
| 21 | 0 | 100 |
| 25 | 0 | 100 |
| 26 | 50 | 50 |
| 32 | 50 | 50 |
注入Fmoc-Leu-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-Leu-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-Leu-Leu-OH(吉尔生化)，Fmoc-Ile-OH(吉尔生化)的混合溶液，以及分别单独进样，从图6看，5个峰成功分离，但其中最难分离的Fmoc-Leu-OH与Fmoc-Ile-OH分离度也能达到1.23，低于分离度1.5的要求。
实施例二：
步骤一：将蒸馏水和0.1％TFA的离子对溶液按一定比例配置流动相A；
步骤二：将乙腈和0.1％TFA的离子对溶液按一定比例配置流动相B；
步骤三：注入待测溶液，以流动相A和流动相B对色谱柱进行梯度洗脱(梯度在方案三的基础上进一步优化)，梯度洗脱的柱温为40℃，进样浓度控制在0.5mg/ml，流动相流速为0.8ml/min,所述梯度洗脱时紫外线检测器的检测波长为220nm。
步骤四：记录色谱图，并采用面积归一化法计算Fmoc-Leu-OH的纯度。
色谱条件采用
色谱柱：C4柱，4.6mm×250mm，5μm；
流速：0.8ml/min
检测波长：220nm
柱温：40℃
进样量：10μl
流动相A:100％H2O+0.1％TFA
流动相B:100％ACN+0.1％TFA
洗脱条件如下：
注入Fmoc-Leu-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-Leu-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-Leu-Leu-OH(吉尔生化)，Fmoc-Ile-OH(吉尔生化)的混合溶液，以及分别单独进样，从图8看，5个峰成功分离，分离度均远远大于1.5，其中最难分离的Fmoc-Leu-OH与Fmoc-Ile-OH分离度也能达到1.56。
由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。
Claims (8)
1.一种氨基酸的分离提纯方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将水和0.1％TFA的离子对溶液按一定比例配置流动相A；
将乙腈和0.1％TFA的离子对溶液按一定比例配置流动相B；
注入氨基酸溶液，以流动相A和流动相B对色谱柱进行梯度洗脱，洗脱条件为：
0min，流动相B的体积变化为40～100；
20min，流动相B的体积变化为40～100；
25min，流动相B的体积变化为80～100；
29min，流动相B的体积变化为80～100；
30min，流动相B的体积变化为40～100；
35min，流动相B的体积为40～100；
记录色谱图，并采用面积归一化法计算氨基酸的纯度。
2.根据权利要求1所述的一种氨基酸的分离提纯方法，其特征在于：所述氨基酸溶液包括Fmoc-Leu-OH的混合溶液或Fmoc-Ile-OH的混合溶液中的一种或两种混合的溶液。
3.根据权利要求2所述的一种氨基酸的分离提纯方法，其特征在于：所述0.1％TFA的离子对溶液的体积含量为0.05～1.2％、乙腈的体积含量为20～90％，水的体积含量为体积含量为10～80％。
4.根据权利要求3所述的一种氨基酸的分离提纯方法，其特征在于：所述色谱柱包括C4色谱柱、C12色谱柱以及C18色谱柱中的一种。
5.根据权利要求4所述的一种氨基酸的分离提纯方法，其特征在于：洗脱时的色谱柱的柱温为22～45℃。
6.根据权利要求5所述的一种氨基酸的分离提纯方法，其特征在于：洗脱的进样浓度控制在0.4～1.0mg/min。
7.根据权利要求6所述的一种氨基酸的分离提纯方法，其特征在于：洗脱时紫外线检测器的检测波长为210～280nm。
8.根据权利要求7所述的一种氨基酸的分离提纯方法，其特征在于：洗脱时流动相流速为0.6～1.2ml/min。
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