CN105541944A - 瓜蒌皮注射液中化学成分的制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了瓜蒌皮注射液中化学成分的制备方法及其用途。该制备方法包括下述步骤：(1)将瓜蒌皮注射液浓缩物与硅胶混合拌样，然后进行硅胶正相柱层析，先用体积比为甲醇：二氯甲烷＝1:(3～4)作为洗脱剂进行洗脱，然后用体积比为甲醇：二氯甲烷＝1:(1～1.5)作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得到层析物；(2)将层析物与甲醇混合，室温搅拌，降温至0～4℃，过滤，得滤液a，滤饼与水混匀后过滤得到滤液b，将滤液a与滤液b合并浓缩即得浓缩物；(3)将浓缩物采用高压制备液相色谱进行纯化，即得腺苷。本发明的制备方法得到的化合物含量稳定均一，可以作为瓜蒌皮注射液质量控制的一个指标。

Description

瓜蒌皮注射液中化学成分的制备方法及其用途
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及瓜蒌皮注射液中化学成分的制备方法及其用途。
背景技术
瓜蒌(拉丁学名：TrichosantheskirilowiiMaxim.)的根(中药名天花粉)、果肉(中药名栝楼实)、果皮(中药名栝楼皮)、种子(中药名栝楼仁)都是有名的中药。其中瓜蒌皮被做成注射液(瓜蒌皮注射液，上海上药第一生化药业有限公司)，凭其优良的品质和疗效，在国内被广泛用于心绞痛，冠心病等。
作为一种常见中药，瓜蒌皮化学成分非常复杂，其真正有效成分至今没有明确，现有文献公开了一些瓜蒌皮化学成分，如：《瓜蒌果皮化学成分》(山东中医药大学博士学位论文，李爱峰，2011)对瓜蒌皮化学成分进行了详尽的综述和分析，在做水溶性化学成分分离时，其选用826型树脂分离得到极性相对较小的化合物；李爱峰等人的专利：一种从瓜蒌皮中分离纯化4种核苷类化学成分的方法(CN103304613A)、一种从瓜蒌皮中分离纯化5种嘌呤及嘧啶碱基的方法(CN103304490A)、一种从瓜蒌皮中分离纯化3种黄酮苷的方法(CN103304611A)等通过反相制备液相色谱，也对瓜蒌皮化学成分进行了研究。然而，上述文献所用方法与瓜蒌皮注射液工业化制备工艺相去甚远，因而上述文献方法分离得到的化合物不能反映瓜蒌皮注射液的真实化学成分；另外，上述文献在反相柱层析前没有进行有效除糖和除色素操作，而瓜蒌中含有丰富的糖类和色素，会对色谱柱造成不可逆损坏，因此，该类方法不适用于工业化生产，且重复性差。
作为一种中药注射液，也有许多文献对瓜蒌皮注射液化学成分进行过报道，瓜蒌皮注射液及其制备方法(专利CN1460493A)对瓜蒌皮注射液的生产工艺进行了描述：1、水提，2、75％乙醇沉淀，3、阳离子树脂分离，收集目标段馏分，进行浓缩即得瓜蒌皮注射液原液，明确说明了所得原液中主要成分为氨基酸。瓜蒌皮或瓜蒌皮注射液的液相指纹图谱测试方法(专利CN101059482A)对瓜蒌皮注射液的指纹图谱进行了公开和说明，作者用柱前衍生法对瓜蒌皮注射液中的主要氨基酸进行了控制。现有文献对瓜蒌皮注射液的化学成分研究还局限在氨基酸类成分。
瓜蒌皮注射液应用越来越广泛，对其化学成分的分离和鉴定具有十分重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种瓜蒌皮注射液中化学成分的制备方法及其用途。本发明的方法可以从瓜蒌皮中同时制备腺苷、香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芦丁，并且提供了以腺苷、香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芦丁为对照品控制瓜蒌皮注射液质量的方法。本发明的方法简单易行，重复性好，环保安全。
本发明利用正相柱层析法对瓜蒌皮注射液中氨基酸进行分离时，意外发现水不溶性沉淀。对该沉淀重结晶，并进行结构鉴定，确定为香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷。本发明对柱层析方法优化，并进行进一步反相色谱柱分离，最终又得到化合物腺苷和芦丁。由于本发明进行反相层析前已用正相柱除去色素和糖类，故本发明可大量制备腺苷和芦丁，为后续的质量控制提供充足的原料。
本发明是通过以下技术方案实现上述目的的：
本发明提供瓜蒌皮注射液中化学成分的制备方法，其包括下述步骤：
(1)将瓜蒌皮注射液浓缩物与硅胶混合拌样，然后进行硅胶正相柱层析，先用体积比为甲醇：二氯甲烷＝1:(3～4)作为洗脱剂进行洗脱，然后用体积比为甲醇：二氯甲烷＝1:(1～1.5)作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得到层析物；
(2)将步骤(1)得到的层析物与甲醇混合，室温搅拌，降温至0～4℃，过滤，得滤液a，滤饼与水混匀后过滤得到滤液b，将滤液a与滤液b合并浓缩即得浓缩物；
(3)将步骤(2)所得的浓缩物采用高压制备液相色谱进行纯化，色谱条件如下：百分比为体积百分比；
时间(min) A水(％) B乙腈(％)
0 90 10
5 90 10
35 0 100
40 0 100
收集10min～11min的洗脱液，减压浓缩即得腺苷。
其中，所述的瓜蒌皮注射液浓缩物是指将瓜蒌皮注射液减压浓缩至无液滴滴下得到的物质。
其中，所述的瓜蒌皮注射液可为本领域常规的瓜蒌皮注射液，较佳地通过下述步骤制得：将瓜蒌皮与水混合后，常压下回流提取3～4次，合并提取液；减压浓缩，加入质量百分比浓度为90％～95％的乙醇，加至乙醇质量百分比为70％～75％，静置，过滤，得上清液；上清液上阳离子交换树脂柱，用水洗涤，然后用氨水作为洗脱剂进行洗脱，将洗脱液用酸调节pH至3.5～4，冷藏过夜，过滤即得瓜蒌皮注射液。
其中，所述的减压浓缩较佳地为减压浓缩至瓜蒌皮的原料重量的0.75～2倍。
其中，所述的阳离子交换树脂柱中的阳离子交换树脂较佳地为购自于上海树脂厂的732型强酸性阳离子交换树脂。
其中，所述的水较佳地为去离子水。
其中，所述的氨水的浓度较佳地为1～2mol/L。
其中，所述的冷藏的温度较佳地为0～3℃。
其中，步骤(1)中，瓜蒌皮注射液浓缩物与硅胶混合拌样中，所述的瓜蒌皮注射液浓缩物与所述的硅胶的质量比较佳地为1：(1～2)。
其中，步骤(1)中，硅胶正相柱层析中，所述的硅胶的用量为较佳地瓜蒌皮注射液浓缩物质量的5～20倍。
其中，步骤(1)中，所述的用体积比为甲醇：二氯甲烷＝1:(3～4)作为洗脱剂进行洗脱较佳地为洗脱3～5个柱体积。
步骤(1)中，所述的硅胶的目数较佳地为100～200目。
步骤(1)的柱层析不仅能将目标化合物进行富集，还能将吸附性较大的色素和糖类化合物保留在硅胶柱上，以免损坏后面操作中的反相色谱柱。
步骤(2)中，所述的层析物与甲醇的质量比较佳地为1：(100～150)。
步骤(2)中，所述的甲醇较佳地为无水甲醇。
步骤(2)中，所述的水较佳地为50～80℃的热水。
步骤(3)中，高压制备液相色谱中，洗脱剂的流速较佳地为70～90mL/min，检测波长较佳地为254nm。
本发明还提供了腺苷作为对照品在检测药品中腺苷含量的应用。
其中，所述的药品较佳地为瓜蒌皮注射液。
其中，所述的应用较佳地包括下述步骤：将瓜蒌皮注射液和腺苷对照品溶液分别进行高效液相色谱检测，根据腺苷对照品色谱图的保留时间确定瓜蒌皮注射液中相关物质的峰，并根据峰面积计算瓜蒌皮注射液中腺苷的含量。
其中，所述的腺苷对照品溶液的浓度较佳地为0.3mg/mL。
其中，所述的瓜蒌皮注射液即为前述制备方法制得的瓜蒌皮注射液。
其中，所述的高效液相色谱的条件优选如下：色谱柱为十八烷基键合硅胶色谱柱，进样量为20μL，洗脱条件如下：
时间(min) A水(％) B乙腈(％) 流速(mL/min) 检测波长
0 90 10 1 254nm
5 90 10 1 254nm
35 0 100 1 254nm
40 0 100 1 254nm
。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)本发明首次从瓜蒌皮注射液中发现并分离纯化出单体化合物：腺苷。
(2)本发明还发现了一种检测方法，可以以腺苷为对照品对瓜蒌皮注射液中的腺苷进行检测和控制。研究发现，五批次注射液中，该化合物含量稳定均一，说明本发明分离得到的化合物腺苷可以作为瓜蒌皮注射液质量控制的一个指标。
附图说明
图1为实施例4制得的香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷的HPLC色谱图。
图2为实施例5制得的腺苷的HPLC色谱图。
图3为实施例5制得的芦丁的HPLC色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1瓜蒌皮注射液原液制备
将5kg瓜蒌皮切成小块后，加入25L去离子水，常压下回流提取3次，每次2小时，合并提取液。将所得提取液浓缩至10kg，趁热加入90％乙醇，加至含醇量为75％，常温放置48小时，使其充分沉淀。过滤取上清液。将所得上清液浓缩至5L，回收乙醇。5L浓缩液上732型阳离子交换树脂柱(其树脂购自上海树脂厂的强酸性阳离子树脂，装入直径40cm长度1.5m的色谱柱，用25L蒸馏水预洗，流速为500mL/min)，吸附有效成分，弃去流出液，上样结束后用50L去离子水洗涤，然后用1.5mol/L的氨水作为洗脱剂洗脱，富集氨基酸类化合物，浓缩除氨后加注射用水至1L，用盐酸调pH至3.5-4，0℃冷藏过夜，过滤即得瓜蒌皮注射液原液1L。
同上法制得瓜蒌皮注射液原液20L，取该原液20L减压浓缩至无液滴滴下，得瓜蒌皮注射液浸膏350g。
实施例2柱层析富集目标化合物
取瓜蒌皮注射液浸膏100g，与购自青岛海洋化工有限公司的100-200目硅胶200g拌样，另取1.5kg青岛海洋化工有限公司的100-200目硅胶装柱，硅胶柱规格为直径12公分，长度1.0米。选用国药集团化学试剂有限公司的分析纯甲醇、二氯甲烷作为洗脱剂，进行柱层析洗脱。
甲醇：二氯甲烷(体积比)＝1:3先洗脱4个柱体积，弃去洗脱液。换用甲醇：二氯甲烷(体积比)＝1:1洗脱，收集洗脱液，并以芦丁为对照品用薄层层析监控，待芦丁所显示斑点变淡后，结束收集，共收集洗脱液6L，减压浓缩除去收集液中的溶剂得层析物0.8g。
实施例3柱层析富集目标化合物
取瓜蒌皮注射液浸膏150g，用购自青岛海洋化工有限公司的100-200目硅胶200g拌样，另取1.5kg青岛海洋化工有限公司的100-200目硅胶装柱，硅胶柱规格为直径12公分，长度1.0米。选用国药试剂的分析纯甲醇、二氯甲烷作为洗脱剂，进行柱层析洗脱。
甲醇：二氯甲烷(体积比)＝1:3先洗脱5个柱体积，弃去洗脱液。换用甲醇：二氯甲烷＝1:1(体积比)，收集洗脱液，并以芦丁为对照品用薄层层析监控，待芦丁所显示斑点变淡后，结束收集，共收集洗脱液8L，减压浓缩除去收集液中的溶剂得层析物1.0g。
实施例4重结晶分离纯化香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷
取按实施例2和3制得的层析物2.5g，加入国药集团化学试剂有限公司的分析纯甲醇500mL，室温下搅拌10分钟，然后降温至0℃，静置12小时后过滤，滤液收集备用。滤饼用80℃热水混匀，搅拌10分钟后趁热过滤，得到固体物25mg，经HPLC检测纯度为98％(见图1所示)，核磁鉴定(AvanceⅢ600MHzBruker)(为香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷，同时将收集得到的滤液合并。
所得香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷核磁数据如下：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm：12.97(1H,s),10.01(1H,br),7.61(2H,m),7.00(1H,s),6.95(1H,d,J＝5.6Hz),6.88(1H,d,J＝1Hz),6.45(1H,d,J＝1Hz),5.41(1H,d,J＝3.2Hz),5.15(1H,d,J＝3.2hz),5.08(2H,m),4.64(1H,m),3.90(3H,s),3.1-3.7(6H,m)。13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm：182.5，164.6，163.5，161.5，157.4，151.4，148.5，121.8，120.9，116.3，110.8，105.8，103.9，100.5，99.9，95.5，77.7，76.9，73.6，70.1，61.0，56.5。
实施例5反相高压色谱制备腺苷和芦丁
将实施例4过滤的滤液减压浓缩，选用VARIANprostarSD-1制备液相系统进行制备，选用2英寸色谱柱，按以下条件进行制备：
时间(min) A水(％) B乙腈(％) 流速(mL/min) 检测波长
0 90 10 80 254nm
5 90 10 80 254nm
35 0 100 80 254nm
40 0 100 80 254nm
收集10min-11min的洗脱液，减压浓缩得化合物腺苷208mg，经HPLC检测纯度为99％(见图2所示)；收集21min-22min的洗脱液，减压浓缩即得化合物芦丁35mg，经HPLC检测纯度为99％(见图3所示)。
所得芦丁核磁数据如下(AvanceⅢ600MHzBruker)：1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δppm：12.61(1H,s),10.70(1H,brs),9.55(1H,brs),7.55(1H,s),7.53(1H,s),6.84(1H,s),6.39(1H,s),6.19(1H,s),5.34(2H,m),4.39(1H,s),1.0(3H,dJ＝5.6Hz)。13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm：177.3，164.0，161.1，156.5，156.3，148.3，144.6，133.2，121.5，116.2，115.1，1.3.9，101.1，100.6，98.6，93.5，76.4，75.8，74.0，71.8，70.5，70.3，69.9，68.1，66.9，17.6。
所得腺苷核磁数据如下(AvanceⅢ400MHzBruker)：1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δppm：8.36(1H，s，2-H),8.14(1H,s,8-H)，5.88(1H,d，J＝6.4Hz，1’-H)，4.61(1H，t,J＝5.6Hz,2’-H),4.15(1H,m,3’-H),4.11(1H,m,3’-H)。13C-NMR(150MHz,DMSO-d6)δppm：156.6,152.8,149.6,140.4,119.9,88.4,86.4,73.9,71.1,61.2。
实施例6以腺苷、香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芦丁为对照品进行瓜蒌皮注射液质控
精密配制腺苷浓度为0.3mg/mL水溶液、香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷0.3mg/mL水/乙醇(体积比1：1)溶液和芦丁0.3mg/mL甲醇溶液作为对照品，供试品选用五个批次瓜蒌皮注射液(上海上药第一生化药业有限公司)，色谱条件如下：色谱柱选用十八烷基键合硅胶Diamonsil,C18(4.6×250mm，5μm)，洗脱条件如下：
时间(min) A水(％) B乙腈(％) 流速(mL/min) 检测波长
0 90 10 1 254nm
5 90 10 1 254nm
35 0 100 1 254nm
40 0 100 1 254nm
供试品与对照品按上述条件各进样20μL，根据对照品腺苷、香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芦丁的峰的保留时间确定供试品中对应物质及其含量。经测定五个批次的瓜蒌皮注射液中腺苷、香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芦丁的含量稳定，且符合标准。如下表所示：

Claims (10)

1.瓜蒌皮注射液中化学成分的制备方法，其包括下述步骤：
(1)将瓜蒌皮注射液浓缩物与硅胶混合拌样，然后进行硅胶正相柱层析，先用体积比为甲醇：二氯甲烷＝1:(3～4)作为洗脱剂进行洗脱，然后用体积比为甲醇：二氯甲烷＝1:(1～1.5)作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得到层析物；
(2)将步骤(1)得到的层析物与甲醇混合，室温搅拌，降温至0～4℃，过滤，得滤液a，滤饼与水混匀后过滤得到滤液b，将滤液a与滤液b合并浓缩即得浓缩物；
(3)将步骤(2)所得的浓缩物采用高压制备液相色谱进行纯化，色谱条件如下：百分比为体积百分比；
时间(min) A水(％) B乙腈(％) 0 90 10 5 90 10 35 0 100 40 0 100
收集10min～11min的洗脱液，减压浓缩即得腺苷。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的瓜蒌皮注射液通过下述步骤制得：将瓜蒌皮与水混合后，常压下回流提取3～4次，合并提取液；减压浓缩，加入质量百分比浓度为90％～95％的乙醇，加至乙醇质量百分比为70％～75％，静置，过滤，得上清液；上清液上阳离子交换树脂柱，用水洗涤，然后用氨水作为洗脱剂进行洗脱，将洗脱液用酸调节pH至3.5～4，冷藏过夜，过滤即得瓜蒌皮注射液。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的减压浓缩为减压浓缩至瓜蒌皮的原料重量的0.75～2倍；
和/或，所述的阳离子交换树脂柱中的阳离子交换树脂为购自于上海树脂厂的732型强酸性阳离子交换树脂；
和/或，所述的水为去离子水；
和/或，所述的氨水的浓度为1～2mol/L；
和/或，所述的冷藏的温度为0～3℃。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，瓜蒌皮注射液浓缩物与硅胶混合拌样中，所述的瓜蒌皮注射液浓缩物与所述的硅胶的质量比为1：(1～2)。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，硅胶正相柱层析中，所述的硅胶的用量为瓜蒌皮注射液浓缩物质量的5～20倍；
和/或，步骤(1)中，所述的用体积比为甲醇：二氯甲烷＝1:(3～4)作为洗脱剂进行洗脱为洗脱3～5个柱体积；
和/或，步骤(1)中，所述的硅胶的目数为100～200目。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的层析物与甲醇的质量比为1：(100～150)；
和/或，步骤(2)中，所述的甲醇为无水甲醇；
和/或，步骤(2)中，所述的水为50～80℃的热水；
和/或，步骤(3)中，高压制备液相色谱中，洗脱剂的流速为70～90mL/min，检测波长为254nm。
7.腺苷作为对照品在检测药品中腺苷含量的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的药品为瓜蒌皮注射液。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用包括下述步骤：将瓜蒌皮注射液和腺苷对照品溶液分别进行高效液相色谱检测，根据腺苷对照品色谱图的保留时间确定瓜蒌皮注射液中相关物质的峰，并根据峰面积计算瓜蒌皮注射液中腺苷的含量。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的腺苷对照品溶液的浓度为0.3mg/mL；
和/或，所述的高效液相色谱的条件如下：色谱柱为十八烷基键合硅胶色谱柱，进样量为20μL，洗脱条件如下：
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