CN107868118B - 一种正相高效液相色谱纯化ghk三肽的方法 - Google Patents

一种正相高效液相色谱纯化ghk三肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种正相高效液相色谱纯化GHK三肽的方法，该方法采用正相色谱先对Boc‑Gly‑His(Trt)‑Lys(Boc)‑OH三肽纯化，然后再进行脱保护，得到产品纯度95％以上的GHK三肽，而脱保护并不影响正相色谱纯化Boc‑Gly‑His(Trt)‑Lys(Boc)‑OH三肽纯化后的纯度，此方法解决了反相色谱法GHK在反相色谱柱中极性大不保留的问题。而且正相色谱中采用累加进样分离法，此方法可以提高有效柱容量，节省大量时间和消耗，可达到成本低、收率高、规模产业化的要求。

Description

一种正相高效液相色谱纯化GHK三肽的方法
技术领域
本发明属于多肽纯化技术领域，具体涉及一种GHK三肽的纯化方法。
背景技术
GHK三肽是一种含有三个氨基酸的活性多肽，氨基酸序列为H-Gly-His-Lys-OH，GHK-Cu在医学上最早用于促进伤口愈合及增进肌肤弹性，近来部分研究认为能改善细纹，GHK有丰唇之功效，使用在唇膏的生产上，使用后使嘴唇看起来丰润柔亮，拥有独特的唇景，也是安全的丰胸产品的必备原料。
经典的固相多肽合成方法合成GHK原材料价格贵、成本高、产率低，不适合规模化生产，同时经典常规的C18反相色谱纯化方法中，GHK极性大而不保留，造成经典的C18反相色谱纯化方法难以达到纯化目的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有C18反相色谱纯化方法中，GHK极性大而不保留，造成经典的C18反相色谱纯化方法难以达到纯化目的的缺点，提供一种成本低、效率高、简单易行、易规模化生产的正相高效液相色谱纯化GHK三肽的方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
1、溶样
将合成的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH粗品加入甲醇与乙醇体积比为2:8～4:6的混合液中，超声分散后用滤膜过滤，收集滤液。
2、纯化
采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为层析硅胶，流动相A为正己烷，流动相B为无水乙醇，将色谱柱用流动相B:15％平衡后，用流动相B:15％累加进样，每隔2～5min进样一次，每次进样量为样品总体积的1/3～1/5，样品全部进完后进行梯度洗脱，收集纯化后的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH溶液，减压浓缩，得到纯度95％以上的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH。
3、脱保护
将纯度95％以上的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH加入三氟乙酸与二氯甲烷体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应3～4小时，减压浓缩，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤，旋转蒸发，冻干，得到纯度95％以上的GHK三肽。
上述溶样步骤1中，优选将合成的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH粗品加入甲醇与无水乙醇体积比为2:8～4:6的混合液中，超声分散后用0.45μm有机滤膜过滤。
上述纯化步骤2中，按照步骤1中Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH粗品的质量加入三氟乙酸与二氯甲烷体积比为1:1的混合液，优选Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH粗品与所述混合液的质量-体积比为1g:10～20mL。
上述纯化步骤2中，所述色谱柱填料为粒径200～300目的层析硅胶；洗脱梯度为：流动相B 15％～17％20～60min、40％～85％30～70min、75％～85％恒流，优选洗脱梯度为：流动相B 15％20min、40％～75％60min、75％恒流；色谱的检测波长为200～240nm；样品流速为20～50mL/min。
本发明的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH粗品是以Boc-Gly-OH、H-His(Trt)-OH、H-Lys(Boc)-OH、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺为原料，用液相合成方法首先合成Boc-Gly-OSu，Boc-Gly-OSu与H-His(Trt)-OH形成二肽Boc-Gly-His(Trt)-OH后，再与HOSu形成活泼脂Boc-Gly-His(Trt)-OSu，最后与H-Lys(Boc)-OH反应制备而成。
本发明先用正相高效液相色谱纯化Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH粗品后，再脱除保护基，利用GHK三肽极性大的特性而有效除去保护基及使用的有机溶剂残留，从而达到GHK三肽的纯化目的。该方法得到的GHK三肽的纯度可达95％以上，而且脱保护并不影响正相色谱纯化Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH后的纯度，解决了反相色谱法纯化GHK三肽时，GHK三肽在反相色谱柱中极性大不保留的问题，而且正相色谱中采用累加进样分离法，可以提高有效柱容量，节省大量时间和消耗，可达到成本低、收率高、效率高、简单易行、规模产业化生产的要求。
附图说明
图1是实施例2纯化后的GHK三肽质谱图。
图2是实施例2纯化后的GHK三肽色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、溶样
称取1g Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH，用60mL甲醇与无水乙醇体积比为2:8的混合溶液溶解，待溶液完全澄清，用0.45μm有机滤膜过滤，收集滤液。
2、纯化
采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为粒径200～300目的层析硅胶，柱子规格为4cm×20cm，填装体积为70mL，流动相A为正己烷，流动相B为无水乙醇，将色谱柱用流动相B:17％平衡后，用流动相B:17％累加进样，每隔2min进样一次，每次进样量为样品总体积的1/4，样品全部进完后进行梯度洗脱，洗脱梯度为：流动相B 17％20min、45％～85％70min、85％恒流，样品流速为20mL/min，检测波长为200nm。收集纯化后的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH溶液，在40℃减压浓缩，得到纯度95.5％的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH。
3、脱保护
将纯度95.5％的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH加入15mL三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应3小时，减压蒸干二氯甲烷，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤3次，旋转蒸发除去有机溶剂残留，冷冻干燥，得到纯度95.6％的GHK三肽0.531g，收率61％。
实施例2
1、溶样
称取1g Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH粗品，用60mL甲醇与无水乙醇体积比为3:7的混合溶液溶解，待溶液完全澄清，用0.45μm有机滤膜过滤，收集滤液。
2、纯化
采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为粒径200～300目的层析硅胶，柱子规格为4cm×20cm，填装体积为70mL，流动相A为正己烷，流动相B为无水乙醇，将色谱柱用流动相B:15％平衡后，用流动相B:15％累加进样，每隔5min进样一次，每次进样量为样品总体积的1/3，样品全部进完后进行梯度洗脱，洗脱梯度为：流动相B 15％20min、40％～75％60min、75％恒流，样品流速为30mL/min，检测波长为215nm。收集纯化后的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH溶液，在40℃减压浓缩，得到纯度98.2％的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH。
3、脱保护
将纯度98.5％的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH加入15mL三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应3小时，减压蒸干二氯甲烷，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤3次，旋转蒸发除去有机溶剂残留，冷冻干燥，得到GHK三肽0.592g，收率68％。
发明人采用质谱仪对合成产物的结构进行表征，结果见图1。由图1可见，所合成的产物的分子量及分子离子峰与GHK三肽的分子量及分子离子峰一致，说明合成产物为GHK三肽。采用液相色谱仪对得到的产物的纯度进行测定，分析条件为：色谱柱C18 5μm250×4.6mm，流速0.8mL/min，检测波长215nm，流动相A：体积浓度0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相B：体积浓度0.1％的三氟乙酸乙腈溶液，洗脱条件：流动相B 1％恒流15min，分析结果见图2。由图2可见，所制备的GHK三肽的出峰时间约为6.2分钟，纯度为98.5％。
实施例3
1、溶样
称取1g Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH粗品，用60mL甲醇与无水乙醇体积比为4:6的混合溶液溶解，待溶液完全澄清，用0.45μm有机滤膜过滤，收集滤液。
2、纯化
采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为粒径200～300目的层析硅胶，柱子规格为4cm×20cm，填装体积为70mL，流动相A为正己烷，流动相B为无水乙醇，将色谱柱用流动相B:16％平衡后，用流动相B:16％累加进样，每隔4min进样一次，每次进样量为样品总体积的1/5，样品全部进完后进行梯度洗脱，洗脱梯度为：流动相B 16％20min、50％～80％60min、80％恒流，样品流速为50mL/min，检测波长为240nm。收集纯化后的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH溶液，在40℃减压浓缩，得到纯度95.8％的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH。
3、脱保护
将纯度95.8％的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH加入15mL三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应3小时，减压蒸干二氯甲烷，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤3次，旋转蒸发除去有机溶剂残留，冷冻干燥，得到纯度96.2％的GHK三肽0.556g，收率64％。
实施例4
1、溶样
称取5g Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH粗品，用60ml甲醇与无水乙醇体积比为3:7的混合溶液溶解，待溶液完全澄清，用0.45μm有机滤膜过滤，收集滤液备用。
2、纯化
采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为粒径200-300目的层析硅胶，柱子规格为5cm×40cm，填装体积为300mL，流动相A为正己烷，流动相B为无水乙醇，将色谱柱用流动相B:15％平衡后，用流动相B:15％累加进样，每隔5min进样一次，每次进样量为样品总体积的1/3，样品全部进完后进行梯度洗脱，洗脱梯度为：流动相B 15％20min、40％～75％60min、75％恒流，样品流速为30mL/min，检测波长为215nm。收集纯化后的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH溶液，在40℃减压浓缩，得到纯度98.1％的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH。
3、脱保护
将纯度98.1％的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH加入75mL三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应4小时，减压蒸干二氯甲烷，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤3次，旋转蒸发除去有机溶剂残留，冷冻干燥，得到纯度98.3％的GHK三肽2.6g，收率60％。
实施例5
1、溶样
称取50g Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH粗品，用100mL甲醇与无水乙醇体积比为3:7的混合溶液溶解，待溶液完全澄清，用0.45μm有机滤膜过滤，收集滤液备用。
2、纯化
采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为粒径200-300目的层析硅胶，柱子规格为5cm×40cm，填装体积为300mL，流动相A为正己烷，流动相B为无水乙醇，将色谱柱用流动相B:15％平衡后，用流动相B:15％累加进样，每隔5min进样一次，每次进样量为样品总体积的1/3，样品全部进完后进行梯度洗脱，洗脱梯度为：流动相B 15％20min、40％～75％30min、75％恒流，样品流速为30mL/min，检测波长为215nm。收集纯化后的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH溶液，在40℃减压浓缩，得到纯度98.0％的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH。
3、脱保护
将纯度98.0％的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH加入750mL三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应4小时，减压蒸干二氯甲烷，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤3次，旋转蒸发除去有机溶剂残留，冷冻干燥，得到纯度98.1％的GHK三肽28.7g，收率66％。
实施例6
1、溶样
称取150g Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH粗品，用150mL甲醇与无水乙醇体积比为3:7的混合溶液溶解，待溶液完全澄清，用0.45μm有机滤膜过滤，收集滤液备用。
2、纯化
采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为粒径200-300目的层析硅胶，柱子规格为10cm×50cm，填装体积为2500mL，流动相A为正己烷，流动相B为无水乙醇，将色谱柱用流动相B:15％平衡后，用流动相B:15％累加进样，每隔5min进样一次，每次进样量为样品总体积的1/3，样品全部进完后进行梯度洗脱，洗脱梯度为：流动相B 15％60min、40％～75％60min、75％恒流，样品流速为50mL/min，检测波长为215nm。收集纯化后的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH溶液，在40℃减压浓缩，得到纯度97.8％的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH。
3、脱保护
将纯度97.8％的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH加入2250mL三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应4小时，减压蒸干二氯甲烷，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤3次，旋转蒸发除去有机溶剂残留，冷冻干燥，得到纯度98.0％的GHK三肽81.0g，收率62％。

Claims (3)

1.一种正相高效液相色谱纯化GHK三肽的方法，其特征在于该方法由下述步骤组成：
（1）溶样
将合成的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH粗品加入甲醇与乙醇体积比为2:8～4:6的混合液中，超声分散后用滤膜过滤，收集滤液；
（2）纯化
采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为粒径200～300目的层析硅胶，流动相A为正己烷，流动相B为无水乙醇，将色谱柱用流动相B:15%平衡后，用流动相B:15%累加进样，每隔2～5min进样一次，每次进样量为样品总体积的1/3～1/5，样品全部进完后进行梯度洗脱，洗脱梯度为：流动相B 15% 20min、40%～75% 60min、75%恒流，样品流速为20～50mL/min，色谱的检测波长为200～240nm；收集纯化后的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH溶液，减压浓缩，得到纯度95%以上的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH；
（3）脱保护
将纯度95%以上的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH加入三氟乙酸与二氯甲烷体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应3～4小时，减压浓缩，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤，旋转蒸发，冻干，得到纯度95%以上的GHK三肽。
2.根据权利要求1所述的正相高效液相色谱纯化GHK三肽的方法，其特征在于：在溶样步骤（1）中，将合成的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH粗品加入甲醇与无水乙醇体积比为2:8～4:6的混合液中，超声分散后用0.45μm有机滤膜过滤，收集滤液。
3.根据权利要求1所述的正相高效液相色谱纯化GHK三肽的方法，其特征在于：在纯化步骤（2）中，按照步骤（1）中Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH粗品的质量加入三氟乙酸与二氯甲烷体积比为1:1的混合液，Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH粗品与所述混合液的质量-体积比为1g:10～20mL。
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