SU1396970A3

SU1396970A3 - Способ получени производных гонадолиберина

Info

Publication number: SU1396970A3
Application number: SU843827701A
Authority: SU
Inventors: Гулиаш Тамаш; Хорват Анико; Кери Дьердь; Николич Карой; Секе Балаж; Теплан Иштван
Original assignee: Кезпонти Валто-Еш Хительбанк Рт.Инновациош Алап (Инопредприятие)
Priority date: 1983-12-23
Filing date: 1984-12-21
Publication date: 1988-05-15
Also published as: SE469032B; DK625084A; FI845051A0; JPS60226898A; ES8607992A1; CZ1021084A3; ZA849985B; NO166449B; ES538988A0; LU85710A1; AT394727B; FI82255B; SE8406554D0; NO845193L; DK625084D0; FI845051L; FI82255C; IL73902A; CH664968A5; FR2557114B1

Abstract

Изобретение относитс к пептидам , в частности к получению производных гонадолиберина формулы I: Gep- HiS-Trp-Ser-Tyr-X -Xj-Xj-Pro-Gly NHCjH, где Х - Gly, DPhe, DTrp, DAla, DLeu, трет.бутил DSer; Xg - Leu, Trp, Phe, Gin; X, - Gin, Leu. Цель - разработка способа получени новых соединений, повышающих способность к овул ции и спермиации стерл ди . Получение целевых соединений ведут построением пептидной цепи твердофазным методом исход из глицина и бенэгидриламингидрохлоридной смолы. К полученному глицилполимеру присоедин ют соответствующим образом защищенные аминокислоты в последовательности , обусловленной пептидом формулы I с использованием карбодиимидного метода или метода активированных эфи- ров. От полученного при этом пепти- дил-полимера формулы II: Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X,-Xj-Xj-Pro-Gly-W. Y Y Y где Y - динитрофенил или тозил; Y - OBZl; W - бензгидриламин, отщепл ют защитные группы и полимерную подложку. Испытани показывают, что указанные соединени способствуют овул ции рыб. 4 табл. i СО 00 со Од СО vj

Description

см

Изобретение относитс к способу получени производных гонадолибери- на - новых биологически активных соединений , которые могут найти примене- ние в рыбоводстве.

Цель изобретени - способ получени новых производных гонадолибери- на - малотоксичных и значительно по- вьтающих способность к овул ции и спермиации стерл ди.

Производные гонадолиберина получают , использу метод синтеза пептидов в твердой фазе,

За ходом реакций след т с помоп ю теста с нингидрином. При обнаружении свободных аминогрупп ацилирование повтор ют. В зависимости от природы аминокислоты продолжительность про- цесса св зывани составл ет 1 - 16 ч.

Отщепление защитных групп и отделение пептида от смолы осуществл ют с помощью жидкого безводного фтористого водорода в одну стадию. При при- менении N -динитрофенила удал ют защитные группы еще до отщеплени смолы с помощью HF-отщеплени . Защищенную пептидную смолу перемешивают в содержащем пропил амин диметилформамида и после удалени растворител обрабатывают обычным образом с помощью HF. Если полученное соединение вл етс пептидалкиламидом, то пептид отдел ют от смолы путем алкиламмонолиза и за- тем в зависимости от характера защитных групп каталитически гидрируют и/или гидролизуют кислотой.

Сырой продукт чист т путем гель- фильтрации на Сефадексе G 25, элюирование ведут с помощью уксусно-кислых растворов.

Дл дальнейшей очистки использую HPhC-колонки жидкостна хроматографи высокого давлени и/или хрома- тографию на силикагеле. Чистоту пептидов исследуют путем аминокислотного анализа и посредством тонкослойной хроматографии. R f- значени тонкослойной хроматографии определ ют на силикареле (тонка алюминиева фольга ) . Merk с помощью следующих смесей растворителей:

Этилацетат:пиридин:уксусна кисло- та:вода 30:20:6:11

Этилацетат:пиридин:уксусна кисло- та:вода 60:20:6:11

Этилацетат:пиридин:уксусна кисло- та:вода 120:.20:6: 11

Этилацетат:пиридин:уксусна кислота: вода 2АО:20:6:11

н-Бутанол:уксусна кислота:вода: :этилацетат 1:1:1:1

н-Бутанол:уксусна кислота:вода

4:1:1

Изопропанол:1 М уксусна кислота 2:1

Этилацетат:пиридин:уксусна кислота: вода 5:5:1:3

нтБутанол:уксусна кислота:аммиак концентрированный аммиак и вода 1; };вода 6:1:1:2

Метилэтилкетон:уксусна кислота: :вода 125:15:20

Пример 1. D- Phe, Gin - гонадолиберин (М:1243)

а). Синтез.

1,25 г (1 ммоль) бензгидриламино- гидрохлоридной смолы (0,8 ммоль/г Pierce) в течение 2 ч оставл ют набухать в дихлорметане. При ацилирова- нии с помощью аминокислот, смотр по обсто тельствам, повтор ют следующий цикл: (см. табл.1).

После последней стадии вес Glp- HislTos|-Trp-Ser|OBZlf-Tyr I OBZll-D- Phe-Leu-Gln-Pro-Gly - пептидной смол составл ет 2,28 г. dW:1,05 г (66%). М (gesch.) полученного пептида:1577.

б), Отщепление с помощью HF.

К смоле добавл ют 3 мл анизола и 100 мг дитиотрейта (Dithiothrit), затем конденсируют в смеси 30 мл HF. Смесь перемешивают в течение 1 ч при 0°С. Затем фторисный водород удал ют в токе азота, остаток суспендируют в абсолютном эфире и затем отфильтровывают . Твердый остаток промьтают 50%-ной уксусной кислотой. Фильтрат выпаривают при . Остаток подают непосредственно на гель-хроматографию .

в). Гель-хроматографи .

Полученное согласно предыдущему пункту вещество очищаетс на колонке с Сефадексом G 25 (2,5x100 см) с помощью уксусной кислоты в качестве элюирующей кислоты. Элюирование осуществл етс с помощью абсорбции УФ- света при длине волны 280 нм, а такж посредством тонкослойной хроматографии . Скорость элюировани составл ет 15 Мл/ч. Собирают фракции между 300м и 350 мл и лиофилизируют. Вес 690 мг (55%).

г). Препаративна жидкостна хроматографи высокого давлени ,

3

Используетс препаративна HPLC- колонка (колонка дл жидкостной хроматографии высокого давлени ) размером 2, см (С,5-силикагель .LRP-1, 13-24 мик. Ватман). Она уравновешена смесью 25% метанола с 75% 30%-ной уксусной кислоты. После установлени равновеси на колонку нанос т 230 мг очищенного с помощью гель-хроматогра фии вещества, растворенного в той смеси растворителей. ЭЛюируют с помощью градиента метанол(уксусна кислота , состав которого линейно измен етс между 25% метанола 75% 30%-ной уксусной кислоты и 40% метанола) и 60% 30%-ной уксусной кислоты.

Скорость элюировани составл ет 2 мл/мин, давление 3,5-10 Па. Фракции детектируют с помощью УФ-света с длиной волны 280 нм, их содержание контролируетс с помощью тонкослойно хроматографии. Вес чистого целевого продукта D - Phe, Gin - GnRH после лиофшшзации составл ет 133 мг. Это соответствует в расчете на общее количество вещества 399 мг (32%) ощищенного целевого продукта. ,76; ,6bi ,33; ,93; ,83, Т.ПЛ. 175 - , - 68,0 (C

1,00;

0,1, 0,1 H CHjCOOH).

Аминокислотный анализ: Gly : 1,02; Pro : 0,95; Leu Phe : 1,02; Tyr : 1,01; Ser : 0,93; His :: 0,99; Glu:1,96. Т.ПЛ. 175 - 178°C, c j -68 (c 0,1, 0,1 CHjCOOH).

П p и M e p 2. Trp, Gln - гона- долиберин. (М:1226).

a). Синтез.

Исход из 2,5 г (1 ммоль) бензгид риламиногидрохлоридной смолы (О,Л.мол эквивалент/г) описанным в примере 1 в п.а) образом получаетс пептидна смола Glp-HisiDNPl-Trp-SerlO-BZI I Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-Gly - смола. Вес пептидной смолы составл ет 3,62 г; ,12 г (76%).

(М полученного пептида: 1468).

б). Удаление защитных групп и отделение пептида от смолы. Отщепление динитрофенильной защитной группы (DNP)..

Пептидную смолу в течение 1 ч при комнатной температуре перемешивают в смеси 20 мл диметилформамида с 1 мл пропиламина. Затем смолу отфильтровывают и промывают дихлорме- таном, затем - зтанолом.

ю

3969704

Расщепление с помощью HF.

После удалени динитрофенильной защитной группы описанным в примере 1 в п. б) образом отдел ют пептид от смолы, а защитные группы - от пептида . По окончании обеих стадий остаютс 0,8 г (65%) вещества,

г). Гель-хроматографи .

Работают указанным в примере 1 в п.в) образом. Вес собранных и лиофи- лизированных фракций составл ет 520 мг (42%).

д) Препаративна жидкостна хрома- 15 тографи высокого давлени .

Работают указанным в примере 1 в п.г) образом с тем отличием, что уравновешивание осуществл етс с помощью смеси из 18% метанола и 82% 20 30%-ной уксусной кислоты. Очищенное с помощью гель-хроматографии вещество элюируетс из колонны с помощью смеси метенол/уксусна кислота, состав которой линейно измен етс между 18% 25 метанола (82% 30%-ной уксусной кислоты и 35% метанола) и 65% 30%-ной уксусной кислоты. Фракционирование, а также прочие услови совпадают с та- ковьп и примера 1 п.г). Вес лиофилизй- рованного целевого продукта составл ет 380 мг (31%) ,66; ,57-,

30

го

. 12,0

35

,78j т.гш. 160 С (С 0,1; 0,1 Н CHjCOOH).

-Аминокислотный анализ: Glu : 1,93; Gly : 2,04; Pro : 1,00; ,98; Ser : 0,93; .Trp : 1,86; His 1,03.

П p и M e p 3. Trp , Leu , des Gly NH гонадодиберин-зтиламид ( 1198).

a). Синтез.

В качестве первой стадии синтеза БОК-Рг известным способом св зывают с хлорметилированной полистирольной смолой. 2 г полученной таким образом БОК-Рг о-смолы (0,5 моль-зквивалент/ /г) в течение 2 ч оставл ют набухать в дихлорметане и затем описанным в п.а) примера 1 образом постепенно . св зывают со смолой соответствующие защищенные аминокислоты. После последнего цикла получают 3,02 г пептидной смолы Glp-HisIDNPf-Trp- Ser|OBZIf-TyrfOBZIf-Gly-Trp-Leu-Pro. 5 1,02 г (83%). (M полученного пепти- да: 1486).

б). Удаление защитных групп и отделение пептида от смолы.

Сначала согласно п. б) примера 2 отдел ют динитрофенильную защитную группу от гистидина.З&тем отщепл ют пептид в форме этиламида от смолы. Дл этой цели на защищенную пептидную смолу наконденсируют 15 мл этиламина и смесь перемешивают при 0 С в течение 3 ч. Избыток амина удал ют с помощью азота. После этого промывают метанолом, затем - диметилформамидом. ДМФ-раствор выпаривают и получающеес в качестве остатка после выпаривани масло растирают с эфиром. Осадок отфильтровывают .

Полученное таким образом твердое вещество с целью удалени защитных групп обрабатывают согласно п.б) примера 1, газообразным фтороводородом. Получают 71,0 мл (59%) нонапептид- этиламида.

г). Гель-хроматографи .

Работают описаннным в п. в) примера 1 способом с колонкой из Сефадекса

гель LRP-1 уравновешиваетс с помо содержащего 10% метанола и 20% укс ной кислоты водного раствора. Элюи ют с помощью линейного градиента,

G 25 и в качестве элюирующего средст-25 торый содержит в 20%-ной уксусной

I OBZI 1-ТугIOBZI -Gly-Phe-Gln-Pro-Gly- смола (3W: 1,27 г (83%). М полученного пептида 1521.

б). Отщепление защитных групп.

Защищенный пептид описанным в примере 1 п.б) образом обрабатывают безводным HF. Получают 980 мг (82%) незащищенного пептида.

в). Гель-фильтраци .

Сырой декапептидамид описанным в примере 1 п.в) образом очищают на заполненной Сефадексом G - 25 колонке с помощью 2М уксусной кислоты.

Выход: 576 мг (49%).

г) . Препаративна FlPL-хроматогра- фи (жидкостна хроматографи высокого давлени ).

Работают описанным в примере 1 п. г)

образом с тем различием, что

гель LRP-1 уравновешиваетс с помощью содержащего 10% метанола и 20% уксусной кислоты водного раствора. Элюиру- ют с помощью линейного градиента, ко

ва используют 30%-ную уксусную кислоту . Вес собранных и лиофилизированны фракций составл ет 490 мг (41%).

Сырой пептид очищают далее на колонке с силикагелем 60 (230-400 мещ. Merck) размером см. Элюируют смесью этилацетата с пиридином, уксусной кислотой и водой в соотнощени 30:20:6:11. гГроточна скорость составл ет 3 мл/ч. Фракции по 4 мл собирают (улавливают) и за элюированием след т с помощью тонкослойной хроматографии .

Соответствующие гонадолиберинэтил амиду Тгр LCU des Gly NH 5 фракции определ ютс на основании аминокис-i. лотного анализа. Получают 320 мг (26%) лиофилизированного материала. Т.пл. 167 - 174°С, o/JiJ - 5,9 (С 0,5i 0,1 Н CHjCOGH) ,6li К 0,42-, ,75.

Аминокислотьй Gly : 0,96; Gly Ley : 1,00; Ser Trp : 1 ,88; His

П p .И M e p 4

анализ; . 0,97;

Pro

0,95-,

1,02;

0,89; Туг

1,03.

Phe, Gin Гонадо

либерин ().

a). Синтез. 1,25 г (1 ммоль) бенз- гидриламиногидрохлоридной смолы (0,8 моль-эквивалент/г) оставл ют на- gg бухать в течение 2 ч в дихлорметане. Из набухшей смолы описанным в примере 1 п.а) образом получают 2,9 г пептидной смолы Glp-His|Tos|-Trp-Ser

0

0 His

1,03-,

1,00;

182 C.

Pro

Phe ; Т.ПЛ, Leu Гонадоg

кислоте количество метанола от 10% с возрастанием вплоть до 25% (2 150 мл). Затем продолжают элюирова- ние с помощью содержащего метнол в возрастающем количестве от 25 до 40%, линейного градиента ( мл). Полученные фракции чистого пептида собирают и выпаривают. Выход: 448 мг (38%), Т.пл. 182 С; 21,0 (С 5 0,1, 0,.1 Н CHjCGOH) .

,12; ,7; ,24; ,87,

Аминокислотый анализ: Ser ; 0,85; Glu : 2,05; Gly : 2,13; Tyr : 0,92; 0,95; Trp : 0,81.

П p и M e p 5. Phe, либерин (M:1172).

a). Синтез.

0,62 г (0,5 ммоль) бензгиДрилами- 5 ногидрохлоридной смолы (0,8 моль-эквивалент/г ) оставл ют набухать в течение 2 ч в дихлорметане. Затем описанным в примере 1 п.а) образом получают пептидную смолу: Glp-HislTos| Trp-SerlOBZIL -Typ-IOBZI l-Gly Phe-Leu- Pro-Gly - смолу.

Выход: 1,33 г aW: 695 мг (92%). M полученного пептида: 1506.

б). Обработка с помощью HF.

Защищенный пептид обрабатывают безводным HF описанным в примере 1 п.б) образом. Получают 510 мг (87%) сырого декапептида.

в). Гель-фильтраци .

0

Полученный согласно стадии б) сырой декапептидамид описанным в примере 1 п.в) образом очищаетс на колонке с Сефадексом G-25 с помощью 2М уксусной кислоты. Выход: 363 мг (62%)

г).Хроматографи на силикагеле.

Дл дальнейшей очистки пептида служит заполненна силикагелем 60 колонка размером 2x100 см, котора элю- ируетс приготовленной в соотношении 1:1:1:1 смесью из н-бутанола, уксусной кислоты, воды и этилацетата. Содержание фракций контролируетс УФ- спектрально, а также с помощью тонкослойной хроматографии. ..Получают 299 мг (51%) чистого декапептидамида. Т.пл. , «хЗ ц- 19,0 (,1i 0,1 Н CHjCOOH). ,55i ,39; ,62; ,73,

Аминокислотньй анализ: Ser:0,91; Gln:0,97; Pro:1,07; Gly: :2,12; Leu:1,00; Туг:1,03; РЬе:0,94; His:1,05.

В услови х способа, описанного в примере 1, получены-соединени согласно табл.2 и 3 (примеры 6-9).

Проведены биологические испытани производных гонадолиберина, полученных в услови х предлагаемого способа.

Производные гонадолиберина вводились рыбам (стерл дь Acipenser Suthe- mis) путем внутримышечной или подкожной иньекции в дозах 0,1 мкг - 5 мг на 1 кг веса (см. табл.4).

Проведенные испытани показали, что аналоги гонадолиберина в указанном интервале доз способствуют овул ции рыб (стерл дь Acipenser Suthemis) в то врем как известное соединение D-Ala des С1у СпК-этиламид в указанном интервале доз не оказывает воздействие на способность этих рыб к размножению.

Claims

Формулаизобретени

Способ получени производных гонадолиберина общей формулы I: Gep-His- Trp-Ser-Tyr-Xi-X j-Xj-Pro-Gly , где X, - Gly, DPhe, DTrp, DAla, DLeu, трет-бутил;

X, - Leu, Trp, Phe, GIN;

X 3 - Gin, Leu,

отличающийс тем, что, построение пептидной цепи осуществл ют твердофазным методом, исход из глицина и бензгидриламингидрохлорид- ной смолы, с последующим присоедине

нием к полученному глицилполимеру соответствующим образом защищенных аминокислот в последовательности, обус- ловленной пептидом общей формулы I с использованием кapбoдии иднoгo метода или метода активированных эфи- ров, и от полученного при этом пеп- тидил-полимера формулы II

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X,-X ,j-X j-Pro-Gly-W,

Y Y Y где Y - динитрофенил или тозил;

Y - OBZl;

W - бензгидриламин, отщепл ют защитные группы и полимерную подложку.

20

10

Т а б л и ц а 1

25

30

35

0

5

0

5

этиламина и 90% CHClj, промывка 2-кратна 2

7CHClj, промывка 2- кратна 1

8Этанол, промывка 2-кратна 1

9CHjCl, промьшка 2-кратна 1

103 ммол БОК-аминокис- лоты, растворенные в дихлорметане и 3 ммо-

л ДЦК или ДИК, раст-- 60 (позоренные в разному

11CH Clj, промывка 2-кратна 1

12Этанол, промывка 2-кратна 1

При св зывании Gin с помощью метода активного сложного эфира св зываетс через БОК-GIn-CNP; в случае пироглутаминовой кислоты работают без защитной группы.

1396970

6 D-TrpS Phe , Leu -GnRH 168-170 7 D-Ala , Gln« - GnRH 182

8 D-Leu Gin -GnRH 183-185

9 0-трет.бутил-В Зег - 178-179 -Gin -GnRH

IТаблицаЗ

Аминокислотный анализ соединений, соответствующих примерам 9-12

60,871,011,121,04

70,911,900,951,10. 1,07

80,972,011,071,00

91,871,981,051,07

j.Таблица4

Число овулированных рыб, %, под действием соединений по изобретению на стерл дь (Acipenser Suthemis)

10 10 30 30

50 60 90

Таблица2

0,1 0,1 H. 0,69 3.2 уксусна кислота

1,0 0,1 н. 0,55 43

уксусна

кислота 1,0 0,1 н. 0,57 47

уксусна кислота 1,0 0,1 н. 0,63 37

уксусна

кислота

1,000,920,951,021,87

1,001,02 -0,950,92

2,121,01 -0,930,91

1,000,96 -1,030,83

90

80

60

50.