SE469032B - Gonadoliberinderivat och farmaceutisk komposition innehaallande dessa - Google Patents

Description

4> Ö\ \O 10 15 20 25 30 35 CD CN i h.) R.P. Miller, J. Bíol. Chem. 257, 10722-28 (1982): South- African Journal of Science lg, 124 (1982): N. Sherwood et al., Proc. Natl. Acad. Soi. §Q, 2794-2798 (1983)]. Dessa skillna-_ der står att finna i aminosyrorna i 7- och/eller 8-ställning.

Det är även känt från litteraturen att de derivat av gonadoli- berin, som i 6-ställning innehåller vissa D-aminosyror, i stället för glycin visar ökad biologisk aktivitet i jämförelse med nativt gonadoliberin (J. Sandow et al., Control of Ûvola- tion, Buttermorth, London, 1978, sid 49-70).

Det är vidare kädt att utbyte av glydinamidgruppen i 10- ställning mot aminogruppærmed alifatisk kolkedja IN. Fujino et al., J.nmed. Chem. lå, 1144-1147 (1973l] ökar den biologis- ka aktiviteten till en ännu högre nivå.

Föreliggande uppfinning syftar till att framställa nya gonadoli- berínderívat, vilka är effektivt användbara för fortplantnings- processen hos fiskar, fåglar och däggdjur.

Dessutom åstadkommer uppfinningen ytterligare derivat med ökad biologisk aktivitet i förhållande till de naturliga.

Uppfinningen är baserad på insikten att en förändring av aminosyrorna i ställningarna 7 och 8 i gonadoliberinmolekylen till andraaninosyror resp. vissa kombinationer av dessa för- ändringar leder till gonadoliberinanaloger lämpliga för fort- plantning av fiskar, fåglar och däggdjur.

Vidare är uppfinningen baserad på insikten att effektiviteten hos gonadolíberinderivat framställda genom förändring av aminosyrorna i ställningarna 7 och 8 kan ökas genom att införa vissa D-aminosyror i 5-ställning och alkyläminogrupper i 10- ställning i stället för glycin resp. glycinamid.

Nonapeptid-E -alkylamiderna och dekapeptidamiderna med den 1-4 allmänna formeln (I) 1D 15 20 25 30 35 3 i 469 052 Blp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-X2-X3-Pro-X (I) 4 X och X är densamma som 1' X2' 3 4 ovan, och salterna och komplexen därav kan framställas i i vilken betydelsen för X enlighet med uppfinningen såsom följer: a) med användning av metoden med fast-fas-peptidsyntes kopplas på lämpligt sätt skyddade aminosyror i den begärda ordningsföljden till ett fast polymerunderlag med hjälp av karbodiimid eller aktiv ester och, i ett givet fall, den färdiga peptiden spaltas av från underlaget genom acídolys eller amínolys och, om så önskas, aminosyrornas skyddsgrup- per avlägsnas från peptiden samtidigt med, före eller efter det att peptiden spaltas av från polymerunderlaget, eller b) den begärda slutprodukten byggs upp från de lämpliga skyddade aminosyrorna med användning av en adekvat kombina- tion av fragmentkondensering och stegvis syntes beroende på den kemiska karaktären hos de variable aminosyrakomponenterna.

Det är fördelaktigt att använda benshydrylamin- eller Boc- prolinharts som fast underlag.

Det är lämpligt att avlägsna den skyddade peptiden från underlaget genom behandling med vätefluoríd och/eller genom etylammonolys.

I enlighet med variant b) är det föredraget att framställa de nya nona- eller dekapeptidderivaten genom att kondensera en pentapeptidazid med formeln (II) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N (II) 3 med en tetra- eller pentapeptid med den allmänna formeln (III) X -X -X -Pro-X (III) 1 2 3 4 eller genom att kondensera en hexapeptidazid med den allmänna 469 032 4 10 15 2Û 25 30 35 formeln (IV) Blp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-N3 (IV) med en tri- eller tetrapeptid med den allmänna formeln (V) X -X 2 3 (V) -Pro-X4 eller genom att kondensera en heptapeptidazid med den allmänna formeln (VI) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-X2-N (VI) 3 med en di- eller tripeptid med den allmänna formeln (VII) X3-Pro-X4 (VII) i vilka formler X , X 1 2, X3 och X4 är definierade som ovan.

Um så önskas kan den erhållna nona- eller dekapeptidamiden omvandlas till ett syrasalt genom att den reageras med en farmaceutiskt lämplig syra eller, om så önskas, kan den fria basen frigöras från ett syraadditionssalt med en bas och, om kan så önskas, en erhâllen nona- eller dekapeptidamid om- vandlas till ett metallkomplex.

Vidare avser uppfinningen även farmaceutiska kompositioner, vilka som aktiva beståndsdelar innehåller föreningar med den -allmänna formeln (I) och deras salt och komplex.

De farmaceutiska kompositionerna framställs i allmähet genom att blanda åtminstone en förening med formeln (I) eller ett farmaceutiskt godtagbart salt eller komplex därav med bärare och/eller tillsatser, som vanligen används vid framställning av farmaceutiska kompositioner och att de erhållna komposi- tionerna formuleras exempelvis som tabletter, dragêer, kapslar, suppositorier, injicerbara lösningar, nässprayer, etc. 1Ü 15 20 25 30 35 5 I 469 052 ßonadoliberinderivaten med formeln (I) kan användas effektivt i fiskar, fåglar och däggdjur, när de administreras intra- muskulärt eller subkutant i en dos av 0,1 /Jg till 5 mg.

Den största fördelen hos föreningarna enligt uppfinningen är, att de nya gonadoliberinderivaten med den allmänna formeln (I) innehåller aminosyrakombinationer i ställningarna 7 och 8 vilka är karakteristiska för fiskar och fåglar, varigenom de företrädesvis även kan användas för fortplantningsprooes- sen för dessa djurarter.

Ytterligare detaljer om uppfinningen belyses med hjälp av följande icke-begränsande exempel.

I exemplen 1-5 syntetiseras föreningarna med fast-fasteknik [Nerrifield, R.B., J. Am. Chem. Soc. gâ, 2149-2151 (1953l] med användning av klormetylerat polystyrendivinylbensenharts vid peptidalkylamider eller benshydrylaminharts vid peptid- amider. De enskilda aminosyrorna kopplas till hartset som sina N-6!-tert.-butyloxikarbonylderivat (Boo) med användning av dicyklohexylkarbodiimid- (DEC), N,N'-diisopropylkarbodí- imid- (DIE) eller aktivestermetoden. Aminosyrans reaktiva sidokedjegrupper skyddas, om så önskas, med lämpliga skydds- grupper.

Kopplingsreaktionens fullständighet mäts med ninhydrin- testet fkaiser, E., Colescott, R.L., Bossinger, C.D. och Cook, P.I., Anal. Biochem. ší, 595-598 (197ÛX7. Ûm testet är positivt, upprepas kopplingen. Kopplingstiden varierar mellan 1 och 16 h beroende på amínosyran.

Avlägsnande av skyddet för peptiden liksom även peptidens utföres företrädesvis i ett steg med (HF) [5akakíbara, S., Shimonishi, Y., Kishida, Y., Ükada, N. och Sugikara, H., Bull. Soo. Japan gg, 2164-2157 (19e71]. När Nim-dinitrofenyi (DNP)skydus- gruppen används, avlägsnas den från histidins sidokedja spaltning från hartset flytande fluorvätesyra 469 032 6 10 15 20 25 30 35 spaltningen med HF. Det skyddade peptidhartset förs om i dimetylformamid (DNF) innehållande några droppar propylamin.

Efter avlägsnande av lösningsmedlet behandlas peptidhartset med vätefluorid på vanligt sätt. När en förening av peptid- alkylamidtyp skall framställas, frånskiljes peptiden från hartset genom alkylammonolys följd av hydrogenolys och/ eller acídolys_beroende på skyddsgruppernas natur.

Den råa produkt, som erhålles efter spaltningen med HF, underkastas gelfiltrering på en kolonn fylld med Sephadex(š) B-25 med användning av en ättiksyralösning som eluerings- medel.

Ytterligare rening utföres med användning av preparativ HPLC ("High-Performance Liquid Chromatography") och/eller kíselgelkromatografí. Peptidernas renhet undersökes genom aminosyraanalys och genom tunnskiktskromatografí (TLC).

Rf-värdena vid TLC bestäms på Kieselgel-plattor (DC, Alufolien¿ Merck) med användning av följande lösnings- medelsblandningar: 1. Etylacetat/pyridin/ättikayra/vatten 3D:2Ü:6:11 2. Etylacetat/pyridín/ättiksyra/vatten 6Ü:2Ü:B:11 3. Etylacetat/pyridin/ättiksyra/vatten 12D:2D:8:11 4. Etylacetat/pyridin/ättiksyra/vatten 24U:2Û:6:11 5. n-Butanol/ättiksyralvatten/etylacetat 1:1:1:1 s; n-Butannl/ättiksyra/vatkzen 4:1:1 7. i-Propanol/1 N ättiksyra 2:1 8. Etylacetat/pyridin/ättiksyra/vatten 5:5:1:3 9. n-Butanol/ättíksyra/ammoniak (1 ml NH3 : 4 H20)/vatten 1Û. Netyletylketon/ättiksyra/vatten 5:1:1:2 12U:15:2U Exempel 1 Framställníng av D-Phes, Elna-gonadoliberín M: 1243 a) Sxntes 1,25 g (1 mmol) benshydrylaminharts'HCl (0,8 mekv/g) 10 15 20 25 30 35 7 ' 469 032 (Pierce) svälls i CH Cl i 2 h och sedan används nedanstående 2 2 schema för att koppla aminosyraresterna: Steg Reagens och operationer Blandn.-tid (min) 1 EH2El2, tvätta 3 ggr 1 2 33% trifluorättiksyra (TFA) i EH2Cl2 1 3 33% TFA i CH2Cl2 25 4 CH2Cl2, tvätta 3 gg 1 5 EHCl3, tvätta 2 ggr 1 s 10% trietylamin (TEA) 1 cHc13, 2 ggr 2 7 CHCl3, tvätta 2 ggr 1 B etanol, tvätta 2 ggr 1 9 EH2Cl2, tvätta 2 ggr 1 10 Boo-aminosyra (3 mmol) i CH2El2 och, om så önskas, DNF, plus DIE eller oss (3 mmoi) 1 cH2c12* en-variabel 11 CH2Cl2, tvätta 2 ggr 1 f12 etanol, tvätta 2 ggr 1 x Gln kopplas som sitt Boc-Gln-0NP (p-nitrofenyl)-derivat genom aktiv-ester-metod; i fallet ßlp är N-aminogruppen inte skyddad.- Efter varje cykel (efter steg 12) tages ett prov ut för ninhydrintest; om testet är negativt, börjas nästa cykel vid steg 1, och om det är positivt, inledes en koppling till (steg 5-12).

Vid syntesens slut erhålles 2,28 g Glp-His(Tos)-Trp-Ser(0Bzl)- Tyr(0Bzl)~D-Phe-Leu-Gln-Pro-Bly-peptidharts..A U: 1,05 g (55%) (mskyudad peptidz 1577)' b) HF-sgaltning Den skyddade peptiden (2,28 g) behandlas med redestillerad HF (30 ml) i närvaro av anisol (3 ml) och ditiotreítol (100 mg) i 80 min vid 000. HF avlägsnas i vattenfri kvävgas- CN “xo 10 15 20 25 30 35 0352 ström, hartset suspenderas sedan i absolut eter och filtreras.

Den fasta återstoden tvättas med 50% ättiksyra och sedan in- dunstas lösningen i vakuum vid 3700. Det indunstade materia- let underkastas direkt gelfiltrering (se steg o) nedan). 0) Gelfiltrering Den råa pe tiden (erhållen i steg b)) renas på en kolonn av R 0-25 (2,5 X 100 cm) 1 50% ättiksyra vid en flödeshastíghet av 15 ml/h. Separationen följs genom UV- absorption vid 280 nm ooh genom TLE. Fraktioner (300-350 ml) tillvaratages och frystorkas. Utbyte: 690 mg (55%).

Sephadex d) Pregarativ HPLC Ytterligare rening utföres med användning av en omvänd fas-C18-bunden kiselgel LRP-1 (13-24-fmfi (whatman) preparativ HPLC-kolonn (2,5 x 45 cm), vilken ekvilibreras med en lösning av 25% metanol i 30% ättiksyra. Efter ekvilíbrering satsas 230 mg gelfiltrerat material på kolonnen. Elueringen utföres med ett linjär-gradientsystem av metanol-30% ättiksyra (25- 40% metanol) vid en flödeshastighet av 2 ml/min och ett tryck av 3,5 x 105 Pa. Fraktionernas halter mäts vid 200 nm och följs genom TLC. Uppsamling ooh frystorkning av produkten gav 133 mg D-Phes, Elna-GnRH. Den absoluta mängden skall multipliceras med 3 för normalisering till 690 mg gelfiltre- 32%).

B Rf = rat material (399 mg, R; = 0,70; R: = 0,00; Aminosyraanalysz ser 0,03, 010 1,00, Pro 0,00, 01y 1,02, Lau 1,00, Tyr 1,01, Phe 1,02, His 0,99. smältpunkt: 175-170°c; [äjâz = -s0,0° (C = 0,93; RB = 0,33; R? = f F 0,830 0,1, 0,1 N ÅCÛH).

Exemgel 2 Framställning av Trp7, Leus, desGlY1Ü M: 1198 a) Sxntes F" t f " _ _ - - Urs ramstalls Boo Pro harts 1 enlighet med metoden enligt -gonadoliberinetylamid """-WlMAuIvn;~<-«~. - - ,. . 'w 10 15 20 25 30 35 469 032 merrifiela /herrifiela, R.B., J. Am. them. soc. gg, 304 (19s4L7, 2,0 9 (1 mmol) som-pro-harts (0,5 mekv/g) svälls i 2 h och sedan kopplas ifrågavarande aminosyror till hartset den ena efter den andra i enlighet med exempel 1 a).

Efter den sista cykeln erhålles 3,02 g Glp-His(DNP)-Trp- Ser(0Bzl)-Tyr(0Bzl)-Gly-Trp-Leu-Pro-nonapeptidharts.

.A\U:1,02 g.(83%) (Mskyddad peptíd: 1486). b) Skyddborttagning och spaltning av peptiden från hartset Först avlägsnas DNP-skyddsgruppen i enlighet med exempel 2 b). Sedan spaltas den partíellt skyddade peptiden bort från hartset som sin etylamidform Ätoy, D.H. et al.

Biochemistry 13, 323-326 (1974)7. I detta syfte rörs peptid- hartset om med 15 ml kondenserad etylamin vid 000 i 3 h. Överskottet etylamin avlägsnas i kvävgasström. Återstoden tvättas med etanol och DNF och filtreras sedan. Filtratet indunstas i vakuum, återstoden behandlas med eter och det fasta materialet filtreras.

Fullständig skyddborttagning från peptiden utföres genom behandling med vattenfri HF i enlighet med exempel 1 b). utbyte: 710 mg (59%). o) Gelfiltrering Nonapeptidetylamiden leds genom en Sephadexçï) G-25 kolonn i 30% ättiksyra i enlighet med exempel 1 o). utbyte: 490 mg (41%). d) Kiselgelkromatografí Den råa peptiden renas pà en kolonn av Kíeselgel 60, 2 x 100 om (230-400 mesh, Merck) i en 30:20:B:11 blandning av etylacetat, pyridin, ättíksyra, vatten vid en flödes- hastighet av B ml/h. 4 ml fraktioner uppsamlas och elueringen följs genom TLE. Fraktionerna innehållande den rena substan- sen indunstas och frystorkas. Utbyte: 320 mg (25%).

R1 = 0,61; R: = 0,42; R: = 0,75. f 0A MD 10 Aminosyraanalys: Ser 0,89, Blu 0,96, Pro 0,95, Bly 0,97, Lau 1,00, Tyr 1,02, Trp 1,88, His 1,03.

Exemgel 3 1 Framställning av D-Phas, Glnß, desßly Û etylamíd mi 1198 a) Boc-His(0NP)-Trp-0Me må B23 godadolíberin- 10 15 20 25 30 35 f_;\| R) u 469 n 21,12 g (50 mmol) Boc-His(DNP)-DH löses i 100 ml DNF och lösningen kyls till 0°C. Därefter tillsättes 10,32 g (50 mmol) occï och 7,66 9 (so mmol) N-hydraxibenstríazoi under omröring. Blandningen rörs om vid DDC i 10 min och den utfällda dicyklohexylurean filtreras bort. 12,76 g (50 mmol) H-Trp-0Me°HCl löses i 70 ml DNF och lös- ningen kyls till DOG. 693 ml (50 mmol) trietylamin till- sättes och efter omröring i 5 min filtreras den utfällda trietylaminhydrokloriden bort.

De båda lösningarna förenas och rörs om vid DOD över natt.

Sedan filtreras utfälld DEU bort och lösningen indunstas till torrhet. Den oljiga återstoden löses i 500 ml etyl- acetat och skakas med tre 100 ml-portioner iskall 1 M KH504-lösning, fem 100 ml-portioner av en mättad NaHCD3- lösning och slutligen med två 100 ml-portioner av en 10% Naßl-lösning. Den organiska fasen torkas över magnesium- sulfat, filtreras och indunstas till torrhet. Den erhållna oljiga substansen pulvriseras med petroleumeter, filtreras och torkas. Den erhållna kristallína produkten kan omkris- talliseras från etylacetat med petroleumeter.

Utbyte: 27,7 g (89%). smä1tpunkt= 119-122°c; /äjäz = +14,1° (C = 1, DMF). 4 Rf = 0,52. b) H-His(DNP)-Trp-DMe'2HCl N: 522,5 (fri nas); 595 (-2Hc1). 24,9 g (40 mmol) Boc-His(DNP)-DNe-dipeptid löses i 100 ml metanol och 100 ml av en 4 n metanolisk saltsyralösning tillsättes. Blandningen får stå 30 min vid rumstemperatur, medan dipeptidhydrokloriden kristalliseras. Kristallerna filtreras bort, tvättas med eter och torkas. utbyte: 21,91 g (92%). smälfpunkt: 198-2n2°c; flæiâz = U,49° (C = Rs = 0,48, = 0,180 f 1, DNF). 4> O\ QD 10 15 20 25 30 35 12 c) ßlp-His(DNP)-Trp-0Ne N: 634 4,85 g (35,B mmol) L-pyroglutaminsyra, 7,58 g dicyklohexyl- karbodiimid och 5,83 g N-hydroxibenstriazol löses i 100 ml DNF. Blandningen rörs om vid 5-1000 i 10 min, varefter utfälld DDU filtreras bort. 20,84 g (35 mmol) H-His(DNP)-Trp-0Ne'2HCl löses i 100 ml dímetylformamid och 9,72 ml (70 mmol) trietylamin sätts till lösningen. Efter omröring i 5 min filtreras den utfällda trietylaminhydrokloríden bort. De båda lösningarna förenas och rörs om vid rumstemperatur över natt. Sedan sätts 90 ml aceton till blandningen och det utfällda olösliga materialet filtreras bort. Indunstning av lösningen ger ett oljigt material, som rivs med etylacetat, filtreras och torkas.

Det torra kristallina materialet tvättas med tre 25 ml portioner vatten och torkas. Produkten kan omkristalliseras genom upplösning i varmt etylacetat och kylning.

Utbyte: 18,42 g (B3,1%). Smältpunkt: 148-15100; flß äs = +5,2° (c = 1, DMF).

R: = 0:53, R: = 0,39. d) Glp-His-Trp-0Ne N: 455 15,84 g (25 mmol) Glp-His(DNP)-Trp-0Ne skyddad tripeptid löses i en blandning av 100 ml DNF och 40 ml vatten. 4 ml merkaptoetanol tillsättes och lösningens pH justeras till 8 med trietylamin. Lösningen får stå 30 min vid rumstemperatur och indunstas till torrhet i vakuum. Det oljiga materíålet rivs med eter, filtreras och torkas. Den erhållna produkten löses i en liten mängd metanol och omkristalliseras genom tillsats av eter; De utfällda kristallerna filtreras bort och torkas. Utbyte: 10,92 g (93,6%). Smältpunkt: 228-23200; ßáíäz = +4,o4° (c = 0,42, DNF).

Rš = man. ,_¿\ f: 10 15 20 25 30 35 13 469 032 e) Glp-His-Trp-NZHS M: 466,5 9,33 g (20 mmol) metanol. 20 ml 98% hydrazinhydrat sätts till lösningen.

Reaktionsblandningen rörs om 3 h vid 4006 och sedan vid rumstemperatur över natt. Det utfällda materialet filtreras Blp-His-Trp-0Ne tripeptid löses i 250 ml sedan bort, tvättas med kall metanol och torkas. utbyte: 7,50 g (e1,2%). smä1tpunkt= 155-155°c; jfflšz = -22,3 (5 = 0,5, 0mF) Rf = 0,50, RF = 0,14. f) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-0Me NI 717 7,0 g (15 mmol) Glp-His-Trp-NZHS erhållen i steg e) löses i 80 ml DNF. Lösningen kyls till 008 och 7,5 ml (45 mmol) av en En Hßl-lösning tillsättes under omröring. Sedan sättes 1,035 g (15 mmol) NaN02 droppvis till blandningen som en koncentrerad vattenlösning och blandingen rörs om vid ÜÜÜ í ytterligare 15 min. En lösning av 4,78 g (15 mmol) H-5er- Tyr-0Ne°HEl i 15 ml DNF sätts till reaktionsblandningen. pH justeras till"neutralt med 6,25 ml (45 mmol) trietylamin och blandningen rörs om vid D-óoß över natt. Nästa dag indunstas den till torrhet i vakuum och den oljiga produk- ten rivs med eter. 12,1 g (10Û%) av den eftersträvade föreningen innehållande en liten mängd förorening erhålles. Denna produkt kan om- vandlas till hydrazid utan rening och den erhållna hydrazi- den kan lätt kristalliseras.

Fysíkaliska egenskaper av ett kontrollprov omkristalliserat från metanol:-” smä1tpunkt= 100-150°c; fixjšz = R1 = 0,50, R2 = 0,25. f F -3,a0° (Q = 1, 0mF); g) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-NZH3 M: 717 12 g rå pulvriserad Glp-His-Trp-Ser-Tyr-ÜMe pentapeptíd- 4659 10 15 20 25 30 35 0252 14 ester upplöses i 200 ml metanol och 10 ml 98% hydrazinhydrat tillsättes. Blandningen rör om 3 h vid 4000 och rörs sedan över natt vid rumstemperatur, varpå de utfällda kristaller- na filtreras bort och torkas i en exsickator över koncent- rerad svavelsyra. Det torra kristallína materialet löses i 250 ml av en 0,5 n saltsyralösning. Lösningens pH justeras till 8 med mättad natriumkarbonatlösning. Efter stående vid DOD i 2 h filtreras de utfällda kristallerna, tvättas med iskallt vatten och torkas. Utbyte: 5,12 g (5B,9%, beräknat för de båda stegen). Smältpunkt: 205-ZDBOC; [uJš2 = -z1,s1° (C = 1, DNF).

Rl = 0,39, = Ûglia- Hydrazinkväve: funnet: 3,79%, 3,75% beräknat: 3,91%. h) Z-Gln-Pro-NHEt N: 405 3,242 g prolinetylamid (erhållen från 22,8 mmol Z-Pro-NHEt genom hydrogenolys) upplöses i 70 ml tetrahydrofuran (THF) och sedan sätts 5,6 g (20 mmol) Z-Gln-DH och 1,034 g N-hydroxibenstríazol till lösningen. Reaktionsblandningen kyls till DOD och en lösning av 5,34 g (25,9 mmol) dicyklo- hexylkarbodiimid i THF droppas till den omrörda reaktions- blandningen. Dmröringen fortsättes i 5 h vid DOD och sedan i 20 h vid rumstemperatur. Fällningen filtreras, tvättas med THF och sedan índunstas filtratet i vakuum och återstoden löses i kloroform. Lösningen skakas med tre 35 ml-portioner 40H och vatten (1:5), två 20 ml-portioner vatten, tre 35 ml-portioner av 0,1 n HCl-lösning och slutligen av en blandning av NH två 20 ml-portioner vatten. Den organiska fasen torkas över vattenfritt natriumsulfat, filtreras, tvättas med kloroform och índunstas. Den erhållna oljiga återstoden löses i en blandning av 35 ml THF och 50 ml etylacetat och filtreras sedan. Lösningen índunstas och återstoden rivs med eter. Den erhållna fasta produkten filtreras, tvättas med eter och torkas i vakuum. Utbyte: 7,69 g (95%).

R1 = 0,73, R: = 0,45. f 10 15 20 25 30 35 469 032 15 i) Z-Leu-Gln-Pro-NHEt N: 516,6 4,5 g (11 mmol) Z-Gln-Pro-NHEt löses i 30 ml isättika och 55 ml 4 n vätebromid i isättika sätts till lösningen.

Reaktionsblandningen hålls 90 min vid rumstemperatur och sedan sätts 250 ml vattenfri eter till blandningen och denna hålls vid rumstemperatur i 60 min. Üvanfasen dekan- teras av, 100 ml eter sätts till återstoden och efter 15 min filtrerar man och tvättar med eter. Den fasta återstoden torkas i vakuum över fosforpentoxid och natriumhydroxid.

Utbyte: 4,9 g (hygroskopisk). 3,8 g (11 mmol) av den erhållna dipeptidetylamid'HBr suspen- deras i 150 ml kloroform och 7 ml tríetylamin sätts till suspensionen. 6,4 g karbobensoxileucylpentaklorfenyl :ter i 65 ml kloroform tillsättes. Reaktionsblandningen re 5 om över natt vid rumstemperatur. Nästa dag tvättas den x,d 1 n saltsyra, mättad natríumklorid, 2 n ammoniumhydroxid och upprepade gånger med mättad natriumkloridlösning. Kloroform- fasen torkas över vattenfritt natriumsulfat och indunstas i vakuum. Återstoden rivs med eter, filtreras, tvättas med eter och torkas i vakuum. Utbyte: 4,6 g (81%). j) H-Leu-Gln-Pro-NHEt'HBr M: 465,5 Den råa produkt som framställs i steg i) löses i 10 ml is- ättika och rörs om i 60 min vid rumstemperatur och sedan späds lösningen med 100 ml vattenfri eter. Fällníngen filtreras och torkas i vakuum. Utbyte: 3,54 g (76%).

R; = 0,1, R: = 0,ss, R: = 0,13, R: = 0,77.

Aminosyraanalys: Glu 1,05, Pr0'T,19, Leu 1,00. k) Boc-D-Phe-Leu-ßln-Pro-NHEt må 531,7 2,33 g (5 mmol) H-Leu-Gln-Pro-NHEt'HBr upplöses i 5 ml DNF och kyls till 006 och sedan sätts 0,7 ml (5 mmol) 469 032 10 15 20 25 30 35 16 trietylamin och 2,57 g (5 mmol) tert.-butyloxikarbonyl-D- fenylalanylpentaklorfenylester i 10 ml DNF till lösningen. pH justeras till ett värde mellan 7 och 8 och sedan rörs reaktionsblandningen om i 48 h vid rumstemperatur. Under tiden justeras pH-värdet då och då till neutralt med tri- etylamin. Efter indunstning av reaktionsblandningen rivs 0 den kvarvarande substansen med eter, filtreras därefter och torkas. Den erhållna råa produkten underkastas avlägsnande av skyddet utan vidare rening. Utbyte: 2,81 g (89%). 1) H-D-Phe-Leu-Bln-Pro-NHEt'TFA N: 545,5. 1,26 g (2 mmol) Boo-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt löses i 10 ml trifluorättiksyra och rörs om i 20 min vid rumstemperatur.

Trifluorättiksyran avdunstas i vakuum och återstoden rivs med eter, filtreras och torkas. Återstoden underkastas kromatografi på en kiselgelkolonn med en 4:1:1 blandning av n-butarïl, ättiksyra och vatten. De önskade fraktionerna uppsamlas och indunstas i vakuum. Återstoden löses i några ml vatten och frystorkas sedan. utbyte: san mg.(sa%).

R2 = 0,25, RB = 0,35. f f Q 20 0 smä1tpunkt= 142 c; fizín = -se (C = 0,1, DNF). m) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt N: 1199 286 mg (0,4 mmol) av pentapeptidhydraziden Glp-His-Trp-Ser- Tyr-N H framställd i steg g) löses i 10 ml dimetylformamid. 2 3 Lösningen kyls till -10OC, varefter 0,27 ml 6 n saltsyra och sedan en koncentrerad vattenlösning av 30,2 mg natriumnitrít tillsätts droppvis under omröring. Efter 5 min tillsätts en lösning av trifluoracetatsaltet av 258 mg (0,4 mmol) av 4 tetrapeptiden H-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt framställt i 1 ml dimetylformamid med 0,27 ml trietylamín vid -1000. 0m nöd- = vändigt justeras reaktionsblandningen till ett neutralt pH- värde med trietylamin, varefter den rörs om i 1 h vid en temperatur av -SDB, 1 h vid DOD och 12 h vid rumstemperatur. 10 15 20 25 30 35 (IQ 46902 17 Dimetylformamider avlägsnas i vakuum, den oljiga återstoden löses í 5 ml 0,2 n ätti syra och lösningen underkastas kroma- tografi på en SephadexÖ-”G-ZS-kolonn (2 x 95 cm) med 0,2 n ättiksyra. De önskade fraktionerna uppsamlas och frystorkas. utbyte: 296 mg (62%).

H1 = 0,39, R2 = 0,13, R: f F Aminosyraanalys: Ser 0,89, Glu 1,98, Pro 0,97, Leu 1,00, Tyr 1,03, Phe 0,99, His 1,01, Trp 0,91. = 0,48, RB f = 8,14; Exempel 4 Framställning av Trp7, Elna, desGly1Û-gonadoliberinetylamid N: 1220 a) Boc-Gln-Pro-NHEt N: 370 1,0 g (7 mmol) prolinetylamíd löses i 15 ml dimetylformamíd och pH-värdet justeras till 8 med trietylamin, varefter 3,2 g (8,4 mmol) tert.-butyloxikarbonylglutaminyl-p-nitrofenylester i 15 ml dimetylformamid sätts till lösningen. Reaktionsbland- ningen rörs om i 48 h vid rumstemperatur medan pH-värdet justeras då och då till 8 med trietylamin. Efter indunstníng av reaktíonsblandningen löses den oljiga återstoden i vatten, tvättas med eter och den frànskilda vattenfasen indunstas i vakuum och torkas. Utbyte: 1,93 g (74,5%).

RF = Ü,7B. b) H-Gln-Pro-NHEt°TFA ~ N: 270 (fri bas) N: 367 (TFA-salt) 1,9 g (7,2 mmol) Boo-Gln-Pro-NHEt löses i 10 ml trifluor- ättíksyra och rörs om i 20 min vid rumstemperatur. Lösningen filtreras och índunstas i vakuum, återstoden rivs med eter, torkas i vakuum. Utbyte: 1,52 g (58%). 1 7 Q 10 R = 0,45, = 0345, = 0,25, = f Hygroskopísk substans; Ãxjšu = -34,5° (C = 1, megH)_ 0,300 10 15 20 25 30 35 18 c) Boc-Trp-Gln-Pro-NHEt N: 557 500 mg (1,B5 mmol) H-Gln-Pro-NHEt löses i 10 ml dimetyl- formamid, pH-värdet justeras till 8 med trietylamín och sedan tillsättes 608 mg (2 mmol) tert.-butyloXíkarbonyl- tryptofan i 10 ml dimetylformamid och 620 fl (4 mmol) N,N'- díisopropylkarbodiimid. Reaktionsblandningen rörs om i 48 h vid rumstemperatur och indunstas sedan i vakuum. Återstoden löses i etylacetat och späds med eter. Den utfällda Boc-Trp- Gln-Pro-NHEt filtreras, Utbyte: 740 mg (72%). tvättas med eter och torkas. 2 3 Rf = 0,75, = 0,380 0) H-TID-Üln-PIO-NHEt°TFÅ M2 455,3 (fri bas) N: 554 (TFA-Salt) 700 mg (1,25 mmol) Boc-Trp-Gln-Pro-NHEt löses i 15 ml av Cl 2 2 Sedan indunstas lösningen i en 1:1 blandning av trífluorättiksyra och CH och rörs om i 20 min vid rumstemperatur. vakuum och återstoden rivs med eter. Den fasta återstoden filtreras och torkas. Den sålunda erhållna råa produkten om ca 500 mg renas genom kromatografi på en kiselgelkolonn i en 47:20:6:11 blandning av etylacetat, pyridim, ättíksyra och vatten. De önskade fraktionerna uppsamlas, indunstas till torrhet i vakuum och återstoden rivs med eter. Sålunda erhålles 360 mg (52%) av ett vitt pulver. 1 2 = 0,18.

R = 0,46; R f f 0 Smältpunktt 110-123 C; [aJšÛ = -4,a° (c = 0,1, 0,1 n Hcl). e) Boc-Bly-Trp-Gln-Pro-NHEt N! 513,7. 350 mg (0,7S mmol) H-Trp-Gln-Pro-NHEt löses i dimetylform- amid och kopplas med 104 mg (0,8 mmol) Boc-Bly i enlighet med steg c) i exempel 7. Sålunda erhålles 375 mg (81%) av en kristallin substans. 3 5 Rf = 0,88, RF = 0,82, R: = g,51_ 10 15 20 25 30 35 19 f) H-Bly-Trp-Gln-Pro-NHEt'TFA N: 509,8 375 mg (0,5 mmol) Boc-Gly-Trp-Bln-Pro-NHEt avskyddas och renas i enlighet med steg d) i exempel 7. Sålunda erhålles 285 mg (76,E%) av ett vitt pulver.

R: = 0,00, R: = 0,10, R: = 0,07, R: = 0,20. g) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt M: 1216,4 288 mg (0,4 mmol) av pentapeptidhydraziden Glp-His-Trp-Ser- Tyr-NZH3 kopplas med 243,8 mg (0,4 mmol) H-Bly-Trp-0ln-Pro- NHEt°TFA erhållen i enlighet med steg m) i exempel 6. Sålunda erhålles 252,9 mg (52%) av en ren substans.

H1 = 0,25, = 0,320 f f Aminosyraanalys: Ser 0,87, Blu 2,02, Pro 0,91, Bly 1,00, Tyr 1,12, His 1,05, Trp 1,80.

Exempel 5 Framställning av injektioner för intramuskulär, subkutan eller intravenös administrering a) Gonadoliberinderívatet med formeln (I) löses i destillerat vatten, en fysiologisk koksaltlösning eller en buffrad vatten- lösning i en koncentration av 1-10 mg/ml. Lösningen filtreras till sterila, små portioner innehållande 50-500 g av den aktiva beståndsdelen, vilka fylls i ampuller och frystorkas, varefter ampullerna förseglas. Ampullernas innehåll av den aktiva beståndsdelen löses färskt före behandlingen genom tillsättning av 1-10 ml destillerat vatten och en volym motsvarande den önskade dosen administreras. b) 20-500lpg/ml av ett gonadoliberinderivat med formeln (I) löses i en vattenlösning innehållande 0,9% NaCl och 0,9% bensylalkohol. Portionerna innehållande 20-500lpg/ml aktiv beståndsdel fylls i ampuller, vilka därefter förseglas. De erhållna lösningarna kan injiceras direkt.

Claims (3)

469 052 'w P A T E N T K R A V

1. “Gonadoliberinderivat med den allmänna formeln (I) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-X2-X3-Pro-X4 (I) k ä n n e t e c k n a t av att betecknar Gly eller D-Phe, 1 X2 är Trp, Leu eller Phe, X3 betecknar Gln eller Leu och X4 är Gly-NH2 eller Cl_4-alkylaminogrupp med det villkoret att om X1 betecknar en annan grupp än glycyl och X2 är en tryptofylgrupp så kan X3 inte vara leucyl samt med det ytterligare villkoret att om X1 be- tecknar glycyl kan X4 endast vara etylaminogrupp.

2. Gonadoliberinderivat enligt krav 1, k ä n n e - t e c k n a t av att det utgöres av en förening vald ur gruppen bestående av e Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly-NH2 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Pro-EA Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-EA Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-EA och de terapeutiskt användbara salterna och komplexen därav.

3. Farmaceutisk komposition, k ä n n e t e c k n a d av att den som aktiv beståndsdel innehåller åtminstone en före- ning med den allmänna formeln (I) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-X2-X3-Pro-X4 (I) i vilken X1, X2, X3 och X4 har den i krav 1 givna definitio- nen, eller ett farmaceutiskt godtagbart salt eller komplex därav tillsammans med en bärare eller ett utspädningsmedel.