AT394727B

AT394727B - Verfahren zur herstellung von neuen gonadoliberin-derivaten

Info

Publication number: AT394727B
Application number: AT0404284A
Authority: AT
Inventors: Tamas Dipl Ing Gulyas; Aniko Dr Horvath; Gyoergy Dr Keri; Karoly Dr Nikolics; Balazs Dr Szoeke; Istvan Dr Teplan
Original assignee: Koezponti Valto Hitelbank
Priority date: 1983-12-23
Filing date: 1984-12-20
Publication date: 1992-06-10
Also published as: SE469032B; DK625084A; FI845051A0; JPS60226898A; ES8607992A1; CZ1021084A3; ZA849985B; NO166449B; ES538988A0; LU85710A1; FI82255B; SE8406554D0; NO845193L; DK625084D0; FI845051L; FI82255C; IL73902A; CH664968A5; FR2557114B1; DD255164A5

Description

AT 394 727 B

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Gonadoliberin-Derivaten sowie deren pharmazeutisch verwendbaren Salzen und Metallkomplexen. Die neuen, durch Nonapeptid-C ^-alkylamide bzw. Dekapeptidamide gebildeten Gonadoliberin-Derivate entsprechen der allgmeinen Formel (I)

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Xi-X2-X3-Pro-X4 , (I) worin X i für eine Glycylgruppe oder eine natürliche oder synthetische D-Aminosäuregruppe, X2 für die L-Phenylalanyl- oder L-Tryptophylgruppe oder eine L-Aminosäuregruppe mit 1 - 4 Kohlenstoffatomen in der Seitenkette, X3 für eine als Seitenkette eine Alkylgruppe mit 1 - 4 Kohlenstoffatomen aufweisende L-Aminosäuregruppe oder für Glp, X4 für die Glycylamidgruppe oder eine Alkylamidgruppe mit 1 - 4 Kohlenstoffatomen steht mit der Einschränkung, daß - falls X^ eine andere Bedeutung hat als Glycyl und X2 für die Tryptophylgruppe steht - X3 eine andere Bedeutung als Leucyl hat.

Die in der Formel verwendeten Symbole entsprechen der in der Peptidchemie üblichen Nomenklatur (s. z. B. J. Biol. Chem. 241, 527 /1966/).

Das Gonadoliberin (es wird in der Fachliteratur auch als gonadotropin releasing hormon Gn-RH, luteinisierendes und Follikel stimulierendes Hormon, releasing hormon, LH/FSH-RH bezeichnet) und seine bekannten Derivate haben die allgemeine Eigenschaft, zur Freisetzung der luteinisierenden und Follikel stimulierenden Hormone (LH und FSH) fähig zu sein.

Zu Beginn der Achtziger-Jahre wurde bekannt, daß sich die Struktur des Gonadoliberins mancher Fische von der Struktur des Gonadoliberins der Säugetiere unterscheidet (J. A. King und R. P. Miliar, J. Biol. Chem. 257. 10722 - 28 /1982/; South-Afncan Journal of Science 2&, 124 /1982/; N. Sherwood et al., Proc. Natl. Acad Sei. 80. 2794 - 2798 /1983/). Dieser Unterschied wird von der an 7. beziehungsweise 8. Stelle befindlichen Aminosäure verursacht.

Aus der Literatur ist ferner bekannt, daß die statt des Glycins in 6-Stellung gewisse D-Aminosäuren enthaltenden Gonadoliberin-Derivate eine stärkere Wirkung haben als das Gonadoliberin selbst (J. Sandow et al.: Control of Ovulation, Butterworth, London 1978, S. 49 - 70.

Bekannt ist auch, daß durch Austausch der Glycinamidgruppe in 10-Stellung gegen Amidgruppen mit aliphatischen Ketten die biologische Wirksamkeit des Gonadoliberins weiter erhöht werden kann (M. Fujino et al., J. Med. Chem. 1£, 1144 - 1147 /1973/).

Den neuen Verbindungen der obenangeführten Formel I ähnliche Verbindungen sind aus der EP-A 2 26640 sowie der DE-A 2 211 101 bekanntgeworden, wobei in den Verbindungen gemäß der EP-A 226 640 in Stellung 8 eine Arginylgruppe enthalten ist, und jene gemäß DE-A 2 211 101 in Stellung 8 eine L-Lysyl-, L-Qrmityl- oder Arginylgruppe aufweisen.

Die neuen Gonadoliberin-Derivate können, wie überraschend gefunden wurde, in der Vermehrung von Fischen wirksam eingesetzt werden. Diese Wirkungsweise dieser Verbindungen ist bisher nicht bekannt geworden. Das unten näher beschriebene erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Erkenntnis, daß durch Austausch der in 7- und 8-Stellung befindlichen Aminosäuren des Gonadoliberins beziehungsweise durch gewisse Kombinationen dieses Austauschs Gonadoliberin-Derivate hergestellt werden können, die speziell zur Vermehrung von Fischen besonders geeignet sind. Es wurde weiters gefunden, daß die diesbezügliche biologische Wirksamkeit der durch Austausch der in 7- und 8-Stellung befindlichen Aminosäuren des Gonadoliberins erhältlichen Gonadoliberin-Derivate durch Austausch der Glycingruppe in 6-Stellung gegen gewisse D-Aminosäuren beziehungsweise der Glycinamidgruppe in 10-Stellung gegen Alkylamidgruppen noch erhöht werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der eingangs beschriebenen neuen Nonapeptid-C j^-alkyl- amide beziehungsweise Dekapeptidamide der allgemeinen Formel (I) sowie von ihren pharmazeutisch verwendbaren Salzen und Komplexen ist dadurch gekennzeichnet, daß man von einer gegebenenfalls an einem festen Träger fixierten Verbindung der allgemeinen Formel (Glp-His-Trp-Ser-Tyr-XrX2-X3-Pro-X4) Z (Π), in der X j, X2, X3 und X4 die in Formel I angegebene Bedeutung haben und Z für eine oder mehrere Schutz- -2-

AT 394 727 B gruppen steht, die Schutzgruppe(n), gegebenenfalls während oder nach Ablösung von dem Träger, abspaltet und das Endprodukt gewünschtenfalls in pharmazeutisch verwendbare Säureadditionssalze oder Komplexe überführt. Zu den Verbindungen der allgemeinen Formel 00 kann man beispielsweise gelangen, indem man a) unter Anwendung der Methode der Peptidsynthese in der festen Phase die entsprechend geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge durch Koppeln mit Carbodiimid oder über einen aktiven Ester an einem festen Träger fixiert und gewünschtenfalls das Endprodukt durch sauers oder basisches Abspalten von dem Träger äblöst und gewünschtenfalls die Schutzgruppe vor, während oder nach dem Abspalten vom Träger ebenfalls abspaltet, oder b) abhängig vom chemischen Charakter der variablen Aminosäureteile in der herzustellenden Verbindung das Endprodukt aus in gewünschtem Maße geschützten Aminosäuren durch entsprechende Kombinationen von schrittweise Kondensation und Fragmentkondensation aufbaut. Bevorzugt werden Ausgangsprodukte der allgemeinen Formel Π eingesetzt, in welchen Xj für De-Phe oder Gly X2 für Leu, Trp oder Phe X3 für Gin oder Leu und X4 für Gly-NH2 oder -NH-C^ stehen. Als fester Träger kann vorteilhaft Benzhydrylaminharz oder BOC-Prolinharz eingesetzt werden. Das Schutzgruppen enthaltende Produkt kann günstigerweise durch Abspalten mit Fluorwasserstoff und/oder durch Äthylammonolyse vom Trägeiharz abgespalten werden. Von den unter b) genannten Kombinationen sind besonders die folgenden bevorzugt durchführbar: das Pentapeptidazid der Formel (Π)

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N-j (Π) wird mit einem Tetra- oder Pentapeptid der allgemeinen Formel (ΙΠ)

XrX2-X3-Pio-X4 m kondensiert; oder ein Hexapeptidazid der allgemeinen Formel (IV)

Glp-His-Tip-Ser-Tyr-XrN3 (IV) wird mit einem Tri- oder Tetrapeptid der allgemeinen Formel (V) X2-X3-Pro-X4 (V) kondensiert; oder ein Heptapeptidazid der allgemeinen Formel (VI)

Glp-His-Tip-Ser-Tyr-Xj-Xj-Ng wird mit einem Di- oder Tripeptid der allgemeinen Formel (VH) -3- (VI)

AT 394 727 B (VH) X3-P10-X4 kondensiert

In den Formeln (ΕΠ) - (VIT) ist die Beudeutung von Xj, X2, X3 und X4 die gleiche wie oben angegeben.

Das gebildete Nona- beziehungsweise Dekapeptidamid kann gewünschtenfalls durch Umsetzen mit einer physiologisch verträglichen Säure zu einem Säureadditionssalz umgesetzt werden. Aus dem Säureadditionssalz kann gewünschtenfalls durch Behandeln mit einer Base die Verbindung freigesetzt und gewünschtenfalls das Nona- beziehungsweise Dekapeptidamid zu einem Metallkomplex umgesetzt werden.

Die neuen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sowie ihre Säureadditionssalze oder Metallkomplexe können mit üblichen Träg»’- und/oder Hilfsstoffen zu Tabletten, Dragees, Kapseln, Suppositorien, Injektionslösungen, Nasensprays usw. formuliert werden.

Die Gonadoliberin-Derivate der allgemeinen Formel (I) werden den Fischen durch intramusculare oder subcutane Injektion appliziert und sind in einem Dosisbereich von 0,1 μg - 5 mg wirksam.

Der Hauptvorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die damit erhältlichen Gonadoliberin-Derivate - unterschiedlich zu den bekannten Derivaten - in 7- und 8-Stellung für Fische charakteristische Aminosäurekombinationen enthalten und deshalb zur Vermehrung gerade dieser Tiergattung erfolgreich eingesetzt werden können.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele, welche auch die konkrete Herstellung der Ausgangsprodukte beinhalten, näher erläutert Gemäß den Beispielen 1-5 wurden die Verbindungen mit den allgemein üblichen Methoden der Peptidsynthese in der festen Phase (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc. 85. 2149 - 2151 /1963/) hergestellt Abhängend von der Struktur der herzustellenden Verbindung ging man im Falle eines Peptidalkylamides von chlormethylierten Polystyrol-Divinylbenzol-Harzen, im Falle von Peptidsäureamiden von Benzhydrylaminharzen aus.

Die einzelnen Aminosäuren wurden mit Hilfe von Diisopropylcarbodiimid (DIQ beziehungsweise Dicyclo-hexylcarbodiimid (DCC) in Form ihrer mit t-Butoxycarbonyl (BOC) geschützten Derivate beziehungsweise mit der Methode des aktiven Esters schrittweise an das Harz gekoppelt

Der Verlauf der Kupplungsreaktion wurde mit dem Ninhydrin-Test (Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I., Anal. Biochem. 24.595 - 598 /1970/) verfolgt Bei Anzeige freier Aminogruppen wurde die Acylierung wiederholt. Die Zeitdauer der Kupplungsreaktionen beträgt abhängend von den Aminosäuren 1 bis 16 Stunden.

Das Abspalten der Schutzgruppen und das Abspalten des Peptids von dem Harz kann mit flüssigem, wasserfreiem Fluorwasserstoff in einem Schritt erfolgen (Sakakibara S., Shimonishi Y., Kishida Y., Okada M., Sugikara H., Bull Soc. Japan 4Q, 2164-2167 /1967/). Bei der Verwendung von N*m-Dinitrophenyl wird die Entfernung der Schutzgruppe noch vor der mit HF vorgenommenen Abspaltung durchgeführt. Das geschützte Peptidharz wird in propylaminhaltigem Dimethylformamid verrührt und nach Entfernung des Lösungsmittels in der üblichen Weise mit HF behandelt. Ist die hergestellte Verbindung ein Peptidalkylamid, so wird das Peptid durch Alkylammonolyse von dem Harz abgetrennt und dann - abhängend von dem Charakter der Schutzgruppen -katalytisch hydriert und/oder sauer hydrolysiert.

Das rohe Produkt wird nach dem mit HF vorgenommenen Abtrennen durch Gelfiltration gereinigt. Dazu dient eine Säule aus Sephadex G25, eluiert wird mit essigsauren Lösungen.

Zur weiteren Reinigung werden HPLC-Säulen (Hochdruckflüssigkeitschromatographie) und/oder Silikagel-chromatographie herangezogen. Die Reinheit der Peptide wird durch Aminosäureanalyse und mittels Dünnschichtchromatographie untersucht. Die Rj- Werte der Dünnschichtchromatographie wurden an Kieselgel (DC Alufolie, Merck) mit den folgenden Lösungsmittelgemischen ermittelt: 30 20 6 : 11 60 20 6 : 11 120 20 6 : 11 240 20 6 : 11 1 1 1 : 1 4 1 1 2 1 5 5 1 : 3 6 1 1 : 2 125 15 20 1. Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 2. Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 3. Äthylacetat/P^din/Essigsäure/Wasser 4. Äthylacetat/Pyridin/EssigsäurevWasser 5. n-Butanol/Essigsäure/Wasser/Äthylacetat 6. n-Butanol/Essigsäure/Wasser 7. i-Propanol/lM Essigsäure 8. Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 9. n-Butanol/Essigsäure/Ammoniak (conc. Ammoniak u. H2O = 1:4)/Wasser 10. Methyläthylketon/Essigsäure/Wasser -4-

AT 394 727 B

Beispiel 1 D-Phe*\ Gln^-Gonadoliberin M: 1243 a) Synthese 1,25 g (1 mMol) Benzhydrylaminhydrochlorid-Harz [0,8 mM/g, Pierce] werden 2 Stunden lang in Dichlormethan gequellt Bei der Acylierung mit den Aminosäuren wird jeweils der folgende Zyklus wiederholt:

Schritt Reagens, Arbeitsgang Rührdauer, min 1 CH2CI2, Waschen 3x 1 2 33 % Trifluoressigsäure im Gemisch mit 67 % CH2CI2, Waschen 3x 1 3 w 25 4 CH2CI2, Waschen 3x 1 5 CHCl-j, Waschen 2x 1 6 Gemisch aus 10 % Triäthylamin und 90 % CHCI3, Waschen 2x 2 7 CHCI3, Waschen 2x 1 8 Äthanol, Waschen 2x 1 9 CH2CI2, Waschen 2x 1 10 3 mMol BOC-minosäure, in Dichlormethan gelöst*), und 3 mMol DCC oder DIC, in CH2CI2 gelöst 60 (verschieden) 11 CH2CI2 Waschen 2x 1 12 Äthanol, Waschen 2x 1 +) Bei Kopplung von Gin wird mit der Methode des aktiven Esters über BOC-Gln-ONP gekoppelt; im Falle von Pyroglutaminsäure wurde ohne Schutzgruppe gearbeitet

Nach dem letzten Schritt beträgt das Gewicht des Glp-His(Tos)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly-Peptidharzes 2,28 g. AW: 1,05 g (66 %) ^gesch. Peptid’ ^17)

b) Abspalten mit HF

Zu dem Harz werden 3 ml Anisol und 100 mg Dithiothreit gegeben, dann werden in dm Gemisch 30 ml HF kondensiert. Das Gemisch wird bei 0 °C eine Stunde lang gerührt Anschließend wird der Fluorwasserstoff im Stickstoffstrom entfernt, der Rückstand wird in absolutem Äther suspendiert und dann nitriert Der feste Rückstand wird in 50 %iger Essigsäure gewaschen. Das Filtrat wird bei 37 °C eingedampft. Der Rückstand wurde unmittelbar der Gelchromatographie zugeführt (s. folgenden Punkt). c) Gelchromatographie

Die gemäß dem vorhergehenden Punkt erhaltene Substanz wurde an einer Säule aus Sephadex G25 (2,5 x 100 cm) mit 50 %iger Essigsäure als Elutionsflüssigkeit gereinigt. Die Elution wurde mittels der Absorption von UV-Licht der Wellenlänge 280 nm sowie mittels Dünnschichtchromatographie verfolgt. Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt 15 ml/h. Die Fraktionen zwischen 300 ml und 350 ml werden gesammelt und lyophilisiert Gewicht: 690 mg (55 %). dl Präparative Hochdruckflüssigkeitschromatographie

Es wurde eine präparative HPLC-Säule der Maße 2,5 x 45 cm (Cjg-Silicagel LRP-1,13-24 μτη; Whatman) verwendet Diese wurde mit einem Gemisch aus 25 % Methanol und 75 % 30 %iger Essigsäure äquilibriert Nach Einstellen des Gleichgewichtes werden 230 mg der gelchromatisch gereinigten Substanz, gelöst in dem gleichen Lösungsmittelgemisch, auf die Säule aufgebracht Eluiert wurde mit einem Methanol/Essigsäure-Gradienten, dessen Zusammensetzung sich zwischen 25 % Methanol/75 % 30 %ige Essigsäure und 40 % -5-

AT 394 727 B

Methanol/60 % 30 %ige Essigsäure linear ändert.

Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt 2 ml/min, der Druck 3,5.10-* Pa. Die Fraktionen werden mit UV-Licht der Wellenlänge 280 nm delektiert, ihr Gehalt wird dünnschichtchromatographisch kontrolliert Das Gewicht des reinen Endproduktes D-Phe*\ Gln8-GnRH beträgt nach dem Lyophilisieren 133 mg. Das entspricht, auf die Gesamtmenge der Substanz bezogen, 399 mg (32 %) an gereinigtem Endprodukt R1f=0,76 R5f = 0,68 R6f = 0,33 R7f = 0,93 R8f=0,83

Aminosäureanalyse:

Gly: 1,02 Pro: 0,95 Leu: 1,00 Phe: 1,02

Tyr: 1,01 Ser: 0,93 His: 0,99 Glu: 1,96

Schmp.: 175 -178 °C; [a]22D = -68° (c = 0,1,0,1 M AcOH)

Beispiel 2

Trp7, Gln8-Gonadoliberin M: 1226 a) Synttess

Ausgehend von 2,5 g (1 mM) Benzhydrylaminhydrochloridharz [0,4 mÄqu./g] wird auf die im Beispiel 1 unter Punkt a) beschriebene Weise das Peptidharz Glp-His(DNP)Trp-Ser(OBzl)-Tyr-Gly-Tip-Gln-Pro-Gly-Haiz hergestellL

Das Gewicht des Peptidharzes beträgt 3,62 g AW: 1,12 g (76%) ^gesch. Peptid’ bl Entfernung der Schutzgruppen und Abspalten des Peptides vom Harz Abspalten der Dinitrophenvl-Schutzgruppe (DNP)

Das Peptidharz wird in dem Gemisch aus 20 ml Dimethylformamid und 1 ml Propylamin bei Raumtemperatur eine Stunde lang gerührt Anschließend wird das Harz abfiltriert und mit Dichlormethan, dann mit Äthanol gewaschen.

SpaltunÄmit.HF

Nach der Entfernung der Dinitrophenyl-Schutzgruppe werden auf die im Beispiel 1 unter Punkt b) beschriebene Weise das Peptid vom Harz beziehungsweise die Schutzgruppen vom Peptid abgespalten. Nach Abschluß der beiden Schritte verbleiben 0,8 g (65 %) Substanz. cl Gelchromatographie

Man arbeitet auf die im Beispiel 1 unter Punkt c) angegebene Weise. Das Gewicht der gesammelten und lyophilisierten Fraktionen beträgt 520 mg (42 %). d) Präparative Hochdruckflüssigkeitschromatographie

Man arbeitet auf die im Beispiel 1 unter Punkt d) angegebene Weise mit dem Unterschied, daß die Äquilibrierung mit einem Gemisch aus 18 % Methanol und 82 % 30 %iger Essigsäure vorgenommen wird. Die gelchromatographisch gereinigte Substanz wird mit einem Methanol/Essigsäure-Gemisch, dessen Zusammensetzung sich zwischen 18 % Methanol/82 % 30 %ige Essigsäure und 35 % Methanol/65 % 30 %ige Essigsäure linear ändert, von der Säule eluiert. Die Fraktionierung sowie die sonstigen Bedingungen stimmen mit denen in Beispiel ld) überein. Das Gewicht des lyophilisierten Endproduktes beträgt 380 mg (31 %). R1f=0,66 R5f = 0,57 R8f = 0,78

Aminosäureanalyse:

Glu: 1,93 Gly: 2,04 Pro: 1,00 Tyr: 0,98

Ser. 0,93 Trp: 1,86 His: 1,03 -6-

AT 394 727 B

Beispiel 3

Tip7, Leu**, des GlyN^^-Gonadoliberin-äthylamid (Μ = 1198) a) Synthese

Als erster Schritt der Synthese wird BOC-Pro in literaturbekannter Weise (Memfield, R. B., J. Am. Chem. Soc. §£, 304 /1964/) an ein chlormethyliertes Polystyrolharz gekoppelt. 2 g des auf diese Weise erhaltenen BOC-Pro-Harzes [0,5 mÄqui./g] werden zwei Stunden lang in Dichlormethan gequellt und dann werden auf die unter Punlct a) in Beispiel 1 beschriebene Weise schrittweise die entsprechenden geschützten Aminosäuren an das Harz gekoppelt Nach dem letzten Zyklus erhält man 3,02 g des Peptidharzes Glp-His(DNP)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)<}ly-Trp-Leu-Pro. AW: 1,02 g (83%) ^gesch. Peptid: ^**Φ b) Entfernung der Schutzgruppen und Absoalten des Peptids vom Hatz

Zuerst wird gemäß Punkt b) des Beispiels 2 die Dinitrophenyl-Schutzgruppe von dem Histidin abgetrennt. Anschließend wird das Peptid in Form des Äthylamids vom Harz abgespalten (Coy, D. H. et al., Biochemistry 13.323 - 326 /1974/). Zu diesem Zweck werden auf das geschützte Peptidharz 15 ml Äthylamin aufkondensiert und das Gemisch wird bei 0 °C 3 Stunden lang gerührt. Der Überschuß des Amins wird mittels Stickstoff ausgetrieben. Dann wird mit Methanol anschließend mit Dimethylformamid gewaschen. Die DMF-Lösung wird eingedampft und das als Eindampfrückstand erhaltene öl mit Äther verrieben. Der Niederschlag wird abfiltriert

Die auf diese Weise erhaltene Festsubstanz wird gemäß Punkt b) des Beispiels 1 zwecks Entfernung der Schutzgruppen mit gasförmigem Fluorwasserstoff behandelt Man erhält 710 mg (59 %) Nonapeptidäthylamid. cl Gelchromatographie

Man arbeitet auf die unter Punkt c) des Beispiels 1 beschriebene Weise mit einer Säule aus Sephadex G25 und verwendet als Elutionsmittel 30 %ige Essigsäure. Das Gewicht der gesammelten und lyophilisierten Fraktionen beträgt 490 mg (41 %).

Das rohe Peptid wird an einer Säule aus Kieselgel 60 (230 - 400 mesh, Merck) der Maße 2 x 100 cm weiter gereinigt. Eluiert wird mit einem Gemisch aus Äthylacetat, Pyridin, Essigsäure und Wasser im Verhältnis 30 : 20 : 6: 11. Die Durchflußgeschwindigkeit beträgt 8 ml/h. Fraktionen zu je 4 ml werden aufgefangen und die Elution wird dünnschichtchromatographisch verfolgt.

Die dem Gonadoliberinäthylamid Trp7, Leu**, des GlyN^1^ entsprechenden Fraktionen werden auf Grund der Aminosäureanalyse bestimmt. Man erhält 320 mg (26 %) lyophilisiertes Material. R1f = 0,61 R2f=0,42 R**f = 0 75

Aminosäureanalyse:

Glu: 0,96 Gly: 0,97 Pro: 0,95 Leu: 1,00

Sen 0,89 Tyr: 1,02 Tip: 1,88 His: 1,03

Beispiel 4

Phe7, Gln**-Gonadoliberin M = 1187 a) Synthese

1,25 g (1 mMol) Benzhydrylaminhydrochlorid-Harz (0,8 mÄqu./g) läßt man zwei Stunden lang in Dichlormethan quellen. Daraus werden auf die im Beispiel la beschriebene Weise 2,9 g des Peptidharzes Glp-His(Tos)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-Gly-Phe-Gln-Pro-Gly-HarzhergestellL AW: 1,27 g (83 %), Mgesch Peptid = 1521 b) Absoalten der Schutzgruppen

Das geschützte Peptid wird auf die im Beispiel lb) beschriebene Weise mit wasserfreiem HF behandelt 980 mg (82 %) ungeschütztes Peptid werden erhalten. -7-

AT 394 727 B c) Gelfiltration

Das rohe Decapeptidamid wird auf die im Beispiel lc) beschriebene Weise an einer mit Sephadex G-25 gefüllten Säule mit 2 M Essigsäure gereinigt Ausbeute 576 mg (49 %). dl Präparative HPL-Chromatopraphie

Man arbeitet auf die im Beispiel ld) beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß das Gel LRP-1 mit einer 10 % Methanol und 20 % Essigsäure enthaltenden wäßrigen Lösung äquilibriert wird. Eluiert wird mit einem linearen Gradienten, der in 20 %iger Essigsäure von 10 % aus ansteigend bis zu 25 % Methanol enthält (2 x 150 ml). Dann wird die Elution mit einem zwischen 25 % und 40 % ansteigend Methanol enthaltenden linearen Gradienten (2 x 150 ml) fortgesetzt Die das reine Peptid enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und eingedampfL Ausbeute: 448 mg (38 %) R!f = 0,12 R5f=0,7 R6f = 0,24 R7f = 0,87

Aminosäureanalyse:

Ser 0,87, Glu 2,05, Pro 1,03, Gly 2,13,

Tyr 0,92, Phe 1,00, His 0,95, Trp0,81.

Schmp.: 182 °C

Beyspiel5

Phe7, Leu^-Gonadoliberin M = 1172 a) Synthese 0,62 g (0,5 mMol) Benzhydrylaminhydrochlorid-Harz (0,8 mÄqu./g) läßt man zwei Stunden lang in Dichlormethan quellen. Dann wird auf die im Beispiel la) beschriebene Weise das Peptidharz Glp-His(Tos)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-Gly-Phe-Leu-Pro-Gly-Harz heigesteUt Ausbeute: 133 g

AW: 695 mg (92 %), Mgesch Peptid = 1506 bl Behandeln mit HF

Das geschützte Peptid wird auf die im Beispiel lb) beschriebene Weise mit wasserfreiem HF behandelt Man erhält 510 mg (87 %) rohes Decapeptid. c) Gelfiltration

Das gemäß Schritt b) erhaltene rohe Decapeptidamid wird auf die im Beispiel lc) beschriebene Weise an einer Säule aus Sephadex G-25 mit 2 M Essigsäure gereinigt, Ausbeute 363 mg (62 %). dl Chromatographie an Silikaeel

Zur weiteren Reinigung des Peptids dient eine mit Kieselgel 60 gefüllte Säule der Maße 2 x 100 cm, die mit einem im Verhältnis 1:1:1:1 bereiteten Gemisch aus n-Butanol, Essigsäure, Wasser und Äthylacetat eluiert wird. Der Gehalt der Fraktionen wird UV-spektroskopisch sowie mittels Dünnschichtchromatographie kontrolliert. Man erhält 299 mg (51 %) des reinen Decapeptidamids. R*f = 0,55 R2f = 0,39 R5f = 0,62 R7f=0,73

Aminosäureanalyse:

Ser 0,91, Glu 0,97, Pro 1,07, Gly 2,12,

Leu 1,00, Tyr 1,03, Phe 0,94, His 1,05

Beispiel 6 D-Phe^, Gln^, desGlyNH^'Gonadoliberin-äthylamid (M = 1198) al BOC-HisfDNPVTm-OMe (M = 622,52) 21,12 g (50 mMol) BOC-His(DNP)-OH werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0 °C gekühlt und unter Rühren mit 10,32 g (50 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid und 7,66 g (50 mMol) N-Hydroxybenztriazol versetzt. Das Gemisch wird bei 0 °C 10 Minuten lang gerührt, dann wird das -8-

AT 394 727 B ausgeschiedene Dicyclohexylkafbamid abfiltriert 12,74 g (50 mMol) H-Trp-OMe.HCl werden in 70 ml Dimethylformamid gelöst, und die Lösung wird auf 0 °C gekühlt. Man gibt 6,94 ml (50 mMol) Triäthylamin zu der Lösung und filtriert nach 5minütigem Rühren das ausgeschiedene Triäthylamin-hydrochlorid ab.

Die beiden Lösungen werden vereinigt und über Nacht bei 0 °C gerührt. Anderntags wird das ausgeschiedene DCU abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Das zurückbleibende Öl wird in 500 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird zuerst mit 3 x 100 ml eiskalter 1 M KHSO^-Lösung, dann mit 5 x 100 ml gesättigter

Natriumhydrogencarbonatlösung und schließlich mit 2 x 100 ml 10 %iger NaCl-Lösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und nach dem Filtrieren zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit Petroläther verrieben, filtriert und dann getrocknet. Die erhaltene kristalline Substanz wurde in Äthylacetat gelöst und mit Petroläther ausgefällt.

Ausbeute: 27,70 g (89 %)

Schmp.: 119 -122 °C

[a]22D = +14,1° (c = 1, in Dimethylformamid) R4f = 0,62 R5f = 0,41 b)H-His(DNPVTrp-OMe.2HCl M = 522,49 (freie Base) 595,41 (.2HC1) 24,9 g (40 mMol) des Dipeptids BOC-His(DNP)-Trp-OMe werden in 100 ml Methanol gelöst. Zu der Lösung werden 100 ml 4n methanolische Salzsäure gegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 30 Minuten lang stehen gelassen. Das in dieser Zeit auskristallisierende Dipeptidesterhydrochlorid wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und dann getrocknet

Ausbeute: 21,91 g (92 %)

Schmp.: 198 - 202 °C

[a]22j-) = 0,49° (c = 1, in Dimethylformamid) R3f = 0,46 R4f = 0,18 cl Gto-HisTONPlTm-OMe M = 633,60 4,85 g (36,8 mMol) L-Pyroglutaminsäure, 7,58 g Dicyclohexylcarbodiimid und 5,63 g N-Hydroxy-benztriazol werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst. Das Gemisch wird bei 5 -10 °C 10 Minuten lang gerührt und dann das ausgefallene DCU abfiltriert 20,84 g (35 mMol) H-His(DNP)-Trp-OMe.2HCl werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst und zu der Lösung 9,72 ml (70 mMol) Triäthylamin gegeben. Nach 5minütigem Rühren wird das ausgeschiedene Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert Die beiden Lösungen werden vereinigt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt Anderntags wird das Gemisch mit 90 ml Aceton versetzt, die sich ausscheidende unlösliche Substanz wird abfiltriert. Das Filtrat wird eingedampft. Das zurückbleibende Öl wird mit Äthylacetat verrieben und dann getrocknet. Die trockene kristalline Substanz wird, mit 3 x 25 ml Wasser gewaschen und erneut getrocknet. Die Substanz kann durch kochendes Lösen in Äthylacetat und Abkühlen der Lösung umkristallisiert werden.

Ausbeute: 18,42 g (83,1 %)

Schmp.: 148 -151 °C

[a]23D=+5,2° (c = 1, in Dimethylformamid) R3f=0,53 R4f = 038 -9-

AT 394 727 B dl Glp-His-Trp-OMe M = 466,50 15,84 g des geschützten Tripeptids Glp-His(DNP)-Trp-OMe werden in einem Gemisch aus 100 ml Dimethylformamid und 40 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 4 ml Mercaptoäthanol versetzt und dann mit Triäthylamin auf pH 8 gestellt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 30 Minuten lang stehengelassen und dann im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit Äther veirieben, filtriert und getrocknet. Die erhaltene Substanz wird in wenig Methanol gelöst und durch Zusatz von Äther ausgefällt. Die Kristalle werden abfiltriert und getrocknet

Ausbeute 10,92 g (93,6 %)

Schmp.: 228 - 232 °C

[a]^jj = +4,04° (c = 0,42, in Dimethylformamid) R2f = 0,30 el Glp-His-Trp-N^Ho M = 466,51 9,33 g (20 mMol) des Tripeptids Glp-His-Trp-OMe werden in 250 ml Methanol gelöst und zu der Lösung 20 ml 98 %iges Hydrazinhydrat gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden lang bei 40 °C, dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anderntags wird die ausgeschiedene Substanz abfiltriert, mit kaltem Methanol gewaschen und dann getrocknet

Ausbeute: 7,58 g (81,2 %)

Schmp.: 166 - 169 °C

[cx]22£) = -22,3° (c = 0,5, in Dimethylformamid) R1f=0,50 R2f = 0,14 f) Glp-His-Trp-Ser-Tvr-OMe M = 716,8 7,0 g (15 mMol) Glp-His-Trp-^^ (Produkt des Schrittes e) werden in 60 ml Dimethylformamid gelösL Die Lösung wird auf 0 °C gekühlt und unter Rühren mit 7,5 ml (45 mMol) 6n HCl versetzt Dann tropft man langsam die gesättigte wäßrige Lösung von 1,035 g (15 mMol) NaN02 zu dem Gemisch und rührt weitere 15 Minuten bei 0 °C. Dann versetzt man das Gemisch mit der Lösung von 4,78 g (15 mMol) H-Ser-Tyr-OMe.HCl in 15 ml Dimethylformamid und stellt den pH-Wert mit 6,25 ml (45 mMol) Triäthylamin auf neutral. Das Gemisch wird über Nacht bei 0 - 4 °C gerührt, anderntags im Vakuum zur Trockne eingedampft und der ölige Rückstand mit Äther verrieben.

Das Gewicht des pulverförmigen Produktes beträgt 12,1 g (100 %). Das Chromatogramm zeigt Flecken von zwei geringfügigen Verunreinigungen, jedoch kann das Produkt ohne zwischenzeitliche Reinigung zum Hydrazid umgesetzt werden, welches gut kristallisiert. Physikalische Daten der zur Kontrolle aus Methanol umkristallisierten Substanz:

Schmp.: 188 - 190 °C

[a]22jj = -3,48° (c = 1, Dimethylformamid) R1f=0,58 R2f=0,26

M = 716,8 12 g des rohen, pulverisierten Pentapeptidesters Glp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe werden in 200 ml Methanol gelöst und zu der Lösung 10 ml 98 %iges Hydrazinhydrat gegeben. Das Gemisch wird bei 40 °C drei Stunden lang und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, die ausgefallenen Kristalle werden abfiltriert und im Exsikkator -10-

AT 394 727 B über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Die getrocknete kristalline Substanz wird in 250 ml 0,5n HCl gelöst, die Lösung mit konzentrierter Sodalösung auf pH 8 gestellt und bei 0 °C zwei Stunden lang stehen gelassen. Die ausgefallenen Kristalle weiden abfiltriert, mit eiskaltem Wasser gewaschen und dann getrocknet.

Ausbeute: 6,12 g (auf beide Schritte bezogen 56,9 %)

Schmp.: 205 - 206 °C

[a]22D = -21,51° (c = 1, Dimethylformamid) R1f=0,39 R2f=0,14

Hydrazinstickstoff berechnet: 3,91 % gefunden: 3,79 %, 3,76 % hlZ-Oln-Pm-NHEt M = 405,4 3,242 g Prolinäthylamid (hergestellt aus 22,8 mMol Z-Pro-NHEt durch Hydrieren) werden in 70 ml Tetrahydrofuran gelöst und zu der Lösung 5,60 g (20 mMol) Z-Gln-OH und 1,034 g N-Hydroxybenztriazol gegeben. Das Reaktionsgemisch wird auf dem Eisbad gekühlt und unter Rühren mit der Lösung von 5,34 g (25,9 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 50 ml Tetrahydrofuran gegeben. Das Reaktionsgemisch wird auf dem Eisbad 5 Stunden lang, dann bei Raumtemperatur noch 20 Stunden lang gerührt, filtriert und das Filter mit Tetrahydrofuran nachgewaschen. Das Filtrat wird im Vakuum eingedampft und Rückstand in Chloroform gelöst. Die Lösung wird mit 3 x 35 ml mit der fünffachen Menge Wassers verdünntem Ammoniak, dann mit 2 x 20 ml Wasser, anschließend mit 3 x 35 ml Salzsäure und schließlich erneut mit 2 x 20 ml Wasser gewaschen. Dann wird die organische Phase über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filter wird mit Chloroform nachgewaschen. Dann wird die Lösung zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wird in einem Gemisch aus 35 ml Tetrahydrofuran und 50 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung filtriert Nach Abdampfen des Lösungsmittels bleibt ein Öl zurück, das mit 100 ml Äther kristallisiert wird. Die feste Substanz wird auf dem Filter mit Äther gewaschen und dann im Vakuum getrocknet Man erhält 7,68 g (95 %) Produkt.

R^f ss 0,45 R^-O.TS Γ> Z-Leu-Gln-Pro-NHEt M = 518,57 4,5 g (11 mMol) des geschützten Dipeptidamids Z-Gln-Pro-NHEt werden in 30 ml Eisessig gelöst. Zu der Lösung werden 55 ml 4n eisessigsaure Bromwasserstoffsäure gegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 1 1/2 Stunden lang stehen gelassen, dann mit 250 ml Äther versetzt und wieder eine Stunde stehen gelassen. Die über dem Niederschlag stehende Flüssigkeit wird dekantiert, der Rückstand mit 100 ml Äther aufgeschlämmt, nach 15 Minuten abfiltriert und mit reichlich Äther gewaschen. Die hygroskopische feste Substanz wird im Vakuum über Phosphorpentoxyd und Natriumhydroxyd getrocknet. Ausbeute: 4,9 g (hygroskopisch). 3,8 g (11 mMol) des erhaltenen Dipeptidäthylamidhydrobromids werden in 150 ml Chloroform suspendiert. Zu der Suspension werden 7,0 ml Triäthylamin gegeben. Dann wird das Reaktionsgemisch mit der Lösung von 6,4 g Z-Leu-pentachlorphenylester in 65 ml Chloroform versetzt und über Nacht gerührt Anderntags wird das Reaktionsgemisch mit in Salzsäure, gesättigter Kochsalzlösung, 2n Ammoniak und schließlich wieder mit gesättigter Kochsalzlösung extrahiert Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann im Vakuum eingedampft Der Rückstand wird mit Äther verrieben, die Festsubstanz abfiltriert, mit Äther gewaschen und dann im Vakuum getrocknet Man erhält 4,6 g (81 %) Rohprodukt j~> H-Leu-Gln-Pro-NHEtHBr M= 465,5

Von dem auf die unter Punkt i) beschriebene Weise hergestellten Tripeptid Z-Leu-Gln-Pro-NHEt wird die Schutzgruppe ohne zwischenzeitliche Reinigung entfernt. Zu diesem Zweck wird das Produkt in 10 ml eisessigsaurer Bromwasserstofflösung gelöst Die Lösung wird bei Raumtemperatur eine Stunde lang gerührt und dann das Produkt durch Zusatz von 100 ml wasserfreiem Äther ausgefällt. Die Substanz wird abfiltriert und im Exsikkator getrocknet. Das Produkt ist ein gelbes hygroskopisches Pulver.

Ausbeute: 3,54 g (76 %) -11-

AT 394 727 B R8f = 0,42 R6f = 0,l3 R5f = 0,55 R1f = 0,l k'i BOT-D-Phe-Leu-flln-Pm-NHEt M = 631,74 2,33 g (5 mMol) des Tripeptidhydrochlorids H-Leu-Gln-Pro-NHELHBr werden in 5 ml Dimethylformamid gelöst Die Lösung wird auf 0 °C gekühlt und zuerst mit 0,70 ml (0,5 mMol) Triäthylamin und dann mit der Lösung von 2,57 ml (5 mMol) BOC-D-Phe-pentachlorphenylester in 10 ml Dimethylformamid versetzt. Der pH-Wert der Lösung wird mit Trimethylamin auf einen Wert zwischen 7 und 8 gestellt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt. Während dieser Zeit wird der pH-Wert mit Triäthylamin auf dem angegebenen Wert gehalten. Dann wird die Lösung im Vakuum eingedampft, der Rückstand wird in 100 ml Chloroform gelöst und die Lösung mit 10 x 10 ml 0,1 M Ammoniak gewaschen. Dann wird die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet, abfiltriert und eingedampft. Der ölige Rückstand kann durch Behandeln mit Äther in ein Pulver überführt werden. Das getrocknete Rohprodukt wiegt 2,81 g (89 %). Die Schutzgruppe wird ohne weitere Reinigung entfernt 1) H-D-Phe-Leii-01n-Pm-NHEt.TFA M = 645,65 1,26 g (2 mMol) des Tetrapeptids BOC-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt werden in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst Die Lösung wird bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gerührt. Die Trifluoressigsäure wird dann im Vakuum schnell entfernt. Der Rückstand wird an einer Silikagelsäule mit einem im Verhältnis 4:1:1 bereiteten Gemisch aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser Chromatographien Die Produktfraktionen werden gesammelt und im Vakuum eingedampft Der Rückstand wird in wenig Wasser gelöst und dann lyophilisiert

Ausbeute: 880 mg (68 %) R2f = 0,25 R6f=0,35

Schmp.: 142 °C; [a]2^ = -66° (c = 0,1, Dimethylformamid). ml Glp-His-Trp-Ser-Tvr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt M = 1199 286 g (0,4 mMol) des gemäß Schritt g hergestellten Pentapeptidhydrazids Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N^ werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf -10 °C gekühlt und unter Rühren mit 0,27 ml 6n Salzsäure und dann mit der gesättigten wäßrigen Lösung von 30,2 mg NaN(>2 versetzt Nach 5 Minuten gibt man die mit einem Gemisch aus 1 ml Dimethylformamid und 0,27 ml Triäthylamin bereitete und auf -10 °C gekühlte Lösung von 258 mg (0,4 mMol) H-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEtTFA zu dem Gemisch. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde lang bei -5 °C, dann eine weitere Stunde lang bei 0 °C gerührt, wobei der pH-Wert notwendigenfalls durch Zusatz von Triäthylamin auf einem neutralen Wert gehalten wird. Schließlich läßt man die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen und dampft das Reaktionsgemisch im Vakuum ein.

Das nach dem Verdampfen erhaltene Öl wird in 5 ml 0,2n Essigsäure gelöst und an einer Säule aus Sephadex G25 (2 x 95 cm) mit 0,2n Essigsäure Chromatographien. Die entsprechenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert

Ausbeute: 298 mg (62 %) R1f=0,74 R5f=0,65 R6f = 0,37 R8f = 0,80

Aminosäurenanalyse

Ser 0,89, Pro 0,97, Leu 1,00, Phe 0,99,

Glu 1,98, His 1,01, Tyr 1,03, Trp 0,91.

Beispiel 7

Tip2, Gin8, desGly ^-Gonadoliberinäthylamid M = 1220 alBOC-Gln-Pm-NHEt M = 370 1,0 g (7 mMol) Prolinäthalamid wird in 15 ml Dimethylformamid gelöst Der pH-Wert der Lösung wird mit -12-

AT 394 727 B

Triäthylamin auf 8 eingestellt. Zu der Lösung wird die Lösung von 3,2 g (8,4 mMol) tert-Butoxycarbonyl-glutaminyl-p-nitrophenylester in 15 ml Dimethylformamid gegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt. Während dieser Zeit wird der pH-Wert mit Triäthylamin bei 8 gehalten. Der nach dem Eindampfen des Reaktionsgemisches verbleibende ölige Rückstand wird in Wasser gelöst, die Lösung mit Äther gewaschen und die wäßrige Phase im Vakuum eingedampft.

Ausbeute 1,93 g (74,5 %) R3^ = 0,76. bi H-01n-Pro-NHEt.TFA M = 270 (freie Base) M = 367 (TFA-Salz) 1,9 g (7,2 mMol) BOC-Gln-Pro-NHEt werden in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gerührt und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther verrieben, abfiltriert und im Vakuum getrocknet

Ausbeute: 1,52 g (58 %). R1f = 0,45 R7f = 0,45 R9f=0,25 R10f = 0,30

Die Substanz ist hygroskopisch.

[a]20D = -34,8° (c = 1, Methanol). c) BOC-Trp-Gln-Pm-NHEt M = 557 500 mg (1,85 mMol) H-Gln-Pro-NHEt werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst Der pH-Wert wird mit Triäthylamin auf 8 eingestellt. Zu dem Reaktionsgemisch gibt man 608 g (2 mMol) tert.-Butoxycarbonyl-tryptophan in 10 ml Dimethylformamid und 620 |il (4 mMol) N,N’-Diisopropylcarbodiimid. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt und dann im Vakuum eingedampft Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst und mit Äther ausgefällt. Das ausgefallene Produkt wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und dann getrocknet.

Ausbeute: 740 mg (72 %) R2f = 0,75 R3f = 0,38 dl H-Tro-Gln-Pro-NHEtTFA M = 456,5 (freie Base) M = 554 (TFA-Salz) 700 mg (1,25 mMol) BOC-Trp-Gln-Pro-NHEt werden in 15 ml eines im Verhältnis 1 : 1 bereiteten Gemisches aus Trifluoressigsäure und Dichlormethan gelöst Die Lösung wird bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gerührt und anschließend im Vakuum eingedampft Der Rückstand wird mit Äther verrieben, abfiltriert und getrocknet. Das Rohprodukt (500 mg) wird an einer Silicagelsäule mit einem im Verhältnis 47 : 20 : 6 : 11 bereiteten Gemisch aus Äthylacetat, Pyridin, Essigsäure und Wasser chromatographisch gereinigt. Die Produktfraktionen werden gesammelt und im Vakuum zur Trockne eingedampft Der Rückstand wird mit Äther verrieben. Man erhält 360 mg (52 %) eines weißen Pulvers. R1f = 0,46 R2f=0,18

Schmp. 119 - 123 °C; [a]20D = -4,8° (c = 0,1,0,ln HCl) e> BOC-Glv-Trp-Gln-Pm-NHEt M = 613,7 350 mg (0,76 mMol) H-Trp-Gln-Pro-NHEt werden in Dimethylformamid gelöst und mit 104 mg (0,8 mMol) BOC-Gly auf die im Schritt c) beschriebene Weise gekoppelt. Man erhält 375 mg (81 %) einer kristallinen Substanz. R3f = 0,88 R5f = 0,82 R6f = 0,61 -13-

Claims

AT 394 727 B fl H-Glv-Tm-Gln-Pro-NHEt.TFA M = 609,6 375 mg (0,6 mMol) BOC-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt werden auf die im Schritt d) beschriebene Weise von der Schutzgruppe befreit und gereinigt. Man erhält 285 mg (76,6 %) eines weißen Pulvers. R2f = 0,08 R3f=0,16 R5f = 0,67 R6f = 0,28 gl Glp-His-Trp-Ser-Tvr-Glv-Tm-Gln-nro-NHEt M = 1216,4 286 g (0,4 mMol) des Pentapeptidhydrazids Glp-His-Trp-Ser-Tyr-^Hg werden mit 243,8 mg (0,4 mMol) des gemäß Schritt f) des Beispiels 7 erhaltenen H-Gly-Trp-Gln-Pro-NHELTFA gekoppelt. Man erhält 252,9 mg (52 %) Reinsubstanz. R1f=0^6 R5f = 0,32 Aminosäurenanalyse: Ser 0,87, Glu 2,02, Pro 0,91, Gly 1,00, Tyr 1,12, His 1,05, Trp 1,80 Vorschrift zur Bereitung von Injektionen für intramusculare. subcutane oder intravenöse Applikation der erfindungsgemäß erhältlichen Wiikstoffe: a) Das Gonadoliberin-Derivat der allgemeinen Formel (I) wird in einer Konzentration von 1-10 mg/ml in destilliertem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder gepufferter wäßriger Lösung gelöst Die Lösung wird sterilfiltriert und dann in 50 - 500 pg Wirkstoff enthaltenden Volumina in Ampullen gefüllt, lyophilisiert, und dann werden die Ampullen verschlossen. Vor der Anwendung wird die in der Ampulle enthaltene Substanz in 1 -10 ml destilliertem Wasser aufgelöst und von der Lösung wird eine der notwendigen Dosis entsprechende Menge den Fischen injiziert b) Aus dem Gonadoliberin-Derivat der allgemeinen Formel (I) bereitet man mit einer 0,9 % NaCl und 0,9 % Benzylalkohol enthaltenden wäßrigen Lösung eine Lösung der Konzentration von 20 - 500 pg/ml und füllt diese in Ampullen. Die Ampullen werden verschlossen. Die auf diese Weise hergestellten Präparate sind zur unmittelbaren Applikation geeignet. PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von neuen Gonadoliberin-Derivaten der allgemeinen Formel (I) ,0) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-X2-X3-Pro-X4 worin Xj für eine Glycylgruppe oder eine natürliche oder synthetische D-Aminosäuregruppe, X2 für die L-Phenylalanyl- oder L-Tryptophylgruppe oder eine L-Aminosäuregruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in der Seitenkette, X3 für eine als Seitenkette eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen aufweisende L-Aminosäuregruppe oder für Gin, X4 für die Glycylamidgruppe oder eine Alkylamidgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen steht mit der Einschränkung, daß - falls Xj eine andere Bedeutung hat als Glycyl und X2 für die Tryptophylgruppe steht - X3 eine andere Bedeutung als Leucyl hat, und ihren pharmazeutisch verwendbaren Säureadditionssalzen -14- AT 394 727 B und Komplexen, dadurch gekennzeichnet, daß man von einer gegebenenfalls an einem festen Träger fixierten Verbindung der allgmeinen Formel (Glp-His-Tip.Ser-Tyr-XrX2-X3-Pro-X4) Z (Π) in der Xj, X2, X3 und X4 die in Formel I angegebene Bedeutung haben und Z für eine oder mehrere Schutzgruppen steht, die Schutzgruppe(n), gegebenenfalls während oder nach Ablösung von dem Träger, abspaltet und das Endprodukt gewünschtenfalls in pharmazeutisch verwendbare Säureadditionssalze oder Komplexe überführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Ausgangsprodukte der allgemeinen Formel II einsetzt, in denen Xj für D-Phe oder Gly X2 für Leu, Trp oder Phe X3 für Gin oder Leu und X4 für Gly-NH2 oder-NH-C2-H5 stehen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als festen Träger Benzhydryl-aminharz oder BOC-Prolinharz einsetzt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die an einen festen Träger fixierte Verbindung II durch Behandeln mit Fluorwasserstoff und/oder durch Äthylammonolyse ablöst. -15-