Verfahren zur Herstellung eines antidiuretisch wirksamen Polypeptids Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines antidiuretisch wirksamen Polypeptids der Formel I
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die in Stellung 1 ssMerkaptopropionsäure (Mep) und Stellung 8 D-Arginin enthält.
Für die Behandlung des Diabetes insipidus zeigen sich solche Präparate am geeignetsten, die eine hohe und spezifische antidiuretische Aktivität aufweisen. Stoffe mit solchen Eigenschaften sind bekannt und werden mit anderen strukturellen Modifikationen des Vasopressinmoleküls hergestellt. Die vorteilhaftesten Eigenschaften der bisher bekannten Stoffe dieses Typs zeigt das 1 Desamino-Phe2-Arg8 vasopressin (siehe die Tabelle).
Es wurde nun festgestellt, dass ein erfindungsgemäss hergestelltes Analogon des Vasopressins eine hohe und auch spezifisch antidiuretische Wirkung hat.
Das erfindungsgemässe Verfahren besteht darin, dass das Azid des ss-Benzylmerkaptopropionyl-L-tyrosyl-L- phenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S benzyl-L-cysteins mit dem Amid des L-Prolyl-NG-tosyl-D-arginyl-glycins zu einem geschützten Derivat des Oktapeptids der Formel II
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worin R1 eine Benzylgruppe und R2 eine p-Toluol- gem Ammoniak abgespalten werden und die gewonnene sulfonylgruppe bedeuten, kondensiert wird, die Schutz- reduzierte Form des Polypeptids der Formel III gruppen durch Einwirkung von Alkalimetallen in flüssi- 20
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durch Oxydation, vorzugsweise in wässriger Lösung bei einem pH-Wert von 6,5-7,0 mit Kaliumferricyanid, in das antidiuretisch aktive Polypeptid der Formel I übergeführt wird.
Das geschützte Derivat des Oktapeptids der Formel II kann auch durch andere allgemein bei der Herstellung von Polypeptiden verwendeten Methoden gewonnen werden. Man kann dieses durch stufenweisen Aufbau sowohl vom Amino- wie auch vom Caboxylende, sowie durch Kupplung vorher dargestellter Polypeptide, welche die Teilaminosäurefolge des Polypeptids gemäss Formel 1 enthalten, herstellen.
Für den vorübergehenden Schutz der Sulfhydrylgruppen, der Aminogruppen und der Guanidingruppe können Substituenten verwendet werden, wie sie in der synthetischen Chemie der Polypeptide angewendet werden. Die Schutzgruppen können wiederum durch die allgemein bei der Synthese der Polypeptiden benützten Methoden beseitigt werden, und zwar entweder in einer Reaktionsstufe oder auch in mehreren Stufen. Die Oxydation der reduzierten Form des Polypeptids der Formel III zum cyclischen Polypeptid der Formel I kann auch nach an sich bekannten Methoden durchgeführt werden, und zwar sowohl in wässriger Lösung als auch in Gemischen von mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln.
Man kann zum Beispiel in folgender Weise vorgehen: Durch Kondensation des Chlorids der ss-Benzylmerkapto- propionsäure mit dem Methylester des Tyrosins wird der bisher nicht beschriebene Methylester des p-Benzyl- merkaptopropionyl-Gtyrosins bereitet, der durch Ein wirkung von Hydrazinhydrat in das bisher nicht beschriebene Hydrazid und Azid übergeführt wird und mit dem Methylester des L-Phenylalanins gekuppelt wird.
Das entstandene Derivat des Dipeptidesters wird wiederum in der Form des Azids mit dem Methylester des L Glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteins zu dem bisher unbekannten Methylester des
3-Benzylmerkaptopropionyl-L-tyrosyl-L-phenyl- alanin-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteins kondensiert, der dann wiederum durch die Azidsynthese mit dem Amid des L-Prolyl-NG-Tosyl-D-arginyl-glycins zu der neuen Verbindung, dem geschützten Derivat des Oktapeptids gemäss der Formel II, verbunden wird.
Die Schutzgruppen werden durch Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak beseitigt, worauf das reduzierte Produkt durch Oxydation mit Kaliumferricyanid in das neue, cyclische, biologisch aktive Disulfid gemäss Formel I übergeführt wird.
Das cyclische Disulfit gemäss Formel I zeichnet sich durch höhere und spezifischere antidiuretische Aktivität (siehe die folgende Tabelle) als das natürliche Argininvasopressin aus, von dem es sich dadurch unterscheidet, dass es in der Stellung 1 anstelle des Cysteins die ss-Merkaptopropionsäure und in der Stellung 8 anstelle des Arginins das D-Arginin enthält.
Aktivität
Verbindung antidiuretische pressorische Spezifität der
Int. Einh./mg Int. Einh./mg Wirkung 1 -Desamino-D-Args-vasopressin 16 000 1 200 11 1454 l-Desamino-Phe2-Arg8-vasopressin 800 + 170 29 + 7 27,5
Die Aktivität ist in internat. Einheiten/mg ausgedrückt. Die Spezifität der Wirkung ist im Verhältnis der
Das Polypeptid der Formel I, das man als l-Desamino-8-D-Argininvasopressin bezeichnen kann, zeigt sich im Hinblick auf seine biologische Wirkung als vorteilhaftes Präparat für die Regulierung der Polyurie und Milderung der Polydipsie bei Diabetes insipidus.
Das erfindungsgemäss hergestellte Polypeptid kann sowohl in Form der freien Base als auch als Salz anorganischer und organischer Säuren verwendet werden, event. mit einem Zusatz von Hilfsstoffen, Stabilisierungsund Konservierungszusätzen, Süssstoffen, aromatischen Stoffen, Netzmitteln und ähnl., für die Herstellung von Applikationsformen für die parenterale, intranasale, subkutane, intramuskuläre und intravenöse Anwendung. Als anorganische Säuren können zum Beispiel Chlorwasserstoff-, Phosphor- und Borsäure, als organische Säuren zum Beispiel Essig-, Citronen- und Weinsäure, als Verbindungen, die eine saure Funktion besitzen, Tannin und ähnliche Verbindungen verwendet werden. Als Hilfsstoffe können Stärke, Laktose, natürliche und gehärtete Öle, Talk, Glycerin und ähnliche Stoffe verwendet werden.
Im folgenden wird anhand eines Beispiels eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung näher erklärt.
Methylester des ss-Benzylmerkaptopropionyl-L-tyrosins
9,2 g ss-Benzylmerkaptopropionsäure werden durch Einwirkung eines Überschusses von Thionylchlorid in das Chlorid übergeführt, das in 20 ml Äthylacetat gelöst wird; die Lösung wird unter intensivem Rühren und Kühlen (00 C) einem Gemisch von 10,9 g L-Tyrosinmethylester-hydrochlorid, 50 ml Wasser und 50 ml Äthylacetat zugesetzt, wobei der pH-Wert des Reaktionsgemisches durch Zusatz von Natriumbicarbonat schwach alkalisch gehalten wird. Die Acetatschicht wird abgetrennt, getrocknet und unter vermindertem Druck abgedampft, der Abdampfrückstand wird aus Athylacetat- Petroläther umkristallisiert. Aus den Mutterlaugen wird durch Abdampfen und Umkristallisieren der zweite Anteil gewonnen.
Die Gesamtausbeute beträgt 16,3 g, das sind 93 % der Th.; Schmelzpunkt 89-90 C, [a] D -3,4 IT 0,50 (c 0,5, Dimethylformamid).
antidiuretischen Aktivität zur pressorischen Aktivität ausgedrückt.
Für C20H23NO4S(373,5) berechnet: 64,31% C, 6,21% H, 3,75% N, gefunden: 64,38% C, 6,25% H, 3,71% N.
Hydrazid des ss-Benzylmerkaptopropionyl-L-tyrosins
15,3 g Methylester des ,B-Benzylmerkaptopropionyl-L tyrosins werden in 60 ml Äthanol gelöst, 6 ml 80 SOiges Hydrazinhydrat werden zugesetzt, und das Gemisch wird 2 Stunden am Rückflusskühler gekocht. Dem breiförmigen Reaktionsgemisch wird Wasser im Überschuss zugesetzt, das ausgeschiedene Produkt wird abgesaugt, auf dem Filter gewaschen und aus wässrigem Äthanol umkristallisiert. Ausbeute 11,95 g (78 %), Schmelzpunkt 195-194 C; k]2D5 6,010,50 C (c 0,5, Dimethylformamid).
Für C19H23N305S (373,5) berechnet: 61,10% C, 6,21% H, 11,25% N; gefunden: 61,10% C, 6,11% H, 11,15% N.
Methylester des f-Benzylmerkaptopropionyl-L-tyrosyl-L-phenylalanin
5,6 g Hydrazid des Iss-Benzylmerkaptopropionyl-G tyrosins werden in einem Gemisch von 50 ml Dimethylformamid und 4 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure gelöst; der Lösung wird unter Rühren und Kühlen bei -100 C 1,03 g Natriumnitrit in 2 ml Wasser zugesetzt.
Der pH-Wert der Reaktionsmischung wird mittels N Athylpiperidin auf 6-7 eingestellt und 2,7 g L-Phenylalaninmethylester, gelöst in 3 ml Dimethylformamid, werden zugesetzt. Nach 12 Stunden Stehen bei 0 C und 2 Stunden bei Zimmertemperatur wird das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck abgedampft, und dem schmierigen Abdampfrückstand wird Wasser im Über- schuss zugesetzt; das abgeschiedene Produkt wird abgesaugt und aus wässrigem Äthanol umkristallisiert, Ausbeute 7,6 g (97 zu); Schmelzpunkt 151-1520 C [a]2n -17,5 f 0,50 (c 0,5, Dimethylformamid).
In der Literatur (Huguenin N. L, Boissonnas R. A: Helv.
Chim. Acta 49 (1966), 695 ist als Schmelzpunkt 147-1480 C und [a]2D3 17,5110 (c 1,45, Dimethylformamid) angeführt, für ein Produkt, das mit einer 68 %igen Ausbeute durch Kupplung des Trichlorphenylesters der ss-Benzylmerkaptopropionsäure mit dem L-Tyrosyl-Lphenylalanin-methylester hergestellt wurde.
Hydrazid des ss-B enzylmerkaptopropionyl-
L-tyrosyl-L-phenylalanins
14,0 g Methylester des ss-Benzylmerkaptopropionyl L-tyrosyl-L-phenylalanins werden 2 Stunden unter dem Rückflusskühler mit 100 ml Methanol und 6 ml 80 %igem Hydrazinhydrat gekocht. Das abgeschiedene Produkt wird abgesaugt, auf dem Filter mit Methanol und Äther gewaschen und aus einem Gemisch von Dimethylformamid-Wasser umkristallisiert. Ausbeute 10,1 g (72%); Schmelzpunkt 248-2500 C, [a] 24 -21,9 + 0,50 (c 0,55, Dimethylformamid). In der Literatur, angeführt im vorherigen Beispiel, wird als Schmelzpunkt 251-2530 C angegeben.
Methylester des ss-Benzylmerkaptopropionyl-L-tyrosyl-L- phenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S benzyl-L-cysteins.
8,0 g ss-Benzylmerkaptopropionyl-L-tyrosyl-L-phenyl-alaninhydrazid werden nach dem üblichen Verfahren (Zaoral M., Collection Czechoslov. Chem. Comun. 30 [1965] 1853) mit 7,2 g Methylester des L-Glutaminyl-Lasparaginyl-S-benzyl-L-cysteins kondensiert. Nach dem Umkristallisieren des Reaktionsproduktes aus Dimethylformamid und Wasser werden 11,3 g (76 %) Produkt mit einem Schmelzpunkt von 253-255 C gewonnen; [cr]D -29,6 6+050 (c 0,5, Dimethylformamid).
Für C48H57N7010S2.¸H2O (965,1) berechnet: 59,73 % C, 6,20% H, 10,17% N; gefunden: 59,61X C, 6,23 /0 H, 10,23 % N.
Hydrazid des ss-Benzylmerkaptopropionyl-L-tyrosyl-L- phenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S benzyl-L-cysteins.
Einer Lösung von 10,8 g Methylester des ss-Benzylmerkaptopropionyl-L-tyrosyl-L-phenylalanyl - L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteins in 160 ml Dimethylformamid werden 12 ml 80 %iges Hydrazinhydrat zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird 12 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Das abgeschiedene Produkt wird abgesaugt, auf dem Filter mit Methanol und Äther gewaschen und dann getrocknet. Ausbeute 6,7 g (62 %); Schmelzpunkt 266-2680 C ohne Ver änderung nach dem Umkristallisieren aus Dimethylformamid-Wasser; [a]25D-33,4+0,5 (c 0,5, Dimethylformamid). Für C47H57N9O952 (956,1) berechnet: 59,04% C, 6,01% H, 13,19% N; gefunden: 59,04% C, 6,16% H, 13,25% N.
Amid des A-Benzylmerkaptopropionyl-L-tyrosyl-L- phenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L- cysteinyl-L-prolyl-NG-tosyl-D-arginyl-glycins .
Dieses wird aus dem Hydrazid des ,B-Benzylmerkapto- propionyl-L-tyrosyl-L-phenylalanyl-L-glutaminyl-L asparaginyl-S-benzyl-L-cysteins und dem Amid des L-Prolyl-NG-tosyl-D-arginyl-glycins nach dem üblichen Verfahren (siehe das- vorhergehende Literaturzitat) mit 68 %igerAusbeute hergestellt. Schmelzpunkt 223-2250 C. Für C6,H84N14014S3 (1405,65) berechnet: 57,24% C, 6,02% H, 13,95% N; gefunden: 57,33 % C, 6,01% H, 13,99% N.
1 -Desamino-8 -D-arginin-vasopressin
0,5 g Amid des A-Benzylmerkaptopropionyl-L- tyrosyl-L-phenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-
S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-NG-tosyl
D-arginyl-glycins wird mit Natrium in flüssigem Ammoniak nach dem üblichen Verfahren (gemäss dem vorher angeführten Zitat) reduziert. Der nach dem Abdampfen des Ammoniaks gewonnene Rückstand wird in 800 ml 5 %iger Essigsäure gelöst, der ungelöste Anteil wird abfiltriert, der pH-Wert der Filtrate wird mit Natriumhydroxyd auf 6,5-7 eingestellt, und die Lösung wird in bekannter Weise oxydiert (Kimbrough R. D. Jr., W. D., Branda L. A., Chan W. Y., du Vigneaud V.: J. Biol. Chem. 238 [1963] 1411).
Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird durch Zugabe von Essigsäure auf 4,0-4,5 eingestellt, das Peptid wird an einer Säule eines Karboxylationenaustauschers aufgefangen, mit 50 %iger Essigsäure eluiert und durch Lyophilisation isoliert. Das Rohprodukt wird in bekannter Weise (Zaoral M., Sorm F.: Collection Czechoslov. Chem. Commun. 31 1966 310) mit trägerloser Hochvoltelektrophorese gereinigt. Ausbeute an Lyphilisat beträgt 100-200 mg, [a]25-65 i 20 (c = 0,2; 1 m CH3COOH). Für C46H46N14O1 - 2CH3.
COOH (1189,3) berechnet: 50,49 C, 6,10% H, 16,48% N; gefunden: 50,39 % C, 6,32% H, 16,45 % N.
Die Analyse der Aminosäurenzusammensetzung ergab: 1/2 Cys 0,40, Tyr 0,98, Phe 1,03 Glu 1,05, Asp. 1,00, Pro 1,03, Arg 0,98, Gly 0,95.