Verfahren zur Herstellung neuer Oktapeptide mit vasopressorischer Wirksamkeit Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Oktapeptide der Formel I
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wo, rin X einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoff- atomen bedeutet. Die nauen Oktapeptide stellen wertvolle Arzneimittel mit insbesonderer vasopresso rischer Wirkung dar. Die Verbindungen werden erhalten, indem man ein Nonapeptid L-Cysteinyl-0- X-L-tyrosyl-L-phenylalanyl-L-glutaminyl-L-aspar- aginyl-L-cystcinyl-L-prolyl-L-lysyl-glycinamid bei Zimmertemperatur in wässriger Lösung bei einem p, H-Wert von 6, 5 bis, 8, 5 mit Luft oxydiert.
Man erhält die als Ausgangsstoffe dienenden Nonapeptide z. B. nach Methoden, die allgemein zur Synthese von Polypeptiden herangezogen werden können, beispielsweise, indem man ein N-R-S-R'-L- Cysteinyl-O-alkyl-L-tyrosyl-L-phenylalaninazid der Formel III (III) S-R'CsH4-OX CsHs
CH2 CH2 CH2 R-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CONs worin R eine zur Stabilisieruqg der Aminogruppe eingeführte Gruppe und R'einen zum Schutz der Sulfhydrylgruppe eingeführten Rest bedeuten, mit einem Hexapeptid der Formel II
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worin R"einen zum Schutz der #-Aminogruppe eingführten Benzolsulfonyl- oder Toluolsulfonylrest bedeutet, oder wenn man ein N-R-S-R'-L-Cysteinyl O-abkyl-L-tyros, heQylaJjanin,
worin R und R' die oiben erwähnte Bedeutungbesitzen,mGegenwart eines Kondensationsmittels mit einem Hexapeptid der Formel II zu einem Nonapeptid N-R-S-R'-L-Cysteinyl-O-alkyl-L-tyrosyl-L-phenylalanyl-L-glutaminyl-L asparaginyl-S-R'-L-cysteinyl-L-prolyl-Ne-R"-L- lysyl-glycinamid umsetzt, oder wenn man ein Heptapeptid der Formel VI
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nit einem funktionellen reaktionsfähigen Derivat eines N-R'''-O-Alkyl-L-tyrosins, worin R''' einen gegebenenfalls substtituierten Carbobenzoxyrest bedeutet, acyliert,
das entstandene N-R'''-O-Alkyl-L-tyrosyl-Lphenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-R'-L cysteinyl-L-prolyl-N#-R''-L-lysyl-glycinamid durch Abspalten des Restes R"'und Idarauffolgende Acylierung der freien Aminogruppe mit einem funktionellen reaktionsfähigen Derivat eines N-R-S-R-LCysteins zu einem Nonapeptid N-R-S-R'-L-Cysteinyl-O-alkyl @-tyrosyl-L-phenyl-alanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-R'-L-cysteinyl-L-prolyl-Ns-R"L-lysyl-glycin- amid umsetzt, in, dieser Verbindung die Gruppen R, R' und R'' durch Reduktion mit einem Alkalimetall in flüssigemAmmoniak abgespaltet, so dass einNona- peptid-L-cysteinyl-0-alkyl-L-tyrosyl-L-phenylalanyl- L-glutaminyl-L-asparaginyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L- lysylaglycmamid entsteht.
Die genannten Umsetzungen können nach an sich bekannten Metboden durohgefuhnt werden, z. B. kann man ein Tripeptid-azid der Formel III in einem geeigneten Lösungsmittel mit einem Hexapeptid der Formel II unter Bildung eines Nonapeptids der Formal IV V
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zur Umsetzung bringen und letztere Verbindung nach Abspaltung der Sohutzgruppen durch Oxydation mit Luft bei Zimmertemperatur m wässriger Lösung bei einem pH-Wert von 6, 5 bis 8, 5 in das gewünschte Dktapeptid der Formel I überführen.
In den Formeln II, III und VI bedeutet der Rest R einen zur Stabilisierung der α-Aminogruppe einge ührten Rest, z. B. einen Benzolsulfonyl-, Toluo iulfonyl-, Carbolphenoxy-, Carbobenzoxy-oder Carbo-p-brombenzoxy-Rest, und R' stellt einen zum.
Schutz der Sulfhydrylgruppen eingeführten Rest, z. B. einen Benzyl-, p-Brombenzyl- oder p-Methylbenzyl R. eat dar. Der Rest R'' bedeutet einen zum Schutz der @-Aminogruppe eingeführten Benzolsulfonyl- oder p Toluolsulfonyl-Rest. Der Substituent X steht für einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise für einen Methyl-o, der Athylrest.
Die Umsetzung kann in üblicher Weise vorge o. ommen und je nach der Beschaffenheit der einzelnen Substituenten variiert und den jeweiligen Verhält- nissen angepasst wenden. Vonteilh. aft setzt man die baiden Komponenten. unter Venwendung eines geeig neten oDganischen Lösungsmittels, beispielsweise Di- methylsulfoxyd oder Dimethylformamid, um und geht im übrigen wie folgt vor :
Die Reaktionslösung wird einige Stunden bei 0 und danach noch 1 bis 2 Tage bei 20 stehen gelassen. Zur Aufarbeitung engt man die Mischung zweckmässig unter vermindertem Druck ein, fällt das Retaktionsprodukt, durch Zugabo von Essigaster. aus, saugt die entstandene Fällung ab und trocknet unter vermindertem Druck über Caicium- chlori, cl.
Das verwendete Hexapeptid der allgemeinen Formel II (z. B. N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-aspar aginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-#-N-tosyl-L- lysyl-glycinamid) kann beispielsweise nach der von 'R. A. Boissonnas in helv. Chim. Acta 43 (1960), Seite 190, angegebenen Vorschrift aus L-Prolyl-#-Ntosyl-L-lysyl-glycinamiid und N-Carbobenzoxy-L- glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinazid durch Erwärmen in Dimethylformamid hergestellt werden. Der Reaktionspartner, des Hexapeptids, das, Tripeptid-azid der Formel III, lässt sich z.
B. nach folgender Methode herstellen :
Man behandelt ein N-R-S-R'-L-Cysteinyl-O-alkyl- L-tyrosin, worin R und R'die angegebene Bedeutung besitzen, mit einem L-PhenyManinalkylester in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Essigester, in Gegenwart von Dicyclohexyl-carbodiimid als Konden- sationsmittel. Der resultierende Tripeptidester wird in an sich bekannter Weise mit Hydrazinhydrat in das entsprechende Hydrazid überfuhrt und dieses mit Natriumnitrit in Essigsäure/Salzsäure zum entspre- chenden Tripeptid-azid (III) umgesetzt.
Anstelle des Triperptid-azids der Formel III kann auch ein Tripeptid mit freier Carboxygruppe (IIIb) zur Umsetzung mit dem vorstehend erwähnten Hexapeptid der Formel II eingesetzt werden. Hierbei kann man in der Weise vorgehen, dass man einen N-R-S R'-L-cysteinyl-O-alkyl-L-tyrosyl-L-phenylalanin- alkylester (Tripeptidester IIIa) mit Alkalilauge vorsichtig zur entsprechenden freien Säure verseift (Tripeptid IIIb) und diese in Gegenwart eines geeigneten Kondensationsmittels, beispielsweise Dicyclohexylcarbodiimid oder Tetraäthyl-pyrophosphit, mit dem Hexapeptid der Formel II zum gewünschten Nonapeptid der Formel IV umsetzt.
Man kann zur Herstellung der Ausgangs-peptide auch von einem Heptapeptid der Formel VI
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worin R'und R"die angegebene Bedeutung besitzen, ausgehen, diese Verbindung nach an sich bekannten Methoden in ein Nbnapeptid der Formel IV und letzteres, nach Abspaltung der Schutzgruppen (nach dem Verfahren gemäss der Erfindung) durch Luft oxydation in das. gewünschte Oktapeptid der Formel I überführen, wobei sich z. B. folgende Arbeitsweise als geeignet erwiesen hat :
Man lässt auf das Heptapeptid der Formel VI einen N-Carbobenzoxy-O-alkyl-L-tyrosin-nitrophenylester oder ein anderes reaktionsfähiges funktionelles Derivat des N-Carbobenzoxy-O-alkyl-L-tyrosins in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, einwirken.
Nach mehrstündigem Stehen bei Zimmertemiperatur fällt man das Reaktionsprodukt mit Essigsäureäthylester aus. Der Niederachlag wird mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel gewaschen und getrocknet. Au, dem erhaltenen Reak- tionsprodukt wird. die Carbobenzoxygruppe in üblicher Weise, z. B. mit Bromwasserstoff in Eisessig, abgespalten. Das mit Ather, ausgefällte Reaktions- produkt wird danach sofort in Dlimethyliormami, d aufgenommen und m, it einem N-R-S-R'-L-cystein- nitmpbenylester in Gegenwart einer tertiären organi schen Base, z. B.
Triäthylamin, zum gewünschten Nonapeptid der Formel IV umgesetzt. Die im Nonapeptid IV zum Schutz der funktionellen Gruppen eingeführten Reste werden durch Behandeln mit Alkalimetall, vorzugsweise Natrium oder Kalium, in flüssigem Ammoniak abgespalten. Bei der darauf- folgenden Oxydation mit Luft in wässdger Lösung bei einem pH-Wert von 6, 5 bis 8, 5 entsteht aus den beiden Mercaptogruppen die Disulfidbrücke des zykli schen Oktapeptids I.
Die neuen Oktapeptide der Formel I besitzen eine aus J. Am. Chem. Soc. , 78 (1956), Seite 2905, und 79 (1957), Seite 5572, sowie aus Helv. Chim. Actap 43 (1960), Seite 190 bekannten, auf synthetischem Wege gewonnenen Lysin-Vasopressin der nachstehen- den Formel VIII
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vergleichbare gute vasopressorisohe Aktivität, haben aber gegenüber der bekannten Verbindung den Vor- teil, dass-wie aus den in der nachstehenden Tabelle enthaltenen Versuchsergebnissen hervorgeht- die unerwünschte oxytoxische Nebenwirkung praktisch verschwunden ist.
Tabelle
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<tb> Verbindung <SEP> M <SEP> R
<tb> <SEP> o <SEP> g <SEP> Ei
<tb> <SEP> cl
<tb> <SEP> Bob
<tb> <SEP> inti
<tb> <SEP> Tu'
<tb> <SEP> 'ou,
<tb> <SEP> aï
<tb> <SEP> P <SEP> ; <SEP> 4j
<tb> <SEP> cl
<tb> 1) Lysin-Vasopressin 80 I.E./mg 2701. E./mg VIII 2) OktapeptidI 0, 2 I. E./mg 125 I. E./mg (X=CH3)
Auf Grund ihrer vasopressorischen Wirksamkeit eignen sich die neuen Verfahrenserzeugnisse als wertvolle Arzneimittel, beispielsweise zur Beseitigung der postoperativen Darmatonie, zur Anregung der Darm peristaltik, zur To, nisierurrjg Ides Urethers bei Pyelitis gravidarum und zur Vasokonstriktion in der Lokal- anästhesie.
Sie können als solche oder unter Beimischung geeigneter pharmazeutischer Hilfs- und Trägerstoffe sowohl parenteral als auch sublingual , appliziert werden. Weiterhin kann ;, die Applikation auch über die Mund- oder Nasenschleimhaut erfolgen, wobei die Produkte z. B. in Form eines Nasensprays oder als Schnupfpulver (Verreibung der gefrier gatrockneten Oktapeptide mit Milchzucker vor der Anwendung) verabreicht werden können. Die bevor- zugte Applikationsform ist. die intravenöse Injektion.
Zu diesem Zweck können die neuen Oktapeptide in Form von vorzugsweise isotonischen und pyrogenfreien wässrigen Lösungen verwendet wendlen, die zweckmässig zur Stabilisierung mit einem Zusatz von Tdchlo. r.-tert. butanol versehen sind. Die Dosierung liegt in der Grössenordnung zwischen 1 und 5 inter- nationalen Einheiten,wobeili.nternatio.naloEinheit etwa 10-50 γ der Produkte entspricht.
Zur Bereitung einer fiir die intravenöse AppMkatio. n brauchbaren Injektionslösung werden 5 g Trichlor.-tert. butanol zusammen mit 6 g Natnumchlorid m 1. 000 ml bidestilliertem, mit Stickstoff gesättigtem, pyrogenfreiem Wasser gelöst ; in diese Lösung wind die gewünschte Mené. des gefriengetrockneten Oktapeptids eingetragen ; die Lösung wind in Ampullen abgefüllt.
Beispiel 1 N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-O-methyl- L-tyrosyl-L-phenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl- S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-Ns-tosyl-L-lysyl- glycinamid (Nonapeptid IV)
7, 5 g N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-O- methyl-L-tyrosyl-L-phenyalanin-azid (Tripeptid-azid III) (ca. 0, 01 Mol) und 8, 1 g (Oj009 Mol) L-Glut- aminyl-L-asparaginyl-S-b onzyl-L-cysteinyl-L-prolyl- N#-tosyl-L-lysyl-glycinamid (Hexapetid II) werden bei Raumtemperatur in 1. 20 ccm reinem Dimethyl- formamid gelöst. Nach dem Absaugen von wenig Ungelöstem wird die Reaktionsmischung über Nacht bei 0 , dann noch 2 Tage bei 20 gehalten.
Anschliessend wird sie unter vermindertem Druck auf 60 ccm eingeengt und mit 500 ccm Essigester durch- geschüttelt. Die farMose Faltung wird. abgesaugt und zweimal mit 200 com Essigester gewaschen. Das feuchte Nonapeptid IV wird dann mit 200 cem Meth anol beiRaumtemperaturverrieben,abgesaugt und nacheinander mit 100 ccm Methanol, Essigester und Ather gewas, chen.
Nach dem Trocknen im Vakuum über Calciumchlorid erhält man 7, 6 g (55 % der Theorie) in Form eines farblosen Pulvers. Die Verbindung schmilzt bei 209-211 ; [a] D20 = 39,1 (c = 2 in Dimethylform- amid).
O-Methyl-tyrosin2-lysin8-Vasopressin (Oktapeptid I) 3,, 08 g des erhaltenen Nonapeptids IV werden in
2000 ml über Kaliumhydroxyd destilliertem, flüssigem Ammoniak gelöst. In die Losung werden unter mechanischem Rühren feine, blanke Natriumschnitzel eingetragen, bis. die Lösung schliesslich tiefblau gefärbt ist und die Färbung eine Minute besteben bleibt.
Nach Zugabe von 1,0 g Ammoniumchlorid lässt man das Ammoniak bei Raumtemperatur abdampfen, nimmt den sicupösen Rückstand mit 2000 ml 0, 2 %iger Essigsäure auf und stellt die Lösung mit 5%iger Essigsäure auf einen pH-Wert von 8, 0 ein. Nach dreistündigem Einleiten von koMendioxydIreier Luft wird filtriert, das farblose Filrtrat mit Eisessig auf 'einen pH-Wert vom 4, 5 eingestellt und gefriergetrock- net. Das Rohprodukt wird durch Gegenstromvertei- lung zwischen sek. Butanol und 0, 08 molarer p Toluolsulfonsäure gereinigt.
Die biologisch aktive Fraktion mit dem Verteilungskoeffizienten K = 0, 82 enthält 45% des Gesamtstickstoffs und zeigt eine Aktivität von 125 15 I. E. Vasopressinwirkung (Blutdruck des chemisch dekapitierten Kaninchens) und 0, 2 0, 5 I. E. Oxytocinfwirkung (isolierter, virgineller Meerschweinchenuterus). Der Rr-Wert liegt bei 0, 33 (Methyläthylketon/Pyridin/Wasser 65/15/20).
Das Tripeptid-azid der Formel III kann z. B. wie fo3gt hergestellt werd-en, : a) N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-O-methyl-
L-tyrosyl-L-phenylalanin-methylester
17, 2 g N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-Omethyl-L-tyrosin werden in 80 ml Essigester gelöst und mit einer Mischung von 8,0 g L-Phenylalanin methylester-hydrochlond, 5, 4 ml Triäthylamin und 80 ml Chloroform versetzt. Dann gibt man bei 0 eine Lösung von 7,1 g Dicyclohexyl-carbodiimid in 20 ml Chloroform zu und lässt einen Tag bei Raumtemperatur stehen.
Der Niederschlag wird abgesaugt und mit 200 ml Easigester ausgekocht. Die vereinigten Filtrate scheiden schom beim Einengen auf 1/4 des ursprünglichen Volumens eine gallertige Kristallmasse ab, die aus, dem gewünschtenTripeptid-esterlila be steht. Man saugt nach dem Abkühlen vom Losungs- mittel ab und kristallisiert den Niederschlag aus Athanol um.
Die Ausbeute beträgt 18, 0 g, der Schmelz- punkt liegt zwischen 167-168 . b) N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-O-methyl- L-tyrosyl-L-phenylalanin-hydrazid (Tripeptid- hydrazid)
Man löst den gemäss Beispiel la hergestellten N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-O-methyl-Ltyrosyl-L-phenylalanin-methylester (Tripeptid IIIa) in 300 ml warmem Äthanol und gibt 25 ml 80"/oignes Hydrazinhy, drat zu.
Beim langsamen Abkühlen auf Raumtemperatur und Stehen über Nacht fallen 10, 0 g N-Carbobenzoxy-Stbenzyl-L-cyseeinylO-methylL-L- tyros. yl-L-phenylalanin-hydrazidaus.Der Schmelz punkt liegt bei 2. 19-, 220 . c) N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-O-methyl
L-tyrosyl-L-phenylalanin-azid (Tripeptid-azid III)
6, 84 g des gemässBeispielIbhergestelltenTri- peptid-hydrazids, werden unter Erwärmen in einer Mischung von 220 ccm Eis, essig und 35 ccm ln Salz- säure gelöst.
In die auf 5 abgekühlte Lösung werden unter mechanischem Rühren innerhalb von 5 Minuten
11, 5 ccm l ml Natmumnitritlösung eingetropft. Nach beendeterZugabewird.dieMischungnoch 5 Minuten n bei 3 gehalten und dann in 500 ccm Eiswasser eingerührt. Das abgeschiedene Tripeiptid-III-, azid wird abgesaugt, mit Eiswasser neutral gewaschen und bei
0, 2 mm Druck über Caiciumchlorid getrocknet.
Beispiel 2 8,3gN-Carbobenzoxy-S-'benzyl-'L-cysteinyl-O- methyl-L-tyrosyl-L-phenylalanin-methylester werden in 10, ml Dioxan gelöst. Man gibt bei Raumtempera- tur 20 ml Methanol und 15 ml ln-Natronlauge zu.
Die anfangs inhomogene Lösung wird unter Vibromischung homogen. Nach 2 Stunden versetzt man die Lösung mit 15, 2 ml In-Schwefelsaure, entfernt das s Lösungmittel unter vermindertem Druck, nimmt den Rückstand in Essigester auf, schüttelt die Essigester- lösung mit etwas Wasser aus, trocknelt über Natriumsulfat und dampft das Filtrat unter vermindertem Druck ein. Es hinterbleiben 7, 7 g eines harzigen Rückstandes, der ams der dem N-Carbobenzoxy-S- benzyl-L-cysteinyl-O-methyl-L-tyrosyl-L-phenyl alamn-methylester entsprechenden freien Säure be steht.
Den harzigen Rückstand nimmt man in 60 ml Dimethylfoanamidauf,gibt8, 9 g L-Glutaminyl-L- asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N#-tosyl-L- lysyl-glycinamid (Hexapeptid II) und 2, 1 g Dicyclo- hexyl-carbodiimid zu und d lässt das Reaktionsgemisch 2 Tage lang bei Raumtemperatur stehen. Dann er wärmt man auf ca. 40 , saugt vom Niederschlag ab und wäschtdenRückstandmit warmem Dimethyl- formamid. Das Produkt enthält noch Spuren an Di cyclohexylharnstoff.
Die Ausbeute an Nonapeptid IV beträgt 7, 5 g.
[a] D20 = -38 (c = 2 in Dimethylformamid).
Die weitere Verarbeitung des Nonapeptids IV wird entsprechend der in Beispiel 1 angegebenen Arbeitsvorschrift vorgenommen.
Beispiel 3
1 0 g L-Phenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl S-benzyl-cysteinyl-L-prolyl-N#-tosyl-L-lysyl-glycin- amid (Heptapeptid VI) und 0, 5 g N-Carbobenzoxy O-netbylL-L-.tyrosin-nitrophenylesterwemlen in 10 ml Dimethylformamide gelöst. Nach 24stündigem Stehen bei Raumtemperaturversetztman.diehalbfestc Masse mit 150 ml ;Essigsäureäthylester, saugt ab, wäscht den Niedersohlag mit 100 ml Äthanol und. dann mit 50 ml Essigester. Das Produkt wiegt nach dem Trocknen 1, 05 g und ist für die weitere Umsetzung genügend' rein.
Man suspendiert die Verbindung in 7 ml Eisessig uns gibet 8 ml 4n-BmmwasseiistofH.ös)un,gimEisessig zu. Nach 2 Stunden versetzt man das Reaktions- gemisch mit 150 ml trookenem Ather, wäscht das ausgefallene Hydrobromid mehrmals mit Ather und löst es in 10 ml Dimethylformamid. Danm fugt man 1, 2 ml Triäthylamin und 0, 45 g N-Carbobenzoxy-S- benzyl-L-cystein-nitrophenylester zu. Nach 2 Tagen gibt man zu der festen Masse 150 ml Essigester, saugt den Niederschlag ab, wäscht ihn mit 100 ml Äthanol, 50 ml Essigester und trocknet ihn unter vermindertem Druck.
Die Ausbeute an Nonapeptid IV beträgt 0, 9 g ; der Schmelzpunkt liegt bei 210-213 . [α]D20 =-39,5 (c = 2 in Dimethylformamid). Die Weiterverarbeitung des Nonapeptids erfolgt gemäss Beispiel 1.
Beispiel 4
O-Äthyl-tyrosin2-lysin8-Vasopressin
Entsprechend der in B eispiel 1 angegebenen Vor schrifterhältmanaus 7, 5 g N-Carbobenzoxy-S- benzyML-cysteinyl-0-äthyl-L-tyrosyl-Lphenylalanin- azid (ca. 0, 01 Mol) und 81, g (0,009 Mol) des Hexa peptides II 7, 5 g (55 O/o der Theorie) N-Carbobenz- oxy-S-benzyl-L-cysteinyl-O-äthyl-L-tyrosyl-L-Phenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cystein yMprolyl-NE-tosyl-L-'lysyl-glycinan'mdvomSchmelz- punkt 216-218 ;
[α]-20 = 39, 1 , das nach der Behandlung g mit Natrium in flüssigem Ammoniak und darauffolgenderLuftoxydationin das gewünschte Oktapeptid übergeht. Die Ausbeuten sind die gleichen wie bei der Herstellung von O-Methyl-tyrosin2-lysin8 Vasopressin. Das entstandene Rohprodukt wird entsprechend der im Beispiel 1 angegebenen Vorschrift durch Gegenstromivorteilungzwischensekund.Butan- ol und 0, 08-molarer p-Toluolsulfonsäure gereinigt.
Verteilungskoeffizient K = 0, 84, RF-Wert = 0, 35 (Methyläthylketon/Pyridin/Wasser).