AT249282B

AT249282B - Verfahren zur Herstellung neuer Heneikosapeptide

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Publication number: AT249282B
Application number: AT865761A
Authority: AT
Original assignee: Ciba Geigy
Priority date: 1960-11-17
Filing date: 1961-11-16
Publication date: 1966-09-12

Description


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  Verfahren zur Herstellung neuer Heneikosapeptide 
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 der entsprechenden Verbindung, die statt des Glutaminylrestes den Rest der Glutaminsäure aufweist, und ihrer Derivate und Säureadditionssalze. 



   Unter Derivaten sind vor allem funktionelle Derivate, wie Ester, Amide, Hydrazide, zu verstehen, ferner N-Substitutionsprodukte, wie N-Acyl-, insbesondere N-Acetylderivate, und Verbindungen, welche die üblichen Amino-Schutzgruppen aufweisen. 



   Die neuen Verbindungen haben eine hohe adrenocorticotrope Wirksamkeit und sollen dementsprechend als Heilmittel in der Human- und Veterinärmedizin verwendet werden. Ferner können sie als Zwischenprodukte zur Herstellung von Heilmitteln, die eine längere Kette von Aminosäure aufweisen, wie der adrenocorticotropen Hormone selbst, verwendet werden. 



   Die neuen Heneikosapeptide werden nach den für die Peptidherstellung bekannten Methoden erhalten, wobei man die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten, ausgehend von dem Dipeptid L-Valyl-L-lysin oder seinen Derivaten, miteinander verbindet. Verknüpfungsmethoden sind beispielsweise die Carbodiimidmethode, die Methode der gemischten Anhydride, die Azidmethode oder die Methode der aktivierten Ester. 



   An der Reaktion nicht beteiligte, freie, funktionelle Gruppen werden zweckmässigerweise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, die Carboxylgruppe vorzugsweise durch Veresterung,   z. B.   mit Methanol, tert.-Butanol, Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, die Aminogruppe beispielsweise durch Einführung des   Tosyl- oder   Tritylrestes   (= TRI)   oder der Carbobenzoxygruppe   (= Z)   oder farbiger Schutzgruppen, wie der p-Phenylazo-benzyloxycarbonylgruppe (= PZ) und der   p- (p'-Methoxy-phenylazo)-benzyloxycarbonylgruppe ( MZ)   oder insbesondere des tert.-Butyloxycarbonylrestes   (BOC)

  .   Zum Schutz der Aminogruppe in der Guanidogruppierung des Arginins ist die Nitrogruppe geeignet die genannte Aminogruppe des Arginins muss aber bei der Reaktion nicht notwendig geschützt werden. 



   Nach der Reaktion werden die Schutzgruppen in bekannter Weise durch Behandlung mit hydrolysierenden oder reduzierenden Mitteln abgespalten. 



   Wie bereits   erwähnt, bestehen verschiedene Möglichkeiten   bezüglich des Aufbaus des Heneikosapeptids 
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 (oder glutamyl)-L-hi--L-arginyl-L-arginyl-L-prolin, in welchem die freie Aminogruppe des Serins und die (-Aminogruppen der Lysinreste geschützt sind, in Gegenwart eines Carbodiimids mit dem Dipeptid L-valyl-L-lysin bzw. dessen Derivaten kondensiert, wie beispielsweise im Schema Fig. 1 gezeigt ist.

   Für die Aminosäuren werden folgende Abkürzungen verwendet : 

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<tb> 
<tb> H-Arg-OH <SEP> = <SEP> L-Arginin
<tb> H-Glu-OH <SEP> = <SEP> L-Glutaminsäure
<tb> H-Glu <SEP> (NH <SEP> )-OH <SEP> = <SEP> L-Glutamin
<tb> H-Gly-OH <SEP> = <SEP> Glycin
<tb> H-His-OH <SEP> = <SEP> L-Histidin
<tb> H-Lys-OH <SEP> = <SEP> L-Lysin
<tb> H-Met-OH <SEP> = <SEP> L-Methionin
<tb> H-Phe-OH <SEP> = <SEP> L-Phenylalanin
<tb> H-Pro-OH <SEP> = <SEP> L-Prolin
<tb> H-Ser-OH <SEP> = <SEP> L-Serin
<tb> H-Try-OH <SEP> = <SEP> L-Tryptophan
<tb> H-Tyr-OH <SEP> = <SEP> L-Tyrosin
<tb> H-Val-OH <SEP> = <SEP> L-Valin
<tb> 
 Das Heneikosapeptid kann ferner gemäss dem Schema Fig. 2 durch stufenweisen Aufbau vom Carb- 
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 EMI3.1 
 



  Fig. 1 

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 EMI4.1 
 

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 Bzy = Benzyl, NB = p-Nitrobenzyl,   R'=-NO   oder Di-carbobenzoxy, R" = OBzy oder   ONB ;   R = TRI, BOC, p-Methoxy-carbobenzoxy, oder Phthalyl (im letzten Fall Abspaltung durch Hydrazin) ;   Y =-OH,   gemischtes oder symmetrisches Anhydrid, aktivierter Ester, Azid, aktiviertes Amid. 



   Fig. 2 

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Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. 



   Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wieder las- sen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind,
Salze gewinhen, wie z. B. solche mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, oder mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Glykolsäure,
Milchsäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure oder Toluolsulfonsäure. 



   Die verfahrensgemäss erhaltenen Heneikosapeptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten
Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale
Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den Polypeptiden nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milch- zucker, Glucose, Kochsalz, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi,
Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeuti-   schen   Präparate können   z. B.   als Tabletten, Dragées, Pulver, Salben, Cremen, Suppositorien, oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen.

   Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie   Konservierungs-,   Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. 



   Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. 



   Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsius- graden angegeben. 



   Beispiel 1 : 27, 06 mg   (0, 01 mMol) L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutaminyl-L-hi-     stidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-   - L-arginyl-L-arginyl-L-prolin-hexaacetat werden in 1 ml Wasser gelöst und mit 1 ml Dioxan und 0,4 ml
0, In-Natronlauge versetzt. Nun wird auf 00 gekühlt. Nach Zugabe von 8,58 mg t-Butyloxycarbonyl-azid (0, 06 mMol) werden im Laufe von 6 h 0,6 ml 0, 1 n-Natronlauge in ganz kleinen Portionen unter Rühren zugegeben. Nach weiteren 15 h wird die Lösung nach Zugabe von 0,4 ml   0, 1 n-Salzsäure   im Vakuum zur Trockene verdampft, der Rückstand. in Wasser gelöst und lyophilisiert.

   Der gut getrocknete, farblose
Rückstand wird in 1 ml Dimethylformamid gelöst und nach Zugabe von 35,9 mg (0, 1 mMol, l0facher Überschuss)   L-Valyl-N-t-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester     auf -50   gekühlt. Diese Lösung wird mit
20,6 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 15 h aufbewahrt. 



   Alsdann wird die Lösung im Vakuum vorsichtig auf etwa die Hälfte eingeengt und mit 10   l   trockenem
Essigester versetzt. Dabei fällt das Heneikosapeptid-Derivat als unlösliches, farbloses Pulver aus, und die Überschüsse anDicyclohexylcarbodiimid und Dipeptidester gehen in Lösung. Das Produkt wird noch zwei- mal umgelöst. 



   Ungeachtet der kleinen Verunreinigung durch Dicyclohexylharnstoff wird die Verbindung in 0,5 ml
Trifluoressigsäure gelöst und darin 1 h beiZimmertemperatur aufbewahrt. Nach Verdampfen des Lösungs- mittels wird das   Heneikosapeptid-Glu-y-amid-lys-methylester-octa-trifluoracetat   in elektrophoretisch reiner Form gewonnen (Papierelektrophorese bei   3 000   V, pi 1, 9). Es zeigt eine beträchtliche Corti- cotropin-Wirkung. Ausbeute   950/0.   



     Amid-und Esterfunktionen   werden verseift durch Aufbewahrung in 0, 1 n-Salzsäure während 24 h bei Zimmertemperatur, nachdem die Trifluoracetatreste durch Passieren einer Säule von Amberlit IR-4B (Acetat-Form)   (Ionenaustauschharz aufPhenol-Formaldehydbasis) gegen Acetat-Reste   ausgetauscht worden waren. Durch Lyophilisieren erhält man das Heneikosapeptid in Form des   Octa-hydrochlorids,   Ausbeute   84%. Es   zeigt eine grosse Corticotropin-Wirkung. 



   Das Dipeptidderivat,   L-Valyl-NE-t-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester, wirdfolgendermassen   hergestellt :
Carbobenzoxy-L-valin und NE-t-Butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester werden im Verhältnis 2,51 g zu 2,60 g in 50 ml Acetonitril gelöst und   bei -50   mit 2,06 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 3 h haben sich   9rP/o   des erwarteten Dicyclohexylharnstoffs ausgeschieden. Dieser wird abfiltriert, das Filtrat wird zur Trockne verdampft, der Rückstand wird in Essigester gelöst und mit verdünnter, kalter Salzsäure, Kaliumcarbonatlösung und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat und Verdampfen des Lösungsmittels werden 4,0 g   (811o) Carbobenzoxy-L-valyl-NE-t-butyloxycarbonyl-L-lysin-   - methylester als dickflüssiges Öl erhalten. 



   Die Carbobenzoxygruppe wird durch Hydrieren von 4,0 g der obigen Verbindung in 100 ml Methanol und 8   ml 1 n-Salzsäure   in Gegenwart von 0, 5 g   10%obigem   Pd-Kohle-Katalysator abgespalten. Nach 40 min wird beim Durchperlen von Wasserstoff kein Kohlendioxyd mehr entwickelt. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum vorsichtig verdampft. Der Rückstand wird sofort mit 10 ml Essigester und 10 ml konz. Kaliumcarbonatlösung geschüttelt, wobei der freie   Dipeptidester   sich in der organischen 

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Schicht löst. Diese wird abgetrennt und mit festem Kaliumcarbonat getrocknet. Nach Verdampfen des
Essigesters verbleibt der   L-Valyl-N#-t-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester   als dickflüssiges Öl, wel- ches sofort weiterverarbeitet werden muss. 



   Beispiel2 :1.H-Lys(PZ)-OBzy,HCl
3, 84g NE-PZ-Lysin werden in 38 ml abs. Tetrahydrofuran aufgeschlämmt und während 1 h mit Phos- gen behandelt bei 40 . Die klare Lösung wird im Vakuum bei 40  verdampft, der kristallisierte Rückstand mit 20 ml abs. Benzylalkohol, enthaltend 0, 73 g Salzsäure-Gas, während 3 min auf 600 erwärmt, wobei eine klare Lösung entsteht. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird mit 60 ml abs. Äther versetzt, da- bei kristallisiert das Hydrochlorid aus.   Ausbeute : 4, 19   g =   8W ; 0 d. Th.,   F.   188 - 1900   unter Zers. Zur
Analyse wird aus Methanol-Äther umkristallisiert. F. 1910 unter Zers. 



   In analoger Weise werden das NE-MZ-L-Lysin-benzylester-hydrochlorid sowie das entsprechende   p-Nitrobenzylesterderivat   hergestellt. Deren weitere Verarbeitung ist ganz analog der des NE-PZ-L-Ly- sin-benzylester-hydrochlorids. 



   2. BOC-Val-Lys (PZ)-OBzy
2,64 g   N-PZ-Lysin-benzylester-HCl   werden in Chloroform und wenig Methanol gelöst und bei 00 mit Kaliumcarbonatlösung ausgeschüttelt. Nach Trocknen mit Natriumsulfat wird das Lösungsmittel im Vakuum bei 400 verdampft, der kristallisierte Rückstand zusammen mit 1, 12 g BOC-Valin in 14 ml Acetonitril gelöst und bei 00 mit   1,     17 g Dicyclohexylcarbodiimid   versetzt. Nach Stehenlassen über Nacht bei 00 wird die dicke Fällung abgenutscht und mit eiskaltem Acetonitril gewaschen. Das Peptid wird mit dem Dicyclohexylharnstoff auskristallisiert. Durch Extraktion mit Dimethylformamid wird das Peptid vom Harnstoff getrennt, aus dem Dimethylformamid kristallisiert es nach Zugabe von Wasser aus. Ausbeute : 2,50 g   = 72% ; F. 154-156 .   



   Zur Analyse wird aus Äthanol-Wasser umkristallisiert. 



   3. H-Val-Lys (PZ)-OBzy, HC1
2,02 g   BOC-Valyl-N#-PZ-lysin-benzylester   werden in 26 ml abs. Essigester gelöst, mit 40 ml 3, 3 n-Salzsäure in Essigester versetzt und 1 h bei Raumtemperatur aufbewahrt. Beim Verdampfen des Lösungsmittels am Vakuum bei 400 fällt das Hydrochlorid fest aus. Ausbeute   : l,   78 g = 97%; F.   200 - 2010   unter Zers. 



   . Der Dipeptidester kann in der in Fig. 2 gezeigten Weise mit den weiteren Aminosäuren zum Heneikosapeptid kondensiert werden. 



   4.   BOC-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy  
2,8 g BOC-Pro-OH werden in 17 ml abs. Tetrahydrofuran und 1, 8 ml Triäthylamin gelöst und bei -15  mit 1, 6 ml Pivaloylchlorid versetzt. 15 min wird   bei-150   rühren gelassen. In der Zwischenzeit wird aus 7,93 g H-Val-Lys (PZ)-OB, HC1 in Dimethylformamid und Triäthylamin das H-Val-Lys (PZ)-OB hergestellt und diese Lösung zum obigen gemischten Anhydrid gegeben. Man bewahrt die Mischung über Nacht bei 00 auf, verdünnt dann mit Essigester undschütteltbei 00 mit   verdünnter Salzsäure   und Natriumbicarbonatlösung aus. Nach Verdampfen des   Lösungsmittels   wird der Rückstand aus Äthanol-Wasser umkristallisiert. Ausbeute : 8, 8 g = 88% d.   Th. ;   F.   123 -1250.   



   5.   H-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy, HC1  
Das Tripeptidderivat wird durch Decarbobenzoxylierung wie unter 3. beschrieben erhalten. Nach 
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 Triäthylamin gelöst.   Bei -150 werden 0.   28 ml   Chlorkohlensäure-isobutylester   zugegeben und 15 min bei -15  gerührt. Dazu gibt man eine Lösung von 1,00 g   H-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy, HC1 in 4   ml abs. Dimethylformamid und 0,2 ml Triäthylamin. Nach einstündigem Rühren bei 00 wird über Nacht bei 00 aufbewahrt, dann mit Essigester verdünnt, bei 00 mit Salzsäure und Natriumhydrogencarbonat gewaschen, 
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   Val-Lys (PZ)-benzylester10IY/o d. Th.    



   Das Produkt ist dünnschichtchromatographisch einheitlich im System Chloroform-Aceton (7 : 3) Rf 0, 53 und Benzol-Aceton   (l : l)   Rf 0,67. 



   7. H-Arg   (Z)-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy  
1, 2 g BOC-Tetrapeptid werden mit 7,   5 ml Trifluoressigsäure 10 min   stehen gelassen ; nach Verdampfen der Trifluoressigsäure wird das Öl in Chloroform gelöst, bei 00 mit Wasser und dann mit Kaliumcarbonatlösung gewaschen, getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum verdampft. Man erhält 

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   , 900 mg = 90% d. Th. eines festen orangen Schaums. Die Substanz ist dünnschichtchromatographisch einheitlich ; im System Benzol-Aceton tel: 1) Rf 0,09 und Dioxan-Wasser (9 : 1) Rf 0, 71.   
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   BOC-Arg (Zg)-Arg (ZDünnschichtchromatogramm : in Benzol-Aceton   (l : l)   Rf 0, 71 ; in Chloroform-Aceton (7   : 3) rif0, 57.   



   9. H-Arg(Z2)-Arg(Z2)-Pro-Val-Lys(PZ)-OBzy
Aus obigen 3, 12 g BOC-Pentapeptidderivat wird die   BOC-Gruppe   in gleicher Weise, wie unter 7. be- schriueben,abgespalten.Ausbeute :2,90g=99%d.Th. 



  Dünnschichtchromatogramm : Einheitlich. Rf 0, 48 in Benzol-Aceton   (l : l)   und 0, 18 in Chloroform- - Aceton (7 : 3). 



   10. BOC-Lys (Z)-Arg(Z2)-Arg(Z2)-Pro-Val-Lys(PZ)-OBzy
587 mg des unter 9. beschriebenen Produkts werden mit 235 mg BOC-Lys (Z)-OH, in analoger Weise wie unter 6. beschrieben, umgesetzt. Das Rohprodukt wird aus Tetrahydrofuran-Äther um gefällt. Ausbeute :725mg=100%d.Th. 



   Dünnschichtchromatogramm : In Benzol-Aceton (1 : 1) Rf 0,68,   in Chloroform-Aceton (7 : 3)   Rf 0,36. 
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 (Z)-Arg (ZDünnschichtchromatogramm : Benzol-Aceton   (l : l)   Rf 0, 38 ; Chloroform-Aceton (7 : 3) Rf   0, 11.   



   12.BOC-Lys (Z)-Lys(Z)-Arg(Z2)-Arg(Z2)-Pro-Val-Lys(PZ)-OBzy
3, 26 g H-Lys(Z)-Arg(Z2)-Arg(Z2)-Pro-Val-Lys(PZ)-OBzy und 1,19 g BOC-Lys (Z)-Nitrophenylester werden in 7 ml abs. Tetrahydrofuran über Nacht bei 400 gerührt ; Die dicke Mischung wird in wenig Di- methylformamid gelöst und in 300 ml Äther-Petroläther 2 : 1 eingetropft. Man saugt die Fällung ab und wäscht gut mit Äther. Ausbeute   : 3, 45 g= 88%.   



   Dünnschichtchromatogramm : Benzol-Aceton   (1   : 1) Rf 0, 57 einheitlich ; Chloroform-Aceton   (7 : 3)  
Rf 0,22 einheitlich. 



   13.H-Lys (Z)-Lys(Z)-Arg(Z2)-Arg(Z2)-Pro-Val-Lys(PZ)-OBzy
Aus dem obigen 3, 45 g Peptidderivat spaltet man die   BOC-Gruppe, wie   unter 7. beschrieben, ab. Aus- beute   : 3, 20 g = 9'P/o d. Th.   



   Dünnschichtchromatogramm : Benzol-Aceton (1:1) Rf 0,   32 ; Chloroform-Aceton (7 : 3)   Rf 0,09. 



   14. BOC-Val-Gly-Lys(Z)-Lys(Z)-Arg(Z2)-Arg(Z2)-Pro-Val-Lys(PZ)-OBzy
Aus obigem 3, 20 g Heptapeptidderivat und 686 mg BOC-Val-Gly-OH wird nach dem unter 6. be- schriebenen Verfahren der geschützte Nonapeptidester hergestellt. Er wird durch Umfällen aus Dime-   thylformamid/Äther   gereinigt. Ausbeute : 2, 92 g =   81%   d. Th. 



   Dünnschichtchromatogramm   : Benzol-Aceton (1 : 1) Rf 0, 34 ; Dioxan   Rf 0,72. 
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 Methode   BOC-Val-Gly-OEt hergestellt. Ausbeute : 4, 45 g= 64% d. Th. ;   F. 95-96  nach Kristallisation aus Ligroin. 



   4, 3 g des Äthylesters werden in 80 ml Dioxan mit 32 ml 0,5 n-Natronlauge während   30 min. verseift.   



  Nach Einengen des Lösungsmittels überschichtet man mit Essigester, säuert bei 00 mit konz. Salzsäure an und extrahiert mit Essigester. Nach Neutralwaschen und Verdampfen hinterbleiben 3, 90 g eines Harzes =   100% d. Th.    



   Das Dicyclohexylaminsalz davon kristallisiert F. 167-169 . 



   15.H-Val-Gly-Lys (Z)-Lys(Z)-Arg(Z2)-Arg(Z2)-Pro-Val-Lys(PZ)-OBzy
Aus 2, 92 g des BOC-Nonapeptidesters wird, wie unter 7. beschrieben, die BOC-Gruppe abgespalten. 



  Ausbeute : 2, 54 g =   91%   d. Th. 



   Diinnschichtchromatogramm : Chloroform-Methanol (9 : 1) Rf   0, 4.   



   16.BOC-Pro-Val-Gly-Lys (Z)-Lys(Z)-Arg(Z2)-Arg(Z2)-Pro-Val-Lys(PZ)-OBzy
2, 985 g Nonapeptidester werden mit 466 mg BOC-Prolin nach der unter 6. beschriebenen Methode umgesetzt. Das erhaltene Rohprodukt wird aus   Dimethylformamid-Äther-Petroläther   umgefällt. Ausbeute   : 2, 70 g = 83'/0   d. Th. 



   Dünnschichtchromatogramm : Chloroform-Methanol (9 : 1) Rf 0,9. 



   17. H-Pro-Val-Gly-Lys (Z)-Lys(Z)-Arg(Z2)-Arg(Z2)-Pro-Val-Lys(PZ)-OBzy
2, 30 g BOC-Dekapeptidester werden, wie unter 5. beschrieben, mit Trifluoressigsäure behandelt. 



  Ausbeute   : 2, 108   g =   96% d. Th.   

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   Da die Dünnschichtchromatographie infolge der abnehmenden Löslichkeit nur noch schwierig durch- zuführen ist, wird folgende Methode zur Reinheitsprüfung verwendet :
Einige mg der obigen Substanz werden in Dimethylformamid gelöst, mit einem Tropfen Triäthyl- amin und einigen mg 2,   4-Dinitrofluorbenzol   versetzt. Nach Stehen über Nacht bei Zimmertemperatur   ! wird   das Dinitrophenylpeptid mit Äther ausgefällt, abzentrifugiert und mit Salzsäure total hydrolysiert. 



   Die Dinitrophenylaminosäuren werden chromatographisch untersucht. Es wurde nur ätherlösliches Dini- trophenyl-prolin gefunden. 



    18. BOC-Lys (Z)-Pro-Val-Gly-Lys (Z)-Lys (Z)-Arg (Z -Arg (Z )-Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy   
2, 10 g Dekapeptidester und 700 mg   BOC-Lys (Z)-Nitrophenylester   werden in 5 ml Dimethylformamid
2 Tage bei Zimmertemperatur und 12 h bei 450 aufbewahrt. Durch Eintropfen in 250 ml Äther wird das
Undekapeptidesterderivat gefällt. Ausbeute : 2,255 g   =93%.   



   19.   H-Lys (Z)-Pro-Val-Gly-Lys (Z)-Lys (Z)-Arg (Z -Arg (Z -Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy  
Das obige Produkt wird entsprechend der unter 7. beschriebenen Methode behandelt. Ausbeute :
2,08 g =   96%   d. Th. 



   Dinitrophenylierung : Ausgeführt wie unter 17. beschrieben. Bei diesem Versuch werden keine äther- löslichen Dinitrophenylaminosäuren erhalten, es wird einzig das wasserlösliche   (X- Dinitrophenyl-Iysin   gefunden. 
 EMI9.1 
 schriebenen Methode umgesetzt.   Ausbeute : l,   725   g = 97%o   d. Th. 



   21.   H-Gly-Lys (Z)-Pro-Val-Gly-Lys (Z)-Lys (Z)-Arg (Z )-Arg (Z -Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy  
1, 725 g BOC-Dodekapeptidester werden nach der unter 7. beschriebenen Methode behandelt. Ausbeute: 1,592 g =   961o     d. Th.   



   Dinitrophenylierung : Es wird nur ätherlösliches Dinitrophenyl-glycin gefunden, keine wasserlöslichen Dinitrophenylaminosäuren. 
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 Methode umgesetzt. Man reinigt das Produkt durch Umfällen aus Dimethylformamid-Äther. Ausbeute : 4,11 g geschützter Tridekapeptidester =   9fJ1/0 d.   Th. 



   23.H-Try-Gly-Lys (Z)-Pro-Val-Gly-Lys(Z)-Lys(Z)-Arg(Z2)-Arg(Z2)-Pro-Val-Lys(PZ)-OBzy
4,0 g des obigen Produkts werden nach der unter 7. beschriebenen Methode behandelt. Ausbeute : 3,86 g   = 1000/0   d. Th. 



   24. BOC-Arg(Z2)-Try-Gly-Lys(Z)-Pro-Val-Gly-Lys(Z)-Lys(Z)-Arg(Z2)-Arg(Z2)-Pro-Val-Lys(PZ)- - OBzy
Die obigen   3,   86 g Peptidester werden mit 2, 37 g   BOC-Arg (Z2) -OH   nach der unter 6. beschriebenen Methode umgesetzt. Man fällt aus Dimethylformamid-Äther um. Ausbeute : 4, 40 g geschützter Tetradekapeptidester =   9   o   d. Th. 



   25. H-Arg(Z2)-Try-Gly-Lys(Z)-Pro-Val-Gly-Lys(Z)-Lys(Z)-Arg(Z2)-Arg(Z2)-Pro-Val-Lys(PZ)-OBzy
4, 30 g der obigen BOC-Verbindung werden, wie unter 7. beschrieben, behandelt. Ausbeute : 4,15   g =     9Wo d. Th.    



     Dinitrophenylierung :   Chromatographisch wird nur wasserlösliches Dinitrophenyl-arginin gefunden. 



   26. BOC-Phe-Arg (Z2)-Try-Gly-Lys(Z)-Pro-Val-Gly-Lys(Z)-Lys(Z)-Arg(Z2)-Arg(Z2)-Pro-Val-Lys(PZ)- - OBzy
Aus 4, 15 g des obigen Produkts und 2, 14 g BOC-Phenylalanin-p-nitrophenylester wird nach der unter 18. beschriebenen Methode 4, 25 g geschützter Pentadekapeptidester =   95%   d. Th. erhalten. 



   27.H-Phe-Arg (Z2)-Try-Gly-Lys(Z)-Pro-Val-Gly-Lys(Z)-Lys(Z)-Arg(Z2)-Arg(Z2)-Pro-Val-Lys(PZ)- - OBzy
Aus 4, 18 g obiger BOC-Verbindung werden nach der unter 7. beschriebenen Methode 4, 14 g Penta-   dekapeptidesterderivat = 10210   d. Th. erhalten. 
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   28. BOC-His-Phe-Arg (Z)-Try-Gly-Lys(Z)-Pro-Val-Gly-Lys(Z)-Lys(Z)-Arg(Z2)-Arg(Z2)-Pro-Val- - Lys (PZ)-OBzy
Aus   4, 14g   des obigen Produkts und 1, 30 g BOC-Histidin werden nach der unter 6. beschriebenen Methode 4, 31 g   (= 97po   d.   Th.)   geschützter Hexadekapeptidester erhalten. 



   29. H-His-Phe-Arg(Z2)-Try-Gly-Lys(Z)-Pro-Val-Gly-Lys(Z)-Lys(Z)-Arg(Z2)-Arg(Z2)-Pro-Val- - Lys (PZ)-OBzy 

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Aus 4,20 g der obigen BOC-Verbindung wird nach der unter 7. beschriebenen Methode 3, 90 g BOCfreier Hexadekapeptidester   = 950/0   d. Th. erhalten. 
 EMI10.1 
 
BOC-Glu (OBzy)-His-Phe-Arg (ZAus obigen 3,90 g und 1, 5 g   BOC-Glutaminsäure-y-benzylester   werden nach der unter 6. beschrie- benen Methode 3, 93 g des geschützten Heptadekapeptidesters erhalten.   Ausbeute : 9210   d. Th. 



   31. H-Glu(OBzy)-His-Phe-Arg(Z2)-Try-Gly-Lys(Z)-Pro-Val-Gly-Lys(Z)-Lys(Z)-Arg(Z2)-Arg(Z2)-   - Pro-Val-Lys (PZ)-OBzy   
Aus 1, 954 g der obigen BOC-Verbindung werden nach der unter 7. beschriebenen Methode 1,   957 g  
BOC-freier Heptadekapeptidester (100% d. Th.) erhalten. 



   Dinitrophenylierung : Es wird einzig Dinitrophenylglutaminsäure gefunden. 
 EMI10.2 
 
Aus 2,00 g des obigen Peptidesters und 752 mg BOC-Methionin wird nach der unter 6. beschriebenen Methode der geschützte Octadekapeptidester hergestellt.   Ausbeute : l,   91 g = 90% d. Th. 



   33. H-Met-Glu(OBzy)-His-Phe-Arg(Z2)-Try-Gly-Lys(Z)-Pro-Val-Gly-Lys(Z)-Lys(Z)-Arg(Z2)- -Arg (Z2)-Pro-Val-Lys(PZ)-OBzy   I, 87   g des obigen Produkts werden nach der unter 7. beschriebenen Methode behandelt. Ausbeute : 
 EMI10.3 
   88- Arg (Z )-Arg (Z )-Pro-Vsl-Lys (PZ)-Obzy   
1, 88 g des obigen Produkts und 797 mg BOC-Serin (Bzy) werden nach der unter 6. beschriebenen Methode umgesetzt.   Ausbeute : l,   847 g geschützter Nonadekapeptidester = 92% d. Th. 
 EMI10.4 
 (Bzy)-Arg(Z2)-Arg(Z2)-Pro-Val-Lys(PZ)-OBzy
Die Behandlung von   l,   826 g des obigen Produkts nach der unter 7. beschriebenen Methode liefert 1, 82 g BOC-freien Nonadekapeptidester   =100ça   d. Th. 
 EMI10.5 
 



   (Z)-Pro-Val-Gly-Lys (Z)-37. H-Tyr(Bzy)-Ser(Bzy)-Met-Glu(OBzy)-His-Phe-Arg(Z2)-Try-Gly-Lys(Z)-Pro-Val-Gly-Lys(Z)- -Lys (Z)-Arg(Z2)-Arg(Z2)-Pro-Val-Lys(PZ)-OBzy
1, 885 g der obigen BOC-Verbindung werden nach der unter 7. beschriebenen Methode behandelt. 



    Ausbeute : l,   91 g BOC-freier Eikosapeptidester   =zo   d. Th. 



   38. BOC-Ser(Bzy)-Tyr(Bzy)-Ser(Bzy)-Met-Glu(OBzy)-His-Phe-Arg(Z2)-Try-Gly-Lys(Z)-Pro-Val- 
 EMI10.6 
    Gly-Lys (Z)-Lys (Z)-Arg (ZAus l, 875   g der obigen BOC-Verbindung wird durch Behandlung mit Trifluoressigsäure, entsprechend der unter 7. beschriebenen Methode, die BOC-Gruppe abgespalten. Das Rohprodukt wird durch Lösen in siedendem Alkohol und Abkühlen pulverig erhalten.   Ausbeute : l,   73 g = 94% d.   Th.   



   40. H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Ar-Arg-Pro-Val- - Lys-OH
259 mg des unter 39. beschriebenen Produkts werden in 11 flüssigem Ammoniak   gerührtbiszurlö-   sung. Nun werden beim Siedepunkt des Ammoniaks kleine Natriumstückchen zugegeben bis zur bleibenden Blaufärbung. Das überschüssige Natrium wird mit Ammoniumacetat zersetzt und das Ammoniak verdampfen lassen. Man löst den Rückstand in Wasser, wobei 55 mg gelbe, unlösliche Substanz zurückbleibt. 



  Die wässerige Lösung wird lyophilisiert und der Rückstand in 0, 1 n-Essigsäure   durch präparative Hochspan-   nungselektrophorese   (700 V) gereinigt.   Die   Sakaguchi-positiven   Fraktionen werden vereinigt und   lyophi-   lisiert. Ausbeute : 75, 9 mg Hexaacetat. Sie zeigen corticotrope Wirkung. 



   Die Ausgangsstoffe werden wie folgt hergestellt :
1.   N-BOC-N, NW-Dicarbobenzoxy-L-arginin  
2, 82 g   N. N -Dicarbobenzoxy-L-arginin   werden in 60 ml Dioxan und 60   ml Wasser   mit 2, 8 g 

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 Magnesiumoxyd und 1, 77 ml BOC-Azid über Nacht bei 450 gerührt. Man dampft das Dioxan im Vakuum ab, versetzt die wässerige Lösung mit Essigester und säuert bei   0    mit 2 n-Salzsäure an. Der Essigesterextrakt wird nach dem Waschen mit Wasser eingedampft. Rückstand : 2,70 g BOC-Arg (Z2) =   781o   d. Th. 



   Zur Reinigung wird das Produkt durch eine Säule von Silicagel (54 g) filtriert. Die mit Chloroform- 
 EMI11.1 
 
12,7 g BOC-Lys (Z) und 5, 5 g p-Nitrophenol werden in 65 ml Essigester gelöst und bei 00 mit 7,6 g
Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 5 h saugt man den Dicyclohexylhamstoff ab und verdampft den
Essigester. Der Rückstand wird in Methylenchlorid gelöst und bei 00 mit 0,   5m-Kaliumcarbonatlösung   ex- trahiert. Nach Waschen mit Salzsäure und Wasser und Trocknen mit Natriumsulfat wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand aus Äthanol-Wasser umkristallisiert. Ausbeute : 16,3 g BOC-Lys (Z)-ONP =   93% d.   Th. ; F. 91,   5 - 920.   



   3. BOC-L-Histidin
Zu einer Lösung von 19,2 g   L-Histidin-HCl   in 100 ml 2 n-Natronlauge und 200 ml Dioxan werden bei 450 langsam 14,6 ml BOC-Azid und 110 ml 1 n-Natronlauge zugetropft. Nach Rühren über Nacht wird das Dioxan im Vakuum eingedampft, die wässerige Lösung mit Essigester extrahiert und dann im
Vakuum auf wenige ml eingeengt. Man   überschichtet   die Lösung mit Butanol, säuert bei 00 mit Schwe- felsäure an und extrahiert mehrmals mit Butanol. Die Butanol-Auszüge hinterlassen nach dem Verdamp- fen des Lösungsmittels 15, 1 g =   5cl1/0   d. Th. eines Harzes des BOC-His, das papierchromatographisch ein- heitlich ist. Es wird noch durch Umfällen aus Äthanol-Äther gereinigt, wobei ein sehr hygroskopisches, amorphes Pulver erhalten wird. 



   4.   BOC-L-Glutaminsäure-y-benzylester  
Eine Suspension von 6,9 g   L-Glutaminsäure-y-benzylester   in 50 ml Dioxan wird mit 4, 45 ml BOC-   - Azid   versetzt. Bei 450 wird unter Rühren eine Lösung von 6, 1 g Kaliumhydrogencarbonat in 50 ml Wasser zugetropft. Die Aminosäure geht dabei langsam in Lösung. Nach Rühren über Nacht verdampft man das Dioxan im Vakuum, extrahiert die wässerige Lösung mit Essigester, säuert dann bei 00 mit Salzsäure an und extrahiert mit Essigester. Nach Waschen mit Wasser werden die Essigesterauszüge mit Natriumbicarbonatlösung (5%) und Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand besteht aus einem nicht kristallisierenden Öl. Ausbeute 7,9 g BOC-Glu (OBzy) =   81% d. Th.   



   Das Dicyclohexylaminsalz kristallisiert praktisch quantitativ aus Äther oder Essigester und wenig Petroläther. F. 145-146 . 



   5. BOC-L-Phenylalanin-p-nitrophenylester
6, 2 g BOC-L-Phenylalanin, 3,9 g p-Nitrophenol und 25 ml abs. Essigester werden bei 00 mit 5,3 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Man lässt über Nacht bei 00 stehen. Durch schwaches Erwärmen wird der auskristallisierte Nitrophenylester in Lösung gebracht, dann der Dicyclohexylhamstoff abgenutscht und das Filtrat im Vakuum zur Trockene verdampft. Nach Umkristallisieren aus Äthanol werden 6, 1 g =   691o     d. Th.   an Nitrophenylester vom F.   130-1320 erhalten.   Das analysenreine Produkt schmilzt bei   1350.   



   6.   BOC-O-Benzyl-L-serin  
10, 8 g   O-Benzyl-L-serin-methylester-D-hydrogentartrat   werden mit 23 ml 4 n-Natronlauge versetzt. 



  Nach 15 min wird die erhaltene Lösung mit Eisessig auf PH 6 gestellt. Man saugt das auskristallisierte 0-Benzyl-L-serin ab und wäscht es mit Wasser. Ausbeute : 4,95 g =   84%   d. Th. Dieses Produkt wird in 25, 4 ml 1 n-Natronlauge und 25 ml Dioxan gelöst, bei 450 mit 3,88 ml BOC-Azid und langsam mit 28 ml 1 n-Natronlauge versetzt. Nach Rühren über Nacht verdampft man das Dioxan im Vakuum, extrahiert die wässerige Lösung mit Essigester, säuert dann bei 00 mit Salzsäure an und extrahiert wieder mit Essigester. Die Essigesterauszüge werden im Vakuum eingeengt, mit 4,2 ml Dicyclohexylamin versetzt, mit Petroläther zur Kristallisation gebracht und das Salz abgenutscht. Ausbeute : 8,2 g Dicyclohexylaminsalz =   6Wo   d. Th. ; F.   134-135 .   



   Das   Dicyc10hexylaminsalz   wird warm in Wasser gelöst, mit Essigester überschichtet, auf 00 gekühlt und mit 2 n-Salzsäure angesäuert. Die Essigesterlösung wird nochmals mit Salzsäure, dann mit Wasser gewaschen, getrocknet und verdampft.   BOC-O-Benzyl-L-serin   bildet ein Öl. Die Ausbeute ist quantitativ. 

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Claims

PATENTANSPRÜCHE : 1. Verfahren zurHerstellung neuerHeneikosapeptide mit der Aminosäuresequenz L-Serin, L-Tyrosin, <Desc/Clms Page number 12> L-Serin, L-Methionin, L-Glutamin oder L-Glutaminsäure, L-Histidin, L-Phenylalanin, L-Arginin, L-Tryptophan, Glycin, L-Lysin, L-Prolin, L-Valin, Glycin, L-Lysin, L-Lysin, L-Arginin, L-Arginin, L-Prolin, L-Valin und L-Lysin und ihrer Derivate unter Anwendung an sich bekannter Verknüpfungsmethoden, dadurch gekennzeichnet, dass man vom Dipeptid L-Valyl-L-lysin oder seinen Derivaten ausgeht. EMI12.1 L-prolin mit dem Dipeptid L-Valyl-L-lysin kondensiert.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die einzelnen Aminosäuren stufenweise vom Carboxylende her miteinander kondensiert, beginnend mit einem L-Valyl-L-lysin-ester, dessen E-Aminogruppe geschützt ist.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die freien EMI12.2

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Dipeptidderivat den L-Valyl-paraphenylazo-benzyloxycarbonyl-lysin-benzylester verwendet.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die stufenweise Kondensation nach der Methode der gemischten Anhydride durchgeführt wird.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 3 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die a-Aminogruppe der zu kondensierenden Aminosäure durch den tert.-Butyloxycarbonylrest, die w-Aminogruppen des Lysins und Arginins durch die Carbobenzoxygruppe, die Hydroxylgruppen des Serins und des Tyrosins durch die Benzylgruppe und gegebenenfalls die y-Carboxylgruppe der Glutaminsäure durch die tert.-Butylestergruppe schützt. EMI12.3 setzt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kondensation in Gegenwart eines Carbodiimids ausführt.