AT256351B

AT256351B - Verfahren zur Herstellung neuer Polypeptide

Info

Publication number: AT256351B
Application number: AT360062A
Authority: AT
Original assignee: Ciba Geigy
Priority date: 1961-05-04
Filing date: 1962-05-03
Publication date: 1967-08-25
Also published as: FR2052M

Description

Verfahren zur Herstellung neuer Polypeptide
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syl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin, sowie der entsprechenden Verbindung, die statt des Glutamylrestes den Rest des Glutamins aufweist, und ihrer Derivate, Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe, z. B. derjenigen des Zinks, Kupfers oder Kobalts.

Unter Derivaten sind vor allem funktionelle Derivate, wie Ester, Amide, Hydrazide, zu verstehen, ferner N-Substitutionsprodukte, wie N-Acyl-, insbesondere N-Acetylderivate, und Verbindungen, welche die üblichen Amino-Schutzgruppen aufweisen.

Die neuen Verbindungen haben eine hohe adrenocorticotrope Wirksamkeit und sollen in der Humanund Veterinärmedizin als reine, einheitliche Stoffe an Stelle von ACTH verwendet werden. Zur Herstellung von synthetischen Corticotropinderivaten mit protahierter Wirkung eignen sich insbesondere auch die schwerlöslichen Zinkkomplexe. Die Verbindungen können ferner als Zwischenprodukte zur Herstellung von Heilmitteln, die eine längere Kette von Aminosäuren aufweisen, wie der adrenocorticotropen Hormone selbst, verwendet werden.

Die neuen Tetracosapeptide werden nach den für die Peptidherstellung bekannten Methoden erhalten, wobei die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleine-
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gruppe enthält, in Gegenwart eines Kondensationsmittels, wie eines Carbodiimids oder eines Phosphorigsäureesterhalogenids, verknüpfen oder man kann mit dem Aminosäure- bzw. Peptidester mit freier Aminogruppe eine Aminosäure bzw. ein Peptid mit aktivierter Carboxylgruppe (und geschützter Aminogruppe), z. B. ein Säurehalogenid,-acid,-anhydrid,-imidazolid,-isoxazolid (z. B. aus N-Äthyl- - 5-phenyl-isoxazolium-3'-sulfonat, s. Woodward et al., J. Am. Chem.

Soc. 89,1011 [1961]), oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester oder Carboxymethylthiolester, umsetzen. Umgekehrt kann auch eine Aminosäure bzw. ein Peptid mit freier Carboxylgruppe (und geschützter Aminogruppe) mit einer Aminosäure bzw. einem Peptid mit aktivierter Aminogruppe (und geschützter Carboxylgruppe), z. B. einem Phosphitamid, zur Reaktion gebracht werden. Alle genannten Methoden sind für jede erfindungsgemäss in Betracht kommende Bildung von Peptidbindungen anwendbar, jedoch sind die in den Beispielen angewendeten Verfahren besonders vorteilhaft.

Wie bereits erwähnt, bestehen verschiedene Möglichkeiten bezüglich des Aufbaues des Tetracosapeptids aus den einzelnen Aminosäuren bzw. kleineren Peptideinheiten. Ein Verfahren besteht z. B. darin, dass man das Decapeptid L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl- (oder glutaminyl)-
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- L-prolin kondensiert, wie beispielsweise im Schema Fig. l für die Verbindung, die als 5. Aminosäure L-Glutaminsäure enthält, gezeigt ist. BOC bedeutet eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe, tBu eine tertiäre Butylgruppe und iBu eine Isobutylgruppe. Das als Ausgangsstoff verwendete Decapeptid kann gemäss dem Verfahren der belgischen Patentschrift Nr. 604 570 hergestellt werden. Das Tetradecapeptid erhält man beispielsweise nach dem Schema der Fig. 2.

Ferner wird das Tetracosapeptid erhalten, wenn man das Tetrapeptid L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl- - L-methionin mit dem Eicosapeptid L-Glutamyl- (oder L-Glutaminyl)-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-ar-
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worin BOC und tBu die oben angegebenen Bedeutungen haben.

An der Reaktion nicht beteiligte, freie, funktionelle Gruppen werden zweckmässigerweise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, die Carboxylgruppe vorzugsweise durch Veresterung, z. B. mit Methanol, tert.-Butanol, Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, die Aminogruppe beispielsweise durch Einführung des Tosyl-, Tritylrestes oder der Carbobenzoxygruppe oder farbiger Schutzgruppen, wie der p-Phenylazo-benzyloxycarbonylgruppe und der p- (p'-Methoxy- -phenylazo)-benzyloxycarbonylgruppe, oder insbesondere des tert.-Butyloxycarbonylrestes. Zum Schutz der Aminogruppe in der Guanidogruppierung des Arginins ist die Nitrogruppe geeignet ; die genannte Aminogruppe des Arginins muss aber bei der Reaktion nicht notwendig geschützt werden.

Die Umwandlung einer geschützten NH-Gruppe in eine freie Gruppe sowie die Überführung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens zur Herstellung der Tetracosapeptide und Zwischenprodukte erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln.

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worin mindestens die a-Aminogruppe und die Seitenkettenaminogruppen sowie die Carboxylgruppe der Seitenkette und die terminale Carboxylgruppe geschützt sind, die Schutzgruppen durch Hydrolyse und bzw. oder Hydrogenolyse abspaltet und, wenn erwünscht, die erhaltenen Verbindungen in ihre Derivate oder Säureadditionssalze überführt.

Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen.

Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wieder lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen, wie z. B. solche mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder Thiocyansäure, Schwefel- oder Phosphorsäuren, oder organische Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure. Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fu- marsäure. Äpfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, 4-Amino-benzoesäure, 4-Hydroxy-benzoesäure, Anthranilsäure,

Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, 4-Amino-salicylsäure, 2-Phenoxy-benzoesäure, 2-Acetoxy-benzoesäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluol-sulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Sulfanilsäure.

Die verfahrensgemäss erhaltenen Tetracosapeptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial.

Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den Polypeptiden nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Glucose, Kochsalz, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger.

Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragées, Pulver, Salben, Cremen, Suppositorien oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzoder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Die in der Chromatographie verwendeten Systeme werden wie folgt bezeichnet :
System 43 : tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (100 : 40 : 55)
System 45 : sek.-Butanol-3 wässeriges Ammoniak (100 : 44)
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15 ml absolutem Methanol mit 0,6 ml Hydrazinhydrat während 1 h am Rückfluss gekocht. Das Lösungsmittel dampft man im Vakuum zur Trockne ein und fällt das Hydrazid mit viel Äther aus. Das anfänglich gallertige Produkt wird beim Zerkratzen fest. Man filtriert ab und wäscht auf der Nutsche gut mit Äther nach. Nach dem Trocknen über Schwefelsäure gewinnt man 1, 1 g PZ-Tetrapeptidhydrazid, F. 130-1310.

Eine Probe, aus heissem Wasser umkristallisiert, zeigt den gleichen Schmelzpunkt. Das Hydrazid
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3,06 g (23,7 mMol) Prolinmethylester in 20 ml Acetonitril gibt man zur Lösung von 7, 18 g (20,3 mMol) Carbobenzoxy-nitro-L-arginin in 20 ml Dimethylformamid, kühlt mit Eiskochsalz auf--50 bis-100 und versetzt hierauf mit der Lösung von 4,9 g Dicyclohexylcarbodiimid in 12 ml Dimethylformamid : Acetonitril = 1 : 1. Die Reaktionslösung wird noch mit 20 ml eiskaltem Acetonitril verdünnt und 17 h bei 00 belassen. Der gebildete Harnstoff wird abfiltriert, mit Acetonitril gewaschen und zur Lösung 5 Tropfen Eisessig gegeben. Nach 30 min dampft man das Lösungsmittel zur Trockne ein, nimmt

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und zum Schluss mit Wasser neutral.

Beim Eindampfen der getrockneten Essigesterlösung auf ein kleines Volumen fällt der Carbobenzoxydipeptidester beinahe quantitativ aus. Ausbeute : 6, 16 g (65, 5go d. Th. ), F. 155 - 1570 (Sintern 1530).

Beispiel 3 : H-Arg- (NOz} -Pro-OCH,.

8, 4 g Z-Arg- (NO)-Pro-OCH. werden unter Erwärmen in 27 ml Eisessig in der Wärme gelöst und bei Zimmertemperatur mit 27 ml"'4n-Bromwasserstoff-Eisessiglösung versetzt. Nach 1 h dampft man im Vakuum bei 400 auf ein kleines Volumen ein und fällt das Decarbobenzoxylösungsprodukt mit viel absolutem Äther aus. Das anfänglich klebrige Produkt wird so lange mit absolutem Äther behandelt, bis ein feines Pulver resultiert. Zur weiteren Reinigung wird das Dihydrobromid des Dipeptidesters noch einmal aus Methanol/Äther umgefällt. Die leicht gelb gefärbte Verbindung nimmt man in 4 ml Wasser auf, gibt dazu 150 ml Chloroform und kühlt das Gemisch im Eisbad auf 00 ab.

Unter intensivem Umschwenken gibt man in Portionen so lange festes Kaliumcarbonat dazu, bis alles Wasser verbraucht ist und sich das Kaliumcarbonat fest abscheidet. Das Kaliumcarbonat wird noch ein zweites Mal mit frischem Chloroform extrahiert, die vereinigten Chloroformextrakte über wasserfreiem Kaliumcarbonat getrocknet und durch eine G4 Glasfilternutsche durch wenig Cellit filtriert. Nach dem Verdampfen des Chloroforms bei 400 erhält man 5,5 g (90% d. Th.) Nitro-L-arginyl-prolin-methylester.

Die Verbindung wird ohne weitere Umsetzung weiterverarbeitet.
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den mit der Lösung von 8,92 g (25,2 mMol) Z-Arg (NO J-OH vereinigt, mit 50 ml Acetonitril verdünnt und im Kältebad auf -100 gekilhlt. Nach 30minütigem Stehen bei dieser Temperatur gibt man unter Rühren 5, 71 g (27, 7 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 12,5 ml eiskaltem Acetonitril dazu, und lässt 22 h bei 00 reagieren. Der Harnstoff wird abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum bis auf ein kleines Volumen eingedampft. Den sirupösen Rückstand nimmt man in Chloroform auf, wäscht 3mal mit 10 ml ln-Salzsäure, 2mal mit 10 ml Wasser und so lange mit ln-Natriumbicarbonat und 1n-Soda- lösung, bis beim Ansäuern der alkalischen Auszüge keine Fällung bzw.

Trübung mehr nachweisbar ist.

Zum Schluss werden die Chloroformauszüge mit Wasser neutral gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhält man 10, 4 g (62go) roher Carbobenzoxy-tripeptidester.

Eine Probe des Rohproduktes mit 2n-Bromwasserstoff-Eisessiglösung, 1 h bei Zimmertemperatur gespalten, zeigt im Papierehromatogramm in den Systemen 54 und 49 neben dem Tripeptid noch weitere
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2,2, 19 g (3,3 mMol) Z-Arg(NO )-Arg(NOJ-Pro-OCH werden in 13,2 ml 2n-Bromwasserstoffsäure- - Eisessiglösung während 1 h bei Zimmertemperatur decarbobenzoxyliert. Nach dem Verdampfen der überschüssigen Säure fällt man das Decarbobenzoxylierungsprodukt mit viel absolutem Äther aus. Das Rohprodukt nimmt man in 2 ml Wasser auf, extrahiert 2mal mit frischem Essigester, wäscht die Essigesterphasen noch einmal mit Wasser und gibt die vereinigten wässerigen Lösungen auf eine Ionenaustauschersäule Merck n.

Den freien Tripeptidester eluiert man mit 200 ml Wasser und dampft das Wasser im Vakuum bei 400 ab. Ausbeute : l, 3 g (74% d. Th.).

Im Papierchromatogramm in den Systemen 43,49 und 54 gibt der freie Tripeptidester mit Ninhydrin nur je einen positiven Fleck. Rf. 43/0, 42 ; 49/0, 67 und 54/0,49.

Beispiel 6 : T-Lys (BOC)-Lys (BOC)-Arg (NOJ-Arg (NO J-Pro-OCH .

1, 07 g (2,01 mMol) H-Arg(NO)-Arg(NOJ-Pro-OCH in 16,5 ml Dimethylformamid/Acetonitril 1 : 1 werden auf-100 gekühlt. Unter intensivem Rühren trägt man rasch 1, 44 g T-Lys (BOC)-Lys (BOC)- - OH (österr. Patentschrift Nr. 224621) in die Lösung ein, verdünnt mit 10 ml vorgekühltem Acetonitril und gibt nach 10 min 456 mg (2,2 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 5 ml eiskaltem Acetonitril dazu. Nach 20stündiger Reaktionszeit bei 00 filtriert man vom Harnstoff ab und dampft das Lösungsmit-

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scheiden sich noch weitere 1, 07 g PZ-Dipeptid aus. F. 167 - 1690.

Die Gesamtausbeute beträgt 5, 48 g (70% d. Th.). Die Analysenfraktion schmilzt nach einmaligem
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Das UV-Spektrum in Feinsprit zeigt bei Xmax 230 mg e = 13400 und Àmax 322 mg E = 23000.

Beispiel 11 : Z-Val-Tyr-Pro-OtBu.

Zu 11,25 g (27,4 mMol) Carbobenzoxy-valyl-tyrosin (österr. Patentschrift Nr. 226386) in 100 ml frisch destilliertem Acetonitril gibt man die Lösung von 4, 65 g (27, 4 mMol) Prolin-tert. -butylester in 25 ml Acetonitril und kühlt im Eisbad auf 00 ab. Dann gibt man die Lösung von 6,21 g Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml kaltem Acetonitril dazu und lässt 15 h bei 00 reagieren. Der auskristallisierte Harnstoff wird abfiltriert (90"/0 d. Th.) und die Reaktionslösung mit 1 ml Eisessig versetzt. Nach 15 min dampft man das Acetonitril im Vakuum ab, nimmt den Verdampfungsrückstand in Essigester auf und filtriert nochmals vom ausgeschiedenen Harnstoff ab.

Die Essigesterlösung wird 2mal mit 10 ml eiskalter 2n-Salzsäure extrahiert, anschliessend so lange mit 2n-Sodalösung-bis angesäuerte Proben keine Ausfällung mehr anzeigen-und zum Schluss mit Wasser neutral gewaschen. Die Essigesterextrakte trocknet man über Natriumsulfat und dampft das Lösungsmittel unter vermindertem Druck ab. Ausbeu- te : 14, 1 g (880/0 d. Th.) amorphen Carbobenzoxy-tripeptidester.

Der Carbobenzoxytripeptidester ist in den meisten organischen Lösungsmitteln, ausser Äther, Petroläther und Benzol, gut löslich. Er wird ohne weitere Reinigung direkt weiter verarbeitet.

Beispiel 12 : H-Val-Tyr-Pro-OtBu.
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Kohlendioxyd wird mit Kalilauge in einer zweiten, dazwischen geschalteten Hydrierente absorbiert.

Nach 2 h ist die Wasserstoffaufnahme beendet. Die vom Katalysator befreite Lösung dampft man im Vakuum bei 400 zur Trockne ein und verteilt den Verdampfungsrückstand zwischen 200 ml Essigester und 2mal 20 ml eiskalter 2n-Sodalösung. Die Sodalösungen werden nochmals mit frischem Essigester extrahier, die Essigesterphasen mit Wasser neutral gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum gewinnt man 7, 69 g (71% d. Th.) freier Tripeptidester.

Im Papierchromatogramm in den Systemen 43,45 und 54 wandert der Tripeptidester mit der Lösungsmittelfront und gibt mit Ninhydrin und Paulyreagens je 1 Fleck.

Beispiel 13 : PZ-Val-Lys (BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu.

Die Lösung von 10,36 g (17,7 mMol) PZ-Val-Lys (BOC)-OH und 7,69 g (17,7 Mol) H-Val-Tyr- - Pro-OtBu in 140 ml frisch destilliertem Dimethylformamid wird bei oc) mit 4,2 g Dicyclohexylcarbodiimid (15loger Überschuss) in 12 ml Dimethylformamid versetzt und 2 Tage bei 00 belassen. Die vom Harnstoff befreite Lösung lässt man noch weitere 30 min mit 0,5 ml Eisessig stehen, dampft das Lösungsmittel im Vakuum bis auf ein kleines Volumen ab und nimmt den sirupösen Rückstand in viel Es-
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waschen. Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat und Verdampfen des Lösungsmittels erhält man 17 g rohes amorphes Reaktionsprodukt. Zur weiteren Reinigung gibt man das Rohprodukt, in 100 ml Chloroform gelöst, auf eine mit 10"/0 Wasser desaktivierte Silikagelsäule (570 g ; 0 5,6 cm, h = 41 cm).

Mit Chloroform eluiert, wandert die orangerote Zone nur langsam, während mit Chloroform : Essigester 2 : 1 sich 2 Fraktionen auswaschen lassen.

Die erste Fraktion 4, 8 g ist noch stark mit Dicyclohexylharnstoff und PZ-Dipeptid verunreinigt und lässt sich aus Acetonitril nur in schlechter Ausbeute kristallisieren, während die zweite Fraktion (7,2 g) aus 200 ml Acetonitril als gallertiges Produkt wieder ausfällt. Ausbeute : 5, 1 g, PZ-Pentapeptidester, F. 154 - 1580.

Die Analysenfraktion schmilzt nach einer weiteren Kristallisation bei 157-159 .

Im UV-Spektrum (in Feinsprit aufgenommen) zeigt die Verbindung 2 Maxima bei 227 mu und 322 mg mit den E-Werten 20700 und 21100.

Im Dünnschichtchromatogramm (Kieselgel G ; Merck) sind die Rf-Werte : 0,23 (Chloroform : Aceton = 95 : 5) und 0,60 (Benzol : Aceton = 1 : 1).
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Man filtriert vom Katalysator ab, wäscht ihn wiederholt mit Methanol und dampft das Lösungsmittel im Vakuum ab. Der Verdampfungsrückstand wird mit viel Äther zerteilt und im Hochvakuum getrocknet.

Es resultiert ein feines amorphes Pulver. Ausbeute : 980 mg.

In den Systemen 54 und 49 wandert die Verbindung mit der Lösungsmittelfront.

Im Dünnschichtchromatogramm (Kieselgel G) im System Dioxan : Wasser = 9 : 1 ist der Rf-Wert 0, 65.

B eispiel 15: PZ-Lys (BOC)-Pro-Val-Gly-Lys (BOC)-Lys (BOC)-Arg (NO2) - Arg (NO )-Pro-Val- -Lys (BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu.
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man 0,16 mMol Triäthylamin in 1, 6 ml Tetrahydrofuran dazu und nach weiteren 5 min 0,16 mMol Chlorameisensäureisobutylester in 1, 6 ml abs. Tetrahydrofuran. Man lässt 15 min im Kältebad reagieren und gibt dann 140 mg H-Val-Lys (BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu, gelöst in 2 ml abs. Tetrahydrofuran, dazu. Man rührt noch 15 min im Eisbad und anschliessend 1 h bei Zimmertemperatur, dann dampft man das Lösungsmittel im Vakuum bei 400 ab und fällt das Reaktionsprodukt mit viel Äther aus. Das getrocknete Rohprodukt (395 mg) wird in 4 ml alkoholfreiem Chloroform auf eine Aluminiumoxydsäule (Aktivität 111 ; 40 g) gegeben und mit 100 ml Chloroform durchgewaschen.

Die gelbe Zone mit dem Peptidderivat wandert dabei nur langsam. Anschliessend wird mit 80 ml Chloroform : Methanol = 95 : 5 durchgewaschen. Dabei lassen sich 290 mg chromatographisch einheitliches Produkt eluieren. Rf = 0, 75,
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: 1- Tyr-Pro-OtBu, 3 CH, COOH.

320 mg PZ-Tetradecapeptid-tert. -butylester (Beispiel 14) werden in 6 ml 90goriger Essigsäure und in Gegenwart von 100 mg 10"/oigem Palladiumkohlekatalysator während 5 h bei 5 atm mit Wasserstoff geschüttelt. Anschliessend füllt man die Reaktionslösung in eine Hydrierente, und schüttelt noch weitere 17 h mit 100 mg frischem Pd-Katalysator unter Normalbedingungen weiter. Zur Absorption des gebildeten Kohlendioxyds wird noch eine 2. Hydrierente mit Kalilauge dazwischen geschaltet. Den abfiltrierten Katalysator wäscht man gut mit 90% figer Essigsäure und Methanol und dampft das Lösungsmittel im Vakuum zur Trockne ein. Nach dem Trocknen erhält man 220 mg eines weissen amorphen Pulvers.

Das UV-Spektrum zeigt in Feinsprit bei 278 mou das für Tyrosin charakteristische Maximum (e = = 1500).

Im Papierchromatogramm in den Systemen 49,50 und 54 wandert die Verbindung mit der Lösungsmittelwand und gibt positive Reaktionen mit Ninhydrin, Pauly- und Sakaguchi-Reagens.

Beispiel 17 : BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu (OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys (BOC)-Pro-Val-Gly- - Lys (BOC)-Lys (BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys (BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu.

210 mg Tetradecapeptid-tert.-butylester (Beispiel 16) werden bei 00 in lOmll/lOn-Salzsäure rasch gelöst und die resultierende Lösung im Hochvakuum lyophil getrocknet. Den feinen weissen Rückstand trocknet man noch 2 h bei 500 im Hochvakuum über Phosphorpentoxyd. Gleichzeitig werden 160 mg (0, 11 mMol) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu (OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH (belg. Patentschrift Nr. 604 570) in der Wärme in 1 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst, wieder auf Zimmertemperatur abgekühlt und zum Trihydrochlorid des Tetradecapeptids gegeben. Man verdünnt noch mit weiteren 2, 5 ml Dimethylformamid und erhält nach 10 - 15 min eine klare Lösung.

Nach 2stündigem Stehen im Eisbad gibt man 42 mg (0,2 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 0,6 ml eiskaltem Acetonitril dazu, lässt 13 h bei 00 und 48 h bei Zimmertemperatur reagieren. Das rohe Reaktionsprodukt wird dann mit viel Essigester ausgefällt und im Hochvakuum bei 400 getrocknet. Rohausbeute : 330 mg.
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18 : H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-- Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH, CH COOH.

100 mg rohes geschütztes Tetracosapeptid (Beispiel 17), das noch mit Ausgangspeptiden verunreinigt ist, werden 1 h bei Zimmertemperatur mit 2 ml wasserfreier Trifluoressigsäure behandelt. Die überschüssige Säure wird bei Zimmertemperatur im Vakuum abgedampft und der resultierende Rückstand mit viel absolutem Äther zerteilt. Das amorphe Spaltprodukt wird in 4,5 ml 0,5n-Essigsäure einer kontinuierlichen Hochspannungselektrophorese unterworfen (700 V ; 30 m A) Auftragsgeschwindig- keit : 1 ml/h. Insgesamt werden 23 Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 1-9,10, 12-13,14-15, 16 und 17-23 werden eingedampft. Die elektrophoretische Analyse zeigt, dass in den Fraktionen 12-15

die Hauptmenge des gewünschten Tetracosapeptids enthalten ist.

Zur weiteren Reinigung gibt man die vereinigten Fraktionen 12-15 in 2 ml 1/100 molarem Ammoniumacetatpuffer gelöst, auf eine Carboxymethylcellulosesäule ( < P l cm ; 1. 16 cm ; 2,5 g).-Die Carboxymethylcellulose wird mit 100 ml 1/100 molarem Ammoniumacetatpuffer in die Säule eingefüllt und noch mit weiteren 50 ml des gleichen Puffers durchgewaschen. - Das Peptid wird dann mit Ammoniumacetatpuffer (PH = 5,4) steigender Molarität (0, 1 - 0, 7 m) von der Säule eluiert.

Es werden Fraktionen von 10 ml Volumen mit einem automatischen Fraktionensammler aufgefangen. Nach 15 Fraktionen ist das Peptid wieder quant. von der Säule getrennt. Man erhält total 15 Fraktionen. Die Gläschen 10-13 enthalten elektrophoretisch reines Tetracosapeptid. Der zurückgelegte Weg nach 1 h bei 3000 V und PH 1, 9 beträgt 13 - 17 cm.

Im In-vitro-Test nach Saffran und Schally zeigt das erhaltene Peptid eine starke ACTH-Aktivität.
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Die Lösung wird mit 0,1n-Natronlauge titriert. Die Titrationskurve zeigt einen Zinkkomplex mit pH = 8, 35 an. Bei und oberhalb vom pH-Wert 8, 35 beginnt der schwerlösliche Komplex in sehr fein verteilter, gelartiger Form auszufallen. Er wird bei PH 9,5 abzentrifugiert und mit Wasser gewaschen. Der Komplex besitzt eine starke ACTH-Aktivität.

PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung neuer Tetracosapeptide, dadurch gekennzeichnet, dass man
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nyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin oder seinem Amid, worin mindestens die a-Aminogruppe und die Seitenkettenaminogruppen sowie die Carboxylgruppe der Seitenkette und die terminale Carboxylgruppe geschützt sind, die Schutzgruppen durch Hydrolyse und/oder Hydrogenolyse abspaltet und, wenn erwünscht, die erhaltenen Verbindungen in ihre Derivate oder Säureadditionssalze überführt.

Claims

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminogruppen durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe geschützt sind. EMI11.3 gruppe (n) durch die tert.-Butylestergruppe geschützt sind.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzgruppen durch saure Hydrolyse abgespalten werden.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man aus tert.- EMI11.4 säure abspaltet.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man aus tert.- EMI11.5 nannten Tetracosapeptide in Schwermetallkomplexe, insbesondere Zinkkomplexe, überführt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man das Tetracosapeptid EMI11.6 syl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin mit einem Zinksalz umsetzt und das PH auf 8, 35 - 9, 5 einstellt.

Druck : Ing. E. Voytjech, Wien