DE1793162C3 - Corticotropes Octadecapeptidamid und Herstellung desselben - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein corticotropes Octadecapeptidamid. dessen Komplexe mit Metallen und pharmazeutisch vertretbare Salze davon. Das neue Octadecapeptidamid hat die Struktur Glycyl-i.-tyrosyl-L - seryl - l - methionyl -1. - glutamyl - L - histidyl -1 - phenylalanyl -L- arginyl -1 - tryptophyl - giycyl -1 - lysyl-L - prolyl -1. - valyl - glycyl -1. - lysyl -1. - lysyl -1 - arginyl-L-argininamid. Die Erfindung bc üeht sich ferner auf ein Verfahren zu seiner Herstellung sowie auf ein neues geschütztes Octadecapeptidamid und ein Verfahren zu dessen Herstellung.

Es ist bekannt, daß die Reaktivität der Hydroxylgruppe von Serin sowie die Labilität der Serylpeptidbindung unter alkalischen Bedingungen, die Neigung zu /-(-Eliminierungen unter Bildung von Dehydropeptid und die N — Ü-Acylwanderung die Herstellung von Serin enthaltenden Peptiden sehr erschwert, die häufig wegen der Labilität gegen alkalische Bedingungen racemisieren. Die Herstellung von Serin enthaltenden Peptiden wird von solchen unerwünschten Nebenreaktionen und Racemisierungen, wie sie oben genannt wurden, begleitet. Dagegen wurde überraschenderweise gefunden, daß das Octadecapeptidamid mit einem Glycinrest an Stelle des N-endständigen Serins weit leichter als das entsprechende Serinpeptid in hoher Reinheit und Ausbeute ohne Nebenreaktionen und Racemisierungen durch Umsetzung des N-endständigen Decapeptids mit dem C-ständigen Octapeptidamid zugänglich ist. Ferner wurde gefunden, daß die erfindungsgemäß erhältlichen Produkte als pharmazeutische Mittel und Wirkstoffe dafür vorteilhaft sind.

Durch die Erfindung wird ein neues Octadecapeptidamid geschaffen, das eines der kürzesten corticotropen Peptide darstellt, ähnliche biologische Eigenschaften wie natürliches Corticotropin, darunter steroidogene, lipolytische und melanotrope Aktivität, aufweist und sich durch ähnliche therapeutische Eigenschaften wie natürliches Corticotropin auszeich-

net. nämlich insbesondere zur Behandlung von Störungen verschiedener Organe wie akutem und chronischem Gelenkrheumatismus und Allergien vorteilhaft ist. Das erfindungsgemäße Octadecapeptid eignet sich zur raschen Prüfung der adrenalen Funktion, ohne daß immunologische Störungen wie bei natürlichen Corticotropinen, die unerwünschte proteinartige Verunreinigungen enthalten, auftreten. Durch die Erfindung wird ferner ein neues geschütztes Octadecapeptidamid, ein neues Verfahren zur Herstellung des Octadecapeptidamids in hoher Reinheit und Ausbeute ohne Nebenreaktionen und Racemisierungen sowie ein neues Verfahren zur Herstellung des geschützten Octadecapeptidamids geschaffen.

Es gibt eine Reihe von Möglichkeiten zur Herstellung des Octadecapeptidamids aus den Aminosäuren oder PeptiJfragmenten. Durch die Erfindung wird ein geeignetes Verfahren zur Herstellung dieses Polypeptids geschaffen.

Erfindungsgemäß kann das Octadecapeptidamid der Struktur Glycyl-i.-tyrosyl-i-seryl-i -methionyi-',. - glutamyl -1. - histidyl -1 - phenylalanyl · : - arginyli. - tryptophyl -glycyl -1. - lysy! -1. - prolyl -1 - valy 1 - glycyl -1. - lysyl -l - lysyl - L-arginyl -1 - argininamid durch Umsetzung des geschützten N-ständigen Decapeptids der Struktur N" - V - Glycyl - L - tyrosyl - l - seryl - L - methionyl-y-W-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycins mit dem geschützten C-ständigen Octapeptidamid der Struktur N'-X-L-Lysyl - L - prolyl - l - valyl - glycyl - Ν^ε - Y -1. - lysyl - N' - Z-i.-lysyl-l.-arginyl-L-argininamid, worin V,X,Y und Z jeweils Gruppen wie Benzyloxycarbonyl-, p- Methoxybenzyloxycarbonyl-, ρ - Nitrobenzyloxycarbonyl-, tert.-Arrryloxycarbonyl-, tert.-Butyloxycarbonyl- oder

Form> igruppen bedeuten und W eine Gruppe wie Methyl, Äthyl, Propyl. Isopropyl, tert.-Butyl. Benzyl, p-Nitrobcnzyl oder p-Methoxybenzyl darstellt, in einem inerten Lösungsmittel bei einer Temperatur von -10 bis 40⁰C während 24 bis 72 Stunden nach Methoden, bei denen beispielsweise Dicyclohexylcarbodiimid, Carbonyldiimidazol, das Azid, der aktivierte Ester, das gemischte Anhydrid, Woodward-Reagens oder eine Kombination dieser Methoden angewandt wird, und anschließende Acidolyse, katalyti-

zo sehe Reduktion oder Hydrol^e, des erhaltenen geschützten Octadecapeptidamids zur Abspaltung aller Schutzgruppen bei einer Temperatur von 0 bis 40 C während 30 bis 90 Minuten unter Bildung des gewünschten Octadecapeptidamids hergestellt werden, wie es in dem nachstehenden Schema dargestellt ist.

W WYZ

! Ill

V—GIy · Tyr · Ser · Met · GIu · His · Phe ■ Arg ■ Try · GIy - Oh · H-Lys · Pro · VaI · GIy · Lys · Lys · Arg ■ Arg ■ NH₂

W j X YZ

! ¹I 11

V—GIy ■ Tyr · Ser · Met · GIu ■ His · Phe · Arg · Try · GIy · Lys · Pro · VaI · GIy · Lys · Lys - Arg · Arg · NH₂

H-GIy Ί yr · Ser · Met ■ GIu - His · Phe ■ Arg · Try · Giy ■ Lys · Pro · VaI · GIy · Lys · Lys · Arg ■ Arg · NH₂

Das als Ausgangsstoff verwendete geschützte N-ständige Decapeptid kann im wesentlichen nach dem Verfahren, das in Bulletin of the Chemical Society of Japan, Bd. 39, Nr. 6, 1171 (1966), beschrieben ist, hergestellt werden. Das als weiterer Ausgangsstoff verwendete geschützte C-ständige Octapeptidamid kann im wesentlichen nach dem Verfahren hergestellt werden, das in Bulletin of the Chemical Society of .Iapan, Bd. 39, Nr. 5, 882 (1966), angegeben ist.

Alle freien funktionellen Gruppen, die nicht an der Umsetzung beteiligt sind, werden vorteilhafterweise geschützt, insbesondere mit Hilfe von Resten, die sich durch Methoden wie Hydrolyse, katalytische Reduktion oder Acidolyse leicht entfernen lassen. Die Carboxylgruppe wird vorteilhafterweise durch Veresterung, beispielsweise mit einem niederen Alkanol (z. B. Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol. tert.-Butanol) oder einem niederen Aralkanol (z. B. Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, p-Methoxybenzylalkohol) geschützt. Die Aminogruppe wird beispielsweise durch Einführung der Benzyloxycarbonylgruppe, p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppc, p-Nitrobenzyloxycarbonylgruppe, Formylgruppe, tert.-Amyloxycarbonylgruppe und vorzugsweise der tert.-Butyloxycarbonylgruppe geschützt. Zum Schutz der Guanidogruppe von Arginin ist die Nitrogruppc geeignet, es ist jedoch nicht immer erforderlich, die Guanidogruppe von Arginin während der Umsetzung zu schützen. Auch die f-Aminogruppe von Lysin wird vorzugsweise durch eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe geschützt. Ferner wird die -/-Carboxylgruppe von Glutaminsäure vorzugsweise in Form des tert.-Butylesters geschützt.

Als inertes Lösungsmittel, das als Reaktionsmedium verwendet wird, ist beispielsweise Dimethylformamid. Dimelhylsulfoxyd, Dimethoxyäthan, Pyridin. Hexamethylphosphortriamid, Dioxan oder eine Mischung daraus geeignet, die sowohl das N-ständige geschützte Decapeptid als auch das C-ständige Octapeptidamid α lösen vermag.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei einer Temperatur von —10 bis 4O⁰C, vorzugsweise 0 bis 20° C, während 24 bis 72 Stunden durchgeführt werden.

Alle für die erfindungsgemäßen Zwecke verwendeten Schutzgruppen können durch katalytische Reduktion, Hydrolyse oder Behandlung mit einem sauren Medium, z. B. Trifluoressigsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Fluorwasserstoff, Flußsäure, Bromwasserstoff, Bromwasserstoffsäure, Chlorwasserstoff, Salzsäure oder einer Mischung daraus entfernt werden. Es wird jedoch besorrlers bevorzugt, die Schutzgruppen für das Octadecapeptidamid so zu wählen, daß die Amino- und Carboxylschutzgruppen in einer Stufe durch milde Acidolyse bei einer Temperatur von 0 bis 40⁰C während 30 bis 90 Minuten entfernt werden können. Das erfindungsgemäß erhältliche Octadecapeptidamid wird durch bekannte Methoden gereinigt, z. B.

durch Säulenchromatographie an Ionenaustauschharzen, lonenaustauschcellulose oder durch Gegenstromverteilung.

Das Octadecapeptidamid wird in der Basenform oder in Form von pharmazeutisch annehmbaren nichttoxischen Säureadditionssalzen davon erzeugt. Diese Salze können durch Behandlung des Peptids mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren (z. B. Flußsäure, Bromwasserstoffsäure, Salzsäure), Schwefelsäure oder Phosphorsäure oder mit organisehen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glycolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Benzolsulfonsäure oder Toluolsulfonsäure hergestellt werden.

Das so erhaltene Octadecapeptidamid zeigt ähnlich wie natürliches Corticotropin ausgeprägte steroidogene, lipolytische und melantrope Aktivität und ist als pharmazeutisches Mittel geeignet, insbesondere zur Behandlung von akutem oder chronischem Gelenkrheumatismus oder von Allergien verschiedener Oigane. Die verschiedenen pharmakologischen Eigenschaften des Octadecapeptidamids sind nachstehend zusammen mit den biologischen Werten angegeben.

Die steroidogene Aktivität des Octadecapeptidamids wird in der folgenden Tabelle gezeigt:

Tabelle 1

Steroidogene Aktivität

Präparat und Dosis

(pro 100 g Körpergewicht der

getesteten Ratten)

Standard-Corticotropin*)

1,0 mU

0,2 mU

Octadecapeptidamid

Zahl

der

Ratten

6
6

6
6

Corticosteron-

produktion

^g/IOO mg

Nebenniere

25 Minuten nach

intravenöser

Injektion)

34,56 ± 2,43
19,53 ± 1,76

40,91 ± 7,37
19,28 ± 0,83

0,002 [ig

*) 3. USA, Corticotropin-Bczugsstandard (5U/AmpuUe).

Bemerkung:

Die steroidogene Aktivität in vivo wurde nach r'mec Modifikation der Methode von Lipscomb und Nelson (Endcrinol, 71.13,1962) an hypophysenectomierten 4-Sttinden-RaUen.

Aus den Werten in Tabelle I wird die steroidogene Aktivität des erfindungsgemäßen Octadecapeptidamids in vivo mit 170,3 U/mg berechnet. Dieser Wert ist hoch im Vergleich zu natürlichem gereinigtem Corticotropin. Die durchschnittliche Aktivität des Peptids in fünf unabhängigen Untersuchungen beträgt 161 ± 13 USP-Einheiten (U)/mg.

Die lipolytische Aktivität des erfindungsgemäßen Octadecapeptidamids wurde an Kaninchen- und Rattenfettgewebe nach einer Modifikation der Methode von White und Engel (J.din.Invest 371556 [1958]) geprüft. Die Ergebnisse sind in Tabellen und Tabelle III angegeben.

Tabelle II
Lipolytische Wirkung auf Kaninchenfett

Behandlung
^g/Röhrchen)

Kontrolle

Octadecapeptidamid

0,1

0,01

0,001

0,0001

Zahl
der
Inkubation

4
4
4
4

NFEA*-Produktion (|LÄq/IOO mg Gewebe)

Gesamtmenge im

Gewebe und

Medium

0,190 ± 0,050

3,684 ±0,152 2,397 ±0,103 0,788 ±0,111 0,343 ± 0,068

hormonale Wirkung

3,494 2,207 0,598 0,153

Tabelle III
Lipolytische Wirkung auf Rattenfett

Lt'handlung
^g/Röhrchen)

Kontrolle

Octadecapeptidamid

1

0,1

0,01

Zahl
der
Fettstücke

4
4

NEFA*-Produktion (nÄq/100 mg Gewebe)

Gesamtmenge im ' Gewebe und Medium

0,510 ± 0,05 i

1,917 ± 0,126 1,138 ± 0,158 0,481 ± 0,007

hormonale Wirkung

1,407

0,628

-0,029

Bemerkung: NEFA* bedeutet nicht veresterte Fettsäuren.

Die lipolytische Aktivität des Peptids wurde aus den vorstehenden Werten Tür Kaninchenfett mit 0,0035 Mikrogramm und für Rattenfestt mit 0,012 Mikrogramm als minimale wirksame Dosis berechnet.

Das Octadecapeptidamid wurde auf melantrope Aktivität in vitro nach der Methode von K. Shizume, A.B. Lerner und T.B. Fitzpatrick, Endocrinol. 54, 553 (1954), unter Verwendung von Rana pipiens als Testtier im Vergleich zu Tetracosapeptid (Synacthen ^e, CIBA-Produktj geprüft. Als Bezugsstandard wurde natürliches reines a-Melanocytenstimulierungshormon (a-MSH) verwendet Die Ergebnisse zeigt die folgende Tabelle.

Melanotrope Aktivität des Octadecapeptidamids und des Tetracosapeptids in vitro

55

Testverbindung

Octadecapeptidamid
_fo Tetracosapeptid

MSH-Aktivität, Einheiten/g

6,7 · 10⁸

2,1 10⁸

Die melanotrope Aktivität des Octadecapeptidamids ist etwa dreimal so hoch wie die des Tetracosapeptids. Da natürliches Schweinecorticotropin eine melanotrope Aktivität von 1,7 · 10⁸ Einheiten g aufweist, wie von R. G. S h e ρ h e r d, J. Am. Chem. Soc. 78, 5051 (1956), berichtet wurde, ist die melanotrope Aktivität des erfindungsgero^'ßen Octadecapepüds

ferner etwa viermal so hoch wie die von natürlichem Schweinecorticotropin.

Das erfindungsgemäße Ocladecapeptidamid hat eine langdauernde Wirkung, die in F i g. 1 dargestellt is..

In F i g. 1 ist der Einfluß des Peptids bei intravenöser Injektion in die vena femoralis (0.2 μg/100 g) auf die Corticosteronkonzentration im adn;nalen Venenblut von hypophysenectomierten 4 Stunden alten Ratten im Vergleich zu einem natürlichen Corticotropin (gereinigtes Schaf-ACTH: 120 LJ. mg) dargestellt. Wie aus F i g. 1 ersichtlich ist, wird ein beträchtlicher Corticosteronspiegel aufrechterhalten.

Im allgemeinen werden Polypeptidhormone häufig infolge Denaturierung, Oxydation, enzymatischem Abbau und durch die physikalischen und chemischen Bedingungen der Umgebung verursachte Veränderungen inaktiv. Das erfindungsgemäße Octadecapeptid dagegen ist lange Zeit ohne Aktivitätsverlust beständig. Zur Prüfung der Stabilität wurde ein Test in einer Salzlösung (pH 6,7) durchgeführt. Die relative steroidogenc Aktivität des in einem Kühlschrank bei 5° C aufbewahrten Octadecapeptidamids wurde 0, 6, 12 und 27 Tage nach der Auflösung bestimmt. Die bei diesem Test festgestellten Aktivitäten des Peptids sind in Tabelle IV angegeben.

Tabelle IV
Beständigkeitstest in Salzlösung

Tag nach Auflösung

Aktivität (U/mg)

187,2
125,0

75.3

60.6

Aus diesem Versuch kann geschlossen werden, daß die Aktivität zwar von Tag zu Tag abzunehmen scheint, daß sich der Wert am 12. Tag jedoch nicht statisch von der Anfangsaktivität unterscheidet. Man kann also das erfindungsgemäße Octadecapeptidamid für wenigstens 12 Tage als stabil bezeichnen.

Das neue Octadecapeptidamid hat feiner keine unerwünschten biologischen Nebenwirkungen, z. B. anaphylaktische Reaktionen, die bei Verabreichung vcn natürlichem Corticotropin häufig auftreten. Diese gefährlichen anaphylaktischen Reaktionen können durch die Anwesenheit hochmolekularer proteinartiger Verunreinigungen verursacht werden, die aus dem natürlichen Corticotropin, das aus tierischen Drüsen hergestellt wird, nicht vollständig entfernt werden können. Selbst wenn solche Verunreinigungen entfernt werden könnten, wären sehr umständliche und aufwendige Maßnahmen zur Reinigung erforderlich. Solche unerwünschten Reaktionen können auch durch eine bestimmte Gruppe im Molekül des natürlichen Hormons bedingt sein. In dieser Hinsicht ist das synthetische Hormon, nämlich das neue Octadecapeptidamid, dem natürlichen Corticotropin überlegen, wie durch die verschiedenen im folgenden beschriebenen biologischen Tests bestätigt wird.

Eine Prüfung auf pyrogene Wirkung wurde mit drei weiblichen Kaninchen durch intravenöse Injektion (8 U/ kg) durchgeführt. Bei diesem Versuch stieg bei keinem der drei getesteten Kaninchen die Körpertemperatur um mehr ais 0,5~ C. Dem erfindur.gbgemäß erhältlichen Octadecapeptidamid fehlt also jegliche pyrogene Aktivität.

Die F i g. 2. 3 und 4 zeigen die Wirkungen des erfindungsgemäßen Octadecapeptidamids auf Blutdruck, Herzfrequenz und Atemfrequenz von Kaninchen mit einem Gewicht von jeweils etwa 2,5 kg im Vergleich zu natürlichem Corticotropin (N. V. Organon, Holland), das als Standard diente. Für jeden Versuch wurden durch subkutane Verabreichung von Urethan anüsthesierte Kaninchen als Prüftiere verwendet. Das Octadecapeptidamid und das natürliche Corticotropin wurden jeweils in einer Salzlösung gelöst und den Kaninchen durch Injektion in die vena femoralis verabreicht (8 U/kg). Die Wirkungen auf Blutdruck.

Herzfrequenz und Atemfrequetiz wurden nach folgender Methode untersucht: Fine Glaskanüle wurde in die Trachea eingesetzt, um die Respirationskurve mit einem Respirationsaufnahmegerät (Nihon Koden MTR-IT) aufzuziehen, und eine weitere Kanüle wurde in die Arteria carotis comm. eingesetzt, um den Blutdruck mit einem elektrischen Manometer (Nihon Koden MP-4) zu bestimmen. Ferner wurde die Ableitung 11 des Elektrokardiogramms unter Verwendunμ eines Wechselstrom-Vorverstärkers (Nihon Koden RB-2) bestimmt. Jedes Signal wurde auf einem Schreiboszillographen mit Tintenschreiber (Nihon Koden WT-180) registriert. Das Octadecapeptidamid und natürliche Corticotropin wurden durch einen Polyäthylcnschlauch in die vena fernnralis verabreicht.

F i g. 2 zeigt die Wirkungen des Octadecapeptidamids und des natürlichen Corticotropins auf den Blutdruck bei Kaninchen. Bei dem Versuch betrug der maximale Abfall des maximalen Blutdrucks und der des minimalen Blutdrucks bei Verabreichung des Octadecapeptidamids 21 ± 8,3 mm Hg bzw. 28.4 ± 4,6 mm Hg. Bei Verabreichung des natürlichen Corticotropins betrug der maximale Abfall des maximalen Blutdrucks und der des minimalen Blutdrucks 36 ± 8,2 mm Hg bzw. 30 ± 6,6 mm Hg. Auch die Depressorwirkung des natürlichen Corticotropins hielt im Vergleich zu dem Octadecapeptidamid länger an. F i g. 3 zeigt, daß die Wirkung des Octadecapeptidamids auf die Herzfrequenz bei Kaninchen schwächer als die des natürlichen Corticotropins ist. Besonders wird eine zeitweilige Abnahmme der Herzfrequenz (in den ersten 0 bis 5 Minuten nach der Verabreichung) beobachtet, wenn das natürliche Corticotropin gegeben wird. Dieses jähe Absinken der Herzfrequenz ist im Hinblick auf klinische Anwendungen unerwünscht.

Bei Verabreichung des Octadecapeptidamids dagegen wird ein solches Absinken der Herzfrequenz von Kaninchen nicht festgestellt Die Wirkung des Octadecapeptidamids auf die Herzfrequenz von Kaninchen ist also nicht so drastisch wie die des natürlichen Corticotropins.

F i g. 4 zeigt außerdem, daß das erfindungsgemäße Octadecapeptidamid die Atemfrequenz von Kaninchen nicht beeinflußt, während bei Verabreichung des natürlichen Corticotropins die Atemfrequenz der Kaninchen erheblich beschleunigt wird.

Auf Grund dieser Ergebnisse bestehen keine Bedenken gegen die praktische Anwendung des Octadecapeptidamids zur Behandlung der obengenannten Krankheiten, selbst wenn natürlichen Corticotropin

und das verwandte synthetische Peptid konU aindiziert sind.

Auch mit einem Metallkomplex des Octadecapeptidamids wird die hohe Aktivität und Einheiten des

Corticosteronblutspiegels erzielt. Ein solcher Komplex kann beispielsweise hergestellt werden, indem man 0,5 g des Octadecapeptidamids in 0,25 ml einer Salzlösung, die 40 mMol Zinkchlorid enthält, bei pH 3 löst· und die Lösung mit 0,25 ml einer Salzlösung von 4OmMoI Dim iriumhydrogenphosphonat und 2% Benzylalkohol mit pH 11,5 versetzt. Wenn das in Salzlösung gelöste Zinkoctadecapeptidamid in den Schenkelmuskel von hypophysenectomierten 4 Stunden alten Ratten injiziert wird, ergibt sich die Plasmacorticosteronkonzentration in Abhängigkeit von der Zeit, die in Tabelle V wiedergegeben ist.

Tabelle V

Zeit nach

Injektion

(hr)

V₂

2
3
4

Plasma-Corticosteron

freies Peptid
(S μ/10 μΙ/Ratle)

8,58 ± 2,76*)

50,35 ± 2,05

37,34 ± 7,44

6,20 ± 2,42

2,44 ± 0,09

Zink-Peptid
(2,5 μ%/2,5 μΙ/Ratte)

6,11 ±0,31

47,61 ± 5,41

53,21 ± 3,78

54,87. ± 6,29

50,00 ± 1,99

8,07 ± 3,73

3,39 ± 0,62

10

Beispiel 1

*) Jeder Wert ist der Durchschnitt von 4 Ratten.

Aus der Tabelle ergibt sich, daß der Zinkkomplex des Octadecapeptidamids hohe Aktivität und eine langanhaltende Wirkung im Vergleich zu freiem Octadecapeptidamid aufweist.

Das erfindungsgemäöe Octadecapeptidamid zeigt also starke steroidogene, lipolytische und melanotrope Aktivität. Es hat ferner keine unerwünschten biologischen Nebenwirkungen, z. B. antigene Wirkungen. Es zeigt ferner beträchtliche Langzeitwirkung.

Das Octadecapeptidamid kann als injektionsflüssigkeit, Suspension oder Emulsion in Form der Base oder von pharmazeutisch annehmbaren nichttoxischen Säureadditionssalzen davon mit geeigneten Trägern, Stabilisatoren, Emulgatoren, konservierenden Mitteln oder Netzmitteln, die mit dem Peptid nicht reagieren und pharmazeutisch annehmbar sind, verabreicht werden. Ferner können Komplexe des Octadecapeptidamids mit den Metallen, Zink, Kupfer, Nickel, Kobalt und Eisen auf Grund ihrer Langzeitwirkung mit Vorteil zur Behandlung der verschiedenen Krankheiten verwendet werden. Ein typischer klinischer Dosierungsbereich für die erfindungsgemäßen Verbindungen beträgt ungefähr 0,2 bis 0,8 U/kg bei einem normalen Erwachsenen.

Das neue erfindungsgemäß erhältliche Octadecapeptidamid bietet also große Vorteile für eine Reihe von Anwendungen als pharmazeutisches Mittel, Mittel für die Veterinärmedizin und Tierzucht und für die Bereitung solcher Mittel. Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel weiter erläutert. Gewichtsteile stehen zu Volumteilen im gleichen Verhältnis wie Gramm zu Milliliter.

80,4 Gewiciitsteile tert. - Butyloxycarbonyl - glycyl-L - tyrosyl -1. - seryl - l - methionyl - γ - tert. - butyli. - glutamyl -1. - histidyl -L- phenylalanyl -1. - arginyl-L-tryptophyl-glycindihydrat und 74,2 Gewichtsteile aus dem entsprechenden Octapeptidamidtriacetat hergestllte Ν^ε - tert. - Butyloxycarbonyl - l - lysyl - l - prolyl-L - valyl - glycyl - N^r- - tert. - butyloxycarbonyl - l - lysyl-

,o N' - tert. - butyl - oxycarbonyl -1 - lysyl -1. - arginyli. - argininamidtrihydrochlorid werden in 150 Volumteilen Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit 12,7 Gewichtsteilen N-Hydioxysuccinimid und hierauf mit 14,4 Gewichtsteilen Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die Mischung wird 1 Stunde bei 0^cC und weitere 48 Stunden bei Zimmertemperatur umgesetzt. Man nitriert den abgeschiedenen kristallinen Niederschlag aus Dicyclohexylharnstoff ab und gießt das Filtrat in 100 000 Volumteile kaltes Äthylacetat. Der entstandene Niederschlag wird abnitriert, mit Äthylacetat gewaschen und getrocknet, wodurch man 139,3 Gewichtsteile tert. - Butyloxycarbonyl - glycyl-L - tyrosyl -1. - seryl -1. - methionyl - γ - tert. - butyl-L - glutamyl -1. - histidyl -1. - phenylalanyl -1. - arginyl-L - tryptophyl - glycyl - N* - tert. - butyloxycarbonyl-L - lysyl - L - prolyl -1. - valyl - glycyl - Ν^ε - tert. - butyloxycarbonyl -1. - lysyl - N¹ - tert. - butyloxycarbonyl -1. - lysyl -1 - arginyl -1. - argininamidtrihydrochlorid erhält. Das geschützte Octadecapeptidamid-trihydrochlorid wird in 5000 Volumteilen 50%igem tert.-Butanol gelöst. Die Lösung wird mit 11OU Volumteilen (in feuchtem Zustand) »Amberlite CG-4B*« (Acetatform) versetzt und 1 Stunde bei Zimmertemperatur gerührt. Man filtriert das Harz ab und läßt das Filtrat nach Zusatz von 500 Volumteilen Mercaptoäthanol 14 Stunden bei 37° C stehen. Die Mischung wird an einer Carboxymethylcellulosekolonne mit Ammoniumacetatpuffer gereinigt. Die Fraktionen 55 bis 70 werden vereinigt, unter verminderteui Druck eingedampft und lyophilisiert, wodurch man 105,3 Gewichtsteile des geschützten Octadecapeptidamidtriacetats erhält. 138,9 Gewichtsteile dieses Peptids werden in einer Mischung aus 200 Volumteilen Wasser und 1800 Volumteilen Trifluoressigsäure gelöst und 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehengelassen. Nach Entfernung der Lösungsmittels unter vermindertem Druck wird der Rückstand in üblicher Weise mit »Amberlite CG-4B*« (Acetatform) behandelt und an einer Carboxymethylcellulosekolonne mit Ammoniumacetatpuffer gereinigt. Die Fraktionen 70 bis 120 werden vereinigt, unter vermindertem Druck eingedampft und lyophilisiert, wodurch man 70 Gewichtsteile Glycyl - L - tyrosyl - l - seryl - l - πκ uiionyl-L - glutamyl - l - histidyl - l - phenylalanyl - l - arginyl-L - tryptophyl - glycyl - L - lysyl - l - prolyl - l - valylglycyl - L - lysyl -1- lysyl - l - arginyl - l - argininamid· hexaacetat erhält. Das Octadecapeptidamidhexaacetai hat einen optischen Drehwert von [α] ψ = -51,^ ± 1,9° (c = 0,472; 0,1 η-Essigsäure). Die Aminosäure analyse ergibt die theoretisch erwarteten Verhältniss< der darin enthaltenen Aminosäuren. Das Peptic liefert ferner auf Papier im Lösungsmittelsystem n-Bu tanol-Essigsäure-Pyridin-Wasser (30:6:20:24) einei einzigen Fleck (R_f = 0,10), der mit Ninhydrin-, Ehr lieh-, Pauly-, Sakaguchi- und Methiontn-Reagen reagiert

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (6)

Patentansprüche:

1. Glycyl - l - tyrosyl - l - seryl L - methionyl-L - glutamyl - L - histidyl - l - phenylalanyl - l - arginyl-L - tryptophyl - glycyl - L - lysyl - l - prolyl -1_ - valylglycyl - L - lysyl - L - lysyl -1. - arginyl - L - argininamid und dessen pharmazeutisch vertretbaren Säureadditionssalze.

2.N³-V-Glycyl-L-tyrosyl-L-seryl-i -methionyl- γ - W - L - glutamyl - L - histidyl - l - phenylalanyl-L - arginyl - L - tryptophyl - glycyl - N^£ - X - l - lysyl-L - prolyl - L - valyl - glycyl - N* - Y - l - lysyl - N - Z-L - iysyl - L - arginyl - l - argininamid. worin V. X. Y und Z die Aminoschutzgruppen tert.-Butyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl, Formyl, Benzyloxycarbonyl, ρ - Methoxybenzyloxycarbonyl oder p-Nitrobenzyloxycarbonyl und W eine der Carboxylschutzgruppen Methyl, Äthyl. Propyl. Isopropyl, tert.-Butyl. Benzyl, p-Nitrobenzy' und p-Methoxybenzyl bedeuten.

3. tert. - Butyloxycarbonyl - glycyl -1 - tyrosyl-L - seryl - L - methionyl - ■.· - tert. - butyl - L - glut? myl-L-histidyl-i -phenylalanyl-i -arginyl-L-tryptophylglycyl-N -tert.-butyl-oxycarbonyl-i-lysyl-L-pro-IyI -i.- valylglycyl - Ν^ε - tert. - butyloxycarbonyl-L - lysyl - N^£ - tert. - butyloxycarbonyl - L - lys/i - L - arginyl-i -argininamid.

4. Verfahren ^ur Herstellung von Glycyl-L-tyrosyl - L - seryl - l - methionyl - L - glutamyl - l - histidyl-L - phenylalany! - L - arginyl - l - tryptophyl - glycyl-

1. - lysyl - L - prolyl - L - valy 1 - £lycy 1 - l - lysyl -1. - lysyI-L - arginyl -L- argininamid, dadurch gekennzeichnet, daß man aus einer Verbindung der Struktur N¹ - V - Glycyl - l - tyrosyl - l - seryl -1. - methionyly-W-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-aiginy 1 - L - try ptophyl - glycyl - N^£ -X - l - lysyl -1 -prolyl-L - valyl - glycyl - N^£ - Y - L - lysyl - N^£ - Z - L - lysyl-L - arginyl -1. - argininamid, worin V. X, Y und Z jeweils eine der Schutzgruppen tert.-Butyloxycar bonyl, tert.-Amyloxycarbonyl, Formyl, Benzyloxycarbonyl, ρ-Methoxybenzyloxycarbonyl und p-Nitrobenzyloxycarbonyl und W eine der Carboxylschutzgruppen Methyl. Äthyl. Propyl, Isopropyl, tert.-Butyl, Benzyl, p-Nitrobenzyl und p-Methoxybenzyl bedeutet, in an sich bekannter Weise sämtliche Schutzgruppen durch katalytische Reduktion, Hydrolyse oder saure Behandlung mit Trifluorcssigsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Fluorwasserstoff, Flußsäure, Bromwasserstoff, so Bromwasserstoffsäure, Chlorwasserstoff, Salzsäure oder einer Kombination daraus bei einer Temperatur von - 10 bis 4O⁰C entfernt.

5. Verfahren zur Herstellung von N^a-V-Glycyl-

L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-·/-W-1.-glutamyl-L-histidyl-i.-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycyl - N^£ - X - L - lysyl - l - prolyl -1. - valyl - glycyl-N^£-Y-L-lysyl-N^£-Z-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Struktur N* - V - Glycyl -1. - tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-y-W-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin mit einer Verbindung der Struktur N'-X-L-lysyl-i.-prolyl-L-valyl-glycyl-N'-Y-i.-lysyl-N'-Z-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid, worin V, X, Y und Z jeweils eine der Aminoschutzgruppen tert.-Butyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl, Formyl, Benzyloxycarbonyl, ρ - Methoxybenzyloxycarbonyl und ρ - Nitro·· benzyloxycarbonyl und W eine der Carboxylschutzgruppen Methyl, Äthyl, Propyl, Isopropyl, tert.-Butyl. Benzyl, p-Nitrobenzyl und p-Methoxybenzyl bedeutet, in an sich bekannter Weise nach der aktivierten Estermethode, Dicyclohexylcarbodümidmethode. Azidmethode, gemischten Anhydridmethoden. Carbonyldiimidazolmethode. mit Woodward - Reagens oder einer Kombination daraus bei einer Temperatur von —10 bis 40^;C während IG bis 50 Stunden in Dimethylformamid. Dimethylsuifoxyd, Dimethoxyäthan. Pyridin, Hexamethylphosphortriamid, Dioxan oder einer Mischung daraus als inertes Lösungsmittel umsetzt.

6. Pharmazeutisches Mittel, gekennzeichnet durch eine Verbindung der Struktur Glycyl-L - tyrosyl - l - seryl - l - methionyl - l - glutamyl-L - histidyl -1. - phenylalanyl - L - arginyl -1. - tryptophyl - glycyl -1. - lysyl -1 - prolyl - 1. - valyl - giycyl-L-lysyl-L-lysyl-i -arginyl-1-argininamid in Mischung oder Verbindung mit pharmazeutisch vertretbaren Trägern. Stabilisatoren. Emulgatoren, konservierenden Mitteln, Netzmitteln und oder den Metallen Zink. Kobalt, Nickel. Kupfer und Eisen.