DE2749932C2

DE2749932C2 - 1-Desamino-asparagin↑4↑-D-arginin↑8↑-vasopressin-Analoga, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese Verbindungen enthaltende antidiuretische Arzneimittel

Info

Publication number: DE2749932C2
Application number: DE2749932A
Authority: DE
Inventors: Lars Åke Ingemar Malmö Carlsson; Jan Mulder
Original assignee: Ferring AB
Current assignee: Ferring AB
Priority date: 1976-11-12
Filing date: 1977-11-08
Publication date: 1985-08-08
Also published as: SE407682B; DE2749932A1; JPS6254120B2; SE7612667L; GB1539318A; BE860717R; JPS5382790A

Description

a) stufenweise die Aminosäuresequenz
Mep(SH)-Tyr-Phe-A-B-Cys(SH)-Pro-D-Arg-Gly-NH₂ (VlI)

I 2 3 4 5 6 7 8 9

aufbaut und
b) dieses Peptid zu I-Desamino-auparagin^D-arginin^vasopressin-Analoga der Formel

I I

Mep-Tyr-Phe-A-B-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NHj (I)

I 2 3 4 5 6 7 8 <>

oxidiert.

3. Antidiuretische Arzneimittel, enthaltend l-Desamino-asparagin⁴-D-arginiri⁸-vasopressin-Analoga nach Anspruch 1 als Wirkstoff sowie pharmazeutisch verträgliche Träger.

Die Erfindung betrifft antidiuretisch wirksame l-Desamino-asparagin⁴-D-arginin⁸-vasopressin-Analoga mit verlängerter Wirksamkeit und ohne Nebeneffekte gemäß der im Anspruch 1 angegebenen allgemeinen Formel i, in der Mep ein 2-Mercaptopropionylrest (-S-CH₂CH₂CO-) ist, sowie A und B jeweils GIn oder A Asn und B GIn bedeuten, und D-Arginyl in der Position 8 vorhanden ist.

Die Dauer der antidiuretischen Aktivität des Vasopressins hängt von der Geschwindigkeit des enzymatischen Abbaus des intakten Peptids ab. Strukturmodifikationen des Peptids, die die Geschwindigkeit des enzymatisehen Abbaus unter Beibehalt der biologischen Aktivität verringern, sind deshalb sehr erwünscht, insbesondere wenn sich dabei zusätzlich eine Verstärkung und Ausweitung der therapeutischen Wirksamkeit ergibt. Wenn man in Arginin-vasopressin die Cysteingruppe in der Position 1 durch Mep und L-Arg in der Position 8 durch D-Arg ersetzt, erhält man Desamino-D-arginin⁸-vasopressin, abgekürzt DDAVP, welches ein Analogon des Vasopressins ist und eine erweiterte antidiuretische Wirksamkeit sowie einen wesentlich verringerten Effekt auf die glatte Muskulatur des Gefäßsystems; und Darmtraktes im Vergleich zu Vasopressin aufweist. Beide Effekte sind wertvoll bei der Behandlung von Diabetes insipidus. Außer diesen beiden wertvollen Effekten muß bei Frauen, die unter Diabetes insipidus leiden und die schwanger sind oder werden wollen, auch die uterotonische Aktivität in Betracht gezogen werden. Die älteren Vasopressinderivate, die in therapeutischem Gebrauch sind, haben eine zu starke uterotonische Aktivität, so daß sie schwangeren Frauen ohne die Gefahr von Fehlgeburten nicht verabreicht werden können. Es besteht deshalb ein Bedürfnis nach einem Medikament für Schwangere mit Diabetes insipidus, das in therapeuti sch wirksamer Dosierung eine ausreichend geringe uterotonische Aktivität hat.

Im Hinblick darauf, daß die Diabetes insipidus eine ständige, d. h. lebenslange medikamentöse Behandlung erfordert, besteht die Gefahr, daß der Patient nach einer gewissen Behandlungsdauer entweder immun oder überempfindlich gegen das Medikament wird. Um die Behandlung der Krankheit fortsetzen zu können, muß dann ein anderes gleichwertiges Medikament verwendet werden, welches keine derartige Immunität oder Allergie beim Patienten hervorruft. Alternative Medikamente zu Vasopressin und DDAVP stehen jedoch bisher nicht zur Verfügung. Aufgabe der Erfindung ist es deshalb, diesem Bedürfnis abzuhelfen. Die vorliegende Erfindung ist auf ein neues Vasopressinderivat gerichtet, das einen antidiuretischen Effekt in dergleichen Größenordnung wie bekannte Mittel bei gleichzeitig wesentlich niedrigerer uterotonischer Wirksamkeit aufweist, so daß das Verhältnis von Antidiurese zu uterotonischer Wirksamkeit wesentlich verbessert wird. Genauer gesagt ist die uterotonische Wirksamkeit des erfindungsgi:mäßen Mittels um eine Zehnerpotenz niedriger als bei den bisher bekanntei Mitteln, so daß man ein um mehr als eine Zehnerpotenz höheres Verhältnis von Antidiurese zu uterotonischer Aktivität erhalt, was als einzigartiges Ergebnis anzusehen ist. Erfindungsgemäße Verbindungen können deshalb Frauen verschrieben werden, die an Diabetes insipidus leiden und die schwanger werden wollen, und die Verschreibung an solche Frauen kann während der gesamten Schwangerschaftsdauer erfolgen, wodurch sich völlig neue Möglichkeiten für diese Patientinnen eröffnen.
Die Verbindungen der Erfindung können sowohl in Form der freien Base als auch als Salze anorganischer oder

organischer Säuren verwendet werden, gegebenenfalls unter Zufügung von Hilfsstofien, Stabilisatoren und Konservierungsmitteln, Süßstoffen, geschmacksgebenden Substanzen, Netzmitteln u. dgl. zur Herstellung geeigneter Verabreichungsformen für die parenterale, perorale, intranasale, subkutane, intramuskuläre und intravenöse Verabreichung. Beispiele von geeigneten anorganischen Säuren sind Salzsäure und Phosphorsäure, während verwendbare organische Säuren z. B. Essigsäure, Zitronensäure und Weinsäure sind. Verbindungen mit Säurefunktionen, z. B. Tannin, können ebenfalls verwendet werden. Geeignete Zusätze sind Stärke, Lactose, natürliche oder gehärtete Öle, Talk, Glycerin usw. Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen Verbindungen ist ihre gute intranasale Resorbierbarkeit. Dies hat zur Folge, daß der Patient sich das Medikament in einfacher und leicht zugänglicher Weise durch die Nase verabreichen und dosieren kann. Er braucht sich deshalb nicht einer Spritze für die intravenöse Verabreichung zu bedienen, was wesentlich umständlicher und unangenehmer wäre.

Die Verbindungen der Erfindung werden hergestellt unter Verwendung eines geschützten Pentapeptidamids (II) als Ausgangsprodukt:

X-B-Cys(Bzl)-Pro-D-Arg(Y)-Gly-NH₂. (II)

Hierbei ist B wie oben definiert, X ist eine Schutzgruppe für die Aminogruppe (Be.izyloxycarbonyl), BzI ist eine Schutzgruppe für die Mercaptogruppe (Benzy!) desCysteins und Y ist eine Schutzgruppe für den Guanidin-Stickstoff (p-Toluolsulfonyl). Die Schutzgruppe X wird entfernt und das Pentapeptid wird mit (III) gekoppelt,

X-A-ONp (IH)

wobei A wie oben definiert und ONp eine p-Nitrophenylestergruppe ist, so daß man das geschützte Hexapeptid (IV) erhält:

X-A-B-Cys(Bzl)-Pro-D-Arg(Y)-Gly-NH₂. (IV)

Nun wird die Schutzgruppe X des Peptids (IV) entfernt und das Hexapeptid mit dem Dipeptidhydrazid (V)

Mep(Bzl)-Tyr-Phe-NHNH₂ (V) so

mittels der Azid-Kopplungsmethode verbunden, wobei man das geschützte Nonapeptidamid (VI) erhält:
Mep(Bzl)-Tyr-Phe-A-B-Cys(Bzl)-Pro-D-Arg(Y)-Gly-NH₂ (VI)

Durch Behandlung dieses geschützten Nonapeptidamids mit einem Alkalimetall in flüssiger Ammoniaklösung werden die Schutzgruppen abgespalten und das reduzierte Nonapeptidamid (VlI)

Mep(SH)-Tyr-Phe-A-B-Cys(SH)-Pro-D-Arg-Gly-NH₂ (VII)

123456789

erhalten, das in einer wäßrigen Lösung mit Kaliumferricyanid bei einem pH von 6,5 bis 7,0 oxydiert wird, wodurch man das cyclische, biologisch aktive Peptid der allgemeinen Formel (I) erhält.

Vom Vasopressin unterscheidet sich das Peptid nach Formel (I) dadurch, daß die Aminosäure in Position 4 durch Asparagin und gleichzeitig die Cysteingruppe in Position 1 durch Mep sowie das L-Arginin in Position 8 durch D-Arginin ersetzt ist. Dieses Peptid nach Fo.mel (I) weist im Vergleich zum Vasopressin außer einer guten intranasalen Resorbierbarkeit eine verbesserte antidiuretische Wirksamkeit, einen wesentlich verringerten Blutdruckerhöhungseffekt, eine sehr nachhaltige Wirksamkeit und eine wesentlich herabgesetzte uterotonische Aktivität (vgl. Tabelle I) auf. Als Vergleichssubstanzen ist in Tabelle I außer Arginin-vasopressin auch DDAVP, ein analoges 4-Val-DDAVP, welches aus der Literatur bekannt ist, (J. Med. Chem. 16, 1973, 975-8) aufgerührt, so Da bei dem antidiuretischen Peptid der allgemeinen Formel (I) die Kurve Tür den Logarithmus der Dosis relativ zur Reaktion nicht linear ist, ist es schwierig, in üblicher Weise die Wirksamkeit in Einheiten pro Milligramm für das D-Arginin⁸-Analogon im Vergleich zu Vasopressin anzugeben. Deshalb wurden in Tabelle I die Stärken als relative Wirksamkeitswerte angegeben, wobei die Werte für DDAVP als Vergleichssubstanz willkürlich zu 1,00 festgelegt wurden.

Tabelle

Vergleichswerte für antidiuretische Wirksamkeit, Blutdruckwirksamkeit und uterotonische Wirksamkeit
für DDAVP-Anaioga im Vergleich zu DDAVP

Peptid	Aktivität	Nachhaltigkcit	Blutdruck	Utcrolonisch	Antidiurese	Antidiurese
	Antidiurese				Blutdruck	Uterotonisch

DDAVP (bekannt) 1,00 ++ 1,00 1,00 1.00 1,00

4-Val-DDAVP (bekannt) 1.44 ++ <0,15 0,9 >9,60 1,6

Fortsetzung

Peptid	Aktivität	Nachhaltigkeit	Blutdruck	Uterotonisch	Antidiurese	Antidiurese
	Antidiurese				Blutdruck	Uterotonisch

5-Gln-DDAVP 0,45 ++

4-ASn-S-GIn-DDAVP 0,40 ++

Arg-Vasopressin (bekannt) 0,10 -

0,18
<0,30
1450

<0,02 <0,02 1,0

2,5

0,00006

>23 >20 0,1

Es ist aus der Tabelle ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen im Vergleich zu den bekannten Verbindungen gute Werte für Antidiurese, Nachhaltigkeit und Blutdruckwirksamkeit aufweisen. Hinzu kommt ein wesentlich verbesserter Wert für die uterotonische Aktivität und ein wesentlich höherer Wert für das Verhältnis Antidiurese zu uterotonischer Aktivität. Hieraus ergibt sich, daß das Mittel gleichzeitig eine gute antidiuretische Wirksamkeit, eine geringere Blutdruckerhöhung, gute Nachhaltigkeit der Wirkung und einen extrem niedrigen uterotonischen Effekt aufweist, was besonders wertvoll für an Diabetes insipidus leidende Frauen nach der Empfängnis ist.

Die Verbindungen der Erfindung können als therapeutische Präparate in wäßrigen oder nichtwäßrigen Lösungen, die organische oder anorganische Salze, Säuren oder Basen enthalten, für die orale, rektale oder subkutane Verabreichung zubereitet werden.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert. Für diese gelten, soweit nichts anderes angegeben ist, die folgenden Angaben und Definitionen.

Es wurden die folgenden Abkürzungen verwendet:

TLC = Dünnschichtchromatographie

AAA = Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung

Cbz = Carbobenzyloxy-Gruppe

Tos = Tosyl-Gruppe (p-Toluolsulfonyl-Gruppe)

Die Eindampfungen wurden mit einer Wasserstrahlpumpe und bei 35°C durchgeführt, falls nichts anderes angegeben ist. Sämtliche Lösungsmittel waren von Reagenzienqualität. Der pH der nichtwäßrigen Lösungen wurde mit angefeuchtetem Lackmuspapier bestimmt. Der optische Drehwinkel wurde mit einem Perkin-Eimer 141 Polarimeter gemessen.

Dünnschichtchromatogramme wurden auf »Merck DC-Fertigplatten Kieselgel 60« in den folgenden Systemen angefertigt:

A: Butanol: Essigsäure : Wasser 4:1:1

B: Butanol : Pyridin : Essigsäure : Wasser 15 : 10 : 3 : 6

C: Cyclohexan : Äthylacetat: Methanol 1:1:1

D: Chloroform : Methanol : Essigsäure 10:2:1

E: Chloroform : Methanol : Essigsäure : Wasser 30 : 20 : 4 : 6

Für die Analysen der Aminosäurezusammensetzungen wurden Proben in 6 M HCl in verschlossenen Rohren bei 11O⁰C 24 Stunden lang hydrolysiert.

Die Analysen-.Vurden mittels eines automatischen Aminosäuren-Analysators vom Typ JEOL-5 AH mit einer Genauigkeit von ±1,2% erhalten.

Beispiel 1
Cbz-D-Arg(Tos)-Gly-OEt

Eine 0°-Lösung von Cbz-D-Arg(Tos) (509 g, 1,10 MoI), GIy-OEt. HCl (169 g, 1,21 Mol) und 169 ml (1,21 Mol) Triäthylamin in 1,81 1 Chloroform wurde mit einer Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid (227 g, 1,10 Mol) in 600 ml Chloroform behandelt und bei Raumtemperatur 24 Stunden lang stehengelassen. Der Dicyclohexylharnstoff wurde abgefiltert und mit 3 Teilen Chloroform gewaschen, und das Filtrat und das Waschprodukt wurden bei verringertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in 61 Äthylacetat aufgelöst und mit 1-1-Anteilen von 0,25 N HCI (6X), Wasser (IX), 5% NaHC₁ (3X) und H₂O (2X) gewaschen. Die EtOAc-Lösung wurde getrocknet (Na₂SO₄) und eingedampft (Ölpumpe), wodurch 554 g (92%) des geschützten Dipeptidesters 1 erhalten wurden.

{atf + 31° (c 3,0, 95% Essigsäure) AAA: Arg, 0,85; GIy, 1,00 TLC: Rf: 0.62. Rf°: 0.67

Beispiel 2
Cbz-Pro-D-Arg(Tos)-Gly-OEt (2)

Der geschützte Dipeptidester 1 (425 g, 0,77 Mol) wurde in einer Lösung von HBr (478 g) in Essigsäure (2800 ml) unter Schütteln aufgelöst, und die Lösung wurde 10 Minuten lang auf 50° erhitzt. Die warme Lösung wurde in 18 I Diäthyläther unter Umrühren gegossen; der weiße Niederschlag wurde auf einem Filter gesammelt, mit 2-l-Anteilen Diäthyläther (8X) gewaschen und im Vakuum über NaOH 5 Stunden lang getrocknet. Der Niederschlag wurde in 1260 ml Chloroform aufgelöst, auf 0⁰C gekühlt, und Et₁N wurde hinzugefügt bis zu einem pH 7,5. Kristallines Cbz-Pro-ONp (280 g, 0,758 Mol) wurde hinzugefügt und die Lösung eine Woche lang bei io l·- Raumtemperatur gehalten, wobei der pH bedarfsweise mit Triäthylamin auf 7,5 nachjustiert wurde. Die Lösung %

wurde mit 5 I CHCI₃ verdünnt und mit jeweils 1-l-Mengen H₂O (1 X), N NH., (10X), H₂O (IX), N HCl (2X) und H₂O (3X) gewaschen. Die CHC1₃-Lösung wurde getrocknet (Na₂SO₄) und eingedampft (Ölpumpe), um den ;.·.'

geschützten Tripeptidester 2 als gelblich-braunen Feststoff zu erhalten. Die Ausbeute betrug 486 g (99%). '· ■

{a)² ₀ ⁵ -23,0° (c 1,80,95% Essigsäure) '⁵ ,

TLC: Rf⁰: 0,64, Rf⁰: 0,74

B e i s ρ i e 1 3

Cbz-Pro-D-Arg(1bs)-Gly-NH₂ (3) ί

in eine Lösung des geschützten Tripeptidesters 2 (210 g, 0,328 Mol) in 6,9 I Methanol läßt man redestilliertes NH₁7 Stunden lang bei Raumtemperatur in Blasen einperlen. Das NH₃ und Methanol wurden abgedampft und das Öl wurde in 400 ml Chloroform verdünnt. Äthylacetat (2500 ml) wurde hinzugefügt zur Ausfällung eines Öls, welches mit drei 1-l-Mengen Diäthyläther durch Anreiben kristallisiert wurde. Der Feststoff wurde auf ·.;■,

einem Filter gesammelt und getrocknet und ergab 168 g (83%) des geschützten Tripeptidamids 3. >

Mg -22,6° (c 1,09, 95% Essigsäure)

AAA: Pro, 1,03; Arg, 0,82; GIy, 1,00 TLC: Rf: 0,37; Rf°: 0,47

B e i s ρ i e 1 4
CbZ-CyS(BzI)-PrO-D-Arg(Tos)-Gly-N H₂ (4) 35 I

Eine Aufschlämmung des geschützten Tripeptidamids 3 (168 g, 0,273 Mol) in 455 ml Essigsäure wurde mit einer Lösung von HBr (240 g) in Essigsäure (700 ml) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur behandelt und dann in 9 1 Diäthyläther unter Umrühren eingegossen. Der weiße Niederschlag wurde auf einem Filter gesammelt und mit 61 Diäthyläther gewaschen. Nach 6stündigem Trocknen im Vakuum über NaOH wurde der Niederschlag in 1070 ml Dimethylformamid aufgelöst und die Lösung auf 0⁰C gekühlt. Die Lösung wurde mit Triäthylamin auf pH 8,0 eingestellt, und Cbz-Cys(Bzl)-ONp (128 g, 0,27 Mol) wurde hinzugefügt. Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur wurde das Dimethylformamid abgedampft (Ölpumpe) und das zurückbleibende Öl in 51 CHCl₃ aufgelöst und mit 1-Liter-Mengen von N NH₃ (3X), N HCl (IX) und H₂O (2X) gewaschen. Die CHC1₃-Lösung wurde getrocknet (Na₂SO₄), auf 500 ml konzentriert, und 1500 ml Diäthyläther wurden hinzugefügt zur Ausfällung eines Öls, welches mit 2-1-Liter-Mengen von Diäthyläther pulverisiert wurde. Der Feststoff wurde auf einem Filter aufgefangen und getrocknet und ergab 194 g (88%) des geschützten Tetrapeptidamids 4.

{a)l³ -15,9° (c 0,91, Dimethylformamid)

AAA: Cys(Bzl), 0,81; Pro, 1,02; Arg, 0,79; GIy, 1,00 TLC: Rf: 0,48; Rf⁰: 0,56

Beispiel 5
Cbz-Tyr-(Bzl)-Phe-OMe (5)

Eine Mischung von Cbz-Tyr(Bzl)-ONp (52,6 g, 0,10 Mol), HCl · Phe-OMe (23,6 g, 0,11 Mol) und Triäthylamin

(15,3 ml, 0,11 Mol) in 170 ml DMF wurde bei Raumtemperatur 19 Stunden lang stehengelassen. Äthanol (600 ^

ml) wurde zu der Lösung hinzugefügt, und das kristalline Material, das sich nach 2,5 Stunden bei 4° gebildet j·

hatte, wurde auf einem Filter gesammelt und mit Äthanol (4 X 200 ml) und Diäthyläther (2 X 200 ml) ge- 60 **

waschen. Nach Trocknung hatte der geschützte Dipeptidester 7 ein Gewicht von 51,8 g (91%). T

Smp: 179-181°C

{<Üd -18,7° (c 1,05 Dimethylformamid)

TLC: Rf⁰: 0,84; Rf°: 0,90

Beispiel 6
HCI · Tyr-Phe-OMe (6)

Eine Suspension von Cbz-Tyr(Bzl)-Phe-OMe (20,4 g, 0,036 Mol) und 1 g Palladium in 400 Mol Methanol, das 7,2 ml 5 N HCl (0,036 Mol enthielt, wurde bei Atmosphärendruck und Raumtemperatur 24 Stunden lang hydriert, zusätzliche 1 g Palladium wurde hinzugefügt und die Hydrierung 10 Stunden lang fortgesetzt. Das Palladium wurde abgefiltert und auf dem Filter mit Methanol gewaschen. Das Methanolfiltrat und die Waschflüssigkeit wurden zusammen eingedampft, und das erhaltene Öl wurde mit Dmthyläther verdünnt und bei 4°C

ίο über Nacht stehengelassen. Das kristalline Hydrochloridsalz 8 wurde auf einem Filter gesammelt, mit Diäthyläther gewaschen und getrocknet und ergab 13,1 g (97%).

{a)p + 2,8° (c 1,0, Dimethylformamid)
TLC: Rf: 0,54; Rf⁰: 0,32

Beispiel 7
Mep(Bzl)-Tyr-Phe-OMe (7)

Eine 0^üC-Lösung von HCI-Tyr-Phe-OMc (5,0 g, 13,2 mMoi), Mep(Bzi)-ONp (4,6 g, 13,2 mMci) und Triäthyiamin (1,85 ml, 13,2 mMol) in 40 ml Dimethylformamid wurde bei Raumtemperatur 2 Tage lang stehengelassen. Das DMF wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand in 100 ml Chloroform aufgelöst. Die Chloroformlösung wurde mit 25-ml-Mengen von N NH₃ (5X), N HCl (IX) und H₂O (2X) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und eingedampft und ergab 6,2 g (90%) der Verbindung 7.

Smp: 135-136°C

TLC: Rf^A: 0,92; Rf: 0,81; Rf⁰: 0,80

Beispiel 8

30

Mep(Bzl)-Tyr-Phe-NHNH₂ (8)

Eine Lösuns von Mep(Bzl)-Tyr-Phe-OMe (3,0 g, 5,8 mMol) und NH₂NH₂ · H₂O (1,5 ml, 30 mMol) in einer Mischung von 50 ml Methanol und 20 ml DMF wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden lang stehengelassen. Das kristalline Hydrazid 8 wurde auf einem Filter gesammelt, mit 6 Portionen Methanol gewaschen und im Vakuum über H₂SO₄ getrocknet und ergab 2,1 g (70%) der Verbindung 8.

Beispiel 9
Cbz-Gln-Cys(SBzl)-Pro-D-Arg(Tos)-Gly-NH₂ (9)

Eine Aufschlämmung des geschützten Tetrapeptids 4 (4,0 g, 4,95 mMol) in 15 ml Essigsäure wurde mit einer Lösung von HBr (12 g) in Essigsäure (55 ml) 1 Stunde lang behandelt und dann unter Umrühren in 300 ml Diäthyläther eingegossen. Der weiße Niederschlag wurde auf einem Filter gesammelt, mit 200 ml Diäthyläther

gewaschen, 5 Stunden lang im Vakuum über NaOH getrocknet und in 125 ml Methanol aufgelöst. Eine Aufschlämmung von IRA 420 (OH") Ionenaustauscherharz (40 ml Bett) in Methanol wurde hinzugefügt und die Mischung 10 Minuten lang gerührt. Das Harz wurde abgefiltert und mit Methanol gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeit zusammen wurden zu einem Öl eingedampft, welches in 20 ml Dimethylformamid aufgelöst wurde. Cbz-Gln-ONp (2,0 g, 4,95 mMol) wurde hinzugefügt, der pH mit Triäthylamin auf 7,5 eingestellt

und die Lösung bei Raumtemperatur 24 Stunden lang stehengelassen. Die Lösung wurde auf 5 ml konzentriert (Ölpumpe), und das erhaltene viskose Öl wurde mit 5 ml Methanol verdünnt. Das geschützte Pentapeptidamid wurde durch Zugabe von 50 ml Äthyiacctat ausgefällt, auf einem Filter aufgefangen und mit 50 ml einer Lösung von Äthylacetat und Methanol im Verhältnis 4 : 1 sowie mit 100 ml Äthylacetat gewaschen. Das getrocknete Peptid 13 wog 2,94 g (63%).

" Ia)²J - 20,2° (c 0,960 Dimethylformamid)

TLC: Ri*: 0,60; Rf: 0,28; Rf°: 0,27

Beispiel 10

60

CbZ-GIn-GIn-CyS(SBzI)-PrO-D-Arg(Tos)-Gly-NH₂ (10)

Das geschützte Pentapeptidamid 9 (1,05 g, 1,12 mMol) wurde in 14 ml 2,5 M HBr in Essigsäure aufgelöst Nach einer Stunde bei Raumtemperatur wurde das Hydrobromidsalz mit Diäthyläther ausgeiallt, abgefiltert, auf dem Filter mit mehreren Portionen Diäthyläther gewaschen und im Vakuum über NaOH getrocknet. Der Niederschlag wurde in 12 ml Dimethylformamid aufgelöst, auf 0⁰C gekühlt, und Cbz-Gln-ONp (0,51 g, 1,25 mMol) sowie Triäthylamin (1,0 ml) wurden hinzugefügt. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Dimethylformamid abgedampft (Ölpumpe), der Rückstand mit Äthanol verdünnt und der entstehende Feststoff filtriert

und auf dem Filter mit mehreren Portionen Äthanol gewaschen. Die Fällung wurde über P₂O₅ getrocknet und ergab 1,04 g (87%) des Hexapeptidamids 10.

Smp: 155-16O⁰C

{<?}£ - 26,8° (c 0,537 Dimethylformamid) TLC: Rf^A: 0,45; RP: 0,10

Beispiel 11
Mep(SBzl)-Tyr-Phe-Gln-Gln-Gys(SBzl)-Pro-D-Arg(Tos)-Üly-NH, (11) Ki

Das geschützte Hexapeptidamid 10 (400 mg, 0,38 mMol) wurde in 15 ml 2,3 M HBr in Essigsäure aufgelöst. Nach einer Stunde wurde das Hydrobromidsalz mit Diäthyläther ausgefällt, auf einem Filter gesammelt, auf dem Filter mit mehreren Portionen Diäthyläther gewaschen und in Vakuum über N ■.. α getrocknet. Das Salz wurde in 5 ml Dimethylformamid aufgelöst, die Lösung mit Triäthylamin basisch gemacht und auf -1O⁰C gekühlt. Diese Lösung wurde zu einer auf -15°C gekühlten Lösung des aus dem Hydrazid 10 (260 mg, 0,50 mMol) in situ mit Isoamylnitrit hergestellten Azids hinzugefügt. Die Reaktion wurde bei -15°C2 Stunden lang gerührt, der pH mit Triäthylamin auf 8,0 eingestellt und die Reaktion 24 Stunden lang bei 4°C gehalten. Das Dimethylformamid wurde entfernt (Ölpumpe) und der Rückstand mit Äthanol behandelt. Nach Stehenlassen über Nachi bei 4"C wurde der Niederschlag auf einem Filter gesammelt, mit mehreren Portionen Äthanoi und 2u Diäthyläther gewaschen und getrocknet und ergab 285 mg (53%) des geschützten Nonapeptids 11.

Smp: 190-195⁰C

{a}²D^S - 32,8° (c 0,470, 95% Essigsäure)

TLC: Ri*: 0,51; Rf³: 0,80; Rr: 0,93 ^:5

Beispiel 12
(Gln⁵)-desamino-D-Arg^s-vasopressin (5-GLn-DDAVP) (12)

Eine Lösung des geschützten Nonapeptidamids 11 (175 mg, 0,123 mMol) in 100 ml NH, bei -40⁰C wurde in Abständen mit Na (das in eine enge Pipette aufgezogen war) behandelt, bis in der Lösung nach Wegnahme des Na eine blaue Farbe verblieb. Die verbleibende blaue Farbe wurde nach 2 Minuten durch Zugabe von 150 mg NH₄Cl wieder entfärbt, und das NH₃ wurde in einem langsamen Strom von N₂ entfernt; der Rückstand wurde mit zwei 20 ml Portionen Äthylacetat extrahiert, in 250 ml Wasser aufgelöst und die Lösung durch Zugabe von js Essigsäure auf pH 6,8 eingestellt. Die Oxydation wurde bei pH 6,8 durch Zugabe von 2,5 ml 0,1 M K₃Fe(CN)₆ durchgeführt. Nach Umrühren während 10 Minuten wurde ein 50 ml Bett von IRA^OO (Ac") Ionenaustauscherharz zu der'gelben Lösung hinzugefügt, die Suspension 10 Minuten lang gerührt und das Harz abgefiltert. Das Harz wurde mit mehreren Portionen Wasser gewaschen, und das Filtrat und die Waschflüssigkeit zusammen wurden mit Essigsäure auf pH 3,9 angesäuert und gefriergetrocknet. 150 mg des Lyophilisates wurden in 10 ml 50%iger Essigsäure aufgelöst und auf eine 2,5 x 114,5 cm Sephadex G-15 Säule aufgegeben, die mit 50%iger Essigsäure abgeglichen worden war, und mit dem gleichen Lösungsmitte! bei einer Fließrate von 100 m!/Std. eluiert. Der Hauptpeak, der bei 280 mm festgestellt wurde und bei 220 ml zentriert war, wurde aufgefangen, mit einem Volumen H₂O verdünnt und gefriergetrocknet, wobei sich 90 mg ergaben. Das entsalzte Peptid wurde in 10 ml 0,2 M Essigsäure verdünnt, auf eine 2,5 X 105,0 cm Sephadex G-15 Säule aufgegeben, die mit 0,2 M Essigsäure ausgeglichen worden war, und mit dem gleichen Lösungsmittel bei einer Fließrate von 100 ml/Std. eluiert Die dem Peak bei 2,63 V₀ entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und gefriergetrocknet und ergaben 62 mg der Verbindung 12.

Mg - 59,9° (c 0,291, 1 % Essigsäure) AAA: Tyr 1,03; Phe 1,06; GIu 2,01; Pro 1,06; Arg 0,96; GIy 1,00
TLC: Ri*: 0,i4; Rf⁸: 0,48; Rf: 0,51

Beispiel 13

CbZ-ASn-GIn-CyS(SBzI)-PrO-D-ATg(ToS)-GIy-NH₂ (13)

Das geschützte Pentapeptidamid 9 (1,05 g, 1,12 mMol) wurde in 14 ml 2,5 M HBr in Essigsäure aufgelöst Nach einer Stunde bei Raumtemperatur wurde das Hydrobromidsalz mit Diäthyläther ausgefällt, abgefiltert, auf dem Filter mit mehreren Portionen Diäthyläther gewaschen und im Vakuum über NaOH getrocknet Die Fällung wurde in 12 ml Dimethylformamid aufgelöst, auf 0⁰C gekühlt, und Cbz-Asn-ONp (0,51. g, 1,25 mMol) sowie Triäthylamin (1 ml) wurden hinzugefügt Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Dimethylformamid abgedampft (Ölpumpe), und der Rückstand wurde mit Äthanol verdünnt, der entstehende Feststoff abfiltriert und auf dem Filter mit mehreren Portionen Äthanol gewaschen. Nach Trocknung über P₂O₅ ergab sich das geschützte Hexapeptidamid 13 im Gewicht von 0,87 g (74%). _

Smp: 175-!80⁰C

{<*)# - 24,9° (f 0,694 Dimethylformamid)

TLC: Rf^A: 0,45; Rf⁰: 0.10

Beispiel 14
Mep(SBzl )-Tyr-Phe-Asn-Gln-Cys(SBzl)-Pro-D-Arg(Tos)-Gly-NH₂ (14)

Das geschützte Hexapeptidamid 13 (400 mg, 0,38 mMol) wurde in 2,3 M HBr in Essigsäure aufgelöst. Nach ίο einer Stunde wurde das Hydrobromidsalz in Diäthyläther ausgefällt, auf einem Filter gesammelt und auf dem Filter mit mehreren Portionen Diäthyläther gewaschen und im Vakuum über NaOH getrocknet. Das Salz wurde in 5 ml Dimethylformamid aufgelöst, und die Lösung wurde mit Triäthylamin (0,5 ml) basisch gemacht und auf -10⁰C gekühlt. Diese Lösung wurde zu einer auf -15°C gekühlten Lösung des aus dem Hydrazid 10 (260 mg, 0,50 mMol) in situ mit Isoamylnitrit hergestellten Azids hinzugefügt. Die Reaktion wurde 2 Stunden lang bei -15°C gerührt, der pH mit Triäthylamin auf 8,0 eingestellt und die Reaktion 24 Stunden lang bei 4°C gehalten. Das Dimethylformamid wuide entfernt (Ölpumpe) und der Rückstand mit Äthanol behandelt. Nach Stehenlassen über Nacht bei 4°C wurde der Niederschlag auf einem Filter gesammelt, mit mehreren Portionen Äthanol und Diäthyläther gewaschen und getrocknet und ergab 185 mg (35%) des geschützten Nonapeptids 14.

Smp: 210-215⁰C

{a)% - 28,3° (c 0,530 Dimethylformamid)
TLC: Rf^A: 0,51; Rf*: 0,80; Rf¹: 0,91

Beispiel 15

(Asn⁴-Gln⁵)-desamino-D-Arg⁸-vasopressin (4-Asn-5Gln,DDAVP) (15)

Eine Lösung des geschützten Nonapeptids 14 (100 mg, 0,071 mMol) in 100 ml NH₁ bei -4O°C wurde in Abständen mit Na (das in eine enge Pipette aufgezogen war) behandelt, bis in der Lösung bei Entfernung des Na eine blaue Farbe zurückblieb. Die beständige Farbe wurde nach 2 Minuten durch Zugabe von 140 mg NH₄Cl wieder entfernt. Das NH₃ wurde in einem langsamen Strom N₂ abgedampft. Der Rückstand wurde mit zwei 20 ml Portionen von Äthylacetat extrahiert, in 200 ml Wasser aufgelöst und die Lösung mit Essigsäure auf pH 6,8 eingestellt. Die Oxydation wurde bei pH 6,8 durch Zugabe von 1,5 ml von 0,1 M K₃Fe(CN)₆ durchgeführt. Nach lOminüiigem Rühren wurde ein 50 m! Bett von lRA-400 (Ac") Ionenaustauscherharz zu der gelben Lösung zugegeben, die Suspension 10 Minuten lang gerührt und das Harz abfiltriert. Das Harz wurde mit mehreren Portionen Wasser gewaschen, und das Filtrat und die Waschflüssigkeit zusammen wurden auf pH 3,9 angesäuert und gefriergetrocknet. 70 mg der gefriergetrockneten Masse wurden in 10 ml 50%iger Essigsäure aufgelöst und auf eine 2,5 x 114,5 cm Sephadex G-15 Säule aufgegeben, die mit 50%iger Essigsäure abgeglichen worden war, und bei einer Fließrate von 100 ml/Std. eluiert. Der bei 280 nm festgestellte, bei 245 ml zentrierte Hauptpeak wurde gesammelt, mit einem Volumen Wasser verdünnt und gefriergetrocknet und ergab 54 mg. Das entsalzte Peptid wurde in 10 ml 0,2 M Essigsäure aufgelöst und auf eine 2,5 x 105 cm Sephadex G-15 Säule aufgegeben, die mit 0,2 M Essigsäure abgeglichen worden war, und mit dem gleichen Lösungsmittel bei einer Fließrate von 100 ml/Std. eluiert. Die dem Peak bei 2,84 V₀ entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und gefriergetrocknet und ergaben 30,0 mg der Verbindung 19.

MJj - 54,3° (c 0,287, 1% Essigsäure)

AAA: Tyr 1,07; Phe 1,11; GIn 1,03; Pro 1,03; Arg 0,99; GIy 1,00; Asp 0,98

TLC: Rf^A: 0,18; Rf⁸: 0,48; Rf: 0,53

Claims

Patentansprüche:
1. l-Desamino-asparagin⁴-D-arginin⁸-vasopressin-Analoga der allgemeinen Formel I

I Ί

Mep-Tyr-Phe-A-B-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NHi (I)

12 3 4 5 6 7 8 9

in der Mep ein 2-Mercapiopropionylrest ist sowie A und B jeweils GIn oder A Asn und B GIn bedeuten. ίο 2. Verfahren zur Herstellung von l-Desamino-asparagin⁴-D-arginin⁸-vasopressin-Analoga nach

Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in jeweils an sich bekannter Weise