DE2739492A1

DE2739492A1 - Antikonzeptivum und methode zur verminderung der fertilitaet bei saeugetieren

Info

Publication number: DE2739492A1
Application number: DE19772739492
Authority: DE
Inventors: Dean W Cheesman
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1976-09-01
Filing date: 1977-08-30
Publication date: 1978-03-02
Also published as: GB1585667A; US4081533A; SE7709790L; FR2363330A1; JPS5366443A

Description

Hamburg, d. 29. Au_cust 1977 207877 478.22A LP

Priorität: v. 1. September U.ü. Ucr. No. 719,659

Anmelder:

THE REGEN¹I¹U OF TUE UHIVEfiSITY OF 04LIFOIiNIA

2200 University Avenue,

Berkeley, CaI. 9^720

U.S.A.

Antik onzeptl vum und Methode zur Verminderung der FertilitMt bei SH uge ti β ren

Für die FertiUt-It weiblicher Säugetiere ist der Genitalzyklus maßgebend, der durch Zusammenwirken von Proteinhormonen (Gonadotrop!ne - luteinisierendes Hormon (LH), folli- kelstimulierendes Hormon (FSH) und Prolaktin) aus der

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Hypophyse sowie Steroldhormone (Östrogene und Progestoron) aus dem Ovarlum gesteuert wird. Die Gonadotropin«? wirken stimulierend auf die Produktion der Steroide. Die gonadalen Steroide ihrerseits üben eine steuernde Wirkung auf die Abgabe von Gonadotroninen cus der Hypophyse aus, und so findet ein im großen und ganzen regelmäßiger Wechsel des Zustande des Genitalapnarates statt, in dessen Verlauf Gonadotropine in sich gegenseitig regelnder Menge freigesetzt werden.

Die Gonadotropine, die über den Kreislauf auf das Ovari um wirken, beeinflussen direkt da.g Wachsen und Pol fön d?r Follikel und den Kisprung. Die Steroide sorgen für die Neubildung, für für die Befruchtung günstige Bedingungen in dem Eileiter sowie für das Einnisten und den Halt d?s Embryos im Uterus.

Bei jedem Zyklus wird, wenn das Kl im Ei follikel reif ist, durch Änderung des Gehalts an Steroiden im JJlut diese Information dem Gehirn zugeleitet und diesen reagiert darauf durch Ausschütten einer großen Menge an LH. Durch dione Präovulatorische Ausschüttung von LH wird die Ovulation eingeleitet, bei der das Ei in den Eileiter ausgpstoßon wird und dort kann dann durch Kontakt mit Spermlen das Ei befruchtet werden. Danach gelangt das Ei in den Uterus, nistet sich in der Unteruswand ein, und damit hat die Schwangerschaft begonnen.

Auch bei den männlichen SHugetieren ist FSH in analoger Weise für die Snermienbildung maßgebend, wHhrend LII die Produktion von Androgenen beeinflußt, die die Abgabe von Gonadotropin aus der Hypophyse Steuer η. Die Androgene fördern auch die Spermienbildung, die reifen Spermlenzellen, und sie sorgen für die Neubildung.

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-Λα

Derzeit werden In der Mehrzahl solche empfängnisverhütende Pharmazeutika verwendet, durch die ständig hohe Gehalte an östrogen und/oder Progesteron dem Organismus d»s Lebewesens eingegeben werden. Diese Steroide inhibieren die Abgabe von Gonadotroplnen aus der Hypophyse, was einen Verlust der Kreis lauf-Mc ti vltät zur Folge hat und eine relative Ruhigstellung des Ovariums, so daß keine Eireifung erfolgt. Infolge des ständig sehr hohen Gehalts an Steroiden und der Tatsache, daß die Steroide auf den gesamten Organismus einwirken, haben die derzeitigen Steroide zuf'lhrendnn Empfängnisverhütenden Mittel deutlich feststellbare Mebnnwirkungen; zahlreiche Vorgänge im Organismus werden mittelbar beeinflußt. Zu den Nebenwirkungen gehören carcenogcno L'igenschaften, erhöhter Blutdruck, erhöhte Gefahr von Blutpfropfenbildung, usw.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Antikonzeptionsmittel zur Verfügung zu stollen, das keine unerwünschten Nebenwirkungen hat,und eine Methode zur Herabsetzung oder Ausschaltung der Fertilität von Säugetier-Orgniamen zu schaffen, bei der ein erhöhter Sterold-Gehalt vermieden wi rd.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß erfindungsgemäß das Konapeptid, 8-Arginln-Vasotodn, oder ein Tripeptid, wie Prolyl-Arglnyl-Glycinamid, als Antikonzeptlvum verwendet und dem Lebewesen gegeben wird, und dadurch die PrHovula-· torisch*? Ausschüttung von Luteini gierendem Hormon aus der Hypophyse selektiv unterdrückt oder eliminiert wird. Infolge der die Ovulation unterbindenden Wirkung beim weiblichen Lebewesen bzw. de3 die Spermiengenese reduzierenden Effekts beim männlichen Lebewesen setzt dann die Fruchbarkeit aus. Denn bei der selektiven Unterdrückung der präovulatorlsehen Ausschüttung von LH wird beim weiblichen Lebewesen die Ovulation verhindert und führt zum Verlust der Fertilitnt, da für die Spermien kein reifes Ei zur Verfügung steht, und beim männlichen Lebewesen wird in-

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folge der Beelnträchtigung der Abgabe von Gonadotrop!non aus der Hypophyse die Spermienproduktion vermindert odor vollständig abgeschaltet.

Da3 erflndungsgemiiß verwendete Antikonzepti vum hat den Vorteil, daß endogen vorhandene Peptide verabreicht werden, durch die 1) kein erhöhter Steroidgehalt im Blut verursacht wird und damit die bisher unerwünschten Nebcneffekte ausgeschaltet sind, 2) die Einwirkung auf die Ooimriotropinhormone erfolgt, die ihrerseits lediglich auf da", ov.irium wirken und dadurch eher eine Abnahme als eine Ziuvilime der endogenen Steroide erfolgt, 3) eine natürlich vorkommende Verbindung dem Organismus zugeführt wird, die <?r von sich aus abzubauen vermag, da ihm die erforderlichen Stoffwechselvorgänge eigen sind,und 4) der Wlederbilrfumr,-prozess unterbrochen wird, bevor die Befruchtung erfolgt ist, so daß auch religiöse Bedenken und die Frage der Unterbrechung von werdendem Leben entfallen.

Es wurde gefunden, daß ein Antikonzeptionsmittel, das selektiv den Hypothalmus beeinflußt, sehr viel subtiler zu wirken vermag, als wenn große Mengen an Steroiden dem Lebewesen verabreicht werden. Und es wurde nun festgestellt, daß eine spezielle Gruppe von Peptiden, von denen wenigstens eines von Natur aus in dem Säugetier-Organismus vorhanden ist, selektiv die präovu la tori sehe Ausschüttung von LII und die anschließende Freisetzung von Eiern zu unterdrücken vermag.

Die Gonadotropin-Sekretion aus dem Hypophysenvorderlapoen steht unter direktem Einfluß von ziemlich spezifischen Polypeptid-Faktoren im Hypothalmua-Bereich des Gehirns. Es ist ein komplexes Steuersystem vorhanden, zu dem das Nervensystem und ovariale Steroide im Blut gehören, und das die

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Leitung dieser Polyneptide freisetzenden oder die Freisetzung inhibierenden Faktoren dieses Hypothalmus-UoroLchFi an den Ilypophysenvorderlappen über ein geschlossenes Portalsystem steuert und ursächlich für die Ausschüttung oder die Inhibierung der Ausschüttung ist.

Wie gefunden wurde, lassen sich als erfindungsgennßes Antikonzeptivum das Nonapeptid 8-Arginin-Vasotocin, das als eine von Natur aus vorhandene Komponente der Zirbemlrüsen-Sekretion bei Säugetieren anwesend ist, sowie analog*» Verbindungen davon und das Tripeptid Prolyl-Arginyl-Glycinamid und analoge Verbindungen davon verwenden.

Wenn man dem Siiugetier-Organismus wHhrend der Präovulahton vertragliche Formulierungen dieser Nonapeptld« oder Tripeptide verabreicht, wird, wie gefunden wurde, die charakteristische LH-Ausschüttung au3 der Hypophyse unter-drüdct, und das hat zur Folge, daß die Ovulation stark vermindert wird oder soaar vollständig ausfällt.

Die Peptidwirkung ist vorübergehend, und wenn die nächstfolgende Ovulation ansetzt, müssen dem Lebewesen weitere Mengen gegeben werden, andernfalls die charakteristische LH-Ausschüttung wieder erfolgt und die Ovulation in normaler Weise stattfindet.

Die Erfindung umfaßt also auch die Methode, die Fertilität dadurch zu unterdrücken, daß die vor der Ovulatton erfolgende Ausschüttung von luteinisierendem Hormon aus der Hypophyse verhindert bzw. beeinträchtigt wird.

Die Erfindung umfaßt weiterhin die erfindungsgem'ißen Antikonzeptionsmittel, die neben üblichen Träger- und Zusatzstoffen ein Nonapeptid, 8-Arginin-Vasotocin, oder ein Tripeptid, Prolyl-Arginal-Glycinamld oder Prolyl-Lysyl-Glycinamid enthalten, und die Erfindung bezieht sich weiterhin

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darauf, daß diese erfindungsgemiißen Pharmazeutlka, wie 8-Arglnln-Vasotocin, Prolyl-Arglnal-Glycinamld, Prolyl-Lysyl-Glyclnamld, einem weiblichen Sfiugetler-Orqanlsnius In einer so ausreichenden Menge gegeben werden, daß dLo Ausschüttung des luteinisierenden Hormons aus der Hypophyse vor der Ovulatlon verhindert wird, und einem männlichen SHugetier-Organismus zur Unterdrückung der Spermntogenese verabreicht werden.

Das Wonapeptld 8-Arglnln-Vasotoclη kommt In der Zirbeldrüsen-Sekretion vor, und der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat in verschiedenen, Im Jahre 1970 veröffentlichten Artikeln über dessen Anwesenheit und Struktur berlHjtcti Der Artikel "Isolation and Characterization of a Gonadotropin-Inhibiting Substance from the Bovine Pineal Gland" wurde In "Proceedings of the Society for Kxperlmental Biological Medicine" 1970, Band 133, Seite 1254, veröffentlicht, und der Artikel "Structural Elucidation of η Gonadotroplc-Inhlbiting Substance from the Bovine Pineal Gland" erschien in "Biochlntica Blophyslca Acts, 1970, Band 207, Seiten 247-253.

In den genannten Veröffentlichungen wird berichtet, daß eine Gonadotronln-Inhlbierende Substanz, 8-Arglnln-Vasotocin, in der Rinder-Zirbeldrüse vorkommt. Es wird angegeben, daß es sich bei dem 8-Arglnln-Vasotocln um ein cycllsches ilonapeptid mit folgender Struktur handelt:

Cys-Tyr-Ileu-Glu (NH₂) -Asp (NH₃)-Cys-Pro-Arg-Gly

worin die abgekürzten Angaben für die Aminosäuren wie folgt zu verstehen sind: Cya »Cystein, Tyr - Tyrosin, Heu = Isoleucin, GIu = Glutaminsäure, Asp = Asparaginsäure, Pro =. Prolin, Arg = Arginin und GIy » Glycin. Weiterhin bedeuten die Angaben GIu(NH₂), GIy(NH₂) bzw. Asp(NH₂) Glutamin, Glycinamld bzw. Asparagin.

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8-Arginin-Vasotocin hat, wie mittels der Verbindung zwischen den beiden Cystein-Grunpen angezeigt, eine cyclische Struktur mit einer Disulfid-Brücke in Form der Bindung zwischen den Schwefelatomen an den beiden funktioneilen Cystein-Gruppen.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß dann, wenn man das 8-Arginin-Vasotocin Säugetieren vor der Ovulation ver abreicht, die Ausschüttung von luteinisierendem Hormon aus der Hypophyse, die bei normalem Ablauf vor der Ovulation stattfindet und diese initiiert, wirksam blockiert wird. Andererseits wird, im Gegensatz zu sonstigen lutei nisi erendes Hormon unterdrückenden Mitteln, über die berichtet worden ist, durch das 8-Arginin-Vasotocin der Grundspiegel des Hormons im Blut nicht abgesenkt, wie weiterhin gefunden wurde, haben Tripeptide der Art Prolyl-Arginyl-Glycinamid, i.e. Pro-Arg-Gly (NII _) einen ähnlichen das luteinisierende Hormon unterdrückenden Effekt, durch den die Ovulation inhibiert wird. In dem Nonapeptid 8-Arginin-Vasotocin ist, wie ersichtlich, ein solches Tripeptid als Endgruppe enthalten; bisher ist das Vorhandensein al3 freie, natürlich vorkommende Substanz im endokrinen System unbekannt. Als wenigstens eine v/eitere analoge Verbindung des genannten Trineptld3 hat beispielsweise auch das Polyl-Lysyl-Glycinamid (worin Lyn = Lysin bedeutet) eine die Ausschüttung von luteinisierendem Hormon unterdrückende und die Ovulation verhindernde Wi rk ung.

Man kann das tlonapePtid und die die Tripeptide in einer beliebigen üblichen pharmakologinchen Form, beispielsweise als Acetat, Ilydrochlorid, Maleat, Sulfat odor in Form sonstiger Salze verabreichen. Die spezielle Salzform der Peptide hat anscheinend keinerlei Bedeutung hinsichtlich dieser biologischen Aktivität der Verbindungen. Es

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ist lediglich erforderlich, daß es sich um solche Salze handelt/ die pharmakοlogisch zugelassen und nraktlsch brauchbar sind. Für die nachstehend angegebenen biologischen Daten wurden die Peptide in Form dr»r Acetat-Salze verwendet, sofern nichts anderes angegeben ist. nie Untersuchung der Peptide in Form ihrer Hydrochloride zeigte Iceinen nennenswerten Effekt bezüglich anderer Unterdrück ungswi rkung oder Ovulati onsak ti vi tHten.

Das cyclische Nonapeptid und die Tripeptide unterdrück on die LU-Produk ti on, wenn man sie dem S*iugetier-Organisum:; zu irgend einer beliebigen Zeit vor dem Zeltnunkt dor orwarteten prüovulatiori sehen Lll-Ausschüttung verabreicht. Wenn es sich um das Nonapeptid handelt, führt man das Peptid durch subkutane oder intravenöse oder intrnpcrlton^ale Injektion zu. Wenn es 3ich um ein Tri peptid handelt, kann man das Präparat oral verabreichen oder injizieren. Für Injekti onszwecke lassen sich verdünnte Salzlösungen verwenden .

Vorzugsweise wird die Peptid-Verabreichung wenigstens mehrere Stunden oder bis zu der erwarteteten LM-Ausschüttung und auch, wenn der Zeitpunkt der Ausschüttung gut bestimmt ist, wShrend der Generation der LII-Ausschüttung vorgenommen. Bei niederen Säugetieren, z.B. Nagetieren, treten diese Ausschüttungszeiten mit großer und gut definierter Regelmäßigkeit ein. Man kann dann die Administration der Peptide ganz exakt festlegen. Bei den Primaten ist das LH-Ausschüttungs-Timi ng nicht annähernd so gut definiert, und aus diesem Grund wird man das Peptid über relativ ausgedehnte Zeitspannen, z.B. mehrere Taqc vor der erwarteten Ovulation, verabreichen. Demzufolge stellt, wenigstens im Fall des Nonapeptids, die Verabreichung mittels einer das Peptid langsam abgeben den Implantation eine besonders praktische Methode dar, mit der sich si-

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cherstellen IHRt, daß die erforderlichen Peptldmengen sich zum Zeitpunkt der LH-Ausschüttung in der Körperflüssigkeit befinden.

Der Gehalt an Nonapeptid oder Tripeptid in der Körperflüssigkeit, der zur Inhibierung der LH-Ausschüttung und der darauf folgenden Ovulation erforderlich ist, ist von Art zu Art und von Idividuum zu Individuum verschieden. Allerdings hat anscheinend das Monaneptld ein«? wenigstens 50-100 mal stärkere Aktivität, bezogen auf pine Gewichtseinheit, im Vergleich zu den Tripeptiden. Oemen tspre chend sind die erforderlichen Gaben an Tripeptiden notwendigerweise höher als die von Wonapeptid, und sie können um das 2- oder sogar 3-fache höher liegen. Andererseits vrerden

, die Tripeptide, da es sich um sehr viel einfachere und

kleinere Moleküle handelt, sehr viel leichter inetabollslert, und die höheren Dosen können ohne weiteres toleriert werden und ergeben keine Nebeneffekte. TatsHchllch wurden Iteinerlei t Nebeneffekte bei Ratten beobachtet, denen Dosierungen in der Größenordnung von mehreren Gramm/Kilogramm Körpergewicht verabreicht wurden. Darüber hinaus lassen sich dle^e Verbindungen aus einfachen And.nosHuren technisch relativ leicht synthetisieren. Dabei kann man sich der nachstehend für die Synthese des Tripeptide beschriebenen Arbeitswelse

V bedienen. Die Gewinnung eines neun Glieder aufweisenden

Peptids ist entsnrechend aufwendiger und erfordert mehr Zelt als die Herstellung von Tripeptiden. Jedoch sind dem Fachmann Synthesemöglichkeiten für die Herstellung des erflndungsgem'iß verwendeten 8-Arginin-Vasotocin bekannt und verfügbar .

Im folgenden Beispiel wird ein Verfahren zur Isolierung von 8-Arginin-Vasotocin aus Rinder-Zirbeldrüsen beschrieben.

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Beispiel 1

Frischen Drüsenmaterial (3,18 kg) wurden in olnom Uarinn-Mischer homogenisiert und unter 18-sttlndigem konstantem Rühren bei 4°C ntit Aceton (12 Liter) extrahiert. !lach Abfi !tarieren wurde der feete Rückstand luftgetrocknet und (310 g) wurden in Wasser (800 ml) und Methanol (4OO ml) suspendiert. Das Gemisch wurde 6 Stunden lang bei 5O gerührt, abgekühlt und 15 Minuten lang mit lOOOO UpM zentrifugiert. Der überstand wurde im Vakuum bei 50 C auf 700 ml konzentriert, und nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur wurde mit Ammoniumsulfat gesättigt und 8 Stunden lang bei 4 C stehen gelassen. Die resultierend.? Ausfüllung (2,5 g) wurde abfiltriert und in 0,05 m Anunonlumhydroxid (50 ml) gelöet. Die Lösung wurde mit Isobutanon (5 χ 15 ml) extrahiert, mit 0,05 m Anunoniunihy<lroxid-T,ör,unri gesättigt und nachdom die kombinierten Extrakte mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet worden waren, wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt.

Der Rückstand wurde in Ammoniumacetatlosung (0,05 m, K) ml) gelöst, mit Trichlorbutanol gesättigt und auf eine mit einem Ionenaustau3cherharζ (Sephades G-25) gefüllte SHuIe ( 4 χ 45 cm) mit dem gleichen Puffer gefertigt, aufgebracht, r.n ' wurde mit einer Durchfließgeschwindigkeit von 5 pil/ min mit dem Puffer eluiert, und das aktive Material wurde durch Vereinigung der zwischen 500 und 580 ml erhaltenen Fraktionen gewonnen. Die vereinigten Fraktionen wurden lyonhiltsiert, das resultierende Pulver wurde in Ammoniumac^tntpuffer (nil 7, 0,05 m, 1,0 ml) gelöst und mit Trichlorbutanol gesättigt. Die Lösung wurde an einer Dlo-Rpx 7o Säule ( 2ΟΟ-4ΟΟ Maschen, 1 χ 40 cm) mit dem gleichen Puffor zubereitet, Chromatograph!ert. Die Durchflußgeschwindigkeit wurde auf 4 ml/Std. eingestellt, und das aktive Material

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wurde durch Messen der Fluoreszenz bei 395 m jeder Fraktion nach Phenanthrenchinon verfolgt. Fraktionen zwischen 90 und 110 ml enthielten das Nonapeptid, und diese wurden zusammengegeben und lyophilisiert; es wurden ein weißes Pulver gewonnen (1,4 mg).

Die "Elektrophorese (1200 V, 4 Std.) in Pyridin/Acetat-Puffor bei ptl 3,5 unter Verwendung eines Whatman 3 MM- Filters und Sichtbarmachung mit hydrochloriger SSure/ortho-Tolidin ergäbe drei Zonen, und die aktive Verbindung (bei 25 cm) wurde eluiert und lyophilisiert. Absteigende Papierchromatoqraphie an einem Whatman Filterpapier Nr. 1 unter Verwendung von Eutanol:Essigsäure:Wasser ( 4:1:5) wahrend 12 Stunden und Eluierung der Zone bei 14,5 cm brachte das homogene mikrokristalline Peptid (380 g).

Synthese den Tripeptlds

Da da3 Tripeptid in der Matur nicht vorkommt, muß es synthetisiert werden. Die Synthese von Peptiden, wenigstens so einfacher, wie Tripeptide, ist in den letzten Jahren zum Fachwissen geworden. Es kann eine beliebige der gut bekannten Arbeitsweisen benutzt werden. Beispielsweise kann man nach folgender Methode arbeiten:

Geschütztes Arginin, z.B. tert.-Butyloxycarbonylnttro-Arginin wird in einem geeigneten Lösungsmittel, wie beispielsweise Dimethylformamid und Tetrahydrofuran, gelöst. Die gelöste geschützte Aminosäure wird dann auf eine etwas unterhalb dem Gefrierpunkt (0°c) gelegene Temperatur abgekühlt,und dann wird Isobutylchlorcarbonat und Triethylamin unter Rühren zugegeben. Nach kurzer Zeit wird in Dimethylformamid gelöstes Glycinamid hinzugefügt, man IHUt das Gemisch dann auf Zimmertemperatur warm werden, rührt mehrere Stunden lang und filtriert anschließend ab. Das Filtrat wird gesammelt, zur Trockene eingedampft und dann mit Dimethylformamid extrahiert. Aus der Di methyl formamid lösung wird

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durch Zugabe von Äthylacetat das Dipeptid, d.i. geschütztes Arginyl-Glycinamid, ausgefällt.

Das geschützte Dlpeptid wird dann in konzentrierter Ameisensäure gelöst, etwa 15 Minuten lang stehen gelassen und anschließend im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in Dimethylformamid aufgenommen, und die Lösung wird anschließend zu einem Gemisch aus geschützten Prolin (Carbobenzoxy-Prolln) , Tri-äthylamin und Isobuty lcarbonat, das zuvor bei einer reduzierten Temoeratur (-10⁰C) einl«,·; Minuten lang in Dimethylformamid und Tetrafuran cjerührt·. worden war, zugegeben. Anschließend wird das G^rjaintgemLsch mehrere Stunden lang bei Zimmertemperatur zusammengerührt. Danach wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in Dimethylformamid gelöst und anschließend durch Zugabe von Äthylacetat ausgefällt. Lösen und AuiTillen werden wiederholt, und dabei gewinnt man das geschützte Tripeptid, das ist Carbobenzoxy-Prolyl-nltro-Arglnyl-Glydnamid.

Das geschützte Tripeptid wird in einem Gemisch au3 Ethanol und Essigsäure gelöst, dann einige Stunden (15) unter Verwendung eines 10% Palladium/Kohle-Katalysators hydriert. Danach wird die Mischung filtriert; es wird im Vakuum zur Trockene eingedampft, und man erhält das Trioeptid-Produkt, das i3t das Acetatsalz von Prolyl-Arginal-Glycinamicl. Da3 gleiche Syntheseverfahren kann man zur Gewinnung analoger Tripeptide, z.B. Pro-Lys-Arg(WH₂) benutzen.

Beispiel 2

Unter Verwendung der zuvor beschriebenen Synthese-Methode ■

wurden 3,04 g tert.-Butyloxycarbonylnitro-arglnin mit i

0,74 g Glydnymld umgesetzt, und es wurden 2,8 g des j

Dipeptide gewonnen. Das Dipeptid wurde mit 1,91 g Carbo- |

benzoxy-Prolin umgesetzt, und dabei wurden 3,2 g des J

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geschützten Tripeptide, Carbobenzoxy-Prolyl-nitro-Arginyl-Glyctnamid erhalten. Nach der Hydrierung ergab ein halbes Gramm des geschützten Tripeptids 0,36 g des Tripeptidacetat-Produk ts.

Biologische Aktivitäten

Die biologischen Aktivitäten des cyclischen Nonapeptids 8-Arginin-Vasotodn und des Tripeptids Prolyl-Arcrinal-Glycinamid sowie wenigstens einer analoger Verbindung des Tripentids, nämlich des Prolyl-Lysyl-Glycinamids, wurden untersucht. Die Wirkung der Peptide auf die Beeinflussung der präovularen Ausschüttung von LH aus der Hypophyse und die Freisetzung der Eier aus dem Ovarium wurden durch Versuche an weiblichen Ratten veranschaulicht.

Für diese Untersuchungen wurden Ratten ausgewählt, die einen deutlich festgestellten regelmäßigen Genitalzyklus aufwiesen. Den Tieren wurden unterschiedliche Dosen mit den erfindungsgemäß zur Verwendung kommenden Peptiden und als Kontrollsubstanz Salzlösung alleine, sowie die natürlich vorkommenden Peptide Vasopressin und Oxytocin, die dem cyclischen Honapeptid 8-Arginin-Vasotocin verwandt sind, in unterschiedlichen Dosen verabreicht. Vasopressin und Oxytocin sind gut bekannte, in der Literatur beschriebene Produkte. Vasopressin ist dem 8-Arginin-Vasotocin nahe verwandt und hat die cyclische Nonapeptid-Struktur:

Cys-Tyr-Phe-Glu(NH₂)-Asp (NH₃)-Cyg-Pro-Arg-rUy(NH^), worin der dritte Aminosäurerest Phenylalanin ist, während in dem 8-Arginin-Vasotocin statt dessen Isoleucin vorhanden ist. Im übrigen ist die Vasopressin-Peptid-Kette die gleiche wie die des 8-Arginin-Vasotocin. Vasopressin findet eich in dem Hypophysenhinterlappen.

Oxytocin ist ein Peptidhormon, das man, wie Vasopressin, im Hypophysenhinterlappen findt. Es ist ebenfalls ein cyclisches Nonapeptid und hat die Formel:

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Cys-Tyr-Ileu-Glu (NH₂) -Asp (NH₂) -Cye-Pro-Leu-CUy

Sowohl Vasopre3sin als auch Oxytocln haben biologische (hormonale) Wirkungen auf Säugetiere. Vasopressln steuert Wasserabgabe aus dem Körner und wirkt mittelbar auf die. Wasserausscheidung, während Oxytocin im wesentlichen die Uteruskontraktion während des Geburtenvorgangr» bewirkt und die Laktation anregt. Da beide Hormone eng verwandt sind dem 8-Arglnln-Vasotocin, ist ihre Wirkung auf die präovulatori sehe LH-Ausschüttung und die Ovulatlon von INteresse.

Beim normalen Genitalzyklus weiblicher Ratten erfolgt eine starke Ausschüttung an luteinisierendem Hormon (ί·Η) In das Blut an dem Pr oös tr us -Nachmittag. Man kann die LII-Ausschüttung durch überwachung periodischer Blutproben ermitteln. Diese Proben werden mittels einer in die rechte Herzkammer eingeführten Kanüle entnommen. 50 MIkrollter Blut werden je Stunde entnommen für 6 bis 7 Proben. Mittels· Radioiramunoassay-Technik werden die LII-Gehalte darin bestimmt. Unter normalen UmstHnden erfolgt die Ovulatlon etwa 12 Stunden später. Die Eileiter werden entfernt und die Eier werden durch Einsetzen von Hypoderm In die Tubenöffnung und Ausspülen mit phosphatgepufferter Salzlösung erhalten. Die freien Eier werden In einer Mikropipette gesammelt und ausgezählt. Bei den Versuchen wurden den Ratten sowohl Kontroll-Salzlösung als auch verschiedene .Dosierungen an 8-Arglnin-Vasotocin, Prolyl-Arglnyl-Olycinamld, Prolyl-Lysyl-Glycinamld, Vasopressin und Oxytocln verabreicht.

In der nachstehenden Tabelle I sind die Versuchsergebnisse zusammengestellt und die inhibierenden Wirkungen auf die* LH-Ausschüttung und die Ovulation der angegebenen Peptide in Vergleich gesetzt.

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Tabelle I

Wirkung von Tripeptiden und cyclischen Non ape ρ ti den auf die priiovulatori sehe Ausschüttung von LH und die Ovulation bei Proöstrus-Ratten '

Verbindung	Do si	S	An ζ de Tie
Salzlösung	—		56
O-Argi nl n- Vasotocin	Ι,ο 0,1	g g	32 18
Vasopree- si η	1,0 0,1	g g	29 18
Oxy tod n	5 ι,ο	g g	16 20
Prolyl- arginyl- glycin- amid	0,6	g	12
Prolyl- lysyl- glycin- aniid	0,6	g	13

Anzahl Anwesenheit Anwesenheit von LH-Aus- von Eiern schüttung (%) (%)

98

5 34

37 94

94 1OO

25

15

45

62 94

94 100

42

30

In jedem Fall wurde die Peptid-Dosis in Salzlösung durch die Herzkanüle während einer Zeitspanne von 4 Stunden in einstündigen Abständen verabreicht.

Die Zahlenwerte zeigen, daß Oxytocin im wesentlichen inaktiv ist-und auf die LH-AusschUttung und die Ovulation keine wesentlich bessere Wirkung hat als reine Salzlösung. Vasopressin zeigt dagegen beträchtliche Aktivität, die jedoch geringer ist als die Aktivität von 8-Arglnin-Vasotocin hei gleichen Dosen.. Vasopressin ist aber ungeeignet zur Verwendung als Antikonzeptionsmittel, weil es ernste gefäßverengende Nebenwirkungen aufweist. Die beiden Tripeptide, Prolyl-arginyl-glydnamld und dessen Analogen Prolyl-lysylgiycinamid zeigen ebenfalls hohe Inhibierende Wirkung auf

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die LH-Ausschüttung und die Ovulation, jedoch sind die Inhibierungswerte nicht ganz so hoch wie bei 8-Arginin-Vasotocln oder Vasopressin.

Darüber hinaus zeigte sich, dafl die cyclischen Nonapeptide, die erfindungsgenvHß verwendet werden, die Prolaktin-Ausschüttung, die ein normales Kennzeichen des Säugetier-Gen! talzyk lus ist, inhibieren. 8-Arginin-Vasotocin, Vasopressin und Oxytocin wurden in verschiedenen Dosierungsmengen und -raten einer Anzahl von Ratten verabreicht. Zur Kontrolle wurde Salzlösung benutzt. In der nachfolgenden Tabelle II sind die Angaben für die Dosierung und die Ergebnisse zusammengestellt:

	die	Tabelle	II	Anzahl der Tiere	Anwesenhoi t von Pro- laktin-Aus- schüttung (I)
Wirkung auf		ρräovulatori		29	93
Verbi ndung		Dosis		23 7	4 14
Salzlösung	1 1	—	sehe Prolaktin-Aus3ch^flttunrj	6	O
8-Arginin- Vasotod η	1	g/30 min g/60 min	Gesamt- dosis	5	80
	1	g/120 min	—	6 7	17 57
	1 1	g/240 min	7 g 4 g	5	60
Vaso pressin	1	g/30 min g/120 min	2 g	6	84
Oxy to ei η	1	g/30 min	5 g
	q/120 min	7 g 2 g
	7 g
2 g

Die Ergebnisse stimmen mit denen in Tabelle I Uberein. 8-Arginin-Vasotocin weist eine hohe inhibierende Wirkung auf, Vasopressin hat eine etwas₍geringere Wirkung und Oxytocin hat den niedrigsten Effekt.

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Zur Ermittlung der vorstehenden Werte wurden die Peptide in Form ihrer Acetatsalze verabreicht. Die Peptide lassen sich auch in Form anderer Salze einsetzen, ohne daß die Aktivität dadurch beeinflußt wird. Dies wird nachstehend am ßeispiel des 8-Arginin-Vasotocin veranschaulicht. E3 wird die Hydrochlorid-Form, erhalten aus mot-.h.-»- nolischer Salzsäure, gesprüft. Dosen von ein Mikrogranm des Dihydrochloride wurden an zehn Ratten unter den gleichen wie im Zusammenhang mit Tabelle I beschriebenen Bedingungen verabreicht. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle III aufgeführt.

Tabelle III

Verbindung Dosis Anzahl Anwesenheit Anwenonhett

der von Tül-Aus- von JJt or η Tiere schüttung (%) Ci)

8-Arcfinin-

Vasotocln- 1 g 10 0 20

Dihydrochlori d

Man sieht, daß durch das Einbringen von 8-Argtnin-Vasotociη in den Säugetierkörper die präovulatori sehe LH-Ausschüttung inhibiert wird und ein die Ovulation unterbindender I'ffokt entsteht. Die gleichen biologischen Aktivitäten zeigen die Tripentide Prolyl-arginyl-glycinamid und Prolyl-lysyl-qlycinamid. Die Einführung dieser Peptide in den Säugotierkörper stellt eine neue Methode zur Steuerung der Ferti-Ii tat dar und erlaubt die Verwendung dieser Peptide aln ein von den bisher störenden Nebenwirkungen freies Antikonzeptivum. Es ergibt sich damit eine Alternative zu anderen bisher in der Praxis verwendeten Methoden.

Es läßt sich beim männlichen Lebewesen mit dem erfindungsgemäßen Antikonzeptionsmittel ebenfalls die Soernia-

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togenese, die von der Gonadotrop!η-Sekretion aus der Hypophyse abhängt, vermindern oder inhibieren, nie Androgen-Bildung hängt direkt mit der LH zusammen und ir.fc ihrerseits notwendig für die Reifung der Spermlen und die Aufrechterhaltung der Neubildung. In dem Mnß, wie die erfindungsgeiniß zur Verwendung kommenden cyclischen iJonaneptide und Tripeptide die LH-Ausschüttung behindern, wird die Snermatogenese vermindert oder ausgeschaltet, wenn man dem männlichen Lebewesen die Peptide verabreicht. Da die Sperma togenese ein kontinuierlicher Vorgang ist, bei dein eine plötzliche höhere Ausschüttung von LII nicht erfolgt, versteht sich, daß zur wirksamen Inhibierung der Produktion ein ständiger niedriger Gehalt an Pontiden In dem Organismus aufrecht erhalten werden muß. Lanαsam den Wirkstoff abgebende, langwirkende Imr> lan täte der Peptide sind daher die gegebene vorteilhafte Methode zur Verminderung der männlichen Zeugungsfähigkeit.

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Claims

Patentansprüche

1. Verwendung eines der Peptide der Formeln; iys-Tyr-Ileu-Glu (NH₂) -ASp(NH₂) -Cys-Pro-Arg-Gly ₂ und

PrO-X-GIy(NH₂), worin X für eine Aminosäure, insbesondere Arg oder Lys steht,

oder deren Salze als Antikonζeptivum.

2. Verfahren zur Verminderung der Fertility bei weiblichen Säugetieren, dadurch gekennzeichnet, daß man die PrHovulationsausschüttung von luteinisierendem Hormon unterdrückt und entsprechend die Ovulation und FertilitSt inhibiert durch Verabreichen einer wirksamen Menge eines cyclischen Nonapeptids der Formel:

Cys-Tyr-Ileu-Glu (NH₃) -Asp (NH-) -Cys-Pro-Arg-Gly (NII_) während der Präovuiationsphase.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das cyclische Nonapeptid in einer Gesamtdosis von etwa 0,5 bis 5 Mikrogramm je Kilogramm Körpergewicht in den Körper des Lebewesens einführt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daB man das cyclische Nonapeptid in Form eines pharmakologisch verträglichen Salzes einsetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das cyclische Nonapeptid in Form des Acetatsalzes einsetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das cyclische Nonapeptid in Form des Salzsäuren Salzes einsetzt.

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ORIGINAL INSPECTED

7. Verfahren zur Verminderung der Fertilit'it bei weiblichen Säugetieren, dadurch gekennzeichnet, daß man die PrH-ovulationsaus3chiittung von lutei ni 3i erendem Hormon unterdrückt und entsorechend die Ovulation und Fertilit.Ht inhibiert durch Verabreichen einer wirk samen Menge eines Trineptids, wie das Tripeptid der Formel

Pro-Arg-Gly(NH₂)
während der Präovulationsphase.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man das Tri peptid in einer Gesamtdosis von etwa 5 Mikrogramm bi3 5 Milligramm je Kilogramm Körpergewicht in den Körper des Lebewesens einführt.

9. Verfahren nach Anspruch 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das Tripeptid in Form eines pharmakοlogt sch verträglichen Salzes einsetzt.

10. Verfahren nach Anspruch 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man das Tripeptid in Form des salzsauren Salzes einsetzt.

11. Verfahren nach Annpruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Tripeptid ein Analogon der Verbindung der angegebenen Formel verabreicht, in der anstelle von Arg eine andere Aminosäure vorhanden ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Tripeptid Pro-Lys-Gly(NH_) verwendet.

13. Antikonzeptionsmittel, enthaltend das Tripeptid Pro-Arg-Gly (NH ) neben üblichen Triiger- und Zusatzstoffen.

14. Antikonzentionsmittel, enthaltend das Tripeptid Pro-Lys-Gly (MH,) neben üblichen Träger- und Zusatzstoffen.

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■•τ

15. Antikonzeptionsmittel nach Anspruch 13 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß das TrIpeptid in Form eines seiner vertraglichen Salze darin enthalten Ist.

Ιό. Verfahren zur Verminderung der Fertilit'it bei männlichen SHugetieren, dadurch gekennzeichnet, daß man die Rekretion von lutelnisierendem Hormon aus der Hyoophys» vermindert und über eine längere Zeitspanne eine wirksame Menge des cyclischen Nonapeptids 8-Arginin-Vasotocin verabreicht.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man anstelle des cyclischen Nonapeptids das Trineptld Proly1-Arginal-Glyd ηamid verabrei cht.

18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man anstelle des cyclischen Nonapeptids das Tripepticl Proly1-Lysyl-GIyeinamid verabreicht.

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