DE1518318A1

DE1518318A1 - Polypeptid

Info

Publication number: DE1518318A1
Application number: DE19651518318
Authority: DE
Inventors: Huguenin Dr Rene; Boissonnas Dr Roger
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 1964-07-17
Filing date: 1965-07-14
Publication date: 1969-08-07
Also published as: DK117637B; FR4863M; DE1518318B2; BR6571349D0; FI43999B; US3454549A; BE666966A; CH442342A; ES315410A1; DE1518318C3; SE344585B; GB1109086A; NL6509148A; AT255667B

Description

PATENTA

Dr. W. SCHALK · Dipl.-Ing. P. WlRTH · Dipl-Ing. G. DANNEN3ERG Dr. V. SCHMIED-KOWARZIK · Dr. P.WEINHOLD

6 FRANKFURTAM MAIN

CB. ESCHENHEIMER STR. 39

Oase 2018

SANDOZ A.G. Basel / SCHWEIZ

Polypeptid

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Polypeptid der Formel I und seine Säureadditionssalze _} sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses neuen Polypeptids und seiner Säureadditionssalze.

Erfindungsgemäss können das Polypeptid der Formel I und seine Säureadditionssalze hergestellt werden, indem nan. ein Polypeptid der 'Formel V auf an sich bekannte Weise oxydiert und das so erhaltene Polypeptid der Formel I gegebenenfalls auf an sich bekannte Weise anschliessend in seine Säureadditionssalze mit organischen oder anorganischen Säuren überführt. Die Oxydation des Polypeptids der Formel V zum gewünschten Endprodukt der Formel I kann vorzugsweise mit Wasserstoffperoxyd, Kaliumferricyanid oder 1,2-Dijodoäthan in wässriger oder wassrig-organischer Lösung bei einem pH von 4 bis 9 durchgeführt werden. Als wässrig-organische Lösung kann z.B. eine wässrigalkoholische Lösung oder ein Aceton-Wasser-Gemisch verwendet werden.

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Neue Unterlagen (Art. 7 i1 Abs. 2 Nr. I Satz 3 des Änderungegto. v. 4. * to;

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Das Polypeptid der Formel V kann erhalten werden, indem man aus einem Octapeptid-Derivat der allgemeinen Formel IV, worin R' einen in der Peptidsynthese zum Schutz der Sulfhydrylgruppe gebrauchlichen Rest und R" einen in der Peptidsynthese zum Schutz der Guanidogruppe, gebräuchlichen Rest bedeutet, die Schutzgruppen R' und R" in einer oder mehreren Stufen abspaltet.

Das Octapeptid-Derivat der allgemeinen Formel XV kann nach an sich für die Synthese von Polypeptiden bekannten Methoden erhalten v/erden, wobei die Aminosäuren in der in der allgemeinen Formel IV angegebenen Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft werden, beispielsweise, indem man ein Hexapeptid-Derivat der allgemeinen Formel II, worin R' und R" obige Bedeutung haben, mit einem reaktionsfähigen Derivat einer freien Saure der allgemeinen Formel III, worin R¹ obige Bedeutung hat, kondensiert.

Zum vorübergehenden Schutz der Sulfhydrylgruppe können die zu diesem Zweck gebrauchlichen Gruppierungen, wie die Benzyl- oder die p-Xylylgruppe verwendet werden, zum Schutz der Guanidogruppe die p-Toluolsulfonyl-(Tosyl-) oder die Benzolsulfonylgruppe.

Das Octapeptid-Derivat der allgemeinen Formel IV kann man jedoch nicht nur auf die oben beschriebene Weise herstellen, sondern auch durch Kondensation zweier anderer

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Polypeptide bzw. eines Polypeptide und einer Aminosäure in Form ihrer geschützten Derivate, bzw. eines Octapeptids und ß-Mereaptopropionsciure in Form ihrer geschützten Derivate .

Die Ausgangsprodukte zur Herstellung des Octapeptid-Derivates IV werden, sofern sie bisher noch nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten, wobei die Aminosäuren einzelr oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.

1 Die Verbindung der Formel I, die man als Desamino -Arg Vasopressin bezeichnen kann, besitzt eine wesentlich stärkere antidiuretische Wirkung als das natürliche

menschliche Vasopressin, Arg -Vasopressin (Formel VI), von welchem sich die neue Verbindung dadurch unterscheidet, dass sie keine a-Amino-Gruppe am Ende der Peptidkette enthalt. Mit einer antidiuretischen Wirkung von 1^00 IU/mg

1 ο

handelt es sich beim Desamino -Arg -Vasopressin um die bisher am stärksten wirksame Verbindung auf dem Gebiet der Polypeptidhormone des Hypophysehinterlappens.

Beim Vergleich der in Internationalen Einheiten (IE) ausgedrückten Aktivitäten zeigt es sich, dass natürliches Arginin-Vasopressin eine pressorische Wirksamkeit besitzt, die gleich hoch wie seine antidiuretische Wirksamkeit ist,

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BAD

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währenddessen die Verbindung I eine pressorische Wirksamkeit aufweist, die nur ca. 1/4 ihrer antidiuretischen Wirksamkeit betragt. Die antidiuretische Wirkung im Vergleich zur pressorischen Wirkung ist demnach bei der Verbindung I selektiver als bei dem in der Natur vorkommenden Arginin-Vasopressin.

α	Ant id iure t i s c he Wirksamkeit in IE/mg	Pressorische Wirksamkeit ■ in IE/mg
1 8 De-araino -Arg -Vaso- pressin (Verbindung I) O Arg -Vasopressin	IJOO 400	570 400

Hauptanwendungsgebiete der neuen Verbindung I sind die Behandlung des Diabetus insipidus sowie diejenige von gewissen Fällen von Hypotonie, Kollaps- und Schockzustanden. Der im Verhältnis zu Arginin-Vasopressin höhere Wirkungsgrad und die grössere Stabilität der neuen Verbindung I sind hierbei von besonderem Vorteil. Die Steigerung der antidiuretischen Wirksamkeit der nöuen Verbindung I gegenüber dem Arginin-Vasopressin war deshalb nicht vorauszusehen, weil der Wegfall der endständigen Aminogruppe beim Lysin-Vasopressin die antidiuretischen Eigenschaften dieses Hormons bekanntlich kaum verändert. Die Dosierung ist dem Ausmass des individuell sehr verschiedenen Hormondefizits anzupassen und schwankt allgemein zwischen 3-4 mal täglich 5 bis 15 IE subcutan oder

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intramuscular.

Das verfahrensgemass hergestellte, bisher unbekannte PoIypeptid I kann als freie Base oder als Salz einer organischen oder anorganischen Saure oder eines sauregruppeenthaltenden Polymers (wie z.B. Alginsäure, Carboxymethylcellulose, Gerbsäure) entweder als Arzneimittel allein oder in entsprechenden Arzneiformen für orale, parenterale, enterale oder intranasale Verabreichung verwendet werden. Zwecks Herstellung geeigneter Arzneiformen werden diese mit anorganischen oder organischen, pharmakologisch indifferenten Hilfsstoffen verwendet.

Als Hilfsstoffe werden verwendet z.B. für Tabletten: Milchzucker, Stärke, Talk, Stearinsäure usw.; für Injektionspräparate: Wasser, Alkohole, Glycerol, pflanzliche OeIe und dergleichen; für Suppositorien: natürliche oder gehärtete OeIe und Wachse u.a.; für intranasale Sprays: Wasser, Glycerol oder andere für die Schleimhaut vertragliche flüssige Stoffe. Zudem können die Zubereitungen geeignete Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmittel, Lösungsvermittler, Süss- und Farbstoffe, Aromantien usw. enthalten.

In den nachfolgenden Beispielen sind die Temperaturangaben in Celsiusgraden angegeben.

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2018 Beispiel I: Polypeptid I

Man löst 20 g S-Benzyl-ß-mercaptopropionsäure und 22 g 2,4„5-Trichlorphenol in 170 ecm Essigester und 20 ml Acetonitril, kühlt bei - 10° und gibt noch 21 g Dieyclohe

zu. Die Lösung wird 4 Stunden bei Zimmertemperatur geschüttelt, der Niederschlag von Dicyclohexylharnstoff wird abgenutscht und das Piltrat im Vakuum bei 30° eingedampft. Der Rückstand wird in Essigester gelöst und diese Lösung wird mit wässerigem Natriumbicarbonat und dann mit Wasser gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat wird der Essigester abgedampft. Beim Stehenlassen des Rückstandes bei Ä1O° 'ristallisiert der S-Benzyl-ßmercaptopropionsäi'""6-2,4,5-trichlor-phenylester, Smp.l7°.

b) Q,N-Dicarbobensoxy-L-tyrosyl-L-phenylalanin-methy!ester Man versetzt 157 g 0,N-Dicarbobenzoxy-L-tyrosin-2,4,5-trichlor-phenylester mit 47 g L-Phenylalanin-methylester in 300 ecm Dimethylformamid. Nach 16 Stunden verdünnt man mit 600 ecm Essigester. Der gebildete Niederschlag wird abgenutscht und mit Essigester, Aether, 1-N Salzsäure und Wasser gewaschen. Nach Trocknen im Hochvakuum bei 40° erhält man den Ο,Ν-Dicarbobenzoxy-L-tyrosyl-L-phenylalanin methylester, vom Smp. 187°. [α·]ψ = - l6° (Dimethylformamid.)

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2018

c) S-Benzyl-ß-rnercaptopropionyl-L-tyrosyl-L-phenylalanin-

92 g Ο,Ν-Dicarbobenzoxy-L-tyrosyl-L-phenylalanin-methylester werden in 900 ecm mit Bromwasserstoff gesättigter, wasserfreier Essigsäure gelöst. Man lässt eine Stunde bei 20° stehen, verdampft im Vakuum unterhalb 40° und wäscht den Rückstand sorgfältig mit Diäthyläther nach. Man löst den Rückstand in 36O ml Wasser bei 0°, gibt 22 g Kaliumcarbonat zu und extrahiert mit Essigester bei 0°. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat gibt man 55 g S-Benzylß-mercaptopropionsäure-2,4,5-trichlor-phenylester zu und lässt 15 Stunden bei 20° stehen. Man wäscht die Lösung mit verdünnter Salzsäure und wässerigem Natriumbicarbonat, trocknet über Natriumsulfat und verdampft den Essigester im Vakuum bei 30⁰. Der Rückstand wird mit Aether/Petroläther 1:2 gewaschen. Nach dem Trocknen im Hochvakuum bei erhält man den S-üenzyl-ß-mercaptopropionyl-L-tyrosyl-L-phenylalanin-methylester vom Smp. 149°; [a]jp * - 18° (Dimethylformamid).

d) S-Benzyl-ß-mercaptopropionyl-L-tyrosyl-L-phenylalaninhydrazid

^ Man löst 52 g S-Benzyl-ß-mercaptopropionyl-L-tyrosyl-L-phenylalanin-methylester in 260 ecm wasserfreiem Methanol,

¹^ gibt 32 ecm wasserfreies Hydrazin zu und lässt I5 Stunden bei ^ 20° stehen. Man nutscht den Niederschlag ab und wäscht mit

cc 0

κ. Methanol nach. Nach dem Trocknen im Vakuum bei 50 erhält

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man S-Benzyl-ß-mercaptopropionyl-L-tyrosyl-L-phenylalaninhydrazid vom Smp. 253° ; [a]jp = - 17° (0,3 N HCl in 95 % Essigsäure).

e) S-Benzyl-ß-mercapto-propionyl-L-tyrosyl-L-phenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-G-tosyl-L-arginyl-glycinamid.

Man löst 33 g S-Benzyl-ß-^nercapto-proplonyl-L-tyrosyl-L-phenylalanin-hydrazid in einem Gemisch von 250 ml Dimethyl« formamid, 250 ml Isopropanol und 32 ecm 6-N Salzsäure, kühlt bei -5° und gibt unter Rühren 13,5 ml einer 5-N Lösung von Natriumnitrit in Wasser zu. Nach 5.Min. giesst man die so erhaltene Lösung in 1,6 1 einer 0,25-n-Lösung von Natriumbicarbonat in Wasser. Der ausgefällte Niederschlag wird abgenutscht, mit Wasser gewaschen, im Hochvakuum bei 2° getrocknet und mit einer Lösung von 50 g L-GIutaminyl-L-asparaginy1-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-G-tosyl-L-arginyl-glycinamid in 300 ml Dimethylformamid versetzt. Man lässt 2 Tage stehen, versetzt hierauf mit 1200 ecm Essigester und wäscht den Niederschlag mit Essigester. Nach Trocknen bei 30⁰ wird das Produkt mit warmem Methanol gev/aschen. Man erhält so das S-Benzyl-ß-mercaptopropionyl -L- tyrosyl-L-phenylalanyl-L-glutarainyl-L-aspara-.. ginyl-S-benzyl-L-cys te inyl-L-prolyl-G-tosyl-L-arginylglycinamid vom Smp.. 197°; [a]*-²=-37° (Dimethylformamid.)

90983 27U92

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f) ß-MGroaρtoρroρionyi-J--tyrosyl-L-pnenylalaαyl-L-_ίίlutafflinyl-L-^spara^inyl-L-c;/ s teinyl -L-proiyl ~L-ar^iny 1 -_rjly jinarnld Man versetzt cine Lösung von 5 Z S-Benayl-ß-iuoroaptopropionyl-L«tyrosyl-L-pheriylalaiiyl-L-:i₁-lutaminyl-L-aspariV5inyl 3- benzyl -L-; sys toinyl-L-prolyl-G- tosyl-L-arginyl -gly ^iaamid in 1200 ecm trockene·«, flüssigem Ara.-noniak iiiit soviel Natriua- oder Kaiiuiiuaetail bis eine beständige blaue Farbe eingetreten iat. üJaeii Zugabe von 1,5 ^ ;\=.ii7ioniu;n^nlorid wird die Lösung zur Tror-kn^ eingedampft. Der Rückstand onth'ilt das ß-Mercaptopropionyi-jj-tyrosyl-L-phenylalanyl-L-glutaminyl -L-aspara^inyi-L-cys teiny i -L-prolyl-L-arvjinyl und kann direkt weiter verarbeitet werden.

Polj>p3ptidver'jindun£s I

Dar iia.A Abschnitt r erhaltene Rückstand wird in ¹I Liter 0,01-ii Essigsäure gelöst und Uüi einem pH von 6,5 - 9*0 duroh Zusatz νοα ι,5 _&.i einer 1-n Lösung von i/asserstoffperoxyd in //asser oxydiert. Man bringt die Lösung auf einen pH von 4,5 «-alt verdünnter Salzsäure und dampft nach Zusatz von 50 G Natriumchlorid oder /on 0,3^t- 5 Methansulfonsäure oder von 0,405 q Trifluorcsaigsäure zur Trockne ab, v-ooei ein trockenes Pulver· erhalten v.drd, das gut haltbar ist. Es kann aufbewahrt verden und bei Gebrauch klar gelöst vrerden. I4an kann jadoch auch dio Lösung direkt verwenden, eventuell nach Verdiinnen tfit tJasser oder einer Salzlösung.

Zur Entfernung der anor^aniscaen Salze kann &±_e obener-'iähnte, _f,.:· einen pH von 4.7 33b;.achte Lösung ei^eei«^ werde, u id anschliessend 9 Q 9 8 3 2 / U 9 2 BAD

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einer Gegenstromverteilung in dem System sek.-Butanol/ Wasser/Eisessig 120/160/I unterworfen werden. Nach 200 Transferstufen befindet sich die Substanz in den Rohren 38 bis 62 mit einem Maximum beim Rohr 50 (K = 0,33). Nach Abdampfen erhalt man mit einer guten Ausbeute das wirksame Polypeptid in Form seines hygroskopischen Acetats, das sich chromatographisch und elektrophoretisch einheitlich verhb.lt. Migration bei der Papierelektrophorese bei pH 5,8 und 40 V/cm: 30 mm in 60 Min. (das als Referenz gebrauchte Histidin wandert 72 mm). Migration bei der Papierelektrophorese bei pH 1,9 und 40 V/cm: 34 mm in 60 Min. (das als Referenz gebrauchte Tryptophan wandert 62 mm). Rf bei Papierchromatographie im System Isoamylalkohol/ Pyridin/tfasser 35/35/30: 0,27. Die Totalhydrolyse (16 Std., 110°, HCl 6 N) liefert die folgenden Aminosäuren in equimolekularen Mengen: Tyrosin, Phenylalanin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Prolin, Arginin und Glycin; sowie die verschiedenen Disulfide von Cystein und ß-Mercaptopropionsaure. [a]p - -92,5° in 0,1 N Essigsäure.

Beispiel 2:

Man verfahrt wie in Beispiel 1. Man oxydiert aber, am Ende bei 0-35° durch Zusatz von 7*1 ecm 1-n Lösung von Kaliuraferricyanid in Wasser bei einem pH von 5*0 - 9,0.

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Beispiel ^:

Man verfahrt wie in Beispiel 1. Man oxydiert aber am Ende bei 0 - 35° durch Zusatz von 1,05 g 1,2-Dijodoa.than, in Aceton gelöst, bei einem pH von 5*5 - 8,5· Nach der Oxy-1,2-dation extrahiert man den Ueberschuss von/Dijodoathan mit ,Essigester. Der in der wässerigen Lösung noch enthaltene Essigester wird im Vakuum bei 20° entfernt.

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CONH₂ 2018

CH₀

ι ^ά

CH,

CH, CONH,

CH,

CH₂-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-Co-

cn_n ' CH,

Tyr

Phe

4 GIu

Asp

6 Cys

NH-

ί ' CH₂

CH₉
²

C -

i! NH

NH,

CH₂-CH₂
CH₂

I CH- CO-NH- CH-CO-NH-CH-,- CONH₀

Pro Arg Gly

CO.

CONH₂ S-R' CH₂-CH₂ NH— 0—NH-R"

CH₂ CONH₂ S-R' CH₂-CH₂ CH₂

CH₂ NH

II

CH₂ CH₂ CH₂ CH₂

NHg-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-N CH-CO-NH-CH-Co-NH-CH₂-CONH₂

GIu

Asp

Cys

Pro Arg

GIy

S-R¹

C₆H₄OH

CH₂-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-OH Mpr Tyr Phe

-Mpr- = ß-Mercapto-propionyl III

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2019

CONH,

S-R¹

CH₂ CONH₂ S-R'

CHp OH₅ CH₀ CH₀ CH₀

CHo-CO-NH- CH- CO-NH-CH- CO-NH-CH- CO-NH-CH-

CO-NH-CH-CO-i

2
Tyr

Phe

4 GIu 5
Asp

NH C

I Il

CH₂ NH

NH-R"

CH₂-CH₂
CH,

2 |"2

GH- CO-NH- CH- CO-NH- CH₀- CONH₀ 8 2q

Pro Arg GIy

u g:

Cys

C₆H₄OH
t

CH₂

Γ²

CH„ CONH,

CH,

SH

ι I ^c I ^β

CH₂-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO·

ι 23456

Mpr Tyr Pne GIu Asp Cys

NH-I

CH₂-

-C-

NH

-NH₂

-CH,

CH₂

-N-

CH₂ CH₂
-CH-CO-NK-CH-CO-NH-

Arg

CH₀-CONH GIy

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201C

CONH₂

^C6^H5^OH

'6⁹S JH₂

COi

CEr NH₂

CH₂ CH₂

Γr ι ,

NH₂-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-Co-NH-CH-CO-

Tyr

Plie

4 GIu Asp

S Cys

NH-

CHp-CH

C-

Ii

NH

^2 ?2

N- CH-CO-NH-CH-CO-NH-Ch₂-CONH₂

GIy

Pro

ö Arg VI

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Claims

- 15 - 2018 Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung des neuen Polypeptids der Formel I und seiner Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Polypeptid der Formel V nach an sich bekannten Methoden oxydiert und das so erhaltene Polypeptid der Formel I anschliessend gegebenenfalls auf an sich bekannte Weise in seine Säureadditionssalze mit organischen oder anorganischen Säuren überführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

dass man diese Oxydation in wässriger oder organisch-wass- riger Lösung ausführt.

3· Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeich,-net, dass man als wässrig-organische Lösung eine wässrigalkoholische Lösung oder ein Wasser-Aceton-Gemisch verwendet.

4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3* dadurch gekennzeichnet, dass man als Oxydationsmittel Wasserstoffperoxyd, Kaliumferricyanid oder 1,2-Dijodoäthan verwendet.

5. Polypeptid der Formel I und seine Säureadditionssalze.

6. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es das Polypeptid der formel I bzw. dessen Säureadditionssalze, enthält.

BAD ORIGINAL 909832/U9Z ^B

Der Patentanwalt: 1 /