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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Polypetids, welches Luliberinagonisteigenschaften aufweist. Luliberin ist der international übliche Trivialname für LH-RF (luteinising hormone releasing factor) (J. Biol. Chem., [1975], 250,3215).
Es ist bekannt (Dutta, Furr, Giles und Morley, Clinical Endocrinology, [1976], 5, Ergänzung, S. 291s bis 298s), dass der Einbau von a-Aza-aminosäuren an der 6-oder 10-Stellung von Luliberin Verbindungen ergibt, die hinsichtlich der Freisetzung von Luteinisierungshormon (LH) aus der Hypophyse weniger wirksam sind als das Ausgangsmolekül.
Es wurde nun gefunden, dass der Einbau von Azaglycin an der 10-Stellung in Verbindung mit dem Einbau von verschiedenen D-a-Aminosäuren an der 6-Stellung in Luliberin Verbindungen ergibt, die hinsichtlich der Freisetzung von Luteinisierungshormon aktiver sind als Luliberin.
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Leu oder MeLeu steht, in Form eines pharmazeutisch oder veterinär verwendbaren Säureadditionssalzes.
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- aminosäurerest ist ein solcher, in welchem das a-CH einer Aminosäure durch Stickstoff ersetzt worden ist. Die Abkürzung für eine a-Aza-aminosäure leitet sich von der entsprechenden Aminosäure durch Hinzufügung der Vorsilbe"Az"ab. Somit steht Azgly für Azaglycin.
Wenn die Konfiguration einer bestimmten Aminosäure nicht angegeben ist, dann besitzt diese Aminosäure (ausser der a-Aza-aminosäure, die benachbart zur Carboxygruppe kein asymmetrisches Zentrum enthält) die natürliche L-Konfiguration.
Eine spezielle Gruppe von erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen ist :
Verbindungen, in welchen A für D-Tyr (Me), D-Ser, D-Ser (But), D-Phe, D-Ala oder D-Trp und B für Leu oder MeLeu steht.
Eine bevorzugte Gruppe von erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen ist jene, in welcher A für D-Tyr (Me), D-Ser (But) oder D-Phe steht und B für Leu oder MeLeu steht.
Die drei bevorzugten erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen besitzen die folgenden Strukturen :
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Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der allgemeinen Formel
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dung
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mit einer Verbindung der allgemeinen Formel
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worin R 1 ein Aktivester ist, oder mit einer Verbindung der allgemeinen Formel
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in Gegenwart von N, -Dicyclohexylcarbodiimid umsetzt.
Die Ausgangsmaterialien für das erfindungsgemässe Verfahren können aus bekannten Verbindungen durch Standardpeptidkupplungsreaktionen, Standardpeptidschutzreaktionen und Standardpeptidschutzgruppenabspaltungsreaktionen hergestellt werden, wie sie Fachleuten, auf diesem Gebiet allgemein bekannt sind und wie sie in den Beispielen 1 bis 8 bzw. im Schema angegeben sind.
Wie bereits oben festgestellt, besitzen die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen Luliberinagonisteigenschaften, d. h., dass sie ähnliche Wirkungen wie Luliberin aufweisen, ein vom Hypothalamus sekretiertes natürliches Hormon, das auf die Hypophyse wirkt und diese zur Freisetzung von Luteinisierungshormon (LH) und Follikelstimulierungshormonen (FSH) veranlasst.
Diese beiden Hypophysenhormone spielen bei reproduktiven Prozessen eine Rolle, wobei letzteres, nämlich FSH, in den Ovarien eine Förderung der Reifung der Follikeln bewirkt und ersteres, nämlich LH, die Ovulation induziert. Die Verbindungen der Formel (I) sind in unerwarteter Weise hinsichtlich des Vermögens der Freisetzung von LH wesentlich wirksamer als Luliberin und eignen sich deshalb für die Beeinflussung und/oder Verbesserung der Vermehrung bei Tieren. Sie eignen sich insbesondere für die Züchtung von grossen Haustieren während eines Anöstrusses und bei jeder künstlich beeinflussten Züchtung zur genauen Bestimmung der Ovulation. Sie eignen sich auch für die Heilung von Unfruchtbarkeitszuständen bei Mann und Frau.
Der Luliberinagonisteffekt der erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen kann beispielsweise durch das Vermögen demonstriert werden, eine Ovulation bei mit Androgen sterilisierten Ratten mit konstantem Östrus zu induzieren oder LH und FSH (gemessen durch doppelten Antikörperradioimmunotest) in das Blutplasma von unreifen männlichen Ratten oder in das Blutplasma von anöstrischen oder diöstrischen Mutterschafen abzugeben.
Der obige Test an mit Androgen sterilisierten Ratten wird wie folgt ausgeführt :
Mit Androgen sterilisierte weibliche Ratten, die durch Behandlung am 3., 4. und 5. Tag ihres Lebens mit 100 I1g Testosteronpropionat präpariert worden sind, zeigen einen beständigen östrischen Vaginalschleim und zahlreiche präovulatorische Follikeln in den Ovarien. Die Verabreichung von Luliberin und aktiven Analogen verursacht die Abgabe eines ovulierenden Anstiegs an LH und FSH, der durch die Anwesenheit von Eiern in den Fallopischen Tuben und frischen Corpora lutea in den Ovarien bestimmt werden kann.
Alle hier beispielsweise genannten Verbindungen sind hinsichtlich ihres Vermögens, eine Ovulation bei Ratten mit konstantem Östrus zu induzieren, aktiver als Luliberin und zeigen ausserdem keine giftigen Wirkungen, wenn sie in mindestens der 4fachen Dosis ihrer minimal aktiven Dosis verabreicht werden. Insbesondere sind die erfindungsgemäss erhältlichen bevorzugten Verbindungen, die in den Beispielen 4,6 und 7 beschrieben sind, annähernd 100mal so aktiv wie Luliberin. Sie zeigen ausserdem keinerlei toxische Effekte, wenn sie in der 100fachen Menge ihrer minimalen effektiven Dosis verabreicht werden.
Die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen können in Form eines pharmazeutisch oder veterinär medizinischen Präparates verwendet werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, auf welche sie jedoch nicht beschränkt ist, näher erläutert.
In den Beispielen bezieht sich Rf auf die aufsteigende Dünnschichtchromatographie (t. I. c.) auf Silicagelplatten (Kieselgel G). Die in dieser Chromatographie verwendeten Lösungsmittelsysteme
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In allen diesen Fällen wurden die Platten unter UV-Licht geprüft und mit Fluorescamin, Ninhydrin und Chlor-Stärke-Jodid-Reagentien behandelt. Wenn nichts anderes angegeben ist, dann
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Zu einer auf 0 C gekühlten und gerührten Suspension von 0,2 mMol L-Pyroglutamyl-L-histidyl- - L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosin-hydrazid in 0, 9 ml Dimethylformamid und 0, 7 ml Dimethylsulfoxyd wurden 0, 8' mMol 5, 7n-Chlorwasserstoff in Dioxan zugegeben. Nach einem 5 min dauernden heftigen Rühren wurde eine klare Lösung erhalten. Die Lösung wurde auf-20 C abgekühlt, 0, 22 mMolt-Butylnitrit wurden zugegeben, und das Rühren wurde 25 min fortgesetzt.
Die Temperatur wurde dann auf-30 C abgesenkt und die Lösung wurde durch Zusatz von 0,8 mMol Triäthyl-
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serstoff über einem 5%igen (G/G) Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator während 16 h] und aus 0,1 Mol Triäthylamin in 1 ml Dimethylformamid wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 24 h bei 4 C gerührt. Dimethylformamid wurde im Vakuum abgedampft, und der Rückstand wurde chromatographiert, wobei Dimethylformamid als Eluiermittel verwendet wurde. Das Peptid-hydrochlorid wurde weiter durch Verteilungschromatographie auf Sephatex G - 25 gereinigt, wobei das Lösungsmittelsystem RfR n-Butanol/Essigsäure/Wasser/Pyridin (5 : 1 : 5 : 1 V/V) verwendet wurde.
Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen, die nach dem vorstehenden Verfahren hergestellt wurden, sind als Beispiele 1 bis 6 in der folgenden Tabelle angeführt.
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<tb>
<tb> Beispiel <SEP> A <SEP> B <SEP> Ausbeute <SEP> % <SEP> Papierelektrophorese <SEP> Rf
<tb> Nr.
<SEP> (relativ <SEP> zu <SEP> Luliberin)
<tb> RfA
<tb> pH <SEP> 1 <SEP> pH <SEP> 6,5
<tb> 1 <SEP> D-Ala <SEP> Leu <SEP> 32 <SEP> 0,97 <SEP> 1,0 <SEP> 0,30
<tb> 2 <SEP> D-Phe <SEP> Leu <SEP> 40 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 0,71 <SEP> 0, <SEP> 27
<tb> 3 <SEP> D-Trp <SEP> Leu <SEP> 15 <SEP> 0,53 <SEP> 0,37 <SEP> 0, <SEP> 37
<tb> 4 <SEP> D-Tyr <SEP> (Me) <SEP> Leu <SEP> 15 <SEP> 0, <SEP> 92 <SEP> 0,87 <SEP> 0, <SEP> 25
<tb> 5 <SEP> D-Ser <SEP> (Bu <SEP> t) <SEP> Leu <SEP> 31 <SEP> 0, <SEP> 94 <SEP> 0, <SEP> 96 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> 6 <SEP> D-Tyr <SEP> (Me) <SEP> MeLeu <SEP> 26 <SEP> 0, <SEP> 87 <SEP> 0, <SEP> 90 <SEP> 0, <SEP> 34 <SEP>
<tb>
Die Ausgangsmaterialien für das erfindungsgemässe Verfahren können so erhalten werden, wie es in dem folgenden Schema beschrieben ist.
In dem Schema wurde die folgende Abkürzung verwendet :
Z = Benzyloxycarbonyl
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<tb>
<tb> Beispiel <SEP> A <SEP> B <SEP> Papierelektrophorese <SEP> Rf
<tb> Nr. <SEP> (relativ <SEP> zu <SEP> Luliberin)
<tb> rif <SEP> A
<tb> PH <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP> PH <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP> RfA <SEP>
<tb> 7 <SEP> D-Ser <SEP> Leu <SEP> 0,94 <SEP> 0,96 <SEP> 0,25
<tb> 8 <SEP> D-Phe <SEP> MeLeu <SEP> 0,84 <SEP> 0,87 <SEP> 0,35
<tb>