AT379599B

AT379599B - Verfahren zur herstellung eines neuen polypeptids

Info

Publication number: AT379599B
Application number: AT328484A
Authority: AT
Original assignee: Ici Plc
Priority date: 1976-05-11
Filing date: 1984-10-15
Publication date: 1986-01-27
Also published as: ATA328484A

Description


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   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Polypeptids, welches Luliberineigenschaften aufweist. Luliberin ist der international übliche Trivialname für LH-RF (luteinising hormone releasing factor)   (J. Biol. Chem., [ 1975],   250, 3215). 



   Es ist bekannt (Dutta, Furr, Giles und Morley, Clinical Endocrinology, [1976], 5, Ergänzung, S. 291s bis 298s), dass der Einbau von   a-Aza-aminsäuren   an der 6- oder 10-Stellung von Luliberin Verbindungen ergibt, die hinsichtlich der Freisetzung von Luteinisierungshormon (LH) aus der Hypophyse weniger wirksam sind als das Ausgangsmolekül.

   Es wurde nun gefunden, dass der Einbau von Azaglycin an der 10-Stellung in Verbindung mit dem Einbau von verschiedenen D-a-Aminosäuren an der 6-Stellung in Luliberin Verbindungen ergibt, die hinsichtlich der Freisetzung von Luteinisierungshormon aktiver sind als Luliberin. 
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 für Leu oder MeLeu steht, in Form eines pharmazeutisch oder veterinär verwendbaren Säureadditionssalzes. 
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   - aminosäurerest   ist ein solcher, in welchem das a-CH einer Aminosäure durch Stickstoff ersetzt worden ist. Die Abkürzung für eine   a-Aza-aminsäure   leitet sich von der entsprechenden Aminosäure durch Hinzufügung der Vorsilbe"Az"ab. Somit steht Azgly für Azaglycin. 



   Wenn die Konfiguration einer bestimmten Aminosäure nicht angegeben ist, dann besitzt diese Aminosäure (ausser der a-Aza-aminosäure, die benachbart zur Carboxygruppe kein asymmetrisches Zentrum enthält) die natürliche L-Konfiguration. 



   Eine spezielle Gruppe von erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen ist :
Verbindungen, in welchen A für   D-Tyr (Me),   D-Ser,   D-Ser   (But), D-Phe, D-Ala oder D-Trp und B für Leu oder MeLeu steht. 



   Eine bevorzugte Gruppe von erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen ist jene, in welcher A für D-Tyr (Me), D-Ser (But) oder D-Phe steht und B für Leu oder MeLeu steht. 



   Die drei bevorzugten erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen besitzen die folgenden Strukturen : 
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 tionssalze sind beispielsweise Hydrochloride, Phosphate, Citrate oder Acetate. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der allgemeinen Formel H-Azgly-NH2 in Form eines pharmazeutisch oder veterinär verwendbaren Säureadditionssalzes mit einer Verbindung der allgemeinen Formel 
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 oder mit einer Verbindung der allgemeinen Formel 
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 worin   R 1 ein   Aktivester ist, oder mit einer Verbindung der allgemeinen Formel 

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 in Gegenwart von N, N'-Dicyclohexylcarbodiimid umsetzt. 



   Die Ausgangsmaterialien für das erfindungsgemässe Verfahren können aus bekannten Verbindungen durch Standardpeptidkupplungsreaktionen, Standardpeptidschutzreaktionen und Standardpeptidschutzgruppenabspaltungsreaktionen hergestellt werden, wie sie Fachleuten, auf diesem Gebiet allgemein bekannt sind und wie sie in den Beispielen 1 bis 8 bzw. im Schema angegeben sind. 



   Wie bereits oben festgestellt, besitzen die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen Luliberinagonisteigenschaften, d. h., dass sie ähnliche Wirkungen wie Luliberin aufweisen, ein vom Hypothalamus sekretiertes natürliches Hormon, das auf die Hypophyse wirkt und diese zur Freisetzung von Luteinisierungshormon (LH) und Follikelstimulierungshormon (FSH) veranlasst. 



  Diese beiden Hypophysenhormone spielen bei reproduktiven Prozessen eine Rolle, wobei letzteres, nämlch FSH, in den Ovarien eine Förderung der Reifung der Follikeln bewirkt und ersteres, nämlich LH, die Ovulation induziert. Die Verbindungen der Formel   (I)   sind in unerwarteter Weise hinsichtlich des Vermögens der Freisetzung von LH wesentlich wirksamer als Luliberin und eignen sich deshalb für die Beeinflussung und/oder Verbesserung der Vermehrung bei Tieren. Sie eignen sich insbesondere für die Züchtung von grossen Haustieren während eines Anöstrusses und bei jeder künstlich beeinflussten Züchtung zur genauen Bestimmung der Ovulation. 



  Sie eignen sich auch für die Heilung von Unfruchtbarkeitszuständen bei Mann und Frau. 



   Der Luliberinagonisteffekt der erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen kann beispielsweise durch das Vermögen demonstriert werden, eine Ovulation bei mit Androgen sterilisierten Ratten mit konstantem Östrus zu induzieren oder LH und FSH (gemessen durch doppelten Antikörperradioimmunotest) in das Blutplasma von unreifen männlichen Ratten oder in das Blutplasma von anöstri- 
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Mit Androgen sterilisierte weibliche Ratten, die durch Behandlung am 3., 4. und 5. Tag ihres Lebens mit   100 ug   Testosteronpropionat präpariert worden sind, zeigen einen beständigen östrischen Vaginalschleim und zahlreiche präovulatorische Follikeln in den Ovarien.

   Die Verabreichung von Luliberin und aktiven Analogen verursacht die Abgabe eines ovulierenden Anstiegs an LH und FSH, der durch die Anwesenheit von Eiern in den Fallopischen Tuben und frischen Corpora lutea in den Ovarien bestimmt werden kann. 



   Alle hier beispielsweise genannten Verbindungen sind hinsichtlich ihres Vermögens, eine Ovulation bei Ratten mit konstantem Östrus zu induzieren, aktiver als Luliberin und zeigen ausserdem keine giftigen Wirkungen, wenn sie in mindestens der 4fachen Dosis ihrer minimal aktiven Dosis verabreicht werden. Insbesondere sind die erfindungsgemäss erhältlichen bevorzugten Verbindungen, die in den Beispielen 4,6 und 7 beschrieben sind, annähernd 100mal so aktiv wie Luliberin. Sie zeigen ausserdem keinerlei toxische Effekte, wenn sie in der 100fachen Menge ihrer minimalen effektiven Dosis verabreicht werden. 



   Die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen können in Form eines pharmazeutischen oder veterinär medizinischen Präparates verwendet werden und einer gesamten täglichen Dosis von   14 tig   bis 7 mg bei parenteraler Verabreichung. Wenn die Verabreichung über die Schleimmembranen erfolgt, dann liegt die Dosis zwischen den oben angegebenen Bereichen für orale und parenterale Verabreichung. 



   Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, auf welche sie jedoch nicht beschränkt ist, näher erläutert. 



   In den Beispielen bezieht sich Rf auf die aufsteigende Dünnschichtchromatographie   (t. I. c.)   auf Silcagelplatten (Kieselgel G). Die in dieser Chromatographie verwendeten Lösungsmittelsysteme waren   Butan-1-01/Essigsäure/Wasser     (4 : 1 : 5 V/V) (R A), Butan-1-ol/Essigsäure/Wasser/Pyridin     (15 : 3 : 12 : 10   V/V)   (RfB), Butan-2-01/3%   G/V wässeriges Ammoniumhydroxyd   (3 : 1 vIV) (RfC),   Acetonitril/Wasser (3 : 1 V/V)   (Rf D),   Aceton/Chloroform   (1 : 1 VIV) (RfE),   Chloroform/Äthanol (1 : 4 V/V) 

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 Ninhydrin und Chlor-Stärke-Jodid-Reagentien behandelt.

   Wenn nichts anderes angegeben ist, dann bedeuten die angegebenen   Rc-Werte,   dass ein einziger Fleck durch diese Verfahren bestimmt wurde. 



   Beispiele 1 bis 6 : Synthese von   L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-trosyl-A-L-     - leucyl-L-arginyl-L-prolyl-azaglycinamid   
Zu einer auf   0 C   gekühlten und gerührten Suspension von 0,2 mMol L-Pyroglutamyl-L-histidyl-   -L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-A-L-leucyl-L-arginyl-L-prolin-hydrazid   in 0, 9 ml Dimethylformamid und 0, 7 ml Dimethylsulfoxyd wurden 0, 8 Mol 5, 7n-Chlorwasserstoff in Dioxan zugegeben. Nach einem 5 min dauernden heftigen Rühren wurde eine klare Lösung erhalten. Die Lösung 
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 Azaglycinamid-dihydrochlorid und aus 0,1 mMol Triäthylamin in 1 ml Dimethylformamid wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 24 h bei   4 C   gerührt.

   Dimethylformamid wurde im Vakuum abgedampft, und der Rückstand wurde chromatographiert, wobei Dimethylformamid als Eluiermittel verwendet wurde. Das Peptid-hydrochlorid wurde weiter durch Verteilungschromatographie gereinigt, wobei das Lösungsmittelsystem n-Butanol/Essigsäure/Wasser/Pyridin (5 : 1 : 5 : 1 V/V) verwendet wurde. 



   Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen, die nach dem obenstehenden Verfahren hergestellt wurden, sind als Beispiele 1 bis 6 in der folgenden Tabelle angeführt. 



   Tabelle 
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 EMI3.4 
 
<tb> 
<tb> Beispiel <SEP> A <SEP> B <SEP> Ausbeute <SEP> % <SEP> Papierelektrophorese <SEP> Rf
<tb> Nr. <SEP> (relativ <SEP> zu <SEP> Luliberin)
<tb> R <SEP> f <SEP> A <SEP> 
<tb> PH <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP> PH <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> 1 <SEP> D-Ala <SEP> Leu <SEP> 32 <SEP> 0, <SEP> 97 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 30 <SEP> 
<tb> 2 <SEP> D-Phe <SEP> Leu <SEP> 40 <SEP> 1,0 <SEP> 0,71 <SEP> 0,27
<tb> 3 <SEP> D-Trp <SEP> Leu <SEP> 15 <SEP> 0, <SEP> 53 <SEP> 0, <SEP> 37 <SEP> 0,37
<tb> 4 <SEP> D-Tyr <SEP> (Me) <SEP> Leu <SEP> 15 <SEP> 0,92 <SEP> 0, <SEP> 87 <SEP> 0,25
<tb> 5 <SEP> D-Ser(But) <SEP> Leu <SEP> 31 <SEP> 0,94 <SEP> 0,96 <SEP> 0,25
<tb> 6 <SEP> D-Tyr <SEP> (Me) <SEP> MeLeu <SEP> 26 <SEP> 0, <SEP> 87 <SEP> 0, <SEP> 90 <SEP> 0, <SEP> 34 <SEP> 
<tb> 
 
Die Ausgangsmaterialien für das erfindungsgemässe Verfahren können so erhalten werden,

   wie es in dem folgenden Schema beschrieben ist. 



   In diesem Schema wurden die folgenden Abkürzungen verwendet :
Bzl = Benzyl
Boc =   tert. Butoxycarbonyl   

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 EMI4.2 
 
 EMI4.3 
 
 EMI4.4 
 
 EMI4.5 
 
<tb> 
<tb> Beispiel <SEP> A <SEP> B <SEP> Papierelektrophorese <SEP> Rf
<tb> Nr. <SEP> (relativ <SEP> zu <SEP> Luliberin)
<tb> Rl
<tb> PH <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP> PH <SEP> 6, <SEP> 5
<tb> 7D-Ser <SEP> Leu0, <SEP> 94 <SEP> 0, <SEP> 96 <SEP> 0, <SEP> 25
<tb> 8 <SEP> D-Phe <SEP> MeLeu <SEP> 0, <SEP> 84 <SEP> 0, <SEP> 87 <SEP> 0,35
<tb>

Claims

EMI4.6 EMI4.7 EMI4.8 EMI4.9 <Desc/Clms Page number 5> oder mit einer Verbindung der allgemeinen Formel EMI5.1 worin R1 ein Aktivester ist, oder mit einer Verbindung der allgemeinen Formel EMI5.2 in Gegenwart von N, -Dicyclohexylcarbodiimid umsetzt.