DE2501091A1 - 17-alpha-aethinyl-(5-alpha)-2-androsten-17-beta-ol und sein 17-beta-acetat, verfahren zu ihrer herstellung und ihre therapeutische verwendung - Google Patents

Description

Anmelder: Societe Dite
THERAMEX S.A.
11 BId Lannes
F-75016 Paris/ Frankreich

A 13 056

17-a-lthinyl-{5-ay2-androsten-i7-ß-ol und sein 17-ß-Acetat, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre therapeutische Verwendung

Die Erfindung betrifft die neue Verbindung 17-a-Ithinyl-(5a)-2-androsten-17-ß-ol und ihr 17-ß-Aeetat, gekennzeichnet durch die Formel

_ _ _ G = OH

worin E H oder Ac bedeutet,

in reiner Form, ohne Beimischung eines Isomeren sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Produktes und dessen therapeutische Verwendung.

SG9830/0949

2501031

Bestimmte Autoren, insbesondere M. Huffman (US-Patentschrift 2 996 524 und französische Patentschrift 3 084M), J.A. Edwards und A. Bowers ("Chemistry and Industry", Seiten 1962-65), B. Pomonis et al ("Cancer Chemotherapy Reports" 1062, Sept., Seiten 31-32), haben ein Verfahren zur Herstellung einer Substanz beschrieben, der sie die Struktur und chemische Formel von 17-a-Äthinyl-(5a)-2-androsten-17-ß-ol (und seinem Acetat) zugeschrieben haben und die solche Eigenschaften aufweisen soll, daß sie

das retikulo-endotheliale System stimuliert, die Gonaden hemmt durch Unterdrücken der Hydrophysen-Gonadotropine.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß es sich bei der nach diesem Verfahren erhaltenen Substanz in Wirklichkeit nicht um die chemische Verbindung 17-a-Äthinyl-(5a)-2-androsten-17-ß-ol, sondern vielmehr um ein Gemisch von Isomeren mit uneinheitlicher biologischer Aktivität, jedoch identischer Polarität, handelt, und daß es deshalb unmöglich ist, dieses Gemisch nach üblichen chromatographischen Verfahren aufzutrennen.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von 17-tx-Äthinyl-(5a)-2-androsten-17-ß-ol, das frei von jeglichen Isomeren ist. Gegenstand der Erfindung ist ferner die dabei erhaltene Verbindung selbst, die erfindungsgemäß zum ersten Mal in reiner Form herstellbar ist·

Es wurde ferner gefunden, daß die Eigenschaften dieser erfindungsgemäßen Verbindung von denjenigen, wie sie ursprünglich der oben angegebenen Mischung zugeschrieben worden sind, verschieden sind und daß einige davon sogar gegensätzlich dazu sind. In dieser Mischung finden sich nämlich sowohl das 17-oc-Äthinyl-(5a)-2-androsten-17-ß-ol (nachfolgend abgekürzt mit "DEI/EA-2") als auch das isomere 17-a-Ithinyl-(5a)-3-androsten-

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17-ß-ol (nachfolgend abgekürzt mit "DEHDA-J") in nicht vernachlässigbaren Mengen; die Mischung aus den beiden Isomeren, die von den oben angegebenen Autoren beschrieben worden ist, wird nachfolgend abgekürzt mit "MIX".

Die Erfindung bezieht sich ferner auf den Nachweis der biologischen Überlegenheit des Isomeren "DELTA-2" gegenüber seinem Analogon "DEI/TA-3" und der durch die Herstellung dieses Produktes in reiner Form erzielbaren Vorteile·

Die Erfindung betrifft schließlich die therapeutische Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Verbindung auf den nachfolgend beschriebenen Anwendungsgebieten.

A) Herstellung der einen Gegenstand'der Erfindung bildenden Verbindung: _;

Die praktisch identische Polarität der beiden Isomeren "DELTA-2" und "DEHDA-3" macht die Trennung dieser Verbindungen nach den klassischen,chromatographischen Verfahren praktisch unmöglich und dies ist der Grund dafür, daß beispielsweise die in der US-Patentschrift 2 996 524 beschriebene Herstellung unvermeidlich zu einem Isomerengemisch führt.

Die vorliegende Erfindung beruht nun darauf, daß gefunden wurde, daß das "DELTA-3"-Isomere gegenüber dem Jones-Reagens empfindlich ist im Gegensatz zu dem "DELQ}A-2"-Isomeren, das gegenüber dem gleichen Reagens (bei dem es sich um eine Lösung von Chromsäureanhydrid in Aceton in Gegenwart von HpSO₂, handelt, vgl. K. Boden, L.N. Heilbron, E.R.H. Jones, E. Weedon in "Journal Chem. Soc." 194-6,39) beständig ist.

Das Verfahren zur Herstellung von reinem "DELTA-2^M, das einen weiteren Gegenstand der Erfindung bildet, ist deshalb dadurch gekennzeichnet, daß man das Ausgangsmaterial, bei dem es sich

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lim ein Isomerengemisch handelt, mit dem Jones-Reagens behandelt; dabei wird das "DELTA-J"-Isomere von 17-Keto-(5a)-2-androsten höchstwahrscheinlich zu einer entsprechenden Disäure oder einem entsprechenden Aldehyd oxidiert und diese (dieser) weist eine andere Polarität auf als das "DELTA-2"-Isomere, wodurch es möglich ist, letzteres durch Silicagel-Ohromatographie in praktisch reiner Form zu isolieren· Von diesem Punkt aus führt das reine 17-Keto-(5a)-2-androsten, wenn es.der in Beispiel 8 der US-Patentschrift 2 996 524 beschriebenen Reaktion unterworfen worden ist, zum 17-oclthinyl-(5a)-2-androsten-17--ß-ol, Jedoch in reiner Form, bei dem es sich um das den Gegenstand der Erfindung bildende Produkt handelt·

Nachfolgend wird ein Herstellungsverfahren beschrieben, bei dem erfindungsgemäß in einer ersten Stufe die 17-Keto-(5oc)-androsten-2- und -3-Isomeren voneinander getrennt und dann in einer zweiten Stufe das Produkt hergestellt wird,

Beispiel

Stufe 1: Auftrennung einer Mischung der 17-Keto-(5a)-androsten-2- und -3-Isomeren '_

20 g des Steroids in 400 ecm Acetonlösung werden in einen 1-Liter-Kolben mit Magnetrührer eingeführt· Sie wird auf -20°C abgekühlt und es werden 60 ecm Jones-Reagens zugetropft· Der Kolben wird 1 1/4 Stunden lang geschüttelt, um wieder Raumtemperatur anzunehmen· Es werden 100 ecm Methanol zugegeben und die Mischung wird 15 Minuten lang geschüttelt· Die Lösungsmittel werden abdestilliert und der Rückstand wird in 700 ecm Wasser aufgenommen» Der Niederschlag wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen, dann in 500 ecm Methylenchlorid gelöst· Die organische Lösung wird mit Natriumsulfat getrocknet und destilliert. Der Rückstand (18,5 g) wird durch Silicagel-Säulenchromatographie

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gereinigt. Die Elution mit Benzol ergibt 11 g des reinen "DELTAS"-Derivats» Die Untersuchung des NMR-Spektrums (CDCl,, IEMS) dieses Derivats zeigt olefinische Protonen an Cp und C, in Form eines breiten Singuletts bei 334 Hz (W/2:5Hz), während bei dem Derivat "DELTAS" die olefinischen Protonen in Form von breiten Signalen zwischen 312 und 348 Hz auftreten.

Stufe 2: Herstellung des reinen 17-a-Äthinyl-(5a)-2-androsten- ^7-ß-ols__ohne

1,2 g Kalium werden in 30,5 ml wasserfreiem t-Amylalkohol gelöst. Eine Lösung von 1,1 g des oben in der Stufe 1 hergestellten reinen 2-Androsten-17-ons in 40 ml wasserfreiem Toluol wird zugegeben und zum Verdrängen der Luft wird Stickstoff durch die Mischung geleitet. Die dabei erhaltene Lösung wird 15 Stunden lang gerührt, wahrend ein langsamer Strom von gereinigtem wasserfreiem Acetylen durchgeleitet wird· Danach werden 300 ml Eiswasser zugegeben. Der pH-Wert wird mit 50 %iger wäßriger Chlorwasserstoffsäure auf 1 eingestellt. Die dabei erhaltene Lösung wird zur Entfernung sämtlicher flüchtiger organischer Materialien destilliert. Sie wird auf O⁰C abgekühlt, mit Äther extrahiert und der Ätherextrakt wird mit Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene 17-a-Äthinyl-2-androsten-17-ß-ol wird aus Hexaiumkristallisiert.

Stufe 3-ί Herstellung des 17-ß-Acetats von 17-a-Äthinyl-(5a)-

600 mg p-Ioluolsulfonsäure werden in eine Lösung von 600 mg 17-a-Äthinyl-2-androsten-17-ß-ol in 10 ecm Essigsäureanhydrid eingeführt. Die so erhaltene Lösung wird 18 Stunden lang bei 20°C unter Luftausschluß ruhen gelassen. Dann wird sie in 100 ecm Eiswasser gegossen und die Mischung wird 3 Stunden lang gekühlt. Der Niederschlag aus 17-a-Äthinyl-(5a)-2-androsten-

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17-ß-ol-acetat wird durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen, dann getrocknet und aus Methanol umkristallisiert.

B) Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindung;

Das in der obigen Stufe 2 erhaltene Produkt liegt in 3?orm von weißen Kristallen vor und hat einen Schmelzpunkt von 160 bis 162°0 (Kofier)· Diese Eigenschaften sind zu vergleichen mit denjenigen der nach dem von den oben genannten Autoren beschriebenen Verfahren erhaltenen Mischung: entsprechend dem Mengenanteil des Isomeren "DEI/PA-3" erhöht sich der unter den gleichen Bedingungen bestimmte Schmelzpunkt der Mischung, der zwischen 158 und 168⁰G variiert, wobei eas sich dem Schmelzpunkt des reinen "DEIfl}A-3"-Isomeren nähert, der bei 198 bis 199⁰G (Kofier) liegt.

Das in der obigen Stufe 3 erhaltene Acetat der Verbindung "DELTA-2" liegt in Form von weißen !Plättchen mit einem Schmelzpunkt von 130 bis 131°G (Kofier) vor.

Unter der Abkürzung "DELTA-2" ist hier sowohl das 17-a-lthinyl-(5a)-2-androsten-17-ß-ol als auch sein 17-ß-Acetat zu verstehen.

Q ) (Therapeut is ehe Anwendung:

Vom biologischen und therapeutischen Standpunkt aus betrachtet muß die den Gegenstand der Erfindung bildende Verbindung als neu angesehen werden, da

a) die unter der gleichen Bezeichnung in der oben genannten US-Patentschrift beschriebene Substanz (sowie ihr Essigsäureester) in Wirklichkeit eine Mischung war, die variable, jedoch stets verhältnismäßig große Mengenanteile des "DELTA-3ⁿ-Isomeren, das weit inaktiver ist, enthielt, und

b) die den Gegenstand der Erfindung bildende Verbindung auf unerwarteten therapeutischen Gebieten verwendbar ist, die

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sich von denjenigen unterscheiden und sogar gegensätzlich zu denen sind, wie sie in der oben angegebenen Literatur ihr zugeschrieben worden sind·

Nachfolgend wird eine Auswahl von biologischen Untersuchungen beschrieben, welche die therapeutischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindung erläutern.

I. Bei der Verbindung "DELTA-2" handelt es sich im Gegensatz zu den Angaben in der obigen Literatur (die in Wahrheit "MIX" betrifft) um einen Gonadenstimulator, die daher unter bestimmten Bedingungen auf verschiedene Weise eine olomiphenartige stimulierende Wirkung auf die Hypophysen-Gonadotropine. ausübt. Aufgrunddessen eignet sie sich für die Behandlung von Ovarial- oder Testitoilar-Funktionsstörungen einschließlich einiger Formen der Sterilität.

Clomiphene, ein klassisches Gonadotropin-Stimulans, das für die Behandlung von Hypophysen-Gonadenf unkt ionsstörungen, unter anderem der weiblichen Sterilität durch Anovulation, verwendet wird, wurde in verschiedenen Versuchsreihen, welche die clomiphen-artigen Wirkungen von 17-a-A'thinyl-(5a)-2-androsten-17-ß-· acetat zeigen, als Standard (Vergleichsverbindung) verwendet.

a) Bei ausgewachsenen weiblichen Ratten, denen eine geeignete Dosis Clomiphene zu einem bestimmten Zeitpunkt des Cyclus injiziert wurde, wurde die Ovulation bei 100 % der Tiere verhindert (Docke, "J. Eeprod. Fertility", 1971, 24, 45-54). Die nachfolgend angegebene Tabelle zeigt, daß die Verbindung "DELTA-2" bei diesem Verfahren qualitative Wirkungen aufweist, die analog zu denjenigen von Clomiphene sind.

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Tabelle	I	Anzahl der Eizellen	rechtes Ovarium	mittlere Ge samtanzahl
Prozentsatz		linkes Ovarium	5-9	13,5
der okulierenden Tiere		5-9.	O	O
Vergleichs versuch. 100 %	O	6-8	14,5
Clomniphene s.c.,Einzel dosis 3mg/kg 0	7-8	5-8	14
"DELTAS" s. c. 1,8mg/kg/Tagx3 40 %	6 - 10
"EEIfflA-2ns.c. 5,4mg/kg/Tagx3 60 %

Dieses erste Experiment war nur ein Reihenversuch (Sichtungsversuch); es erlaubte außerdem die Feststellung, daß die geringste verabreichte Dosis (1,8 mg/kg/Tagx3) bereits zu der maximalen Wirkung führte.

Eine Wiederholung des Experiments unter Verabreichung der Einzeldosen an "DEI/DA-2" von 1,8 mg und 5,4 mg/kg zu verschiedenen Zeitpunkten des Cyclus zeigte, daß die Wirksamkeit von "DEHDA-2" sowohl vom qualitativen als auch vom quantitativen Standpunkt aus betrachtet noch ähnlicher derjenigen von Clomniphene war, wenn das Steroid in der Mitte des Östruscyelus und im Proöstrocyclus verabreicht wurde:

Tabelle II

% Ovulation bei Injektion im Met-Ö'struscyclus im Proostruscyclus

"DEIffA-2" ¹'^{8 m}s/^kS 25 80

5,4 mg/kg 40 20

b) Bei nicht ausgewachsenen weiblichen Batten kann die Ovulation bei 80 % der Tiere hervorgemifen werden durch Injektion einer verhältnismäßig geringen Dosis (4 HJ) Gonadotropinen (Pregnant

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Mare Serum oder PMS). Bei diesem Verfahren führen sowohl Glomiphene als auch "DELTA-2" in einer geringen Dosis zu einer Herabsetzung des Prozentsatzes der ovulierenden Ratten;

Tabelle III

Kontrollversuch: 4	IU	PMS	80 j
4	IU	PMS η	30 5
4	IU	PMS η	20 ?
4	IU	PMS -i	100 9
	ό Ovulation
h Clomiphene (3 mg/kg)	ό "
h "DEI/rA-2" (0,6 mg/kg)
r "DELTAS" (1,8 mg/kg)	έ "

Der Mechanismus dieses Phänomens ist folgender: Die PMS bewirkt, daß die Ovarien eine entsprechende Menge östrogene ausscheiden, welche die !Freisetzung des IH-Hypophysen-Gonadotropine bewirken, das seinerseits die Ovulation auslösen.

ölomniphene, das ein Antiöstrogen ist, verhindert, daß die Östrogene, die unter der Einwirkung von PMS abgeschieden werden, auf die Hypophyse einwirken, so daß keine EH-Freisetzung und daher keine Ovulation auftritt.

"DELTA-2" ist kein Antiöstrogen. Theoretisch kann der antiovulatorische Effekt, den es bei niedrigen Dosen (0,6 mg/kg) hat, nur durch eine der folgenden Hypothesen erklärt werden:

a) Verhinderung der !Freisetzung des IH-Gonadotropins durch die Hypophyse,

b) Verhinderung der Abscheidung in den Ovarien unter der Einwirkung von PMS,

c) und/oder Verhinderung der Ovulation in den Ovarien unter der Einwirkung von LH, das gegebenenfalls nach der östrogenstimulierung freigesetzt worden ist.

Bei der hohen Dosis (1,8 mg/kg) wurde festgestellt, daß die Verbindung "DELTA-2" die Ovulation aufrechterhält und sie sogar stimuliert; dabei verhält sie sich wie ein direktes Hypophysen-

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Stimulans, in dem sie als FSH und LG oder das LH-EH hypothalamische Hormon freisetzender Paktor wirkt. Bei klinischen Versuchen wirkte die Verbindung "DELTA-2" wie LH-EH durch Erhöhung der Freisetzung von FSH und LH, selbst wenn diese bereits übermäßig war (z.B. bei dem Klinefelter-Syndrom) und selbst wenn der Überschuß die Folge eines genetischen Fehlens von Gonaden war (ä.B. Turner-Syndrom). Bei Verabreichung von höheren Dosen von HIS ( 8 I.U.) wurde eine (umgekehrte) Bestätigung der ölomiphenartigen Wirkung von "DELTA-2" erhalten und der zweite der oben erwähnten drei theoretischen Mechanismen ist der wahrscheinlichste, nämlich die Verhinderung der Ovariensekretion als Folge der PMS-Stimulierung. Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse von vier Versuchsreihen:

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Tabelle IV

Einzelne s.c. Injektion

Prozentsatz der okulierenden Ratten

I.Ver- 2.Ver- 3.Ver- 4.Ver- cumulative Anzahl der suchs- suchs- suchs- suchs- Ergebnisse Tiere reihe reihe reihe reihe

Kontroll-

CD
CO
CO

+ Olomiphene

I.tJ. HiS

0,75mg/kg

1,5 mg/kg

mg/kg

mg/kg

20

50

25 O

25 25

21

15 4

mittlere Anzahl der Eizellen

7 3 3 O

0,6 mg/kg

"DEL0?A-2" 1,8 mg/kg 5,4 mg/kg

20

75 50 50

16 10

5 8

1,5

Die beiden Verbindungen sind biologisch analog, sie wirken jedoch in verschiedener Weise:

Clomiphene ist ein AntiÖstrogen, das somit die Hemmwirkung der östrogene auf die Freisetzung des LH-Gonadotropins verhindert ,

das Steroid "DEI/PA-2" hindert die Ovarien an der Ausscheidung einer großen Menge von Östrogenen, die aufgrund der I¹SH-St imulierung erforderlich wäre.

II. Die Verbindung ^xl7-a-lthinyl-(5-a)-2-androsten-17-ß-ol (in der Acetatform) ist unter bestimmten Umständen ein direkter Gonadeninhibitor und im Gegensatz zu dem, was aufgrund des physiologischen Mechanismus der Rückkopplung zu erwarten gewesen wäre, ist die gonadeninhibierende Aktivität von "DELTA-2" verbunden mit einer Inhibierung der Hypophysen-Gonadotropine.

In der Praxis betrifft die Anwendung dieser Effekte die Behandlung einiger endokriner Tumoren, die nicht, nur hypophysenabhängig (was sich logischerweise aus den früheren Publikationen ergeben würde),sondern auch nicht-hypophysenabhängig sind.

A) Die direkten gonadeninhibierenden Effekte von "DEIiDA-2" treten gleichzeitig mit der Hypophysengonadotropin-Unterdrückung auf.

Bei weiblichen Ratten führt die Autotransplantation eines Teils eines Ovariums in das Omentum unmittelbar nach einer zweiseitigen Ovariektomie zu einer Ableitung der Gonadalhormone in die Leber und zu ihrer Zerstörung in diesem Organ. Es folgt eine starke, permanente, reaktionelle Erhöhung der Bildung von Hypophysen-Gonadotropinen, die eine Tumorwucherung des Ovarientransplantats hervorruft (die histologischen Befunde der auf diese Weise stimulierten Hypophyse sind charakteristisch).

Ein spezifisches hypophysenunterdrückendes Arzneimittel, wie

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Methallibure, führt bei diesem Versuch zu einem Stillstand der Entwicklung des Transplantats und zum Verschwinden der mikroskopischen Aspekte der ÜberStimulierung der Hypophyse (vgl. A. Ber, "Endokrinologie", 1968, =£, 62, ibid. 1968, ^, 257, "Acta Endocrinologica", 1972, 22, 167). Die Zugabe einer geeigneten Menge exogener Hypophysengonadotropine (PMB) führt zum Wiederauftreten der Entwicklung des Tumors, die durch Methallibure gestoppt worden war. Die Verabreichung einer Substanz "Zi", deren Effekt direkt gonadeninhibierend ist, führt zur Involution (Rückbildung) des Transplantats und verhindert das Wiederauftreten seiner Entwicklung bei der PMS-Stimulierung. Die Verbindung "DEIffiA-2" wirkte (wie die folgende Tabelle V zeigt) auf diese Weise, wenn sie nach diesem Verfahren getestet wurde, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden:

Tabelle V

Behandlung

Dosis/Tag Gewicht des Gewicht des (mg/kg oder Transplan- Uterus (mg) I.U./Tier) tats (mg)

transplantierte Kontro!!proben

+ Methallibure	120·	3	120 20
+Methallibure +PMS	120	6	120 20
+DELTA-2
+DEHDA-2
+Methallibure +PMS+DELTA-2
+Methallibure +PMS+DELTA-2

217,4+16,4- 58,6+8 22,6+2,4-*** 29 +4-,5**

20 136,5+24,5* 77 +9,7 136,7+10,7**119,5+14,9** 62,4+9,9***139,4+10,4***

" (D
3 153,7+35,2 128 +23,8*

₆ 69,7+ 9,8** 124,8+9,7***

(1). Aus dem Vergleich mit der Charge "Methallibure + PMS" können die folgenden Schlußfolgerungen gezogen werden:

1. "DE_TA-2" allein führt zur Involution des Ovarientransplantats, die statistisch signifikant unproportional zu den verabreichten Dosen ist;

2. "DEI/EA-2", das dem System Methallibure + PMS zugesetzt wird, führt ebenfalls zu einer statistisch signifikanten Involution des Transplantats.

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Dies ist der Beweis dafür, daß "DEI/DA-2" einen direkten gonadaninhibierenden Effekt aufweist, der, wie überraschend gefunden wurde, ein wesentlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung ist. Die histologische Untersuchung des Ovarientransplantats und der Hypophyse der behandelten Tiere bestätigt diese Tatsache.

Dieser direkte antigonadale Mechanismus der Verbindung "DELTA-2" liegt überraschenderweise gleichzeitig mit einem Hypophysengonadotropien-inhibierenden Effekt vor. Dies ist ein weiteres neues und überraschendes Element der vorliegenden Erfindung, weil es im Gegensatz- zu dem steht, was normalerweise zu erwarten gewesen wäre: nach den Gesetzen der Physiologie wird durch jede direkte Inhibierung der Gonaden automatisch die Stimulierung der Bildung und/oder Freisetzung von Hypophysengonadotropinen durch positive Bückkoppelung ausgelöst.

B) Untersuchung der direkten antitumoralen Aktivität durch nicht—hypophysenabhängige Methoden der experimentellen Onkogenese.

Die Verbindung "DELTA-2" ist sehr aktiv bei einigenexperimentell hervorgerufenenGonadentumoren, die nach den Methoden der lang andauernden gonadotropen Stimulierung, analog zu der vorstehend beschriebenen, induziert worden sind.

Hach 45-tägiger oraler Behandlung betrug das mittlere Gewicht des bei Satten induzierten Testikulartumors nach einer Latenzperiode von 1 Jahr 45 + 18,9 mg gegenüber einem mittleren Gewicht des Tumors bei den Kontrolltieren (p<0,001) von etwa 2533»3 + 260,3 mg; bei der Hälfte der behandelten Tiere war eine vollständige Semission festzustellen, während bei sämtlichen Kontrolltieren die Tumoren bestehen blieben·

Dieser Unterschied zwischen den Tumoren der Kontrolltiere und denjenigen der behandelten Tiere (Gern cht und Semission) ist

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so beträchtlich, daß es schwierig wäre, ihn durch gonadotrope Hypophysenunterdrüekung allein zu erklären; er legt stark die Addition eines direkten antitumoralen Mechanismus nahe, wie er beispielsweise in den obigen Versuchen beschrieben worden ist. Der direkte antitumorale Effekt von "DELTA-2" wurde bei nichthypophysenabhängigen malignen Tumoren bestätigt, die transplantiert oder überimpft wurden.

Eines dieser Modelle ist das Mammaadenocarcinom bei der Maus (A. Eivenzon und A. Macrineau, "Neoplasma", 1968, Ij?, 2), das unter dem Einfluß von "DELTA-2" bei 33 »3 % der Mäuse verschwand (in sämtlichen Kontrolltieren jedoch bestehen blieb) und dessen mittleres Gewicht sich auf 4-33,66 + 14-7,23 mg verringerte (gegenüber 1713,33 + 189,19 mg bei den Kontrolltieren, p<0,001).

Ein anderes Modell ist der Ovariumaszitestumor der hyperakuten Evolution, der bei weiblichen Ratten in der Kegel alle Kontrolltiere innerhalb von 16 Tagen nach der intraperitonealen Inokulation tötet (E. Pogosianz et al, "Voprose Onkologgi", 1962, 8, 11,29-36). Den 16. Tag überleben unter dem Einfluß der Verbindung "DELTA-2" 93»3 % der Tiere (gegenüber 20,6 % bei den Kontrolltieren) und nach der Tötung der behandelten überlebenden Tiere am 27. Tag wird die Häufigkeit der Tumorzellen in dem Peritoneum und in dem Omentum sowie das Fehlen von Ganglienmetastasen und das Verschwinden der Fluoreszenz bestimmt, die bei den Kontrolltieren stark war, was die Bedeutung der mit der Onkogenese verbundenen enzymatischen Aktivität zeigt.

III. Die Verbindung 17-a-lthinyl-(5a)-2-androsten-17-ß-ol £das 17-ß-Acetat) führt zu qualitativen und quantitativen morphologischen Veränderungen, die sich von denjenigen unterscheiden, die durch die Sexualhormone hervorgerufen werden; sie kann in Kliniken als neuer Typ der Empfängnisverhütung angewendet werden.

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Die letzte Spalte der obigen Tabelle V zeigt, daß das "DELTA-2", das keine östrogenen Eigenschaften hat, zu einer Erhöhung des Gewichtes des Uterus, die signifikant und proportional zu den Dosen ist, bei solchen Tieren führt, deren Ovarientransplantate, die in jedem Falle stark inhibiert sind, keine Östrogene freisetzen können, welche die Inaktivierung durch die Leber nicht vermeiden.würden. Diese Stimulierung des Uterus £etrefjkid den Muskel, das Stroma und das Endometrium^ist weder charakteristisch für die durch Östrogene hervorgerufenen Effekte noch für diejenigen, die durch Androgene hervorgerufen werden, noch für östroprogestationale Effekte; sie steht mit speziellen hisfcoenzymatischen Veränderungen in Verbindung. Deshalb besitzt die Verbindung "DELTA-2" offensichtlich qualitative Effekte auf die Uteri von bestimmten Versuchstieren, welche die für die normale Fruchtbarkeit erforderlichen Bedingungen verändern können.

IV. Die Antiparathyroiden Eigenschaften von 17-a-Äthinyl-(5a)-2-androsten-17-ß-ol-acetat äußern sich nicht nur in einer experimentellen parathyroiden· Hyperplasie, sondern auch im Knochen.

In bezug auf letzteren ist es bekannt, daß das parathyroide Hormon (PTH) zur Zerstörung des Knochens führt, was zur Folge hat, daß entsprechende Mengen Calcium freigesetzt werden. Der Effekt und seine eventuelle Inhibierung können in Knoehengewebekulturen bestimmt werden (HB. Fell und L. Weiss, "J.-exp. Med.", 1965, 121, 551-560). Zu den Verbindungen, die dem Effekt des PTH auf den Knochen entgegenwirken können, gehören einige Östrogene (D. Atkins et al., "J. Endocrinology", 1972, j>4, 107-117); diesbezüglich wird das aktivste unter ihnen, das Ithiny!östradiol, als Standard verwendet, wenn die antiosteolytische Aktivität einer anderen Substanz bestimmt werden soll. Die Freisetzung von Calcium durch das Schädeldach der Maus unter dem Effekt von 0,6 U PTH in einer Knochengewebekultur wird inhibiert

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zu 137 + 2 % durch. 200 ug Äthinylöstradiol und zu 96 +6 % durch 200 /Ug IB 021.

Die scheinbare Überlegenheit des Standards verschwindet, wenn die üblichen Humandosen der beiden Steroide miteinander

verglichen werden:

10 bis 100 /Ug pro !Tag für Äthinylöstradiol, 5 bis 50 mg pro Tag für "DEI/TA-2".

In Kliniken führen tägliche Dosen von etwa 10 mg "DELTA-2"

zu einer Verringerung der übermäßigen Knochenzerstörung,

was sich äußert in einer Verminderung sowohl des Verhältnisses zwischen Michternurincalcium und Kreatinin (B.E.G. ÜTordin et al)

und des Gehaltes an Serumcalcium auf unter 100 mg/l.

¥. Die erfindungsgemäße Verbindung "DELTA-2" weist einen antiseborrhoischen Effekt auf, der insbesondere die ' histologischen Parameter umfaßt; sie wirkt daher mehr wie Antiandrogene als wie Östrogene. Dies ist eine weitere überraschende Eigenschaft, da die Verbindung ^IfDELTA-2" frei von jeder antiandrogenen Aktivität (sowie von jeder östrοgenen Aktivität) ist·

Die anti-seborrhoische Aktivität wurde nach der Methode von F.J. Ebling ("J. Embryol. exp. morph.", 1957, j?, 1, 74-82; Kapitel XIII, Band 4-, Seiten 200-219 in "Hormonal Control of Sebaceous Glands in Experimental Animals", "Advances in Biology of the skin", H. Montagna, H.A. Ellis, A.F. Silver, Herausgeber, 1954- und dgl.) untersucht, deren Prinzip darin besteht, ausgewachsenen, männlichen, kastrierten Ratten Androgene einer bekannten Stärke zu verabreichen, welche die verschiedenen Dermalparameter stimulieren, die aufgrund der Kastration zusammengebrochen sind:

a) Bildung von Hautlipoiden,

b) Wucherung von Zellen in den Talgdrüsen, die sich durch die Anzahl der Mitosen äußert,

c) Anzahl der Kerne in den Schaumzellen, welche die Talgdrüsen bilden,

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d) Anzahl der Mitosen in der Epidermis,

e) Dicke der Epidermis.

In der folgenden Tabelle sind die in einem der Versuche erhaltenen Ergebnisse zusammengefaßt.

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Tabelle VI

Behandlung

Kontrolltiere

kastrierte kastrierte Tiere + Testosteron

Kontroll- +Östradiol +"DELTA-2" +"DELTA-2" tiere s.c. oral oral

Dosis

Anzahl d. Tiere 9

Lipoide (mg/g/

Tag) 1,20+0,199

Anzahl d. Mitosen in den Talgdrüsen , 33,2+7,8

Anzahl der Mitosen in dem Epithel pro 2 cm 87,2+14,4

Anzahl der Kerne in den Schäumzellen pro 20 SG 105,4+6,7

Dicke des
Epithels

11,5+0,5

10 20/ug
9

1800/ug 2400/Ug

7 10

0,97+0,120 1,27+0,188 0,89+0,129 1,52+0,184 1,39+0,162

oo

20,6+4,5 29,5+^,8 16,5±2,6^U 10,8+2,9 16,4+2,8

,oo OO

49,5+8,1 91,2+10,6 51,7+9,1 30,2+9,9 40 +8,4

,000

ooo

89 +7,3" 108,5+7,1 68,7+5,1^w" 97,8+8,5 83 +6,3

,00

⁰⁰⁰

ns * nicht-signifikant, ° = p<0,05, °° p,, C3 * Vergleich zwischen zwei aufeinanderfolgenden Spalten SG - Talgdrüse

10,7+0,^⁰⁰ 12,9+0,6 8,3+0,3°°° 10,1+0,4⁰⁰⁰8,9+ 0,3

p<0,01, ⁰⁰° « ρ-CO,001

⁰⁰⁰

•ro um ο

Daher inhibiert "DELTA-2¹¹, wenn es oral verabreicht wird, b), c), d), e) auf eine statistisch signifikante Weise. Die Brauchbarkeit dieser Eigenschaft für die Systembehandlung der menschlichen Hyperseborrhoe ist offensichtlich,

C) Biologische Überlegenheit der Verbindung "DELTA-2" gegenüber seinem Isomeren "DEI/DA-3" .und infolgedessen gegenüber der Vereinigung der beiden Isomeren ("MIX")» wie sie nach dem bekannten Verfahren erhalten wird.

Bei jungen Ratten führt eine einseitige Ovariektomie zu einer ausgleichenden Hypertrophie des restlichen Ovariums als Folge der durch die Operation ausgelösten positiven Rückkopplung. Die Behandlung mit einer Verbindung, die ausschließlich antigonadotrop ist, kann höchstens die gesamte reaktionen© Hypertrophie eliminieren, das Gewicht des verbleibenden Ovariums ist dann das gleiche wie dasjenige der Ovarien der nicht-operierten Vergleichstiere, d.h. die Inhibierung übersteigt nicht 100 %.

Eine Verbindung, die zu einer Abnahme des Gewichtes des verbleibenden Ovariums auf einen Wert unterhalb des Gewichtes des nicht herausoperierten Vergleichsovariums (Inhibierung >100 %) führt, wirkt offensichtlich mindestens z.T. auf das Ovarium selbst. Dies ist der Mechanismus von "DELTA-2", wodurch bestätigt wird, daß es auf beide Pole der Hypophysen-Gonaden-Achse wirkt.

Die vergleichende Untersuchung der Isomeren "DEI)TA-2" und "DELTA-3" wurde nach dieser Methode durchgeführt, weil sie reproduzierbare, gleichmäßige und quantifizierbare Ergebnisse liefert. In einem ersten Versuch wurde ermittelt, daß "MIX", das bei der in der eingangs erwähnten Literaturstelle beschriebenen Herstellung erhalten wird, bei einer Dosis von 120 g/Tier/Tag oral zu einer 121 %igen Inhibierung des ver*- bleibenden Ovariums führte, was hoch-signifikant ist (p<0,001), während das reine Isomere ^llDELTA-3" bis zu Dosen von 240/ug

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nur zu einer weniger als 50 %igen Inhibierung führte, was nicht statistisch signifikant ist. In einem zweiten Versuch wurden die Effekte von "MIX¹¹ mit denjenigen von reinem "DEIZDA-2" und "DELTA-5" getrennt verglichen. In der folgenden Tabelle sind die dabei erhaltenen Ergebnisse angegeben.

	Tabelle VII	der Uterus hörnerimg)	Inhibierung	des Ova- riums (mg)	in %
Behandlung	mittleres Gewicht	103	20,7
Qug/Tier/Tag) des	Körpers (B)	81,5	12,4°°	100
Kontrolltiere mit 1/2 heraus operierten Ovarien	108,6	151,9	13,9°	81,9
Kontrolltiere	106,8	113,5	12,5°	99,1
Östradiol s.c, 0,2	115,2	114,3	9j4ooo	136,5
Mischung 120	104,1	122,1 110	16,2(ns) 15,2 (ns)	54,9 66,9
("MIX") 240	104,4	103,2 116,9	8ooo α 7ooo	153,2 132,8
120 reines "DELTAS" 240	110 106,7
reines "DBM?A-2" 2W	98,3++ 101,6

Die Überlegenheit der erfindungsgemäßen Verbindung "DEI/PA-2" geht daraus eindeutig hervor. Sie wird bestätigt durch die geringste Aktivität von "MIX" und durch die Inaktivität der Verbindung "DELTA-3" bei den verabreichten Dosen.

D) Therapeutische Anwendung der erfindungsgemäßen Verbindung 17-a-Jithinyl-(5a)-2-androsten-17-ß-ol (Acetat).

Das erfindungsgemäße 17-a-i"thinyl-(5ot)-2-androsten-17-ß-ol,

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insbesondere sein Acetat, eignet sich für die therapeutische Behandlung der folgenden Indikationen (die folgende Aufzählung ist nicht erschöpfend und die Erfindung ist darauf keineswegs beschränkt):

a) Ovarien- oder Testikular-Funktionsstörung einschließlich bestimmter Formen der Sterilität,

b) einigerhormonempfindlicher Tumoren: benigne (Prostataadenom, Mammaadenom oder Fibroadenom) oder maligne (Brust, Ovarium, Uterus, Testis, Prostata und dgl.)

c) als neue Methode der oralen Empfängnisverhütung,

d) bestimmter Zustände, die charakterisiert sind durch Osteolyse (z.B. Osteoporose, verbunden mit einem primären oder sekundären Parathyroidismus),

e) Überfunktion der Talgdrüsen (Seborrhoe, Akne).

Die erfindungsgemäße Verbindung ist im wesentlichen, jedoch nicht ausschließlich, bestimmt für die orale Verabreichung in einer der üblichen festen Formen: Tabletten, Kapseln, Pillen, oder auch in einem flüssigen Träger, als Suspension oder Lösung in Olivenöl, in Gelatinekapseln, in einem Sirup oder einer Mixtur» Die Konzentration pro Einheit beträgt vorzugsweise 5 mg» 10 mg oder 25 mg·

Die Verbindung kann auch in Form von Sujpositorien, die 5 10 mg enthalten, für die vaginale oder rektale Verabreichung oder in Form einer Lotion oder eines Sprays, das in einem geeigneten Träger (Alkohol, flüchtigen Flüssigkeiten) 10 mg/ml enthält, verabreicht werden. Diese Formen werden vorzugsweise für die Behandlung von Hauterkrankungen reserviert. Schließlich kann die Erfindung in Ausnahmefällen in einer injizierbaren Fora für die intramuskuläre Verabreichung in einer Konzentration von 10 bis 25 mg pro Ampulle, eingearbeitet in ein akzeptables Lipoidlösungsmittel (Oliven- oder Sesamöl, Benzylalkohol und dgl.)_fT«rwendet werden.

Unabhängig von der Art des gewählten Verabreichungsweges liegen

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die erforderlichen täglichen Dosen zwischen iO und 50 mg, in Ausnahmefällen höher, wobei die richtige Menge und Dauer der Behandlung von der zu behandelnden Erkrankung abhängen. So kann beispielsweise

in bestimmten Fällen einer Ovarienfunktionsstörung mit oder ohne Sterilität die Behandlung 5 bis ΪΟ Tage pro Cyclus dauern und die mittlere tägliche Dosis beträgt etwa 40 mg; die Behandlung von Tumoren ist notwendigerweise länger oder sogar unbegrenzt in Fällen von malignen Tumoren und die täglichen Dosen betragen in der Regel 30 bis 50 mg; für die Empfängnisverhütung (cyclische Behandlung) und den Hyperparäthyroidismus (sehr lange ununterbrochene Behandlung) sollten die Dosen I5 oder 20 mg pro Tag nicht übersteigen; die Behandlung von Seborrhoe-Symptomen ist langwierig und die tägliche Dosis liegt zwischen 10 und 30 mg ohne jeden Unterschied zwischen dem gewählten Verabreichungsweg: oral, rektal oder perkutan· Die Verbindung "DELTA-2" (Acetat) kann auch in der Veterinärpraxis für die oben in der Humantherapie angegebenen Indikationen in den angegebenen pharmazeutischen Formen und ia analogen Dosen wie oben für die Humantherapie beschrieben, verwendet werden.

Patentansprüche;

SO 9830/094

Claims (5)

Patentansprüche

1. /'' 17-a-ithinyl-(5a)-2-androsten-17-ß-ol, das nicht durch

ein Isomeres 17-a-lthinyl-(5a)-3-androsten-17-ß-ol verunreinigt ist, sowie das Acetat davon.

2. Verfahren zur Herstellung von 17-oc-lthinyl-(5a)-2-androsten-17-ß-ol, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer ersten Stufe eine Mischung aus 17-Keto-(5a)-2-androsten und 17-Keto-(5a)-5-androsten mit dem Jones-Reagens oxidiert, in einer zweiten Stufe die oxidierte Reaktionsmischung durch Silicagelsäulenchromatographie reinigt und das Benzoleluat sammelt und in einer dritten Stufe dieses Eluat mit Acetylen in einer Lösung von Kalium in t-Amylalkohol umsetzt und das dabei erhaltene Reaktionsprodukt durck Extraktion abtrennt und umkristallisiert.

3. 17-a-A"thinyl-(5oO-2-androsten-17-ß-ol, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist.

-|i VfI y^ySTPTlffoΊΤ1 Of CJ Γ*Τ" "VftT^t) ίϊ1(ίΐίΏ£ΓΘΤΊ Tin.CVl -AtIBT)T¹ VLCIi *Ί 3-Π CLOT* H^IT^ 3Τΐ—

medizin für die Behandlung von

a) Ovarien- und Testikular-Funktionsstörungen einschließlich bestimmter Formen der Sterilität,

b) einiger hormonabhängiger Tumoren benign@TÄrt (Prostataadenom, Mammaadenom oder FibroadenpaO oder maligner Art (Brust, Ovarium, Uterus, Test^jr^Erostata und dgl.),

c) "bestimmter Zustände, die sine Osteolyse umfassen (d.h. der Osteoporose), die mij^einem primären oder sekundären Hyperparathyroidjrsmus verbunden ist, und

d) der Überfunktion der Talgdrüsen (Seborrhoe, Akne)

in ali^n für die orale Verabreichung geeigneten pharmazeutieseln,

5 0 9 8 3 Q/U9 4 9

PATENTANWÄLTE

DIPL.-ING. LEO FLEUCHAUS ο Γ η 1 Π Q 1

DR.-ING. HANS LEYH /DU I U^ I

München 71, 10. 3· 1975 Melchioretr. 42

Unser Zeichen: A 13 056/Lh/Ig

NACHGEREiCHT

Neuer Patentanspruch k

4. Arzneimittel bestehend aus den Verbindungen nach Anspruch 1 geeignet, in der Humanmedizin für die Behandlung von

a) Ovarien- und Testikular-Funktionsstörungen einschließlich bestimmter Formen der Sterilität,

b) einiger hormonabhängiger Tumoren benigner Art (Prostataadenom, Mammaadenom oder Fibroadenom) oder maligner Art (Brust, Ovarium, Uterus, Testis, Prostata und dgl.)»

c) bestimmter Zustände, die eine Osteolyse.umfassen

(d.h. der Osteoporose), die mit einem primären oder sekundären Hyperparathyroidismus verbunden ist, und

d) der Überfunktion der Talgdrüsen (Seborrhoe, Akne)

in allen für die orale Verabreichung geeigneten pharmazeutischen Formen, insbesondere in Form von Tabletten, Kapseln, Suspensionen, sowie für die anale und vaginale Einführung und f.ür die intramuskuläre Verabreichung in täglichen Dosen yon IO bis 50 mg.

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Zt'

e ee Besen

5. Verwendung der Verbindungen nach Anspruch 1 in allen für die orale Verabreichung geeigneten pharmazeutischen Formen als orales Empfängnisverhütungsmittel in täglichen Dosen von 10 bis 20

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