DE3854159T2

DE3854159T2 - Effektive antagonisten für den das luteinisierende hormon freisetzenden faktor mit unbedeutender histaminfreisetzung.

Info

Publication number: DE3854159T2
Application number: DE3854159T
Authority: DE
Inventors: Cyril Bowers; Dong-Mei Feng; Karl Folkers; Minoru Kobota; Anders Ljungquist; Pui-Fun Tang
Original assignee: Tulane University; University of Texas System
Current assignee: Tulane University; University of Texas System
Priority date: 1987-08-24
Filing date: 1988-08-24
Publication date: 1996-02-15
Anticipated expiration: 2008-08-25
Also published as: DK173753B1; KR890701117A; HU213098B; DK48690D0; EP0377665A1; DK48690A; AU619221B2; MX9203688A; US4935491A; NO301015B1; AU2529488A; HU885868D0; NO900888D0; HU211882A9; US5763404A; ATE124957T1; FI900947A0; FI102074B1; OA09786A; JP2621970B2

Description

Dies ist eine Continuation-in-part-Anmeldung der US-Patentanmeldung Nr. 088,431, eingereicht am 24. August 1987, die durch Bezugnahme hierin eingefügt wird.
Die Forschung in bezug auf die Entwicklung dieser Erfindung wurde zum Teil durch den Contraceptive Branch of the National Institutes of Child Health and Human Development, Vertrag Nr. NOI HD-6-2938 und an die Robert A. Welch Foundation unterstützt.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Ausgestaltung, Synthese und Verwendung von synthetischen Analogen des Luteinisierungshormon-freisetztenden Hormons (luteinizing hormone releasing hormone, LHRH). Eine wichtige Errungenschaft betraf die Synthese von Analogen, die als Antagonisten von LHRH wirkten, und ausreichend wirkten, um die Ovulation zu hemmen, und die Freisetzung von nur vernachlässigbaren Mengen an Histamin erlaubten. Da es keine Möglichkeit gab, die Struktur eines Antagonisten mit hoher Wirksamkeit und sehr geringer Histaminfreisetzung zuverlässig vorauszusagen, war es notwendig, verschiedene Herangehensweisen zu erforschen, um eine Kombination von strukturellen Eigenschaften zu entdecken, die einen Antagonisten von LHRH mit hoher Wirksamkeit für die Hemmung der Ovulation und einer sehr geringen Histamin-freisetzenden Aktivität ergeben.
Von verschiedenen Peptiden wie Substanz P, das vasoaktive intestinale Peptid, Gastrin, Somatostatin sowie anderen ist wohlbekannt, das sie die Freisetzung von Histamin aus Mastzellen verursachen. Es gibt diese Zellen in vielen Geweben wie Haut, Lunge und Mesenterium, Zahnfleisch etc. Mastzellen besitzen Granula, die Histamin und andere Entzündungsmediatoren enthalten, die durch Peptide freigesetzt werden können zum Bewirken von Kapillarerweiterung und erhöhter Gefäßpermeabilität. Als festgestellt worden war, daß ein Antagonist von LHRH, z.B. [Ac-D-2-Nal¹, D-4-F-Phe², D-Trp³, D-Arg&sup6;]-LHRH, bei der Verabreichung an Ratten Ödeme auf dem Gesicht und den Extremitäten verursachte, schien es wahrscheinlich, daß derartige Antagonisten bei Verabreichung als Empfängnisverhütungsmittel an menschliche Individuen ernsthafte Ödeme auf dem Gesicht und sonstigen Stellen des menschlichen Körpers hervorrufen würden. Derartige Nebeneffekte würden wahrscheinlich die Verabreichung derartiger Antagonisten an menschliche Individuen verhindern.
Die Histamin-enthaltende Leukozyte ist eine Basophile, die ebenfalls Histamin freisetzen kann, wenn sie durch viele der vorstehend erwähnten gleichen Peptide stimuliert wird. Basophile unterscheiden sich biochemisch von Mastzellen und derartige Unterschiede können sowohl eine vorhersagbare als auch nichtvorhersagbare Histaminfreisetzung in Antwort auf LHRH-Antagonisten ergeben. Ein LHRH-Antagonist, der klinisch zur Verhinderung der Ovulation verwendet wird, sollte nicht bedeutende Mengen an Histamin aus entweder Mastzellen oder Basophilen freisetzen.
Die Entdeckung der Nebenwirkungen wie der ödematogenen und anaphylactoiden Wirkungen der LHRH-Antagonisten machten die Entdeckung neuer LHRH-Antagonisten wünschenswert, die eine Ovulation verhindern, aber nicht bedeutende Mengen an Histamin freisetzen. Diese unerwünschten Nebenwirkungen sind in Ratten beobachtet worden und es ist wahrscheinlich, daß die Food and Drug Administration das Testen derartiger Antagonisten an menschlichen Individuen nicht erlauben würde.
Karten et al. (4) haben einen Überblick über das zur Verfügung stehende Wissen bezüglich der strukturellen Charakeristiken für eine wirksame Histaminfreisetzung durch Antagonisten von LHRH gegeben. Einige der wichtigsten Ergebnisse werden wie folgt wiedergegeben. Einer der wirksamsten LHRH-Antagonisten bei der Auslösung einer Histaminfreisetzung in vitro beinhaltete eine Kombination einer stark basischen D- Aminosäure-Seitenkette (Arg oder Lys) an Position 6 und in unmittelbarer Nähe von Arg&sup8; und einen Block aus hydrophoben aromatischen Aminosäuren an dem N-terminalen Ende. Somit gibt es keine spezifische Aminosäure von den zehn Aminosäuren, die allein für die Histaminfreisetzung verantwortlich ist. Im Gegenteil dazu nehmen die am N- terminalen Ende liegenden strukturellen Merkmale (die Aminosäuren in den ersten paar Positionen, 1-4, etc.) und die basischen Aminosäuren in Richtung auf das C-terminale Ende (Positionen 6 und 8) irgendwie an der Histaminfreisetzung teil. Sogar D-Ala in Position 10 besitzt einen gewissen Einfluß auf die Histaminfreisetzung, wobei der Grund hierfür unklar ist. Für sich genommen reichen die beiden basischen Seitenketten in der unmittelbaren Nähe, wie in Positionen 6 und 8, allein nicht aus, um eine hohe Histaminfreisetzung zu verleihen. Der Block von hydrophoben Aminosäuren an dem N-terminalen Ende reicht allein für eine hohe Histamin-freisetzende Aktivität nicht aus. Sogar ein Hexapeptid-Fragment hat eine mäßige Histamin-freisetzende Wirksamkeit gezeigt. Es scheint keine Korrelation zwischen der antiovulatorischen Wirksamkeit und der Histaminfreisetzung dieser Antagonisten in vitro zu geben.
Aus der Perspektive gesehen kann ein großer Teil der gesamten Kette derartiger Decapeptid-Antagonisten einen Einfluß auf die Histaminfreisetzung besitzen. Die gleiche Sichtweise scheint auch für die hohe antiovulatorische Aktivität zu gelten, aber mit unterschiedlichen Ausmaßen. Diese LHRH-Antagonisten sind üblicherweise Decapeptide, was bedeutet, daß zehn Variablen für eine gewünschte antiovulatorische Aktivität eingestellt werden müssen und zehn Variablen für das Ausschalten einer Histamin-freisetzenden Aktivität eingestellt werden müssen. Es gibt sogar weitere Variationen für jede dieser zwanzig Variablen, wobei die Anzahl der möglichen Peptide, die auszugestalten, zu synthetisieren und zu testen sind, unkalkulierbar wird. Vermutlich sind einige dieser zehn Variablen in bezug auf die antiovulatorische Aktivität und die Histamin-freisetzende Aktivität unabhängig voneinander, während einige Variablen für diese beiden biologischen Aktivitäten überlappen können. Diese Situation wirft außerordentliche Schwierigkeiten auf, die zu lösen waren, bevor ein Antagonist mit einer hohen antiovulatorischen Wirksamkeit und einer sehr niedrigen Histamin-freisetzenden Wirksamkeit erzeugt werden konnte.
Verschiedene strukturelle Veränderungen und Kombinationen der zehn Aminosäuren, gefolgt von Tests auf sowohl die antiovulatorische als auch die Histamin-freisetzende Aktivität, sollten in der Hoffnung durchgeführt werden, daß ein wirksamer Antagonist, der im wesentlichen keine Nebenwirkungen besitzt, entdeckt wird. Die Synthese neuer Aminosäuren zur Einführung in die Decapeptid-Kette sollte ebenfalls erforscht werden, da die üblicherweise verfügbaren Aminosäuren möglicherweise nicht ausreichen.
In den erfindungsgemäß hergestellten Antagonisten werden Arginin und seine Derivate nicht verwendet. Lysin wurde in Derivate mit Acyl- Gruppen oder Alkyl-Gruppen an der E-Amino-Gruppe umgesetzt. Die Aminosäure Ornithin wurde an der d-Amino-Gruppe acyliert oder alkyliert. Bei der Synthese dieser Acyl- und Alkyl-Derivate wurden sowohl die L- und D-Formen von Lysin als auch die L-Form von Ornithin verwendet. Strukturell verwandte Zwischenprodukte wurden ebenfalls synthetisiert. Insgesamt wurden durch die grundsätzlichen und minimalen Konzepte der zehn Variablen für die antiovulatorische Aktivität und der zehn Variablen für die Histaminfreisetzung sehr viele neue Peptide synthetisiert, die unabhängig sein können oder zum Teil überlappen können. Auf einer derartigen Grundlage wird die Anzahl derartiger Peptide, die designed werden können, überwältigend, und jede vernünftige Priorität muß berücksichtigt werden, um die Anzahl der zu synthetisierenden Peptide zu verringern, in der Hoffnung, daß eine Entdeckung gemacht wird.
Bestimmte Peptide wurden synthetisiert, getestet und man stellte fest, daß sie vorteilhafte Peptide darstellen. Unter diesen wünschenswerten Peptiden waren die beiden folgenden:
[N-Ac-D-2-Nal¹, D-pClPhe², D-3-Pal³, NicLys&sup5;, D-NicLys&sup6;, ILys&sup8;, D- Ala¹&sup0;]-LHRH bewirkte die Hemmung der Ovulation und setzte bemerkenswert wenig Histamin frei.
[N-Ac-D-2-Nal¹, D-pClPhe², D-3-Pal³, PicLys&sup5;, D-PicLys&sup6;, ILys&sup8;, D-Ala¹&sup0;]- LHRH war doppelt so wirksam wie das "Superagonisten" von LHRH, die zur Zeit durch mehrere pharmazeutische Unternehmen vertrieben werden.
Diese beiden neuen Peptide und noch weitere zusätzliche, verwandte Peptide, die hierin beschrieben werden, stellen ein annehmbares Gleichgewicht einer hohen antiovulatorischen Aktivität und einer geringen Histaminfreisetzung für eine umfassende potentielle klinische Verwendbarkeit bereit.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung und die Verwendung von Decapeptiden mit antiovulatorischer Aktivität und mit minimalen Histamin-freisetzenden Wirkungen. Diese Decapeptide schließen solche ein, die umfassen:
Ser&sup4;, PicLys&sup5; und D-PicLys&sup6;;
N-Ac-D-2-Nal¹, D-pClPhe², Ser&sup4;, D-PicLys&sup5; und Pro&sup9;;
N-Ac-D-2-Nal¹, D-pClPhe², D-3-Pal³, Ser&sup4;, D-PicLys&sup6;, Pro&sup9; und D-Ala¹&sup0;;
N-Ac-D-2-Nal¹, D-pClPhe², D-3-Pal³, Ser&sup4;, NicLys&sup5;, Pro&sup9; und D-Ala¹&sup0;;
N-Ac-D-2-Nal¹, D-pClPhe², D-3-Pal³, Ser&sup4;, Leu&sup7;, Pro&sup9; und D-Ala¹&sup0;;
N-Ac-D-2-Nal¹, D-pClPhe², D-3-Pal³, Ser&sup4;, Leu&sup7;, Pro&sup9; und D-Ser¹&sup0;;
D-pClPhe², Pro&sup9; und D-Ala¹&sup0;;
D-pClPhe², Pro&sup9; und Ser¹&sup0;;
N-Ac-D-2-Nal¹, D-pClPhe², D-3-Pal³, NicLys&sup5;, D-NicLys&sup6;, ILys&sup8; und D- Ala¹&sup0;;
N-Ac-D-2-Nal¹, D-pClPhe², D-3-Pal³, NicLys&sup5;, D-NicLys&sup6;, ILys&sup8; und D- Ala¹&sup0;;
N-Ac-D-2-Nal¹, D-pClPhe², D-3-Pal³, PicLys&sup5;, D-PicLys&sup6;, ILys&sup8; und D- Ala¹&sup0;;
N-Ac-D-2-Nal¹, D-pClPhe², D-3-Pal³, NicLys&sup5;, D-NicLys&sup6;, IOrn&sup8; und D- Ala¹&sup0;;
N-Ac-D-2-Nal¹, D-pClPhe², D-3-Pal³, PicLys&sup5;, D-PicLys&sup6;, IOrn&sup8; und D- Ala¹&sup0;;
N-Ac-D-2-Na¹, D-pClPhe², D-3-Pal³, MNicLys&sup5;, D-MNicLys&sup6;, IOrn&sup8; und D-Ala¹&sup0;;
N-Ac-D-2-Nal¹, D-pClPhe², D-3-Pal³, PzcLys&sup5;, D-PzcLys&sup6;, IOrn&sup8; und D- Ala¹&sup0;;
N-Ac-D-2-Nal¹, D-3-Pal³, Tyr&sup5;, D-NicLys&sup6;, und ILys&sup8;;
N-Ac-D-Cl&sub2;Phe¹, D-3-Pal³, Tyr&sup5;, D-NicLys&sup6; und ILys&sup8;;
acyliertes Lys&sup5;, D-acyliertes Lys&sup6; und N-alkylierte Diaminosäure&sup8;, NicLys&sup5;, D-NicLys&sup6; und ILys&sup8;;
PicLys&sup5; D-PicLys&sup6; und ILys&sup8;;
NicLys&sup5;, D-NicLys&sup6; und IOrn&sup8;;
PicLys&sup5;, D-PicLys&sup6; und IOrn&sup8;;
MNicLys&sup5;, D-MNicLys&sup6; und IOrn&sup8;;
PzcLys&sup5;, D-PzcLys&sup6; und IOrn&sup8;;
Tyr&sup5;, D-NicLys&sup6; und ILys&sup8;;
Tyr&sup5;, D-NicLys&sup6; und IOrn&sup8;;
N-Ac-D-2-Nal¹, D-pClPhe², D-3-Pal³, Ser&sup4;, NicLys&sup5;, D-NicLys&sup6;, Leu&sup7;, ILys&sup8;, Pro&sup9; und D-Ala¹&sup0;NH&sub2;; und
N-Ac-D-2-Nal¹, D-pClPhe², D-3-Pal³, Ser&sup4;, PicLys&sup5;, cis-D-PzACAla&sup6;, Leu&sup7;, ILys&sup8;, Pro&sup9; und D-Ala¹&sup0;NH&sub2;.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der vorstehend genannten Decapeptide in einem Verfahren zum Hemmen der Ovulation bei einem Tier. Dieses Verfahren umfaßt das Verabreichen eines Decapeptides an das Tier, wobei das Decapeptid vorzugsweise die Struktur besitzt: N-Ac-D-2-Nal¹, D-pClPhe², D-3-Pal³, Ser&sup4;, NicLys&sup5;, D- NicLys&sup6;, Leu&sup7;, ILys&sup8;, Pro&sup9; und D-Ala¹&sup0;NH&sub2;. In gleicher Weise kann das erfinderische Verfahren zur Hemmung der Ovulation bei einem Tier angewendet werden; zum Hemmen des Einsetzens der Pubertät bei einem Tier; zum Hemmen der Sexualkraft bei einem Tier; zum Verändern der Funktion der Keimdrüsen bei einem Tier; zum Hemmen des Wachstums Hormon-abhängiger Tumore bei einem Tier; und zum Erniedrigen des LH- und FSH-Spiegels im Serum von Frauen in der Postmenopause. Diese und andere verwandte Anwendungen sind dem Fachmann nach Studium dieser Patentanmeldung offensichtlich.
Die hierin verwendeten Abkürzungen und Formein schließen die folgenden ein:
a = alpha
BOC = t-Butoxycarbonyl
Br-Z = o-Brombenzyloxycarbonyl
nBuOAc = Butylacetat
n-BuOH = n-Butanol
c = cis
CDCl&sub3; = Deuterochloroform
CHCl&sub3; = Chloroform
CH&sub2;Cl&sub2; = Dichlormethan
CH&sub3;CN = Acetonitril
Cl-Z = o-Chlorbenzyloxycarbonyl
d = delta
DCC = Dicyclohexylcarbodiimid
DIEA = Diisopropylethylamin
DMF = Dimethylformamid
E = epsilon
Et = Ethyl
EtOAc = Ethylacetat
EtOH = Ethanol
Et&sub2;O = Diethylether
HF = Fluorwasserstoff
HOAc = Essigsäure
KH&sub2;PO&sub4; = Kaliumdihydrogenphosphat
MeOH = Methanol
MgSO&sub4; = Magnesiumsulfat
NH&sub4;OAc = Ammoniumacetat
iPrOH = 2-Propanol
py = Pyridin
t = trans
TFA = Trifluoressigsäure
THF = Tetrahydrofuran
TOS = p-Toluolsulfonyl
m = micro
Z = Benzyloxycarbonyl
Abu = 2-Aminobuttersäure
Aile = Alloisoleucin
AnGlu = 4-(4-Methoxyphenylcarbamoyl)-2-aminobuttersäure
BzLys = NE-Benzoyllysin
Cit = Citrullin
Cl&sub2;Phe = 3,4-Dichlorphenylalanin
CypLys = NE-Cyclopentyllysin
DMGLys = NE-N,N-Dimethylglycyllysin
Dpo = Nd-(4,6-Dimethyl-2-pyrimidyl)ornithin
Et&sub2;hArg = NG,NG-Diethylhomoarginin
FPhe = A-Fluorphenylalanin
HOBLys = NE-(4-Hydroxybenzoyl)lysin
ILys = NE-Isopropyllysin
INicLys = NE-Isonicotinoyllysin
IOrn = Nd-Isoproppylornithin
Me&sub3;Arg = NG,NG,NGl-Trimethylarginin
Me&sub2;Lys = NE,NE-Dimethyllysin
MNicLys = NE-(6-Methylnicotinoyl)lysin
MPicLys = NE-(6-Methylpicolinoyl)lysin
NACAla = 3-(4-Nicotinoylaminocyclohexyl)alanin
2-Nal = 3-(2-Napthyl)alanin
NicLys = NE-Nicotinoyllysin
NicOrn = Nd-Nicotinoylornithin
Nle = Norleucin, 2-Aminohexansäure
PACAla = 3-(4-Picolinoylaminocyclohexyl)alanin
NMeLeu = N-Methylleucin
Nval = Norvalin, 2-Aminopentansäure
3-Pal = 3-(3-Pyridyl)alanin
pClPhe = 3-(4-Chlor)phenyilalanin
PicLys = NE-Picoloyllysin
Pip = Piperidin-2-carbonsäure
PmcLys = NE-(4-pyrimidinylcarbonyl)lysin
PmACAla = 3-[4-(4-Pyrimidinylcarbonyl)aminocyclohexyl)]alanin
PzACAla = 3-(4-Pyrazinylcarbonylaminocyclohexyl)alanin
3-PzAla = 3-Pyrazinylalanin
PzcLys = NE-Pyrazinylcarbonyllysin
Sar = N-Methylglycin
TinGly = 3-Thienylglycin
Die meisten natürlichen Aminosäuren wurden von Peninsula Laboratories, San Carlos, CA, erhalten. Die Hydroxyl-Gruppe von Ser wurde als ein Benzylether geschützt, die phenolische Hydroxyl-Gruppe von Tyr als das Br-Z-Derivat und die E-Amino-Gruppe von Lys als das Cl-Z-Derivat, die Guanidino-Gruppe von Arg und die Imidazol-Gruppe von His als die TOS-Derivate. Die a-Aminofunktion wurde als das BOC-Derivat geschützt. BOC-Orn(Z) wurde von Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., erhalten. BOC-D-2-Nal, BOC-D-3-Pal, BOC-D-Cl&sub2;Phe, BOC-pClPhe und das Dycylohexylaminsalz von BOC-ILys(Z) wurden durch die Southwest Foundation for Biomedical Research, San Antonio, Tx., bereitgestellt. Das Benzhydrylaminhydrochloridharz wurde von Beckman Bioproducts, Palo Alto, Ca., erhalten. Der Stickstoftgehalt betrug ungefähr 0,65 mmol/g. Das CH&sub2;Cl&sub2; wurde vor Gebrauch destilliert.
Die vorliegende Erfindung betrifft das Design, die Synthese und die Verwendung von LHRH-Antagonisten mit hoher antiovulatorischer Wirksamkeit und abgeschwächter Histamin-freisetzender Aktivität (1). Diese neuen Antagonisten sind z.B. durch D-NE-Nicotinoyllysin (D-NicLys) in Position 6 und NE-Isopropyllysin (ILys) in Position 8 gekennzeichnet. Die Lösung von D-Arg&sup6;, insbesondere in Kombination mit Arg&sup8; und einem Block von hydrophoben aromatischen Aminosäureresten an dem N-terminalen Ende ist in die Freisetzung von Histamin einbezogen worden (2-4).
Andere Verringerungen der anaphylaktischen Aktivität wurden erhalten durch Erhöhen des Abstands zwischen den positiven Ladungen in Positionen 6 und 8 durch Arg&sup5; und durch Einschluß eines neutralen Rests in Position wie in [N-Ac-D-2-Nal¹, D-pClPhe², D-3-Pal³, Arg&sup5;, D-4-(p-Methoxybenzoyl)-2-aminobuttersäure&sup6;, D-Ala¹&sup0;]-LHRH (2-Nal stellt 3-(2- Napththyl)alanin dar; pClPhe stellt 3-(4-Chlorphenyl)alanin dar; 3-Pal stellt 3-(3-Pyridyl)alanin dar) nach Revier et al. (5) und [N-Ac-D-2-Nal¹, D-aMepClPhe², D-Trp³, Arg&sup5;, D-Tyr&sup6;, D-Ala¹&sup0;]-LHRH (aMepClPhe stellt 2-Methyl-3-(4-chlorphenyl)alanin dar) nach Roeske et al. (6). Weitere Modifikationen in Position 6 sind die reduktive Alkylierung von D-Lys&sup6; durch Hocart et al. (7), der Einbau von N,N-Diethylhomoarginin durch Nestor et al. (9). Die vor kurzem durch Revier et al. synthetisierten zyklischen Analoge zeigen im Vergleich zu den linearen Gegenstücken (10) keine Verringerung der Histaminfreisetzung.
Von den erfindungsgemäßen Peptiden wurden anfänglich zwei als Modelle für ein weiteres Design ausgewählt. Das Peptid [N-Ac-D-2-Nal¹, D- pClPhe², D-3-Pal³, NicLys&sup5;, D-NicLys&sup6;, ILys&sup8;, D-Ala¹&sup0;]-LHRH (genannt Antide) besaß eine beeindruckende Kombination an Wirksamkeit und niedriger Histaminfreisetzung; die antiovulatorische Aktivität (AOA) betrug 100% bei 1 ug und 36% bei 0-5 ug; der ED&sub5;&sub0;-Wert für die Histaminfreisetzung war in vitro durchweg über 300 ug/ul im Vergleich zu ungefähr 0,17 für das Standardanalog [N-Ac-D-2-Nal¹, D-pFPhe², D- Trp³, D-Arg&sup6;]-LHRH (pFPhe stellt 3(4-Fluorophenyl)alanin dar) (5). Ein anderes Analog war mit Antide identisch, abgesehen von PicLys&sup5; und D- PicLys&sup6; (PicLys stellt N-Picolyilysin dar); 100% AOA bei 0,5 ug und 40% bei 0,25 ug; ED 50, 93 ± 11.
Hierin eingeschlossen sind die Ergebnisse von LHRH-Analogen mit acylierten Aminocylcohexylalanin-Resten in Position 6, von Analogen, in denen Leu&sup7; durch andere neutrale Reste ersetzt worden ist, von einem Vergleich yon ILys&sup8; vs. IOrn&sup8;, und von Tests auf orale Wirksamkeit und Dauer der Antagonistenwirkung bei oraler oder parenteraler (s.c.) Verabreichung.
Die Schmelzpunkte sind unkorrigiert. Die NMR-Daten werden als d- Werte bei niedrigerem Feld zu TMS wiedergegeben.
Vor der Acylierung wurden die Z- und Cl-Z-Gruppen von Lys und Orn durch Hydrogenolyse in MeOH in der Gegenwart von 10% Pd/C abgespalten.
BOC-D-BzLys wurde durch Acylierung von BOC-D-Lys mit Benzoylchlorid synthetisiert, wie es für das L-Isomer von Bernardi et al. (17) beschrieben wurde.
BOC-DMG-Lys wurde durch Acylierung von BOC-Lys mit Chloracetylchlorid unter Verwendung des gleichen Verfahrens und dem Umsetzen des Rohprodukts von 10 mmol BOC-Lys in 10 ul THF mit 10 ul 40% wässrigem Diemethylamin hergestellt. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten in einem Eisbad gerührt und dann 2,5 Stunden bei Raumtemperatur. Nach dem Eindampfen in vacuo wurde das Rohprodukt in 10 ul H&sub2;O gelöst und auf eine Bio-Rad-AG1-X8-Säule, Acetatform, 1 x 25 cm, aufgetragen. Die Säule wurde zuerst mit 200 ul Wasser gewaschen und dann wurde das Produkt mit 6% HOAc eluiert und mehrere Mal lyophilisiert, um das HOAc zu entfernen. Die Ausbeute betrug 60-70%. Es handelte sich um eine amorphe Masse. Rf (n-BuOH:py:HOAc:H&sub2;O = 30:10:3:12) = 0,27. Die Reinheit war über 95%. NMR (CDCl&sub3;):1.45,s,9H, t-Butoxy-Gruppe; 1,85-1,48,m,6H,B,y,d,CH&sub2;- Gruppen; 2,6,s,6H,N(CH&sub3;)&sub2;; 3,25,m,2H,E-CH&sub2;; 3,37,s,2H,N-CH&sub2;-CO; 4,15,m,1H,a-CH.
Die anderen acylierten Lys-Derivate in den Tabellen wurden aus BOC-D oder L-Lys und dem entsprechenden p-Nitrophenylester hergestellt.
p-Nitrophenylnicotinat. Zu 9,85 g, 80 mmol, Nicotinsäure und 13,35 g, 96 mmol, p-Nitrophenol in 250 ul DMF wurden 16,5 g, 80 mmol, DCC unter Rühren in einem Eisbad zugesetzt. Nach einer Stunde bei 0ºC und drei Stunden bei Raumtemperatur wurde der Harnstoff abfiltriert und das Produkt wurde durch das Zusetzen eines gleichen Volumens an Wasser ausgefällt. Nach Filtration, Trocknen in vacuo und Rekristallisation aus i-PrOH wurden 11,22 g, 57% an weißen Nadeln, Smp. 172,5- 173ºC erhalten (24).
p-Nitrophenylisonicotinat wurde hergestellt, auf die gleiche Weise 12 g, 61%, Smp. 139-141ºC, Smp. 137-139ºC (18).
Auch p-Nitrophenyl-6-methylnicotinat wurde auf die gleiche Weise hergestellt. Ausbeute aus 70 mmol 6-Methylnicotinsäure: 6,0 g, 33% nach Rekristallisierung aus MeOH. Smp. 156-157ºC. Rf (2% MeOH in CHCl&sub3;) = 0,57 NMR (CDCl&sub3;): 2,7,s,3H,CH&sub3;; 7,36,d,1H,py H&sup5;; 7,45,m,2H,H benachbart zu dem Sauerstoff indem Phenylring; 8,34,m,3H,H benachbart zu der NO&sub2;-Gruppe in dem Phenylring überlappend mit py H&sup4;: 9,27,d,1H,py H².
p-Nitrophenylpicolinat. 4,92 g, 40 mmol, Picolinsäure und 5,84 g, 42 mmol, p-Nitrophenol wurden in 200 ul CH&sub2;Cl&sub2; suspendiert/gelöst. Dann wurden 8,24 g, 40 mmol, DCC unter kräftige m Rühren in 20 ul CH&sub2;Cl&sub2; zugegeben. Das Rühren wurde bei Raumtemperatur für 17 Stunden fortgesetzt. Dann wurde das Gemisch fiitriert und der Filterkuchen wurde mit 30-40 ul CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Das Rohprodukt wurde zuerst mit 100 ul Et&sub2;O unter Rühren in einem Eisbad behandelt und filtriert. Die Rekristallisation aus 250 ul iPrOH ergab 6,24 g, 63% Produkt. Smp. 154-6ºC (dec.). Smp. 145-7ºC (18.).
Pyrazincarbonsäure-p-nitrophenylester. Diese Verbindung wurde unter Anwendung des gleichen Verfahrens wie die vorhergehende Verbindung hergestellt. Aus 40 mmol Pyrazincarbonsäure und 44 mmol p-Nitrophenol wurden 35,2 mmol, 88%, Ester erhalten. Smp. 180-182ºC (dec.). Rf(CHCl&sub3;:MeOH = 49:1) = 0,72. NMR (CDCl&sub3;): 7,5,m und 8,37m,2H jeweils, Wasserstoffatome benachbart zu der Sauerstoff-Atom- bzw. der Nitro-Gruppe in dem Phenolring; 8,84,m,1H, Pyrazin H&sup5;; 8,9,d,1H, Pyrazin H&sup6;; 9,48,d,1H, Pyrazin H³.
BOC-NicLys. 2,5 g BOC-Lys (L oder D) wurden in 200 ul DMF unter Rühren suspendiert. Dann wurden 1,1 Äquivalente von p-Nitrophenylnicotinat zugesetzt und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 36 Stunden gerührt. Die Mischung wurde dann filtriert und das Filtrat wurde bei verringertem Druck bis zur Trockne unter Erhalt eines gelben Öls eingedampft. Der Rückstand wurde mit 2 x 50 ul Et&sub2;O im Eisbad gerührt. Die erste Et&sub2;O-Phase wurde dekantiert, die zweite wurde abfiltriert. Die Rekristallisation aus EtOAc/Hexanen ergab 2,05 g Produkt, 58% (L-Form). Smp. 138ºC, Lit. (17) 138-141ºC. L-Form [a]²&sup0;D= -2,91º (MeOH), D-Form [a]²&sup0;D = 3,35º (MeOH).
L- und D-BOC-INicLys wurden in ähnlicher Weise durch Acylieren von 10 mmol L- oder D-BOC-Lys mit p-Nitrophenylisonicotinat in 100 ul DMF, 40 Stunden, Raumtemperatur, hergestellt. Das Rohprodukt wurde zwischen 120 ul EtOAc und 50 ul H&sub2;O aufgeteilt. Die EtOAc-Phase wurde mit 2 x 50 ul H&sub2;O und 50 ul Kochsalzlösung extrahiert. Die ursprüngliche wässrige Phase wurde mit 30 ul EtOAc rückextrahiert. Die vereinigten EtOAc-Phasen wurden dann getrocknet (MgSO&sub4;) und eingedampft und der Rückstand wurde mit Et&sub2;O behandelt und wie vorstehend beschrieben re kristallisiert unter Erhalt von 1,07 g, BOC-L-INicLys, 30,5%. Die Ausbeute für die D-Verbindung war 1,26 g, 36%. NMR (Aceton d&sub6;): 1,4,s,9H,t-Butoxy-Gruppe: 1,8-1,48,m,6H,B,y,d, -CH&sub2;-; 3,44,t,2H,E-CH&sub2;; 4,13,m,1H,a-CH; 7,77,m,2H,py H&sup5; und H³; 8,70,m,2H,py H² und H&sup6;.
L- und D-BOC-PicLys. 1,23 g, 5 mmol, L- oder D-BOC-Lys wurden mit 1,34, 5,5 mmol, p-Nitrophenylpicolinat in 60 ul DMF für 16 Stunden gerührt. Nach Filtration und Eindampfen wurde das Produkt durch Säulenchromatographie auf Silicagel auf einer Säule von 4,5 x 32 cm gereinigt und das Lösungsmittelsystem war n-BuOH:py:HOAc:H&sub2;O = 30:10:3:12. Das Produkt wurde nach der Chromatographie in EtOAc gelöst und gewaschen mit H&sub2;O, Kochsalzlösung, getrocknet und in vacuo eingedampft. Die Ausbeuten waren üblicherweise 60-70%. NMR (CDCl&sub3;): 1,43,s,9H,t-Butoxy-Gruppe; 1,73-1,45,m,6H,B,y,d-CH&sub2;; 3,47,m,2H,E-CH&sub2;; 4,32,m,1H,a-CH; 7,43,m,1H,py H&sup5;; 7,85,m,1H,py H&sup4;; 8,2,m,1H,py H³; 8,55,m,1H,py H&sup6;.
L- und D-BOC-MNicLys. 10 mmol BOC-Lys und 10,5 mmol p-Nitrophenyl-6-methylnicotinat wurden auf die übliche Weise in 150 ul DMF umgesetzt. Nach 27 Stunden ergaben Filtration und Eindampfen ein gelbes Ol. Die Et&sub2;O-Behandlung (2 x 50 ul) ergab 3,3 g Produkt, welches aus 50 ul 20%-igem MeOH in EtOAc/Hexan rekristallisiert wurde. Die Ausbeute betrug 2,87 g, 78,6% (L-Form). Rf(n-Bu- OH:py:HOAc:H&sub2;O = 32:10:3:12) = 0,61. NMR(CDCl&sub3;): 1,46,s,9H,t- Butoxy-Gruppe; 1,9-1,5,m,6H,B,y,d-CH&sub2;; 2,57,s,3H,py CH&sub3;; 3,36,m,2H,E- CH&sub2;; 4,11,m,1H,a-CH; 7,22,d,1H,py H&sup5;; 8,08,m,1H,py H&sup4;; 8,95 breites s,1H,py H².
L- und D-BOC-PzcLys. Unter Anwendung des vorstehend genannten Verfahrens wurden aus 7,7 mmol Pyrazincarbonsäure-p-nitrophenylester und 7 mmol BOC-Lys, L oder D, in 100 ul DMF ungefähr 6 mmol Produkt nach Rekristallisation aus iPrOH erhalten. Rf(n-BuOH:py:HO- Ac:H&sub2;O = 30:10:3:12) = 0,47. NMR(CDCl&sub3;): 1,45,s,9H, t-Butoxy-Gruppe; 1,9-1,48,m,6H,B,y,d-CH&sub2;-; 3,51,m,2H,E-CH&sub2;; 4,29,m,1H,a-CH; 8,52,q,1H,Pyrazin H&sup5;; 8,77,d,1H,Pyrazin H&sup6;; 9,41,d,1H,Pyrazin H³.
BOC-L-NicOrn. Diese Verbindung wurde auf die übliche Weise durch Umsetzen von 7 mmol p-Nitrophenylnicotinat mit 5 mmol BOC-Orn in 75 ul DMF für 36 Stunden hergestellt. Das Eindampfen und die Rekristallisation aus EtOAc ergab 3,5mmol, 70%, NicOrn, Smp. 143-144ºC. Rf(n-BuOH:HOAc:H&sub2;O = 4:1:2) = 0,70. NMR(CDCl&sub3;): 1,45,s,9H,t- Butoxy-Gruppe; 7,46,m,1H,py H&sup5;; 8,27,m,1H,py H&sup4;; 8,69,m,1H,py H&sup6;; 9,05,m,1H,py H².
BOC-D-trans-NACAla. 1,43 g, 5 mmol, BOC-D-trans-3-(4-Aminocyclohexyl)alanin (geliefert durch die Southwest Foundation for Biomedical Research) wurden mit 1,35 g, 5,5 mmol, p-Nitrophenylnicotinat in 60 ul DMF für 120 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde dann filtriert, eingedampft, mit Et&sub2;O in einem Eisbad behandelt und wiederum filtriert. Die Rekristallisation wurde durch Erhitzen in 12 ul EtOH und Zusetzen von 18 ul heißem H&sub2;O durchgeführt. So wurde eine klare Lösung erzeugt, aus der sich beim Kühlen Kristalle abschieden. Dieses Verfahren wurde zweimal wiederholt. Ausbeute: 0,98 g, 50%, Reinheit > 95%. Smp. > 220ºC. NMR(DMSO d&sub6;): 1,46,s,9H,t- Butoxy-Gruppe; 1,9-1,48,m,11H,Ring-CH&sub2;, Ring-CH in Position 1 und B- CH&sub2;; 3,72,m,1H,Ring-CH in Position 4; 3,95,m,1H,a-CH; 7,48,m,1H,py H&sup5;; 8,16,m,1H,py H&sup4;; 8,67,m,1H,py H&sup6;; 8,96,m,1H,py H².
BOC-D-cis-NACAla. 5 mmol BOC-D-cis-3-(4-Aminocyclohexyl)alanin (Quelle: wie vorstehend genannt) und 5,5 mmol p-Nitrophenylnicotinat wurden in DMF wie vorstehend beschrieben umgesetzt. Umsetzungszeit: 25 Stunden. Die Reinigung wurde durch Et&sub2;O-Behandlung wie vorstehend beschrieben und durch Silicagel-Chromatographie auf einer Säule von 4,5 x 32 cm erzielt unter Verwendung des Lösungsmittelsystems CHCl&sub3;:MeOH:py:HOAc = 75:10:10:5. Ausbeute 1,3 g, 61%, amorphes Pulver. Rf(Säulensystem) = 0,58. NMR(CDCl&sub3;): 1,44,s,9H,t-Butoxy- Gruppe; 1,95-1,45,m,11H,Ring-CH&sub2;, Ring-CH in Position 1 und B-CH&sub2;; 4,22,m,1H,a-CH; 4,35,m,1H, Ring-CH in Position 4: 7,35, 8,24, 8,63 und 8,98, 1H jeweils, Zuordnung wie bei vorstehender Verbindung.
BOC-IOrn(Z). Diese Verbindung wurde aus BOC-Orn(Z) hergestellt durch reduktive Alkylierung mit Aceton und H&sub2;/Pd, wie durch Prasad et al. (23) beschrieben, gefolgt von einer Umsetzung zu dem Nd-Z-Derivat mit Benzylchlorformat in wässrigem alkalischem Milieu (Schotten-Baumann-Bedingungen). Die Reinigung wurde erzielt durch Chromatographie auf Silicagel mit CHCl&sub3;/MeOH 85:15. Rf (CHCl&sub3;:MeOH:HOAc = 85:15:3) = 0,8. NMR(CHCl&sub3;): 1,10,d,6H,Isopropyl-CH&sub3;; 1,40,s,9H,t-Butoxy-Gruppe; 1,7-1,5,m,4H,B,y-CH&sub2;; 3,09,m,2H,d-CH&sub2;; 4,2,m,1H,a-CH; 5,10,s,2H,Benzyl-CH&sub2;; 7,3,m,5H,Aromaten.
BOC-CypLys(Z). 2,04 g BOC-Lys(Z) wurden in 8 ul Cyclopentanon und 32 ul H&sub2;O, die 0,22 g NaOH enthielten, gelöst. Die Hydrierung wurde in Gegenwart von 0,4 g 10%-igem Pd/C bei 50-60 Psi in einer Parr- Vorrichtung durchgeführt. Nach vier Stunden wurde die Hydrierung unterbrochen und 2 ul 0,5 M NaOH und 10 ul MeOH wurden zugesetzt. Die Hydrierung wurde dann für 16 Stunden bei 50-60 Psi fortgesetzt. Dann wurde eine Filtration und ein Eindampfen durchgeführt. Der Rückstand wurde in 75 ul H&sub2;O gelöst und die wässrige Phase dreimal mit Et&sub2;O und einmal mit Hexan extrahiert. Der pH wurde dann mit HCl auf 6-7 gebracht und die Lösung wurde dann in einem Rotationsverdampfer bei einer Badtemperatur von 40ºC eingedampft. Das resultierende Produkt wurde dann unter Verwendung von Benzylchlorformat in wässriger NaOH (Schotten-Baumann-Bedingungen) zu dem Z-Derivat umgesetzt. Ausbeute: 1,3 g insgesamt 58%. Rf (n-BuOH:py:HO- Ac:H&sub2;O = 30:10:3:12) = 0,60. Reinheit > 95%. NMR(CDCl&sub3;): 1,45,s,9H,t-Butoxy-Gruppe; 1,95-1,35,m,14H,Ring-CH&sub2; + B,y,d-CH&sub2;; 3,13, breites t,2H,E-CH&sub2;; 4,34-4,05,m,2H,a-CH + Ring-CH; 5,13,s,2H,Benzyl- CH&sub2;; 7,35,m,5H, aromatische Protonen.
BOC-Me&sub2;Lys, D- und L-. Diese Verbindungen wurden durch Hydrogenolyse der entsprechenden Z- oder Cl-Z-Derivate in Gegenwart von 37%- igem Formaldehyd im wesentlichen wie durch L. Benoiton (22) für das Na-Acetylanaloge beschrieben, hergestellt. Die Reinigung wurde durch Chromatographie auf Silicagel mit dem Lösungsmittelsystem n-Bu- OH:py:H&sub2;O = 2:2:1 erzielt. Die Ausbeuten waren 40-65% und die Produkte waren amorph. NMR(CDCl&sub3;): 1,41,s,9H,t-Butoxy-Gruppe; 1,9- 1,5,m,6H,B,y,d-CH&sub2;; 2,6,s,6H,N(CH&sub3;)&sub2;; 2,8,m,2H,E-CH&sub2;; 4,03,m,1H,a-CH.
BOC-D-AnGlu. 0,62 g, 3 mmol, DCC wurden zu der eisgekühlten Lösung von 1,10 g, 3 mmol, BOC-D-Glutaminsäure-a-benzylester und 0,39 g, 3 mmol, p-Anisidin in 25 ul CH&sub2;Cl&sub2; zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Erwärmung auf Raumtemperatur und dann für weitere 17 Stunden gerührt. Der Dicyclohexylharnstoft wurde dann abfiltriert und CHCl&sub3; wurde auf ein Gesamtvolumen von 125 ul zugesetzt. Diese Lösung wurde mit 2 x 1N H&sub2;SO&sub4;, H&sub2;O, gesättigtem NaHCO&sub3;, 2 x H&sub2;O extrahiert und getrocknet (MgSO&sub4;). Das Eindampfen und die Rekristallisation aus EtOH ergab 0,99 g, 74% Produkt, Smp. 129,5-131ºC. Rf (4% MeOH in CHCl&sub3;) = 0,53. Dieses Produkt wurde in 30 ul MeOH und 10 ul [EtOH gelöst und in Gegenwart von 0,3 g Pd/C bei 50 Psi für 2,5 Stunden hydriert. Filtration und Eindampfen ergaben eine quantitative Ausbeute von BOC-D-AnGlu. Nicht kristallin. Reinheit > 98%. NMR(CDCl&sub3;): 1,45,s,9H,t-Butoxy-Gruppe; 2,35-1,95,m,2H,B-CH&sub2;; 2,6- 2,4,m,2H,y-CH&sub2;; 3,76,s,3H,OCH&sub3;; 4,3,m,1H,a-CH; 6,82 und 7,42, breites d, 2H jeweils, aromatische Protonen.
BOC-Me&sub3;Arg. Zuerst wurde N,N,N', S-Tetramethylisothioharnstoff durch das Verfahren von Lecher und Hardy (19) hergestellt. Sdp. (15 mm) = 74ºC, Lit. (siehe oben) 68ºC bei 11 mm. BOC-Orn, 9 mmol, und Tetramethylisothioharnstoff, 10 mmol, wurden in 15 ul DMF und 2 ul Triethylamin gelöst und bei 100ºC für 2 Stunden und bei Raumtemperatur für 10 Stunden inkubiert. Dann wurde das Reaktionsgemisch bis zur Trockne eingedampft und über eine Silicagel-Säule geleitet, die mit iPrOH: Triethylamin:H&sub2;O = 42:6:13 eluiert wurde. Der so erhaltene weiße Feststoff wurde in H&sub2;O gelöst und die Lösung wurde mit 6N HCl angesäuert und unter Erhalt von 5,5 mmol Produkt lyophilisiert. Rf(Säulen-Elutionsmittel) = 0,50. NMR(D&sub2;O): 1.42,s,9H,t-Butoxy-Gruppe; 2,80,m,1H,a-CH; 2,89,s,3H,CH&sub3; an der Guanidino-Gruppe; 2,96,s,6H,(CH&sub3;)&sub2;N; 3,25,t,2H,d-CH&sub2;; 1,50,m,4H,B,y-CH&sub2;.
BOC-Dpo. Aus 10 mmol Argininhydrochlorid und 1,72 g Natriumhydingencarbonat, gelöst in 17 ul H&sub2;O, 28,6 ul Acetylaceton und 28,6 ul EtOH wurden 7,5 mmol Dpo gemäß dem Verfahren nach F-S. (20) erhalten. Das Produkt wurde dann unter Verwendung von Di-t-butyldicarbonat in 50%-igem wässrigen Dioxan in Gegenwart von Natriumhydroxid zu dem entsprechenden BOC-Derivat umgesetzt. Diese Umsetzung ergab im wesentlichen eine quantitative Ausbeute. Rf(nBuOH:HO- Ac:H&sub2;O = 4:1:2) = 0,63. NMR(CDCl&sub3;): 1,45,s,9H,t-Butoxy-Gruppe; 1,9- 1,5,4H,B,y-CH&sub2;; 2,33,s,6H,CH&sub3;; 3,46,m,2H,d-CH&sub2;; 4,24,m,1H,a-CH; 6,35,s,1H, aromatischer H. Die L- und D-Formen reagierten in ähnlicher Weise.
BOC-D-Et&sub2;hArg. Diese Verbindung wurde durch das Verfahren von Nestor und Vickery, US-Patent 4,530,920, 23. Juli 1985, hergestellt. Rf(nBuOH:HOAc:H&sub2;O = 4:1:2) = 0,52.
Die erfindungsgemäßen Peptide wurden unter Verwendung eines Peptidsynthesegerätes der Firma Beckman Model 990 durch Festphasen-Verfahren hergestellt (1, 11). Das Benzylhydrylaminhydrochlorid-Harz (BHA- Harz) wurde als fester Träger verwendet. Das Programm des Synthesegerätes wurde in Unterprogramme aufgeteilt.
1. Entfernung der Schutzgruppen: 1. CH&sub2;Cl&sub2; ( 2 x waschen, 1 oder 2 min); 2. 50% TFA in CH&sub2;Cl&sub2;, das 0,1% Indol enthält, (1 x waschen, 1 oder 2 min); 3. 50% TFA in CH&sub2;Cl&sub2;, das 0,1% Indol enthält, (Entfernung der Schutzgruppe, 20 min); 4. CH&sub2;Cl&sub2; (2 x waschen).
2. Neutralisierung: 1. CH&sub2;Cl&sub2; (2 x waschen, 1 oder 2 min); 2. DIEA (10% in CH&sub2;Cl&sub2;) (2 x waschen, 1 oder 2 min); 3. DIEA (10% in CH&sub2;Cl&sub2;) (Neutralisierung, 5 min); 4. CH&sub2;Cl&sub2; ( 2 x waschen, 1 oder 2 min).
3. DCC-Kopplung: 1. CH&sub2;Cl&sub2; (2 x waschen, 1 oder 2 min); 2. Aminosäurelösung in CH&sub2;Cl&sub2; (Zufuhr, Transfer, Mischen, 5 min); 3. DCC (10% in CH&sub2;Cl&sub2;, (Zufuhr und Mischen, 180 min); 4. CH&sub2;Cl&sub2; (2 x waschen, 1 oder 2 min).
4. Aktive Ester-Kopplung: nicht angewendet
5. Abschließendes Waschen: 1. CH&sub2;Cl&sub2; (2 x waschen, 1 oder 2 min); 2. i-PrOH (3 x waschen, 1 oder 2 min); 3. DMF (3 x waschen, 1 oder 2 min); 4. CH&sub2;Cl&sub2; (3 x waschen, 1 oder 2 min).
6. Waschen nach TFA-Behandlung: 1. CH&sub2;Cl&sub2; (2 x waschen, 1 oder 2 min); 2. i-PrOH (2 x waschen, 1 oder 2 min); CH&sub2;Cl&sub2; (3 x waschen, 1 oder 2 min).
7. Acetylierung: 1. CH&sub2;Cl&sub2; (2 x waschen, 1 oder 2 min); 2. 25% Ac&sub2;O und Py in CH&sub2;Cl&sub2; (1 x waschen, 1 oder 2 min); 3. 25% Ac&sub2;O und Py in CH&sub2;Cl&sub2; (Acetylierung, 20 min), 4. CH&sub2;Cl&sub2; (2 x waschen, 1 oder 2 min).
Die erste Aminosäure wurde durch die Programmsequenz 2-3-5 an dem Harz befestigt. Bevor das Harz in das Reaktionsgefäß eingebracht wurde, wurde das Harz in einem Scheidetrichter mit 25 ul CH&sub2;Cl&sub2;/g Harz gewaschen, um die feinen Partikel zu entfernen. Bei allen Kopplungen wurde üblicherweise ein 3-4-facher Überschuß der BOC-Aminosäure in bezug auf den Stickstoffgehalt des Harzes verwendet. Dieses Verfahren führte im allgemeinen zu einer vollständigen Kopplungsreaktion. Wenn eine positive Nynhydrin-Farbreaktion beobachtet wurde, wurde eine zweite Kopplung durchgeführt (Programmsequenz 3-5). Dann wurde das Harz acetyliert (Programmsequenz 7-5).
Die nächste Aminosäure wurde durch die Programmsequenz 1-6-2-3-5 angehängt. Für die DCC-Kopplung wurden alle Aminosäuren in CH&sub2;Cl&sub2; gelöst. Die Acetylierung des Aminosäurerests in Position 1 wurde unter Anwendung der Programmsequenz 1-6-2-7-5 durchgeführt. Das Volumen der Lösungsmittel und der Reagenzien, die für das Waschen und das Durchführen der chemischen Umsetzungen verwendet wurden, betrug ungefähr 10 ul/g Harz.
Nachdem alle Aminosäuren gekoppelt worden waren wurde das Peptidharz über Nacht, in vacuo, getrocknet. Das Harz wurde dann mit doppeltdestilliertem flüssigen Fluorwasserstoff (10 ul/g Harz), das 10-25% destilliertes Anisol oder p-Cresol enthielt, für eine Stunde bei 0ºC behandelt. Dann wurde das HF unter verringertem Druck verdampft und der Rückstand wurde über Nacht, in vacuo, mittels einer Ölpumpe getrocknet. Das Gemisch wurde dann mehrere Male mit Et&sub2;O (25 ul/g Harz) mit wässrigem HOAC, 30%, 50%, 10%, und einmal mit 25 ul destilliertem, deionisiertem Wasser extrahiert. Die vereinigte wässrige Lösung wurde unter Erhalt eines Rohpeptids lyophilisiert.
Die meisten Peptide wurden gereinigt durch Silicagel-Chromatographie (1 x 60 cm- Säule) unter Verwendung eines der Lösungsmittelsysteme nBuOH:HOAc:H&sub2;O = 4:1:2 oder 4:1:5, obere Phase, oder nBuOAc: nBu-OH:HOAc:H&sub2;O = 2:8:2:3, gefolgt von einer Gelfiltration über Sephadex G 25 mit 6%-igem HOAc als dem Elutionsmittel. Im Falle nicht zufriedenstellender Reinheit nach diesem Verfahren wurden die Peptide durch semipräparative HPLC unter Verwendung eines Waters-Flüssigchromatographen, der mit einem Lösungsmittel-Programmgeber 660 ausgerüstet war, weiter gereinigt. Eine m-Bondapak C&sub1;&sub8;-Säule von 1,2 x 25 cm wurde mit dem Lösungsmittelsystem A = 0,1 M NH&sub4;OAc pH 5,0 und B = 20% A + 80% CH&sub3;CN verwendet. Verschiedene Gradienten mit ansteigenden Mengen von B innerhalb von 15-25 Minuten wurden verwendet, um eine Reinigung zu bewirken.
Ein alternatives Reinigungsprogramm umfaßte Gelfiltration über Sephadex G-25 mit 6%-iger HOAc, gefolgt von Chromatographie über Sephadex LH 20 (2,5 x 100 cm) mit dem Lösungsmittelsystem H&sub2;O:nBuOH: HOAc:MeOH = 90:10:10:8. Sofern erforderlich wurde das letztgenannte Verfahren ein- bis zweimal wiederholt.
Die Reinheit der Peptide wurde durch Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten von Merck in mindestens vier verschiedenen Lösungsmittelsystemen, wie in Tabelle II gezeigt, überprüft. Die Tüpfelproben (spots) wurden dann mit dem Chlor/o-Tolidin-Reagens entwickelt. In Tabelle II sind ebenfalls die Bedingungen und die Ergebnisse der analytischen HPLC gezeigt. Die Vorrichtung war die vorstehend beschriebene, außer daß eine analytische m-Bondapak C&sub1;&sub8;-Säure (3,9 mm x 30 cm) verwendet wurde.
Die Aminosäureanalysen wurden auf einem Aminosäure-Analysegerät von Beckman, Modell 118 CL durchgeführt. Proben von ungefähr 0,5 ug wurden in 6N Salzsäure in abgeschlossenen Glasröhrchen für 24 Stunden bei 110ºC hydrolysiert. Der Rückstand wurde dann eingedampft und in Citratpuffer pH 2,2 gelöst und in das Analysegerät eingebracht. Die Ergebnisse sind in Tabelle III wiedergegeben.
Die antiovulatorische Aktivität, AOA, bei Ratten wurde wie von Humphries et al. (12) beschrieben, bestimmt. Der Quaddeltest (wheal test) wurde durchgeführt, indem 10 ug Peptid in 100 ul Salzlösung den betäubten Ratten intradermal injiziert wurde, die idealerweise kreisförmige Quaddelreaktion gemessen und die Fläche berechnet wurde. Der in vitro-Histaminfreisetzungstest wurde wie durch Karten et al. (4) beschrieben durchgeführt.
Die Ergebnisse dieser Bioassays werden in Tabelle I und anderen hieran beigefügten Tabellen wiedergegeben.
Von den 57 Peptiden in Tabelle I besaßen 21 eine AOA von ungefähr 90% oder mehr bei einer Dosierung von 1 ug in dem vorliegenden Assay. Von den 37 Peptiden aus Tabelle I, die auf Histaminfreisetzung in einem Ratten-Mastzellen-Assay getestet wurden, besaßen 10 ED&sub5;&sub0;- Werte von 300 oder mehr im Vergleich zu 0,17 für die Standardverbindung [N-Ac-D-2-Nal¹,D-4-F-Phe²,D-Trp³,D-Arg&sup6;]-LHRH. Neun weitere Analoge besaßen ED&sub5;&sub0;-Werte die von 86 bis 288 reichten, d.h. sie setzten nicht mehr Histamin frei als die klinisch verwendeten "Superagonisten".
Von den 37 Peptiden aus Tabelle I, die in dem Ratten-Mastzellen-Assay getestet wurden, besaßen sieben (Nr. 4, 23, 24, 43 (Antide), 44, 53, 55) sowohl eine AOA von ungefähr 90% oder mehr bei 1 ug als auch einen ED&sub5;&sub0;-Wert von ungefähr ≥ 86 ug/ul. Darin eingeschlossen war das wirksame Analog Nr. 53, das eine 100%-ige AOA bei 0,5 ug und eine 40%-ige AOA bei 0,25 ug besaß. Der ED&sub5;&sub0;-Wert für dieses Analog war 93±28. Es wurde somit gezeigt, daß eine hohe AOA mit einer geringen Histaminfreisetzung in den erfindungsgemäßen Analogen festgestellt werden konnte.
Strukturelle Eigenschaften, die diese sieben Peptide gemein haben, sind: 1) Ein D-Lys-Rest in Position 6, der acyliert war durch die schwachbasische Nicotinsäure oder Analoge wie Picolin- und 6-Methylnicotinsäure. 2) Der entsprechende acylierte L-Lys-Rest oder das natürliche Tyr in Position 5. 3) Die alkylierten Derivate ILys oder IOrn in Position 8. 4) Arg kommt in der Sequenz nicht vor.
Zwei Beispiele für den Einfluß von Arg auf die Histaminfreisetzung sind die Paare 43,10 und 4,1. Nr. 43 (Antide) besaß die Sequenz N-Ac-D-2- Nal¹,D-pClPhe²sub,D-3-Pal³,Ser&sup4;,NicLys&sup5;,D-NicLys&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;- NH&sub2;. Sein ED&sub5;&sub0;-Wert ist > 300. Nr. 10 ist von der Sequenz her identisch, außer daß NicLys&sup5; durch Arg&sup5; ersetzt ist. Dies bewirkt, daß der ED&sub5;&sub0;-Wert auf 4,3±0,52 sinkt. Nr. 4 besitzt eine identische Sequenz wie Nr. 43, abgesehen von Tyr in Position 5. Sein ED&sub5;&sub0;-Wert ist 133±22. Bei Nr. 1 wird ILys&sup8; in dieser Sequenz durch Arg&sup8; ersetzt, was dazu führt, daß der ED&sub5;&sub0;-Wert auf 39,2±7 sinkt. Es scheint somit, daß Position 5 für die Arg-Substitution empfindlicher ist als Position 8.
In Position 8 sind die alkylierten ILys- und IOrn-Reste Lys bzw. Orn überlegen, sowohl bezüglich der AOA als auch der Histaminfreisetzung (Paare 3,4 und 6,7). Ob ILys&sup8; oder IOrn&sup8; am besten ist, scheint sequenzabhängig zu sein.
Für die Bestimmung der Wirkungsdauer wurden die Antagonisten s.c. oder oral an 26 Tage alte weibliche Ratten zu einer bestimmten Zeit vor der Verabreichung des Agonisten [D-Qal&sup6;]-LHRH verabreicht. Die Serumspiegel des Luteinisierenden Hormons (LH) von Ratten und des Follikel-stimulierenden Hormons (FSH) von Ratten wurden dann zwei Stunden nach der Verabreichung des Agonisten durch RIA gemessen. Die orale Verabreichung wurde durch Zwangsfütterung mit Fütterröhrchen durchgeführt.
Tabelle IV zeigt die Daten für die AOA und die Histaminfreisetzung für Analoge, die acylierte Aminocyclohexylalanin-Reste enthalten. Für die Analoge mit NicLys&sup5;, D-NACAla&sup6;, IV-1 und IV-2, (NACAla stellt 3-(4- Nicotinoylaminocyclohexyl)alanin dar), ist das Analog 2 mit cis-D-NACA- la&sup6; etwas aktiver, 100% vs. 70% bei 1 ug. Die Analoge IV-7 und IV-8 mit NicLys&sup5;, D-PzACAla&sup6; (PzACAla stellt 3-(4-Pyrazinylcabonylaminocyclohexyl)alanin dar) zeigen die umgekehrte Reihenfolge der Aktivitäten. Der trans-Rest besitzt die höhere AOA, 88% vs. 25% bei 1ug.
Die Analoge IV-3 und IV-4 mit PicLys&sup5;, trans und cis PACAla&sup6; (PACA- la stellt 3-(4-Picolinoylaminocyclohexyl)alanin dar) sind gleich wirksam, 50 bzw. 54% AOA bei 0,5 ug, während in dem Fall von PicLys&sup5;, trans und cis PzACAla&sup6; die cis-Verbindung mehr als zweimal so aktiv ist. Das erstere, Analog IV-5 ist ungefähr so wirksam wie die Analoge IV-3 und IV-4 (44% bei 0,5 ug), während das letztere, 100%, 73% und 29% AOA bei 0,5, 0,25 bzw 0,125 ug besitzt. Das hohe Wirksamkeit besitzende Analog IV-6 ist im Vergleich mit der geringen Aktivität des strukturell ähnlichen Analogs IV-8 einzigartig.
Das Analog IV-9 weist cis-PzACAla&sup5;, D-PicLys&sup6; auf und, obwohl die Reste 5 und 6 umgedreht sind, behält die hohe Wirksamkeit von Analog IV-6, 90% und 67% bei 0,5 bzw. 0,25 ug.
Bezüglich der Histaminfreisetzung besitzen alle getesteten Analoge in vitro niedrigere ED&sub5;&sub0;-Werte als die Stammverbindung. Die ED&sub5;&sub0;-Werte reichen von ungefähr 30 bis 60, verglichen mit > 300 und 93±11 für Antide und Analog V-10. Die Tests auf die Quaddel-Reaktion zeigen einen Bereich von 99,5 bis 129,6, was Antide (132,7) und Analog V-10 (123,0) ähnelt. Das Fehlen einer Korrelation zwischen den beiden Tests mag hauptsächlich einen Unterschied der Assays widerspiegeln.
Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß für die Analoge mit NicLys&sup5; der Einbau von Aminocyclohexylalanin-Derivaten in Position 6 in vitro zu einem wesentlichen Ansteigen der Histaminfreisetzung und einer unveränderten oder verringerten AOA führte. Für die PicLys&sup5;-Analoge mit den gleichen Substitutionen gab es eine Verringerung der AOA-Wirksamkeit in allen Fällen außer einem, in dem ein beträchtliches Ansteigen beobachtet wurde. Die Kombination von PicLys&sup5; und cis-D-PzACAla&sup6; besitzt offensichtlich irgendeine vorteilhafte Struktur. Die Histaminfreisetzung für die PicLys&sup5;-Analoge wurde um 50-100% erhöht.
In Tabelle V sind die Ergebnisse von Austauschen in Position 7 des Analogs V-10 wiedergegeben. Diese Position erlaubt etwas strukturelle Freiheit, obwohl keines der Peptide eine höhere AOA als das Analog V- 10 zeigt. Die Analoge V-12, V-14 und V-16 weisen Aile&sup7; (Alloisoleucin), Val&sup7; und Abu&sup7; (2-Aminobuttersäure) auf und besitzen die gleiche Wirksamkeit wie Analog V-10. Das Analog V-16 mit der geraden Kette Abu&sup7; ist etwas wirksamer als die Analoge V-13 und V-15 mit Nle&sup7; (Norleucin) bzw. Nval&sup7; (Norvalin), die stärker dem natürlichen Leu&sup7; ähneln.
Für die Verbindung V-17 mit dem kleinen Rest Ala&sup7; sank die AOA auf 60% bei 0,5 ug. Der Einbau von Trp&sup7;, das der natürliche Rest in Hühner II-, Lachs- und Neunauge-LHRH ist (13-15) ergab Analog 18 mit nur 10% AOA bei 0,5 ug. Trp&sup7; kann zu groß sein unter Berücksichtigung der Größe der benachbarten D-PicLys&sup6; und ILys&sup8;.
Die am stärksten interessierenden Eigenschaften in Tabelle V sind die in vitro-Histaminfreisetzungsdaten. Die drei Analoge mit ähnlicher AOA- Wirkung wie Analog V-10 zeigen eine deutlich verminderte Histaminfreisetzung. Die ED&sub5;&sub0;-Werte für die Analogen V-12, V-14 und V-16 sind > 300, 213±30 bzw. 273±27; d.h. eine zwei- bis dreifache Verringerung der Histaminfreisetzung wird durch kleine Änderungen in der Seitenkettenstruktur erzielt. Auch ist die Quaddel-Reaktion im Vergleich zu V-10 bei allen Analogen vermindert.
Es wurde zuvor festgestellt (1), daß es sequenzabhängig ist, ob ILys oder IOrn der beste Substituent in Position 8 ist. Um diesen Aspekt weiter zu erforschen wurden die IOrn&sup8;-Analoge, die einigen der besten Peptide entsprechen, synthetisiert und getestet. Die Ergebnisse in Tabelle VI zeigen, daß ILys&sup8; besser sein kann. Für zwei der Paare, die Analoge VI-10 VI-19 und VI-12 und VI-21 waren ILys&sup8; und IOrn&sup8; ungefähr gleichwertig. Für die anderen drei Paare waren die Analoge mit ILys&sup8; aktiver, aber die Unterschiede waren nicht groß. Der größte Unterschied betraf das Paar mit Val&sup7;, wobei das ILys&sup8;-Analog VI-14 90% AOA bei 0,5 ug vs. 57% für das IOrn&sup8;-Analog VI-20 zeigt.
Das Analog VI-19 wurde in vitro auf die Histaminfreisetzung getestet. Der ED&sub5;&sub0;-Wert ist 42±3,1 d.h. die Histaminfreisetzung beträgt das zweifache des Analogen, das eine CH&sub2;-Einheit mehr besitzt. Die Quaddel-Reaktion änderte sich nicht deutlich mit Ausnahme des Analogs 21 mit Aile&sup7; und IOrn&sup8;, das den niedrigen Wert von 78,6±45 verglichen mit dem ILys-Analogen 12, besaß, das einen Wert von 97,9±2,9 besaß.
Tabelle VII zeigt die Wirkungsdauer von Antide und zweier Analoge. Wenn Antide mit einer Dosis von 3, 10 und 30 ug 44 Stunden vor einer Verabreichung von 50 ng [D-Qal&sup6;]-LHRH (Qal stellt 3-(3-Quinolyl)alanin dar), einem Superagonisten, injiziert wurde, wurden bei den beiden höheren Dosierungen deutliche Verringerungen in dem Serum-LH beobachtet. Das LH sank von 113±11 auf 46±12 und 5±0,7 ng/ul. Das Serum-FSH war ebenfalls erniedrigt, am deutlichsten von ungefähr 300 auf ungefähr 300 ng/ul bei 30 ug.
Das Analog VII-24 [Tyr&sup5;]-Antide, und das Analog VI-6 wurden in ähnlicher Weise 24 Stunden vor dem Agonisten injiziert. Das Analog VII-24 zeigte hohe Aktivität und verringerte den LH-Spiegel auf 19±4 3±0,4 und 0,3±0,03 ng/ul bei einer Dosls von 3, 10 bzw. 30 ug. Die entsprechenden Werte für das Analog IV-6 sind 42±7, 15±3 und 3,4±2 ng/ul. Dies ist interessant, da Analog IV-6 in dem antiovulatorischen Assay beträchtlich wirksamer ist, 73% bei 0,25 ug vs. 54% bei 0,5 ug. Vielleicht wird das Analog IV-6 enzymatisch schneller abgebaut als das Analog VII-24. Die lange Wirkungsdauer dieser Analoge s.c. kann ebenfalls auf "Depot"-Wirkungen an der Injektionsstelle beruhen.
Tabelle VIII zeigt die Wirkungsdauer von Antide nach oraler Verabreichung. 48 Stunden nach der Verabreichung von 100 oder 300 ug Dosis- Spiegel von Antide wurden deutlich verringerte Spiegel von LH, die durch 5 ng von [D-Qal&sup6;]-LHRH s.c. freigesetzt worden waren, beobachtet. Es wurden Verringerungen von 21±3 auf 4±0,8 bzw. 8±2 ng/ul beobachtet. In dem 24 Stunden-Experiment wurden ungefähr die gleichen Ergebnisse erhalten (9±2 und 6±0,3 ng/ul). Antide scheint eine beträchtliche Resistenz gegen abbauende Enzyme zu besitzen. Wenn Antide zwei Stunden vor dem Agonisten gegeben wurde, wurde ein starker Abfall in den LH-Werten beobachtet. Bei einer Dosis von 30 ug war eine deutliche Verringerung des LH-Spiegels auf 6±1 ng/ul zu sehen. Bei 100 und 300 ug waren die Spiegel 1±0,3 und 0,4±0,4 ng/ul, d.h. sehr geringe Spiegel. Wenn 10 ng des Agonisten verwendet wurden, waren die Ergebnisse qualitativ sehr ähnlich.
Als Vergleich dienen die letzten drei Eintragungen in Tabelle VIII von Experimenten mit [N-Ac-D-pClPhe1,2, D-Trp³, D-Arg&sup6;, D-Ala¹&sup0;]-LHRH, VIII-25, ein Analog, das Berichten zufolge orale Wirksamkeit besitzt (16). Diese Daten zeigen, daß Antide aktiver ist als VIII-25, da eine Dosis von 30 ug, die zwei Stunden vor dem Agonisten gegeben wurde, den LH-Spiegel von 44±4 auf 22±4 ng/ul (p< 0,01) senkte. Der Wert für das Analog VIII-25 ist 39±6 (NS). Bei 100 ug sind die entsprechenden Zahlen 7±3 (p< 0,001) und 26±7 (p< 0,05). Die FSH-Spiegel waren im allgemeinen verringert, wenn Antide bei -2 Stunden mit Dosis-Spiegeln von 109 oder 300 ug verabreicht wurde.
Die Ergebnisse in Tabelle IX zeigen, daß es keinen deutlichen Unterschied zwischen der Verabreichung von Antide in Wasser oder in Getreide-/Mais-Öl gibt.
Antide wurde ebenfalls oral in dem antiovulatorischen Assay getestet (Tabelle X). Die AOA-Werte bei Dosis-Spiegeln von 300, 600 und 1200 ug sind 18, 73 bzw. 100%. Drückt man dies als ovulierte Ratten/Gesamtzahl der Ratten aus, dann sind die Zahlen 9/11, 3/11 und 0/11. Für das Analog VIII-25 sind die Zahlen 9/11, 4/11 und 0/11 bei Dosis- Spiegeln von 500, 1000 bzw. 2000 ug berichtet worden (16). Antide war ungefähr doppelt so wirksam wie das Analog VIII-25.
Tabelle XI zeigt einen Vergleich der oralen Aktivitäten von Antide und vier Analogen. Eines war so aktiv wie Antide, eines beträchtlich weniger aktiv und zwei waren weniger aktiv bei niedrigen Dosen (30 und 100 ug) und ungefähr so aktiv bei einer Dosis von 300 ug.
Nach einer Dosis von 15 ng s.c. [D-Qal&sup6;]-LHRH stieg der LH-Spiegel auf 91±4,6 ng/ul. Bei oralen Dosis-Spiegeln von 30, 100 und 300 ul wurden verringerte LH-Spiegel von 75±3 20±4 bzw. 5±1 ng/ul aufgezeichnet. Das Analog 4 mit PicLys&sup5; und D-PACAla&sup6; zeigte keine deutliche Verringerung von LH bei Spiegeln von 30 und 100 ug, aber es gab eine Verringerung auf 51±6 ng/ul bei einer Dosis von 300 ug.
Das Analog V-12 mit PicLys&sup5;, D-PicLys&sup6; und Aile&sup7; und das Analog IV-6 mit PicLys&sup5;, cis-D-PzACAla&sup6; waren weniger wirksam als Antide bei 30 und 100 ug, aber gleichwirksam bei 300 ug. Diese beiden Peptide waren im wesentlichen in dem s.c. antiovulatorischen Assay wirksamer als Antide.
Das Analog 26 besaß die gleiche Wirksamkeit wie Antide. Dies ist nicht überraschend, da der einzige strukturelle Unterschied ein Pyrazinanstelle eines Pyridin-Anteils in der NE-Acyl-Gruppe des D-Lys&sup6;-Rests ist.
Die Tabellen XI und XII zeigen ebenfalls Ergebnisse mit Antide, z.B., wenn 50 ng des Agonisten verwendet wurden. Ein Vergleich dieser Ergebnisse mit den Daten der Experimente, in denen 15 ng des Agonisten verwendet wurden, zeigt eine Dosis-Antwort-Beziehung, die von kompetitiven Antagonismen erwartet wird. Unter Verwendung von 15 ng des Agonisten, verringerten 100 und 300 ug Antide den LH-Spiegel von 115±15 ng/ul auf 20±4 bzw. 5±1 ng/ul, während in den Experimenten unter Verwendung von 50 ng des Agonisten 300 und 900 ug von Antide das LH auf den gleichen Spiegel (19±3 und 5,3±1,2 ng/ul) verringerten.
Die Tabelle XIII zeigt die biologischen Wirkungen von Antide in einem Kultursystem von dispergierten Hypophysen-Zellen.
Die Strukturen und biologischen Aktivitäten bestimmter bevorzugter LHRH-Analoge, die bei einer Dosis von 0,25 ug die ovulatorische Aktivität um mehr als 50% hemmen, werden in Tabelle XIV gezeigt.
Es wird vorgeschlagen, daß Antide und andere Antagonisten der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, um einen Zustand der reversiblen medizinischen Kastration zu induzieren. Dies wäre wertvoll bei der Behandlung einer ziemlich großen Anzahl von Krankheitszuständen wie Endometriose, Uterus-Fibroiden und Hormon-abhängigen Krebsarten (Prostata, Brust). Bei einigen Patienten kann die vorübergehende Hemmung der Gonadenfunktion mit Antide, z.B. während der Patient chemotherapeutische Mittel und/oder Bestrahlung erhält, nachteilige Wirkungen dieser Mittel auf die Gonaden/Keimdrüsen verhindern oder minimieren und auf diese Weise helfen, eine zukünftige Fruchtbarkeit zu gewährleisten. Therapeutische Beispiele wären die Bestrahlung bei einer Knochenmark-Transplantation, Cervixkarzinom, metastasischer Schilddrüse und Uteruskarzinom, möglicherweise Thyreotoxikose bzw. Hyperthyreose, etc. während der Chemotherapie gegen disseminierten Lupus Erythematosus und bei bestimmten Stadien der Organtransplantation. Eine mehr physiologische Verwendung der erfindungsgemäßen Antagonisten wie Antide wäre das Hemmen der Fruchtbarkeit bei sowohl Frauen wie Männern.
Eine einzigartige mögliche Verwendung von Antide oder anderen Decapeptiden der vorliegenden Erfindung wäre die Modifizierung des Sexualverhaltens bei ausgewählten Krankheitszuständen. Derartige Krankheitszustände könnten Patienten mit AIDS betreffen, sowie das aggressive Verhalten von Sexualstraftätern in Gefängnissen oder aggressiven Jugendlichen, die in Erziehungsanstalten eingesperrt sind. Es ist auch möglich, daß hohe Gonadotropin-Spiegel im Serum von Frauen in der Postmenopause funktionelle Anormalitäten in Fettzellen, die zu einer Gewichtszunahme führen können, oder in Knochenzellen, die eine Rolle bei der beschleunigten Osteoporose spielen, induzieren können. Diese funktionellen Anormalitäten können potentiell mit der Verabreichung von Antide verringert werden, indem die hohen LH- und/oder FSH-Spiegel in dem Serum von Frauen in der Postmenopause gehemmt werden.
Ausgewählte LHRH-Antagonisten, hauptsächlich mit geladenen Aminosäuresubstitutionen in Position 6 und/oder 8 des Decapeptids, stimulieren wahrscheinlich die Histaminfreisetzung durch eine direkte Wirkung auf Mastzellen, die Histamin freisetzen, während andere LHRH-Antagonisten wie Antide dies nicht tun. Es wird somit vorgeschlagen, daß die Mastzellen-stimulierenden Antagonisten, die lokal auf Hautwunden aufgebracht Histamin nicht stimulieren, einige der allergischen Reaktionen, die bei Menschen auftreten, verhindern können.
Das Verzögern bzw. das Hinausschieben des Einsetzens der Pubertät bei Kindern von geringem Wuchs durch Verabreichung von Antide mit oder ohne begleitende Verabreichung von GH oder GH-freisetzenden Peptiden wird als ein einzigartiges Verfahren zur Erhöhung der Körpergröße vorgeschlagen. Die Gegenwart von Gonaden-Hormonen verbindet die Epiphyse von langen Knochen und verhindert deren weitere Verlängerung. Diese Herangehensweise sollte die Verwendung und Wirksamkeit von GH und GH-freisetzenden Peptiden ausdehnen und vergrößern.
Die Verabreichung von LHRH-Antagonisten der vorliegenden Erfindung hemmt die Funktion der Gonaden unmittelbar innerhalb von 24 Stunden. Die kontinuierliche Verabreichung von LHRH-Superagonisten kann ebenfalls die Funktion der Gonaden hemmen, aber dies geschieht erst nach mehreren Tagen der Stimulation der Gonaden zur Hyperfunktion. Eine derartige Verabreichung von Superagonisten führt zu einer Anzahl von potentiell unerwünschten klinischen Problemen bei Patienten mit Prostatakrebs, Endometriose, Uterusfibroiden sowie bei Sexualstraftätern und solchen Patienten, die einer vorübergehenden Induzierung einer medizinischen Kastration unterworfen sind. Aus diesen Gründen wird vorgeschlagen, daß LHRH-Antagonisten für das Einleiten eines reversiblen Zustands der medizinischen Kastration wünschenswertere Mittel darstellen als die LHRH-Agonisten. Auf der Ebene der Diagnose, wie der Differenzierung der anatomischen Quelle der Steriodsekretion aus der Nebenniere versus den Eierstock oder um den Grad der Abhängigkeit der Kalziumexkretion von den Steriodhormonen der Gonaden zu enthüllen, führt das schnelle Einsetzen der Hemmung der Gonadenfunktion mit LHRH-Antagonisten dazu, daß sie bezüglich der LHRH-Agonisten ein eindeutig überlegenes Mittel sind. Es wird vorgeschlagen, daß bei jeder klinischen Situation, in der LHRH-Superagonisten verwendet worden sind, um die Gonadenfunktion zu hemmen, die LHRH-Antagonisten die Mittel der Wahl sind.
Die Dokumente in dem folgenden Verzeichnis werden hierin unter Bezugnahme eingefügt.
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Es können Veränderungen in der besonderen Aminosäure oder Derivaten und deren hierin beschriebener Zusammenstellung oder in den Schriften oder der Abfolge der hierin beschriebenen Verfahrensschritte vorgenommen wetden, ohne daß von dem Konzept und dem Schutzbereich der Erfindung, wie in den nachstehenden Patentansprüchen definiert, abgewichen wird.

Claims

1. LHRH-Antagonist mit einer beträchtlichen anti-ovulatorischen Aktivität und einer geringfügigen Histamin-freisetzenden Aktivität, der ein Decapeptide ist, dadurch gekennzeichnet, daß (a) Arginin und seine Derivate nicht verwendet werden, (b) Lysin in Position 5 und/oder 6 zu Derivaten mit Acylgruppen an der &epsi;-Aminogruppe umgesetzt ist, und (c) in Position 8 ein alkylierter Lysinrest oder Ornithinrest enthalten ist.

2. LHRH-Antagonist nach Anspruch 1, wobei das Decapeptid auf der Formel [( )¹, D-pClPhe², D-3-Pal³, Ser&sup4;, ( )&sup5;, ( )&sup6;, Leu&sup7;, ( )&sup8;, Pro&sup9;, D-Ala¹&sup0;] - NH&sub2; basiert.

3. LHRH-Antagonist nach Anspruch 2, der [N-Ac-D-2-Nal¹, NicLys&sup5;, D- NicLys&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2; oder [N-Ac-D-2-Nal¹, PicLys&sup5;, D-PicLys&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2; ist.

4. LHRH-Antagonist nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß er ausgewählt wird aus:

[N-Ac-D-2-Nal¹, Tyr&sup5;, D-NicLys&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, Tyr&sup5;, D-NicLys&sup6;, Me&sub2;Lys&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, Tyr&sup5;, D-NicLys&sup6;, IOrn&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, Dpo&sup5;, D-NicLys&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, ILys&sup5;, D-NicLys&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, 3-Pal&sup5;, D-NicLys&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, 3-Pal&sup5;, D-NicLys&sup6;, IOrn&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, Ile&sup5;, D-NicLys&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, Ile&sup5;, D-NicLys&sup6;, IOrn&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, NicOrn&sup5;, D-NicLys&sup6;, IOrn&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, DMGlys&sup5;, D-NicLys&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, PicLys&sup5;, D-NicLys&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-pClPhe¹, Tyr&sup5;, D-NicLys&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-Cl&sub2;Phe¹, Tyr&sup5;, D-NicLys&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, NicLys&sup5;, D-Dpo&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, NicLys&sup5;, D-BzLys&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, NicLys&sup5;, D-PicLys&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, NicLys&sup5;, D-AnGlu&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, NicLys&sup5;, trans-D-NACAla&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, NicLys&sup5;, cis-D-NACAla&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, NicLys&sup5;, D-Me&sub2;Lys&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, NicLys&sup5;, D-PzcLys&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, NicLys&sup5;, D-NicLys&sup6;, Dpo&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, NicLys&sup5;, D-NicLys&sup6;, IOrn&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, NicLys&sup5;, D-NicLys&sup6;, CypLys&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, NicLys&sup5;, NicLys&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, INicLys&sup5;, D-INicLys&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, MNicLys&sup5;, D-MNicLys&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹, DMGLys&sup5;, D-BzLys&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2;; and

[N-Ac-D-2-Nal¹, PzcLys&sup5;, D-PzcLys&sup6;, ILys&sup8;] - NH&sub2;.

5. LHRH-Antagonist mit einer beträchtlichen anti-ovulatorischen Aktivität und einer geringfügigen Histamin-freisetzenden Aktivität, der ein Decapeptid ist, das ausgewählt wird aus:

[N-Ac-D-Cl&sub2;Phe¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,D-PicLys&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-Cl&sub2;Phe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,D-PicLys&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-3-Pal²,D-pClPhe³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,D-PicLys&sup6;,Leu&sup7;,IOrn&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-PzAla³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,D-PicLys&sup6;,Leu&sup7;,IOrn&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClphe²,D-Trp³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,D-PicLys&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,D-PicLys&sup6;,Val&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,D-PicLys&sup6;,Val&sup7;,IOrn&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,D-PicLys&sup6;,Aile&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,D-PicLys&sup6;,Aile&sup7;,IOrn&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,D-PicLys&sup6;,Abu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pa1³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,D-PicLys&sup6;,Abu&sup7;,IOrn&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,D-PicLys&sup6;,Trp&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-AIa¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,D-PicLys&sup6;,Nle&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,D-PicLys&sup6;,Nval&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,D-PicLys&sup6;,Ile&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,D-PicLys&sup6;,Ala&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,D-PicLys&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Pip&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,D-PicLys&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,D-PicLys&sup6;,Leu&sup7;,IOrn&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-TinGly³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;c-D-PzACAla&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]- NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-PzAla³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,c-D-PzACAla&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]- NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,c-D-PzACAla&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,c-D-PzACAla&sup6;,Leu&sup7;,IOrn&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,c-D-PzACAla&sup6;,Val&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,c-D-PzACAla&sup6;,Phe&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,c-D-PzACAla&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ser¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,c-D-PzACAla&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,NHEt¹&sup0;];

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,c-D-PmACAla&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]- NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,c-PzACAla&sup5;,D-PicLys&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,HOBLys&sup5;,D-PicLys&sup6;,Abu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,Cit&sup5;,D-PicLys&sup6;,Abu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,Tyr&sup5;,D-PicLys&sup6;,Leu&sup7;,IOrn&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,NicLys&sup5;,t-DPzACAla&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,NicLys&sup5;,c-DPzACAla&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,NicLys&sup5;,D-NicLys&sup6;,NMeLeu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]- NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,NicLys&sup5;,D-PzcLys&sup6;,Leu&sup7;,IOrn&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,MPicLys&sup5;,D-M-PicLys&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;l-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PmcLys&sup5;,D-PmcLys&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,c-PzACAla&sup5;,c-D-PzACAla&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]- NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,Tyr&sup5;,c-D-PzACAla&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,Tyr&sup5;,c-D-PzACAla&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-ser¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,c-D-PzACAla&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,Sar¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,c-PzACAla&sup5;,D-PicLys&sup6;,Val&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,t-D-PACAla&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;;

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,c-D-PACAla&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Prn&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;; and

[N-Ac-D-2-Nal¹,D-pClPhe²,D-3-Pal³,Ser&sup4;,PicLys&sup5;,t-D-PzACAla&sup6;,Leu&sup7;,ILys&sup8;,Pro&sup9;,D-Ala¹&sup0;]-NH&sub2;

6. Decapeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit einer anti-ovulatorischen Aktivität von etwa 90 % oder mehr bei einer Dosierung von 1 ug gemäß dem Test nach Humphries et al. (J. Med. Chem. 21: 120-123, 1978).

7. Decapeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit einer Histaminfreisetzung, die einem ED&sub5;&sub0;-Wert von etwa 86 ug/ml oder mehr gemäß dem Test nach Karten et al. (LHRH and its Analogs: Contraceptive and Therapeutic Applications Part 2, 179-190, 1987) entspricht.

8. Decapeptid nach Anspruch 1 oder 5 zur Verwendung in der Medizin und/oder Tiermedizin.

9. Verwendung des Decapeptids nach Anspruch 1 oder 5 zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen der Ovulation bei einem Tier.

10. Verwendung des Decapeptids nach Anspruch 1 oder 5 zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen des Einsetzens der Pubertät bei einem Tier.

11. Verwendung des Decapeptids nach Anspruch 1 oder 5 zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen der Sexualkraft bei einem Tier.

12. Verwendung des Decapeptids nach Anspruch 1 oder 5 zur Herstellung eines Medikaments zum Verändern der Funktion der Keimdrüsen bei einem Tier.

13. Verwendung des Decapeptids nach Anspruch 1 oder 5 zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen des Wachstums Hormon-abhängiger Tumore bei einem Tier.

14. Verwendung des Decapeptids nach Anspruch 1 oder 5 zur Herstellung eines Medikaments zum Erniedrigen des LH- und FSH-Spiegels im Serum von Frauen in der Postmenopause.