DK173753B1 - LHRH-antagonist med negligerbar histaminfrigørelsesaktivitet, som er et decapeptid og anvendelse af decapeptidet - Google Patents

Description

i DK 173753 B1

Opfindelsen angår en LHRH-antagonist med i hovedsagen antiovulatorisk aktivitet og negligerbar histaminfrigørelsesaktivitet, som er et decapeptid. Opfindelsen angår også decapeptidet og anvendelse heraf.

5

Den foreliggende opfindelse vedrører opbygningen, syntese og anvendelsen af syntetiske analoge af det luteiniserende hormonfrigørende hormon (LHRH). En vigtig forbedring ved syntesen af analoge, der virker som 10 antagonister for LHRH, var ligeså kraftige til at hæmme ovulation og muliggjorde frigørelsen af kun meget små mængder histamin. Da der ikke fandtes nogen pålidelig måde til at forudsige opbygningen af en antagonist med kraftig aktivitet og særdeles lav histaminfrigørelse, var 15 det nødvendigt at undersøge forskellige metoder for at finde en kombination ved de strukturelle træk, der ville give en antagonist for LHRH, der havde høj aktivitet med hensyn til ovuleringshæmning og meget lav aktivitet med hensyn til histaminfrigørelse.

20

Forskellige peptider som forbindelse P, vasoaktiv intestinal peptid, gastrin, somatostatin såvel som andre er velkendte for at bevirke frigørelsen af histamin fra mast-celler. Disse celler forefindes i mange væv som 25 f.eks. hud, lunge og mesenteriet, gingiva og lignende. De fleste celler har granuler, der indeholder histamin og andre mediatorer for inflammation, der kan blive frigjort af peptider til at forårsage capillær dilatering og forøget vaskulær permeabilitet. Da det blev bemærket, at en 30 antagonist af LHRH, f.eks. [Ac-D-2-Nal1, D-4-F-Phe", D-

Trp3, D-Arg6]-LHRH, bevirkede ødem i ansigtet og i ekstremiteterne, når forbindelsen blev administreret til rotter, forekom det sandsynligt, at sådanne antagonister, dersom de administreredes til mennesker som et kontracep- 2 DK 173753 B1 tivt middel, ville forårsage alvorlige ødemer i ansigtet og andre steder i det menneskelige legeme. Sådanne be-virkninger ville sandsynligvis forhindre administrering af disse antagonister til mennesker.

5

Den histaminholdige leukocyt er en basofil, der også kan frigøre histamin, når en stimuleres af mange af de samme peptider nævnt ovenfor. Basofiler er forskellige biokemisk fra mast-celler, og sådanne forskelle kan muliggør 10 både forudsigelig og ikke-forudsigelig histaminfrigørelse som respons på antagonister af LHRH. En antagonist af LHRH, der skal anvendes klinisk til at forhindre ovule-ring, bør ikke signifikant frigøre histamin fra hverken mast-celler eller basofiler.

15

Opdagelsen af bivirkningerne som f.eks. de ødematogene og anaphylactoide virkninger af LHRH antagonister har gjort det ønskeligt at finde hidtil ukendte LHRH antagonister, der forhindrer ovulering, men ikke frigør signifikante 20 mængder af histamin. Disse uønskede bivirkninger er blevet observeret hos rotter, og det er højst sandsynligt, at Food and Drug Administration ikke ville tillade en undersøgelse af sådanne antagonister hos mennesker.

25 Karten et al., (4) har foretaget en oversigt over tilgængeligt kendskab med hensyn til de strukturelle karakteristika for kraftig histaminfrigørelse af antagonister af LHRH. Nogen af de vigtigste fund er følgende. En særdeles kraftig LHRH antagonist til at udvirke histaminfrigørelse 30 in vitro indebærer en kombination af stærke basiske D-aminosyrekæder (Arg eller Lys) ved stilling 6 og tæt på Arg* og en klynge af hydrofobe aromatiske aminosyrer ved N-endestillingen. Der er således ingen specifik aminosyre blandt de 10 aminosyrer, der alene er ansvarlig for hist- 3 DK 173753 B1 aminfrigørelse. Tværtimod gentager de strukturelle træk, der ligger fra N-endestillingen (aminosyrerne i de første få positioner, 1-4, osv.) og basiske aminosyrer mod C-en-destillingen (stillinger 6 og 8) på en eller anden måde i 5 histaminfrigørelse. Selv D-Ala i stilling 10 har nogen indflydelse på histaminfrigørelse, men årsagen hertil er uklar. I sig selv er to basiske sidekæder tæt ved, som i stillinger 6 og 8, utilstrækkelige alene til at tildele høj frigørelse af histamin. Klyngen af hydrophobe amino-10 syrer ved N-endestillingen er utilstrækkelig alene for at udvirke høj histaminfrigørende virkning. Selv et hexapep-tidfragment har afsløret moderat histaminfrigørende aktivitet. Der synes ikke at være nogen korrelation mellem antioTOlær aktivitet og histaminfrigørelse af disse anta-15 gonister, in vitro.

Generelt kan meget af hele kæden af disse decapeptidanta-gonister have indflydelse på histaminfrigørelse. Det samme synes at gælde, men i anden målestok, for høj antiovu-20 latorisk virkning. Disse LHRH antagonister er sædvanligvis decapeptider, hvilket viser, at der er ti variable til at indstille for en ønsket anti-ovulatorisk virkning og 10 variable, til at indstille for at fjerne histaminfrigørende virkning. Der er endog yderligere variationer 25 for hver af disse 20 variable, hvorved antallet af mulige peptider, der skal opbygges, syntetiseres og undersøges bliver fuldstændig uberegnelig. Sandsynligvis kan visse af de 10 variable være uafhængig med hensyn til anti-ovulatorisk virkning og histaminfrigørende virkning, medens 30 visse variable kan overlappe med hensyn til disse to biologiske aktiviteter. Denne situation bevirker at ekstraordinære vanskeligheder skal løses inden man kan fremstille en antagonist med høj aktivitet med hensyn til an- ti-ovulering og meget lav aktivitet med hensyn til hist aminfrigørelse .

4 DK 173753 B1

Forskellige strukturelle ændringer og kombinationer af de 5 10 aminosyrer efterfulgt af undersøgelser for både anti- ovulerings- og histaminfrigørende virkninger kunne udføres idet håb, at en kraftig antagonist i det væsentlige uden bivirkninger kunne opdages. Syntesen af nye aminosyrer til indførsel i decapeptidkæderne kunne også undetsø-10 ges nærmere, da almindelige tilgængelige aminosyrer ikke ville være tilstrækkelige.

Den foreliggende opfindelse vedrører således en LHRH-antagonist med i hovedsagen antiovulatorisk aktivitet og 15 negligerbar histaminfrigørelsesaktivitet som er et decapeptid, som er særegen ved, at (a) arginin og dets derivater ikke udnyttes, (b) lysin i position 5 og/eller 6 er konverteret til 20 derivater med acylgrupper på e-amino gruppen, og (c) i position 8 er indeholdt en alkyleret lysin eller ornithin.

I antagonisterne ifølge opfindelsen blev ikke anvendt arginin og derivater heraf. Lysin blev omdannet til deriva 25 ter med acylgrupper eller med alkylgrupper på E-amino-gruppen. Aminosyren ornithin blev acyleret eller alkyleret på d-arainogruppen. Både L- og D-formerne af lysin og L-formen af ornithin blev anvendt ved syntesen af disse acyl- og alkylderivater. Strukturelt beslægtede mellem-30 produkter blev også syntetiseret. Alt ialt blev mange hidtil ukendte peptider syntetiseret ud fra de fundamentale og minimale oplæg på 10 variable for anti-ovulerende virkning og 10 variable for histaminfrigørelse, som kan 5 DK 173753 B1 være uafhængige eller delvis overlappende. På en sådan basis bliver antallet af sådanne peptider, der kan designes, overvældende, og enhver som helst fornuftig begrundelse bør tages i bestragtning for at reducere det antal 5 peptider, er skal syntetiseres, idet håb, at man kan realisere en ny opfindelse.

Visse peptider blev syntetiseret, undersøgt og viste sig at være fordelagtige peptider. Blandt disse ønskede pep-10 tider var følgende to.

[N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, NicLys5, D-NicLys6, ILys", D-Ala1'') -LHRH var effektiv til at forhindre ovule-ring og frigjort bemærkelsesværdig lidt histamin.

15 [N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, PicLys5, D-PicLys6,

Ilys8, D-Ala1"]-LHRH var dobbelt så aktiv som ovennævnte peptid og frigjorde ikke mere histamin, end "superagonisterne" af LHRH, der for øjeblikket markedsføres af ad-20 skillige farmaceutiske fabrikanter.

Disse to hidtil ukendte peptider, og herudover yderligere beslægtede peptider beskrevet i foreliggende beskrivelse med krav tilvejebringer acceptabel balance mellem høj an-25 ti-ovulerende virkning og lav histaminfrigørelse til fuld potentiel klinisk udnyttelse.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer således deca-peptider med antiovulerende virkning og med en minimal 30 histaminfrigørende virkning. Disse decapeptider omfatter således:

Ser4, PicLys5 og D-PicLys6; 6 DK 173753 B1 N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, Ser4, D-PicLys5 og Pro5; N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, Ser4, D-PicLys6, Prolog D-Ala10.

5 N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, Ser4, NicLys5, Pro9og D-Ala10; N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, Ser4, Leu7, Pro9 og D-10 Ala10; N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, Ser4, Leu7, Pro9 og D-Ser10; 15 N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, Ser4, Leu7, Pro9 og Ser10; D-PclPhe2, Pro9 og D-Ala10; 20 D-PclPhe-’, Pro5 og Ser10; N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, NicLys5, D-NicLys6, I Lys9 og D-Ala10; 25 N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe:, D-3-Pal3, NicLys5, D-NicLyss,

Hys" og D-Ala1'·1; N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, PicLys5, D-PicLys6, ILys8 og D-Ala10; 30 N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, NicLys5, D-NicLys5, IOrrr og D-Ala10; Ί DK 173753 B1 N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, PicLys5, D-PicLys6, IOrn* og D-Ala10; N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, MNicLys5/ D-MNicLys6, 5 IOrn* og D-Ala10; N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, PzcLys5, D-PzcLys6, IOrn* og D-Ala1'·'; 10 N-Ac-D-pClPhe1, D-3-Pal2, Tyr5, D-NicLys6 og ILys8; N-Ac-D-Cl-Phe1, D-3-Pal3, Tyr5, D-NicLys6 og ILys®/ acyleret Lys5, D-acyleret Lys6 og N-alkyleret diamino-15 syre®;

NicLys5, D-NicLys6 og ILys8;

PicLys5, D-PicLys6 og ILys8; 20

NicLys5, D-NicLys6 og IOrn8;

PicLys5, D-PicLys6 og IOrn8; 25 MNicLys5, D-MNicLys6 og IOrn8;

PzcLys5, D-PzcLys6 og IOrn8;

Tyr5, D-NicLys6 og ILys8; 30

Tyr5, D-NicLys6 og IOrn8; N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, Ser4, NicLys5, cis D-NicLys6, Leu7, ILys®, Pro9 og D-Ala1 PNH2; 8 DK 173753 B1 N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal2, Ser4, PicLys5, cis D-PzACAla6, Leu7, ILys8, Pro9 og D-Alau>NH.;; 5 Herudover tilvejebringer opfindelsen præparater omfattende decapeptider til frembringelse af hæmning af ovulering hos et dyr. Dette opnås ved til dyret at administrere et decapeptid, fortrinvis med formlen: N-Ac-D-2-Nal1, D- pClPhe2, D-3-PalJ, Ser4, NicLys5, D-NicLys5, Leu7, ILys8, 10 Pro3 og D-AlaluNH2. Ligeledes kan præparaterne anvendes til at hæmme ovulering hos et dyr; til at hæmme start af pubertet hos et dyr; til at hæmme den seksuelle impetus hos et dyr; til at ændre den gonadale funktion hos et dyr; til at hæmme væksten af hormon-afhængige tumorer hos 15 et dyr og til at sænke LH og FSH niveauerne i serum hos post-menopausale kvinder.

Opfindelsen beskrives nærmere i det efterfølgende.

20 Forkortelser og formler anvendt i det efterfølgende er angivet nedenfor: a = alpha BOC = t-butoxycarbonyl 25 Br-Z = o-brombenzyloxycarbonyl nBuOAc = n-butylacetat n-BuOH = n-butanol c = cis CDClj = deuterochloroform 30 CHC1· = chloroform CH;Cl2 = dichlormethan CHjCN = acetonitril

Cl-Z = o-chlorbenzyloxycarbonyl d = delta 9 DK 173753 B1 DCC = dicyclohexylcarbodiimid DIEA = diisopropylethylamin DMF = dimethylformamid E = eta 5 Et = ethyl

EtOAc = ethylacetat

EtOH = ethanol

Et-0 = diethylether HF = hydrogenfluorid 10 HOAc = eddikesyre KH;PC>4 = kaliumdihydrogenphosphat

MeOH = methanol

MgSOj = magnesiumsulfat NH4OAc = ammoniumacetat 15 iPrOH = 2-propanol py = pyridin t = trans TFA = trifluoreddikesyre THF = tetrahydrofuran 20 TOS = p-toluensulfonyl m = micro Z = benzyloxycarbonyl

Abu = 2-aminosmørsyre 25 Aile = alloisoleucin

AnGlu = 4-(4-methoxyphenylcarbamoyl)-2-aminosmørsyre

BzLys = NE-benzoyllysin

Cit = citrullin

Cl;Phe = 3,4-dichlorphenylalanin 30 CypLys = NE-cyclopentyllysin DMGLys = NE-N,N-dimethylglycyl)lysin

Dpo = NJ-(4,6-dimethyl-2-pyrimidyl)ornithin

EtjhArg = N'3, N'3-diethylhomoarginin FPhe = A-fluorphenylalanin 10 DK 173753 B1 HOBLys = NE-(4-hydroxybenzoyl)lysin Hys = NE-isopropyllysin INicLys = NE-isonicotinoyllysin IOrn = N^-isopropylornithin 5 Me.jArg = Nc',N'3,N*1-trimethylarginin

Me^Lys = NE,NE-dimethyllysin MNicLys = Ne-(6-methylnicotinoyl)lysin MPicLys = NE-(6-methylpicolinoyl)lysin NACAla = 3(4-nicotinoylaminocyclohexyl)alanin 10 2-Nal = 3-(2-naphthyl)alanin

NicLys = NE-nicotinoyllysin

NicOrn = N'-nicotinoylornithin

Nle = norleucin, 2-aminohexansyre NMeLeu = N-methylleucin 15 Nval = norvalin, 2-aminopentansyre 3-Pal = 3-(3-pyridyl)alanin pCIPhe = 3-(4-chlor)phenylalanin

PicLys = NE-picoloyllysin

Pip * piperidin-2-carboxylsyre 20 PmcLys = Νε-(4-pyrimidinylcarbonyl)lysin

PmACAla = 3 [ 4 (4- pyrimidinylcarbonyl)aminocyclohexyl]alanin PzACAla = 3(4-pyrazinylcarbonylaminocyclohexyl)alanin 3-PzAla = 3-pyrazinylalanin 25 PzcLys = NE-pyrazinylcarbonyllysin

Sar = N-methylglycin

TinGly = 3-thienylglycin

De fleste naturlige aminosyrer blev indkøbt fra Peninsula 30 Laboratories, San Carlos, CA. Hydroxylgruppen af Ser blev beskyttet som benzyletheren, den phenoliske hydroxylgrup-pe af Tyr som Br-Z derivatet og E-aminogruppen af Lys som Cl-Z derivatet, guanidinogruppen af Arg og imidazolgrup-pen af His som TOS derivaterne, a-aminofunktionen blev 11 DK 173753 B1 beskyttet som BOC-derivatet. BOC-Orn(Z) blev indkøbt fra Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. BOC-D-2-Nal, BOC-D-3-Pal, BOC-D-Cl_Phe,, BOC-pCIPhe og BOC-ILys(Z) dicyclo-hexylaminsalt blev leveret af Southwest Foundation for 5 Biomedical Research, San Antonio, TX. Benzhydrylaminhy-drochloridharpiksen blev leveret af BeckmanBioproducts,

Palo Alto, CA. Nitrogenindholdet var ca. 0,65 mmol/g.

CH_C1- blev destilleret inden anvendelsen.

10 Den foreliggende opfindelse tilvejebringer opbygning, syntese og anvendelse af LHRH antagonister med høj anti-ovulerende aktivitet og formindsket aktivitet med hensyn til frigørelse af histamin (1). Disse hidtil ukendte antagonistiske træk er f.eks. D-NE-nicotinoyllysin (D-15 NicLys) i stilling 6 og NE-isopropyl lys in (Hys) i stilling 8. Opløsningen af D-Arg6, specielt i kombination med Arg8 og en klynge af hydrophobe aromatiske aminosyre-rester ved N-endesstillingen har være impliceret i frigørelsen af histamin (2-4).

20

Andre reduktioner af anaphylactoid aktivitet blev opnået ved at øge afstanden mellem positive ladninger i stillinger 6 og 8 hos Arg5 og ved inklusion af en neutral rest i stilling 6 som i [N-Ac-D-2-Nal1, D-pCIPhe2, D-3-Pal3, 25 Arg5, D- (4-p-methoxybenzoyl) -2-aminosmørsyre6, D-Ala1''] -LHRH (2-Nal repræsenterer 3-(2-naphthyl) alanin; PClPhe repræsenterer 3(4-chlorphenyl)alanin; 3-Pal repræsenterer 3(3-pyridyl)alanin) af Rivier et al., (5) og [N-Ac-D-2-Nal1, D-aMepClPhe2, D-Trp3, Arg5, D-Tyr6, D-Ala10]-LHRH 30 (aMepCIPhe repræsenterer 2-methyl-3-(4-chlorphenyl)alanin) af Roeske et al., (6). Yderligere modifikationer i stilling 6 er reduktiv alkylering af D-Lys6 af Hocart et al., (7), inkorporering af Ν,Ν-diethylhomoarginin af Nestor et al., (9). Det cycliske analoge fornylig synte- 12 DK 173753 B1 tiserede af Rivier et al., viste ikke nogen sænkning med hensyn til histaminfrigørelse i forhold til de lige tilsvarende forbindelser (10) .

5 Udfra peptiderne ifølge opfindelsen blev to til at begynde med udvalgt som modeller for yderligere opbygning. Peptidet [N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, NicLys5, D-NicLys6, ILys8, D-Ala10] -LHRH (betegnet Antide) udviste en forbavsende kombination af aktivitet og lav histaminfri-10 gørelse; antiovulatorisk aktivitet (AOA) var 100% ved 1 pg og 36% ved 0,5 pg. ED50 for histaminfrigørelse, in vitro, var vedvarende over 300 pg/uliter i forhold til ca. 0,17 for den stardardanaloge [N-Ac-D-2-Nal1, D-pFPhe2, D-Trp3, D-Arg6]-LHRH (pFPhe repræsenterer 3- (4-15 fluorphenyl)alanin) (5). Anden analog var identisk med Antide bortset fra PicLys5, D-PicLys6, (PicLys repræsenterer N-picoloyllysin); 100% AOA ved 0,5 U9 og 401 ved 0,25 ug; ED*-, 93 + 11.

20 Omfattet heri er resultaterne fra LHRH analoge med acyle-rede aminocyclohexylalaninrester i stilling 6, fra analoge, hvori Leu7 er substitueret med andre neutrale rester, fra en sammenligning af Hys8 i forhold til IOrn8, og fra undersøgelser over peroral aktivitet og varighed af anta-25 gonistvirkning, dersom der administreres peroralt eller parenteralt (subkutant).

Smeltepunkter er ukorrigerede. NMR data er angivet som d-værdier nedenfor TMS.

30

Inden acylering blev Z og Cl-Z grupperne af Lys og Orn spaltet ved hydrogenolyse i MeOH i nærværelse af 10%

Pd/C.

13 DK 173753 B1 BOC-D-BzLys

Blev syntetiseret ved acylering af Boc-D-Lys med benzoyl-chlorid som beskrevet for den L-isomere af Bernardi et 5 al., (17).

BOC-DMG-Lys

Blev fremstillet ved acylering af BOC-Lys med chlorace-10 tylchlorid under anvendelse af den samme metode og omsætning af det urensede produkt fra 10 mmol BOC-Lys i 10 μΐ THF med 10 μΐ 40% vandig dimethylamin. Reaktionsblandingen blev omrørt 15 minutter i isbad og herefter 2,5 timer ved stuetemperatur. Efter inddampning i vakuum blev det 15 urensede produkt opløst i 10 μΐ H-O og påført en Bio-Rad Agl-X8 søjle, acetatform, 1 x 25 cm. Søjlen blev først vasket med 200 μΐ vand, og herefter blev produktet elue-ret med 5% HOAc og lyofiliseret adskillige gange for at fjerne HOAc. Udbytte 60-70%.

20

Amorf masse. Rf (n-BuOH:py:H0Ac:H;0 = 30:10:3:12) = 0,27.

Renhed >95%. NMR (CDCl^) : 1,45, s, 9H, t-butoxygruppe; 1, 85-1,48, m, 6H, B, y, d, 0¾ grupper; 2,6 s, 6H, N (CH;) 3,25, m, 2H, E-CH-; 3,37, s, 2H, N-CHj-CO; 4,15, 25 m, IH, a-CH.

De andre acylerede Lys derivater i tabellen blev fremstillet ud fra BOC-D eller L-Lys og den tilsvarende p-ni-trophenylester.

30 p-Nitrophenylnicotinat.

Til 9,85 g , 80 mmol, nicotinsyre og 13,35 g, 96 mmol p-nitrophenol i 250 μΐ DMF blev sat 16,5 g, 80 mmol DCC un- 14 DK 173753 B1 der omrøring i isbad. Efter 1 timer ved 0 °c og 3 timer ved stuetemperatur blev urinstoffet frafiltreret, og produktet blev udfældet ved tilsætning af samme rumfang vand. Filtrering, tørring i vakuum og omkrystallisation 5 med i-PrOH gav 11,22 g, 57% hvide nåle med smp. 172,5-173 °C (24) .

p-nitrophenylisonicotinat.

10 Forbindelsen blev fremstillet på samme måde, 12 g, 61%, smp. 139-141 eC , smp. 137-139 °C (18).

Også p-nitrophenyl-6-methylnicotinat blev fremstillet pasamme måde. Udbyttet fra 70 mmol 6-methylnicotinsyre: 15 6,0 g, 33% efter omkrystallisation med MeOH. Smp. 156-157 °C . Rf (2% MeOH i CHC13) = 0,57 NMR (CDC13) : 2,7, s, 3H, CHv; 7,36, d, IH, py H5; 7,45, m, 2H, H nabostillet til oxygenet i phenylringen; 8,34, m, 3H, H nabostillet til NO:-gruppen i phenylringen overlappende me py H4; 9,2, d, 20 IH, py H-.

P-nitrophenylpicolinat.

4,92 g, 40 mmol, picolinsyre og 5,84 g,, 42 mmol p-nitro-25 phenol blev opslæmmet/opløst i 200 pi CH^Cl;. Herefter blev 8,24 g, 40 mmol, DCC tilsat i 20 pi CHrCl; under kraftig omrøring. Omrøringen blev foretaget ved stuetemperatur i 17 timer. Herefter blev blandingen filtreret, og filterkagen blev vasket med 30-40 pi CH^Cls. Det uren-30 sede produkt blev først behandlet med 100 pi Et^O under omrøring i isbad og filtreret. Omkrystallisation med 250 pi i-PrOH gav 6,24 g, 63% produkt. Smp. 154-156 °C (de-komponering). Smp. 145-17 °C (18).

15 DK 173753 B1

Pyrazincarboxylsyre p-nitrophenylester.

Denne forbindelse blev fremstillet på samme måde som den ovenfor beskrevne forbindelse. Ud fra 40 mmol pyrazin-5 carboxylsyre og 44 mmol p-nitrophenol blev opnået 35,2 mmol, 88%, ester. Smp. 180-182 °C (dekomponering),

Rf (CHClj: MeOH = 49:1) = 0,72. NMR (CDCI3) : 7,5, m og 8,37 m, 2H hver, hydrogener nabostillet til henholdsvis oxygen- og nitrogruppen i phenolringen; 8,84, m, IH, pyrazin 10 H5; 8,9, d, IH, pyrazin H6; 9,48, d, IH, pyrazin H3.

BOC-NicLys.

2,5 g BOC-Lys (L eller D) blev opslæmmet i 200 μΐ DMF un-15 der omrøring. Herefter blev 1,1 ækvivalent p-nitrophenyl-nicotinat tilsat, og blandingen blev omrørt 36 timer ved stuetemperatur. Dernæst blev blandingen filtreret, og filtratet blev inddampet til tørhed under reduceret tryk til opnåelse af en gul olie. Remanensen blev omrørt ved 2 20 x 50 μΐ Et;0 i isbad. Den første Et20 fase blev dekanteret, den anden blev frafiltreret. Omkrystallisation ved Et^O/hexaner gav 2,05 g produkt, 58% (L-form) . Smp. 138 °C , lit. (17) 138-141 °C. L-form [a] 20/D = -2,910(MeOH), D-form [a]20/D = 3,350 (MeOH).

25 L- og D-BOC-INicLys

Blev fremstillet på samme måde ved at acylere 10 romol L eller D BOC-Lys med p-nitrophenylisonicotinat i 100 μΐ 30 DMF, 40 timer, stuetemperatur. Det urensede produkt blev udrystet mellem 120 μΐ EtOAc og 50 μΐ H^O. EtOAc fasen blev ekstraheret med 2 x 50 μΐ H;0 og 50 μΐ saltvand. Den oprindelige vandige fase blev ekstraheret tilbage med 30 μΐ EtOAc. De forenede EtOAc faser blev herefter tørret 16 DK 173753 B1 (MgSOJ og inddampet, og remanensen blev behandlet med Et;0 og omkrystallseret som beskrevet ovenfor til opnåelse af 1,07 g BOC-L-INicLys, 30,5%. Udbyttet af D-forbin-delsen var 1,26 g, 36%. NMR (Acetone dr·): 1,4, s, 9H, t-5 butoxygruppe; 1,8-1,48, m, 6H, B, y, d, -CHz~f 3,44, t, 2H, E-CH-; 4,13, m, IH, a-CH; 7,77, m, 2H, py H5 og H3; 8,70, m, 2H, py U2 og He.

L- og D-BOC-PicLys 10 l, 23 g, 5 mmol, L- eller D-BOC-Lys blev omrørt med 1,34 g, 5,5 mmol, p-nitrophenylpicolinat i 60 μΐ DMF i 16 timer. Efter filtrering og inddampning blev produktet renset ved søjlekromatografi på silicagel på en 4,5 x 32 cm 15 søjle og opløsningsmiddelsystemet n--BuOH:py :HOAc:H^O = 30:10:3:12. Produktet blev efter kromatografi opløst i EtOAc og vasket med H^O, saltopløsning, tørret og inddampet i vakuum. Udbytterne var sædvanligvis 60-70%. NMR (CDClv) : 1,43, s, 9H, t-butoxygruppe; 1,73-1,45, m, 6H, 20 B, y, d-CH;/ 3,47, m, 2H, E-CH:; 4,32, m, IH, a-CH; 7,43, m, IH, py H5; 7,85, m, IH, py H4; 8,2, m, IH, py H3; 8,55, m, IH, py H5.

L- og D-BOC-MNicLys 25 10 mmol, BOC-Lys og 10,5 mmol p-nitrophenyl-6-methylnico-tinat henstod for at reagere i 150 μΐ DMF på sædvanlig måde. Efter 27 timers forløb gav filtrering og inddampning en gul olie. Et:0 behandling {2 x 50 μΐ) gav 3,3 g 30 forbindelse, der blev omkrystalliseret med 50 μΐ 20% MeOH i EtOAc/hexan. Udbytte 2,87 g, 78,6% (L-form). Rf (n-BuOH:py:HOAc:HcO = 32:10:3:12) = 0,61. NMR (CDCl*) : 1,46, s, 9H, t-butoxygruppe; 1,9-1,5, m, 6H, B, y, d-CH~; 2,57, s, 2H, py CH3; 3,36 m, 2H, E-CH_v 4,11, m, IH, a-CH; 17 DK 173753 B1 1,22, m, IH, py H5; 8,08, m, IH, py H4; 8,95, bred, s, IH, py H-.

L- og D-BOC-PzcLys 5

Under anvendelse af ovennævnte metode blev opnået ud fra 7,7 mmol pyrazincarboxylsyre p-nitrophenylester og 7 mmol BOC-Lys, L eller D, i 100 μΐ DMF ca. 6 mmol produkt efter omkrystallisation med iPrOH. Rf (n-Bu0H:py:H0Ac:H;0 * 10 30:10:3:12) = 0,47. NMR (CDC13) : 1,45, s, 9H, t-butoxy- gruppe; 1,9-1,48, m, 6H, B, y, d-CH;,· 3,51, m, 2H, E-CHj, 4,29, m, IH, a-CH; 8,52, q, IH, pyrazin H5; 8,77, d, IH, pyrazin H6; 9,41, d, IH, pyrazin H3.

15 BOC-L-NicOrn

Denne forbindelse blev fremstillet på sædvanlig måde ved at omsætte 7 mmol p-nitrophenylnicotinat med 5 mmol BOO Orn i 75 μΐ DMF i 36 timer. Inddampning og omkrystallisa-20 tion med EtOAc gav 3,5 mmol, 70%, NicOrn, smp. 143-144 °C . Rf (n-BuOH:py:HOAc:H;0 = 4:1:2) = 0,70. NMR (CDCI3) : 1,45, s, 9H, t-butoxygruppe; 7,46 m, IH, pyH5; 8,27, m, IH, py H4; 8,69, m, IH, py He; 9,05, m, IH, py H2.

25 BOC-D-trans-NACAla 1,43 g, 5 mmol, BOC-D-trans-3(4-aminocyclohexyl)alanin (leveret af Southwest Foundation for Biomedical Research) blev omrørt med 1,35 g, 5,5 mmol, p-nitrophenylnicotinat 30 i 60 μΐ DMF i 120 timer ved stuetemperatur. Herefter blev blandingen filtreret, inddampet, behandlet med Et^O i is bad og atter filtreret. Omkrystallisation blev foretaget ved opvarmning i 12 μΐ EtOH og tilsætning af 18 μΐ varm H_0. Dette frembragte en klar opløsning, hvor krystaller 18 DK 173753 B1 udskilte ved afkøling. Denne behandling blev gentaget 2 gange. Udbytte: 0,98 g, 50%. Renhed >95%. Smp. >220 °C.

NMR(DMSO d5) : 1,46, s, 9H, t-butoxygruppe; 1,9-1,48, m, 1 IH, ring CH;; ring CH i stilling 1 og B-CH^; 3,72 m, IH, 5 ring CH i stilling 4; 3,95, m, IH, a-CH; 7,48, m, IH, py H5; 8,16, m, IH, py H4; 8,67, m, IH, py H6; 8,96, m, IH, py H:.

BOC-D-cis-NACAla 10 5 mmol BOC-D-cis-3(4-aminocyclohexyl)alanin (leverandør: som ovenfor) og 5,5 mmol p-nitrophenylnicotinat henstod for at reagere i DMF som angivet ovenfor. Reaktionstid: 25 timer. Rensning blev opnået ved EtcO behandling som 15 ovenfor og silicagelkromatografi på et 4,5 x 32 cm søjle under anvendelse af opløsningsmiddelsystemet CHCl3:MeOH:py:HOAc = 75:10:10:5. Udbytte 1,3 g, 61%, amorf pulver. Rf(søjlesystem) = 0,58. NMR (CDCI3) : 1*44, s, 9H, t-butoxygruppe; 1,95-1,45, m, 11H, ring CH;,· ring 20 CH i stilling 1 og B-CH;; 4,22 m, IH, a-CH; 4,35, m, IH, ring CH i stilling 4: 7, 35, 8,24, 8, 63 og 8,98, IH hver, fastsættelse som tidligere forbindelse.

BOC-IOrn(Z) 25

Denne forbindelse blev fremstillet ud fra BOC-Orn(Z) ved reduktiv alkylering med acetone og H;/Pd som beskrevet af Prasad et al., (23) efterfulgt af omdannelse til Nd-Z derivatet med benzylchloroformiat i vandig alkali (Schot-30 ten-Baumann betingelser). Rensning blev opnået ved kromatografi på silicagel med CHCl^/MeOH 85:15. Rf (CHCl2;MeOH:HOAc = 85:15:3) = 0,8. NMR (CDClj) : 1,10, s, 6H, isopropyl CH2; 1,40, s, 9H, t-butoxygruppe; 1,7-1,5, 19 DK 173753 B1 m, 4H, B, y-CH:·; 3,09 m, 2H, d-CH;; 4,2 m, IH, a-CH; 5,10, s, 2H, benzyl CH:; 7,3, m, 5H, aromater.

BOC-CypLys(Z) 5 2,04 g BOC-Lys(Z) blev opløst i 8 μΐ cyclopentanon og 32 μΐ H:0 indeholdende 0,22 g NaOH. Hydrogenering blev udført i nærværelse af 0,4 g 10%Q Pd/C ved 50-60 psi i et Parr-apparat. Efter 4 timers forløb blev hydrogeneringen 10 afbrudt, og 2 μΐ 0,5 M NaOH og 10 μΐ MeOH blev tilsat. Herefter blev hydrogeneringen fortsat i 16 timer ved 50-60 psi. Herefter blev filtreret og inddampet. Remanensen blev opløst i 75 μΐ H;0, og den vandige fase blev ekstraheret tre gange med Et;0 og en gang med hexan. pH blev 15 indstillet til 6-7 med HCl, og opløsningen blev inddampet på en roterende inddamper, badtemperatur 40 °C. Det fremstillede produkt blev herefter omdannet til Z-derivatet under anvendelse af benzylchlorformiat i vandig NaOH (Schotten-Baumann betingelser). Udbytte: 1,3 g, ialt 58%.

20 R.- (n-BuOH:py:HOAc:H;0 = 30:10:3:12) = 0,69. Renhed >95%.

NMR (CDCI3) : 1,45, s, 9H, t-butoxygruppe; 1,95-1,35, m, 14H, ring, CH: + B, y, d-CH^; 3,13, bred t, 2H, E-CH;, 4,34-4,05, m, 2H, a-CH + ring CH; 5,13, s, 2H, benzyl CH^; 7,35, s, 2H, benzyl CH-; 7,35, m, 5H, aromatiske 25 protoner.

Boc-Me-Lys, D- og L-

Disse forbindelser blev fremstillet ved hydrogenolyse af 30 de tilsvarende Z- eller Cl-Z-derivater i nærværelse af 37% formaldehyd i det væsentlige som beskrevet af L. Be-noiton (22) for den Na-acetylanaloge. Rensning blev opnået ved kromatografi på silicagel med opløsningsmiddelsystemet n-BuOH:py:H;0 = 2:1:1. Udbytterne er 40-65%, og 20 DK 173753 B1 produkterne er amorfe. NMR (CDClj) : 1,41, s, 9H, t-but-oxygruppe; 1,9-1,5 m, 6H, B, y, d-CHc; 2,6, s, 6H, N(CH3):; 2,8, m, 2H, E-CH:; 4,03, m, IH, a-CH.

5 Boc-D-AnGlu 0,62 g, 3 mmol, DCC blev sat til den isafkølede opløsning af 1,10 g, 3 mmol, BOC-D-glutaminsyre a-benzylester og 0,39 g, 3 mmol, p-anisidin i 25 μΐ CHiCl;. Reaktionsblan-10 dingen blev omrørt medens temperaturen steg til stuetemperatur og herefter yderligere 17 timer. Dicyclohexyl- urinstoffet blev herefter frafiltreret og CHCI3 blev sat til til ialt 125 μΐ. Denne opløsning blev ekstraheret med 2 x IN H^SO^, H;0, mættet NaHCOj, 2 x H;0 og tørret 15 (MgSO^) . Inddampning og omkrystallisation med EtOH gav 0,99 g, 74¾ produkt med smp. 129,5-131 °C . Rf (4% MeOH i CHClj) = 0,53. Dette produkt blev opløst i 30 μΐ MeOH og 10 μΐ EtOH og hydrogeneret i nærværelse af 0,3 g Pd/C ved 50 psi i 2,5 timer. Filtrering og inddampning gav et 20 kvantitativt udbytte af Boc-D-AnGlu. Ikke krystallinsk.

Renhed >98%. NMR (CDClj) : 1,45, s, 9H, t-butoxygruppe; 2,35-1,95, m, 2H, B-CH:; 2,6-2,4, m, 2H, y-CH;; 3,76, s, 3H, OCH3; 4,3, m, IH, a-CH; 6,82 og 7,42, bred, d, 2H hver aromatiske protoner.

25 BOC-MejArg Først blev Ν,Ν,Ν',S-tetramethylisothiourinstof fremstillet som beskrevet af Lecher and Hardy (19). Kogepunkt (15 30 mm) = 74 ®C , lit.(ovenfor) 68 °C ved 11 mm. BOC-Orn, 9 mmol og tetramethylisothiourinstof, 10 mmol blev opløst i 15 μΐ DMF og 2 μΐ triethylamin og inkuberet ved 100 °C i 2 timer og ved stuetemperatur i 10 timer. Herefter blev reaktionsblandingen inddampet til tørhed og hældt gennem 21 DK 173753 B1 en silicagelsøjle, der blev elueret med iPrOH:triethyl-amin:H;0 = 42:6:13. Det opnåede hvide faste materiale blev opløst i H:0, og opløsningen blev syrnet med 6 N HC1 og lyofiliseret til opnåelse af 5,5 mmol produkt.

5 Rf (søjleeluant) = 0,50. NMR (D;0): 1,42, s, 9H, t-butoxy-gruppe, 2,80, m, IH, a-CH; 2,89, s, 3H, CHj på guanidino-gruppe; 2,96, s, 6H, (CHj):N; 3,25, t, 2H, d-CH:; 1,50, m, 4H, B, y-CH2.

10 BOC-Dpo

Ud fra 10 mmol argininhydrochlorid og 1,72 g natriumhy-drogencarbonat opløst i 17 μΐ H20, 28,6 μΐ acetylacetone og 28,6 μΐ EtOH blev opnået 7,5 mmol Dpo ved at følge me-15 toden beskrevet af F.-S. (20). Herefter blev produktet omdannet til det tilsvarende BOC-derivat under anvendelse af di-t-butyl-dicarbonat i 50% vandig dioxan i nærværelse af natriumhydroxid. Denne reaktion skred frem i det væsentlige med kvantitativt udbytte. Rf (nBu0H:H0Ac:H20 = 20 4:1:2) = 0, 63. NMR (CDCI3) : 1,45, s, 9H, t-butoxygruppe; 1,9-1,5, 4H, B, y-CH2; 2,33, s, 6H, CH3; 3,46, m, 2H, d-CH:·; 4,24, m, IH, a-CH; 6,35, s, IH, aromatisk H. L- og D-former reagerer på samme måde.

25 BOC-D-Et2hArg

Denne forbindelse blev fremstillet som beskrevet af Nestor and Vickery, USA patentskrift nr. 4 530 920.

R:- (nBuOH:HOAc:H20 « 4:1:2) = 0,52.

30

Syntese af peptider

Peptiderne ifølge opfindelsen blev syntetiseret ved hjælp af fastfasemetoden under anvendelse af en Beckman Model 22 DK 173753 B1 990 peptid syntesemaskine. (1, 11) . Benzhydrylaminhydro-chloridharpiksen (BHA-harpiks) blev anvendt som en fast understøttelse. Programmet for syntesemaskinen var opdelt i to underprogrammer.

5 1. Fjernelse af beskyttelse: 1. CH^Cl- (2 x vask, 1 eller minutter); 50% TFA i CH2C1: indeholdende 0,1% indol (1 x vask, 1 eller 2 minutter); 3. 50% TFA i CH-Cl; indeholdende 0,1% indol (fjernelse af beskyttelse, 20 minutter); 10 4. CH:C1:· (2 x vask).

2. Neutralisering: 1. CHcCl- (2 x vask, 1 eller 2 minutter); 2. DIEA (10% i CHcCl;) (2 x vask, 1 eller 2 minutter); 3. DIEA (10% i CH^Cli) (neutralisering, 5 minut- 15 ter); 4. CH:C12 (2 x vask, 1 eller 2 minutter).

3. DCC kobling: 1. CH:C12 (2 x vask, 1 eller 2 minutter); 2. Aminisyreopløsning i CHcC12 (anbringelse, overførsel, mix, 5 minutter); 3. DCC (10% i CH-Cl:) (anbringelse og 20 mix, 180 minutter); 4. CH-Cl; (2 x vask, 1 eller 2 minutter) .

4. Aktiv esterkobling: ikke anvendt.

25 5. Slutvask: 1. CH2C12 (2 x vask, 1 eller 2 minutter); 2.

i-PrOH (3 x vask, 1 eller 2 minutter); 3. DMF (3 x vask, 1 eller 2 minutter); 4. CH;C12 (3 x vask, 1 eller 2 minutter) .

30 6. Vask efter TFA behandling: 1. CH2C12 (2 x vask, 1 el ler 2 minutter); 2. i-PrOH (2 x vask, 1 eller 2 minutter) ; CH:C1- (3 x vask, 1 eller 2 minutter) .

23 DK 173753 B1 7. Acetylering: 1. CH-Cl: (2 x vask, 1 eller 2 minutter)/ 2. 25% AcsO og Py i CH2CI2 (1 x vask, 1 eller 2 minutter); 3. 25% AczO og Py i CH;Cl2 (acetylering, 20 minutter) 4.

CH.C1; (2 x vask, 1 eller 2 minutter).

5

Den første aminosyre blev fastgjort til harpiksen ved hjælp af programsekvensen 2-3-5. Inden anbringelse af harpiksen i reaktionsbeholderen, blev harpiksen vasket ved skilletragt med 25 μΐ CH^Cl^/g harpiks for at fjerne 10 fine partikler. Ved alle koblinger blev sædvanligvis anvendt en 3-4 fold overskud af Boc-aminosyren i forhold til nitrogenindholdet af harpiksen. Denne metode resulterede sædvanligvis i en fuldstændig kobling. Dersom man så en positiv ninhydrinfarvereaktion, blev udført en anden 15 kobling (programsekvens 3-5). Herefter blev harpiksen acetyleret (programsekvens 7-5).

Den næste aminosyre blev fastgjort ved hjælp af programsekvensen 1-6-2-3-5. Til DCC kobling blev alle aminosyrer 20 opløst i CH^Cl;. Acetylering af aminosyreresten i stilling 1 blev udført under anvendelse af programsekvensen 1-6-2-7-5. Rumfanget af opløsningsmidlerne og reagenserne anvendt til vask og udførslen af de kemiske reaktioner var ca. 10 μΐ/g harpiks.

25

Spaltning af peptiderne fra harpiksen

Efter at alle aminosyrerne var blevet koblet tørredes peptidharpiksen natten over i vakuum. Derefter blev har-30 piksen behandlet med dobbeltdestilleret flydende hydrogenfluorid (10 μΐ/g harpiks) indeholdende 10-25% destilleret anisol eller p-cresol i 1 time ved 0 °C. Herefter blev HF afdampet under reduceret tryk, og remanensen blev tørret natten over i vakuum med en oliepumpe. Derefter 24 DK 173753 B1 blev blandingen ekstraheret adskillige gange med Et;0 (25 μΐ/g harpiks) derefter med vandig HOAc, 30%, 50%, 10% og en gang med 25 μΐ destilleret, afioniseret vand. De forenede vandige opløsninger blev lyofiliseret til opnåelse 5 af det urensede peptid.

Rensning og karakterisering af peptider

De fleste peptider blev renset ved hjælp af siligacelsøj-10 lekromatografi (1 x 60 cm søjle) under anvendelse af opløsningsmiddelsystemerne nBuOH: HOAc: H:-0 = 4:1:2 eller 4:1:5 øvre fase eller nBuOAc:nBuOH:HOAc:H-O = 2:8:2:3 efterfulgt af gelfiltrering over Sephadex G25 med 6% HOAc som elueringsmidlet. I tilfældet af utilfredsstillende 15 renhed efter denne metode blev peptiderne yderligere renset ved semipræparativt HPLC under anvendelse af en Waters væskekromatograf udstyret med en 660 opløsningsmiddelprogrammør. En 1,2 x 25 cm m-Bondapak Ci* søjle anvendtes med opløsningsmiddelsystemet A = 0,1 M NH^OAc pH 20 5, 0 og B = 20% A + 80% CHjCN. Forskellige gradienter af stigende mængder af B i løbet af 15-25 minutter blev anvendt for at rense.

En anden oprensningsmetode var gelfiltrering over Sepha-25 dex G-25 med 6% HOAc efterfulgt af kromatografi over Sephadex LH 20 (2, 5 x 100 cm) med opløsningsmiddelsystemet H^O:nBuOH:HOAc:MeOH = 90:10:10:8. Eventuelt blev sidste metode gentaget 1-2 gange.

30 Peptidernes renhed blev undersøgt ved tyndtlagskromato-grafi på Merck silicagelplader i mindst fire forskellige opløsningsmiddelsystemer som vist i tabel II. Pletterne blev fremkaldt med chlor/o-tolidinreagens. I tabel II er også vist betingelserne og resultaterne af analytisk 25 DK 173753 B1 HPLC. Udstyret var det ovenfor beskrevne bortset fra, at en analytisk m-Bondapak Cie søjle (3,9 rom x 30 cm) blev anvendt.

5 Aminosyreanalyser blev udført på en Beckman model 118 CL aminosyreanalysator. Prøver på ca. 0,5 pg blev hydrolyseret i 6 N saltsyre i forseglede glasrør i 24 timer ved 110 °C . Herefter blev remanensen inddampet og opløst i citratpuffer, pH 2,2 og påført analysemaskinen. Resulta-10 terne er angivet i tabel III.

Bioundersøqelser af peptiderne og diskussion af resultaterne 15 Den antiovulatoriske aktivitet, AOA, i rotter blev bestemt som beskrevet af Humphries et al., (12). Blegneforsøget blev udført ved intradermal indsprøjtning af 10 pg peptid i 100 pi saltvand i bedøvede rotter, måling af det ideelt cirkulære blegnerespons og beregning af arealet.

20 In vitro histaminfrigørelsesforsøg blev foretaget som beskrevet af Karten et al., (4).

Resultaterne af disse bioundersøgelser er angivet i tabel I og andre tabeller i forbindelse hermed.

25

Blandt de 57 peptider i tabel I, havde 21 en AOA på ca.

90¾ eller mere ved en dosis på 1 pg i den foreliggende undersøgelsesmetode. Blande de 37 peptider i tabel 1 undersøgt for histaminfrigørelse i rottemastcelleforsøget 30 havde 10 ED5o værdier på 300 eller mere i forhold til 0,17 for standardforbindelsen [N-Ac-D-2-Nal1, D-4-F-Phe', " D-Trp·2,D-Arg6] -LHRH. Ni yderligere analoge havde EDsovær-dier, der lå fra 86-288, dvs. de frigjorde ikke mere histamin end kliniske anvendte "superagonister".

26 DK 173753 B1

Blande de 37 peptider i tabel 1 undersøgt ved rottemast-celleundersøgelsen havde syv (nr. 4, 23, 24, 43 (Antide), 44, 53 og 55) bade en AOA på ca. 90% eller mere ved 1 yg 5 og en ED5o værdi på ca. _ 8 6 yg/yl. Dette omfatter den kraftige analoge, nr. 53, der havde 100% AOA ved 0,5 yg og 4 0% AOA ved 0,25 yg. ED50 værdien for denne analoge var 93 + 28. Det demonstreredes således, at høj AOA med lav histaminfrigørelse kan findes hos de analoge ifølge 10 opfindelsen.

Strukturelle træk, der er fælles for disse syv peptider, er: 15 1) En D-lys rest i stilling 6, der var acyleret ved den svagt basiske nicotinsyre eller analoge som picolin og 6-methylnicotinsyre.

27 DK 173753 B1 af Arg”, hvilket bevirkede at EDso faldt til 39,2 + 7. Det synes således, at stilling 5 er mere følsom end stilling 8 med hensyn til Arg-substition.

5 I stilling 8 er de alkylerede ILys og IOrn rester bedre end henholdsvis Lys og Orn både med hensyn til AOA og histaminfrigørelse (parrene 3,4 og 6,7). Om ILys* eller IOrn* er bedst synes at være sekvensafhængig.

10 Biologiske aktiviteter

For at bestemme virkningens varighed blev antagonisterne administreret subkutant eller peroralt til 26 dage gamle hunrotter på et forud bestemt tidspunkt inden administre-15 ring af agonisten [D-Qal6]-LHRH. Serumniveauerne af rotte luteiniserende hormon (LH) og rotte follicle stimulerende hormon (FSH) blev herefter målt 2 timer efter agonistad-ministreringen ved RIA. Den peroale administrering blev foretaget ved tvangsfodring med sonder.

20 AOA og histaminfrigørelsesdata

Tabel IV viser resultaterne over AOA og histaminfrigørelse for analoge indeholdende acylerede aminocyclohexylala-25 ninrester. For de analoge med NicLys5, D-NACAla5, IV-1 og IV-2, (NACAla er 3(4-nicotinoylaminocyclohexyl)alanin), er analog 2 med cis-D-NACAla6 noget mere aktiv, 100% i modsætning til 70% AOA ved 1 pg. Analoge IV-7 og IV-8 med NicLys5, D-PzACAla6 (PzACAla er 3(4-pyrazinylcarbonylami-30 nocyclohexyl)alanin) viser modsat aktivitetsorden. Transresterne har højere AOA, 88% i forhold til 25% ved 1 pg.

Analoge IV-3 og IV4 med PicLys5, trans og cis PACAla6 (PACAla er 3 (4-picolinoylaminocyclohexyl) alanin) 28 DK 173753 B1 er lige aktive, henholdsvis 50 og 54% AOA ved 0,5 pg, medens når det drejer sig om PicLys5, trans og cis PzACAla6 er cis-forbindelsen mere end to gange så aktiv. Førstnævnte, analog IV-5 er ca. så aktiv som analogene 5 IV-3 og IV-4 (44% ved 0,5 ug), medens sidstnævnte forbindelse, analog 6, har 100%, 73% og 29% AOA ved henholdsvis 0,5, 0,25 og 0,125 ug. Den højaktive analoge IV-6 er unik i sammenligning med den strukturelt lignende analoge IV-8 med lav aktivitet.

10

Analog IV-9 har cis-PzACAla5, D-PicLys6 og skønt resterne 5 og 6 er omvendte bibeholdt den høje aktivitet af analog IV-6 på 90% og 67% ved henholdsvis 0,5 og 0,25 ug.

15 Med hensyn til histamin frigørelse har alle undersøgte analoge in vitro lavere EDso værdier end stamforbindel-serne. ED50 værdierne ligger fra ca. 30 til ca. 60 i forhold til >300 og 93+11 for Antide og analog V-10. Undersøgelserne over blegnerespons viser et område fra 99,5 20 til 129,6, der svarer til Antide (132,7) og analog V-10 (123,0). Manglen på korrelation mellem de to undersøgelsesmetoder afslører først og fremmest metodevariation.

Kort fortalt bevirkede for de analoge med NicLys5 indar-25 bejdning af aminocyclohexylalaninderivater i stilling 6 i væsentlig stigning i, in vitro, histaminfrigørelse og uændret eller sænket AOA. For de PicLys5 analoge med de samme substitutioner var der sænkning af AOA aktiviteten i alle tilfælde bortset fra et, hvor der observeredes en 30 betydelig stigning. Kombinationen PicLys5 og cis-D-PzACAla6 er klart i besiddelse af en eller anden heldig opbygning. Histaminfrigørelse for PicLYs5 analoge steg med 50-100%.

29 DK 173753 B1 I tabel V er resultaterne fra substitutioner i stilling 7 af analog V-10. Denne stilling muliggør en vis strukturel frihed, skønt ingen af peptiderne udviser højere AOA end analog IV-10. Analogene V-12, V-14 og V-16 med Aile7 (al-5 loisoleucin), Val7 og Abu7 (2-axninosmørsyre) er lige så aktive som analog V-10. Analog V-16 med den ligekædede Abu7 er noget mere aktiv end analogene V-13 og V-15 med henholdsvis Nle7 (norleucin) og Nval7 (norvalin) , der nærmere ligner den naturlige Leu7.

10

Med hensyn til forbindelse V-17 med det lille Ala7, faldt AOA værdien til 60% ved 0,5 ug. Inkorporering af Trp7, der er den naturlige rest i kyllinge II, lakse og lampret LHRH'er (13-15) gav analog 18 med kun 10% AOA ved 0,5 ug.

15 Trp7 kan være for stor, når man tager størrelsen af det nabostillede D-PicLys6 og Hys8 i betragtning.

Det mest interessante træk ved tabel V er in vitro histaminfrigørelsesresultaterne. De tre analoge ved lignende 20 AOA aktivitet som analog V-10 viste markant formindsket histaminfrigørelse. EDso værdierne for analogene V-12, V-14 og V-16 er henholdsvis >300, 213_+30 og 273+27; dvs. en 2-3 fold nedgang i histaminfrigørelse opnås ved småændringer i sidekædeopbygningen. Også blegneresponset 25 formindskes for alle analoge i forhold til V-10.

Det er tidligere blevet omtalt (1), at om Hys eller IOrn er den bedste substituent i stilling 8, er sekvensafhængig. For yderligere at undersøge dette, blev IOrn8 analo-30 ge svarende til visse af de bedste peptider syntetiseret og undersøgt. Resultaterne i tabel VI indicerer, at ILys^kan være bedre. For to af parrene, analogene VI-10, VI-19 og VI-12, VI-21 var ILys8 og IOrn3 ca. svarende til hinanden. For den andre tre par var analogene med ILys8 30 DK 173753 B1 mere aktive, men forskellene var ikke store. Den største forskel var med parret med Val', hvor ILys8-analogen VI-14 udviste 90% AOA ved 0,5 pg i forhold til 97% for den IOrn*-analoge VI-20.

5

Aanalog VI-19 blev undersøgt in vitro med hensyn til histaminfrigørelse. ED5,;, værdien er 42+3,1; dvs. histaminfrigørelsen er to gange frigørelsen for den analoge med en yderligere CH; enhed. Blegneresponset ændrede sig 10 ikke dramatisk bortset fra den Aile7 og IOrn8 analoge 21, der havde den lave værdi på 78,6+4,5 i forhold til den ILys analoge 12, der udviste 97,9+2,9.

Varighed af virkning 15

Tabel vil viser varigheden af virkningen af Antide og to analoge. Dersom Antide blev indsprøjtet 44 timer inden 50 ng [D-Qal6] -LHRH (Qal er 3 (3-quinolyl) alanin) , en super-agonist, i doser på 3, 10 og 30 pg blev observerede sig-20 nifikante reduktioner i serum LH ved de to højere doser.

LH faldt fra 113+11 til 46+12 og 5+0,7 ng/pl. Serum FSH aftog også, mest signifikant fra ca. 300 til ca. 300 ng/pl ved 30 pg.

25 Analog VII-24 [Tyr5]-Antide og analog IV-6 blev på samme måde indsprøjtet -24 timer inden agonisten. Analog VII-24 udviste høj aktivitet, idet den reducerer LH niveauet til 19+4, 3+0,4 og 0,3j^0,03 ng/pl ved doser på henholdsvis 3, og 30 pg. De tilsvarende tal for analog IV-6 er 42+7, 30 15jh3 og 3,4+2 ng/pl. Dette er interessant, da i det anti- ovulatoriske forsøg er analog IV-6 betydelig kraftigere, 73% ved 0,25 pg i forhold til 45% ved 0,5 pg. Måske nedbrydes analog IV-6 enzymatisk hurtigere end analog VII- 31 DK 173753 B1 24. Den lange virkningsvarighed af disse analoge subkutant kan også skyldes "depot" virkninger på injektions stedet.

5 Peroral aktivitet

Tabel VIII viser virkningsvarigheden af Antide efter peroral administrering. 48 timer efter administrering af 100 eller 300 ug dosisniveauer af Antide, var der signifikant 10 reducerede niveauer af LH, der var blevet frigjort ved 5 ng [D-Qal6]-LHRH subkutant. Reduktioner på henholdsvis fra 21 + 3 til 4 + 0,8 og 8+2 ng/.μΐ blev observeret. Resultaterne er omtrent det samme ved 24 timers forsøget (9+2 og 6+0,3 ng/μΐ). Antide forekommer at være i besiddelse af 15 betydelig resistens overfor nedbrydende enzymer. Dersom Antide blev givet 2 timer inden agonisten, observeredes en stærk nedgang i LH niveauer. I en dosis på 30 ug sås en signifikant sænkning af LH niveauet til 6+1 ng/μΐ. Ved 100 og 300 ug var niveauerne 1+0,3 og 0,4+0,4 ng/μΐ dvs.

20 særdeles lave niveauer. Dersom 10 ng agonist anvendtes, var resultaterne kvalitativt svarende hertil.

For at sammenligne er de sidste tre enheder i tabel VIII fra forsøg med [N-Ac-D-pCIPhe1'2, D-Trp3, D-Arg6, D-Ala10] -25 LHRH, VIII-25 en analog, der er blevet rapporteret som havende peroral virkning (16). Disse resultater viser, at Antide er kraftigere end VIII-25, da en dosis på 30 pg indgivet 2 timer inden agonisten reducerer LH niveauet fra 44+4 til 22+4 ng/μΐ (p<0,01). Værdien for analoge 30 VIII-25 er 39+6 (NS) . Ved 100 ug er de tilsvarende tal 7+3 (p<0,001) og 26+_7 (p<0,05). FSH niveauerne var generelt lavere, dersom Antide blev administreret ved -2 timer i 100 eller 300 pg dosisniveauer.

Resultaterne i tabel IX viser, at der ikke er nogen sig nifikant forskel mellem administrering af Antide i vand eller i majsolie.

32 DK 173753 B1 5 Antide blev også undersøgt peroralt i det antiovulatoris-ke forsøg (tabel X) . AOA værdierne ved 300, 600 og 1200 pg doser er henholdsvis 18, 73 og 100%. Udtrykt som rotter ovuleret/totale rotter er tallene 9/11, 3/11 og 0/11.

For analog VIII-25 er tallene 9/11/ 4/11 og 0/11 blev 10 rapporteret ved doser på henholdsvis 500, 1000 og 2000 pg (16). Antide var ca. dobbelt så aktiv som analog VIII-25.

Tabel XI viser en sammenligning mellem perorale aktiviteter af Antide og fire analoge. En var så aktiv som Anti-15 de, en var betydelig mindre aktiv og to var mindre aktive ved lave doser (30 og 100 pg) og omtrent så aktiv ved 300 pg.

Efter en 15 ng subkutan dosis af [D-Qal6] -LHRH steg LH 20 værdien til 91+4,6 ng/pl. Ved perorale doser på 30, 100 og 300 pg Antide registreredes reducerede niveauer af LH på henholdsvis 75+3, 20+4 og 5+1 ng/μΐ. Analog 4 med Pie-Lys5 og D-PACAla6 udviste ingen signifikant reduktion af LH ved 30 og 100 pg niveauerne, men der var en reduktion 25 til 51+6 ng/pl ved en 300 pg dosis.

Analog V-12 med PicLys5, D-PicLys6 og Aile7 og analog IV-6 med PicLys5, cis-D-PzACAla6 er mindre aktive end Antide ved 30 og 100 pg, men var lige så aktive 300 pg. Begge 30 disse peptider var væsentlig mere aktive end Antide i den subkutane antiovulatoriske undersøgelse.

Analog 26 var lige så aktiv som Antide. Dette er ikke overraskende, da den eneste strukturelle forskel mellem 33 DK 173753 B1 disse analoge er en pyrazin i stedet for en pyridingruppe i NE-acylgruppen i D-Lys6 resten.

Tabel XI og XII viser også resultaterne med Antide f.eks.

5 dersom 50 ng af agonisten blev anvendt. Sammenligning af disse resultater med resultaterne fra forsøgene, der anvender 15 ng agonist, viser et dosisafhasngigt forhold, der er forventet ved kompetitiv antagonisme. Under anvendelse af 15 ng agonist reducerede 100 og 300 pg Antide LH 10 niveauet fra 115+15 ng/μΐ til henholdsvis 20+4 og 5+1 ng/μΐ, medens forsøgene, der anvendte 50 ng agonist, viste at Antide reducerede LH til det samme niveau {19+3 og 5,3+1,2 ng/μΐ) .

15 Tabel XIII viser de biologiske virkninger af Antide i et dispergeret hypofyse celledyrkningssystem.

Strukturerne og de biologiske aktiviteter af visse foretrukne LHRH analoge, der hæmmer mere end 50% ovulerende 20 aktivitet i en dosis på 0,25 yg er angivet i tabel XIV.

Det foreslås, at Antide og andre antagonister ifølge opfindelsen kan anvendes til at inducere en tilstand af reversibel medicin kastrering, der vil være af værdi ved 25 behandling af et stort antal sygelige tilstande som f.eks. endometriosis, uterine fibroider og hormonalafhæn-gige cancere (prostata, bryst). I visse patienter kan temporer hæmning af funktionen af kønskirtlerne med Antide f.eks. dersom patienten er i kemoterapeutisk behand-30 ling og/eller bestråling forhindrer eller formindskes disse midlers uheldige indvirkning på kønskirtlerne og derved hjælpe til at bevare fremtidig frugtbarhed. Terapeutiske eksempler kunne være bestråling under knoglemarvstransplantation, cervicale carcinomer, metastatiske 34 DK 173753 B1 thyroide og uterus carcinomer, muligvis thyrotoxicosis osv. under kemoterapi for dissemineret lupus erythematosus og visse stadier af organtransplantation. Kere fysiologiske anvendelser af antagonisterne ifølge opfindelsen 5 som f.eks. Antide ville at være hæmme fertilitet hos både hanner og hunner.

Mere unikke mulige anvendelser af Antide eller andre de-capeptider ifølge opfindelsen ville være at modificere 10 den seksuelle opførsel under specielle sygelige tilstande. Sådanne sygelige tilstande kunne være patienter med AIDS, den aggressive opførsel af voldtægtsforbrydere i fængsel eller aggressive voksne personer, der er dømt til ophold på 15 behandlingsinstitutioner. Det er også muligt, at høje serum gonadotrophinniveauer hos post-menopausale kvinder kan inducere funktionelle abnormaliteter i fedtceller, hvilket bevirker vægtforøgelse eller i knogleceller, der spiller en rolle ved accelereret osteoporose. Sådanne 20 funktionelle anormaliteter kunne potentielt reduceres ved administrering af Antide ved at hæmme det høje LH og/eller FSH niveau i serum fra postmenopausale kvinder.

Selektive LH-RH antagonister specielt med ladede aminosy-25 resubstitutioner i stilling 6 og/eller 8 i decapeptiderne stimulerer sandsynligvis histaminfrigørelse ved en direkte virkning på mastceller til at frigøre histamin, medens andre LH-RH antagonister som Antide ikke bevirker dette.

Det foreslås således, at de mast-celle-stimulerende anta-30 gonister, der tilføres lokalt til hudsår kan fremskynde opheling, medens ikke-histamin stimulerende antagonister kan forhindre visse af de allergiske reaktioner, der forekommer hos mennesker.

35 DK 173753 B1

For at forsinke pubertetsstarten hos børn med lav vækst ved administrering af Antide med og uden samtidig administrering af GH eller GH-frigørende peptider opnås en unik metode til at forøge legemshøjde. Tilstedeværelsen af go-5 nadale hormoner kobler epiphysen af lange knogler og forhindre deres yderligere forlængelse. En sådan metode ville udstrække og forøge anvendelse og effektiviteten af GH og GH-frigørende peptider.

10 Administreringen af LH-RH antagonister ifølge opfindelsen hæmmer akut kønskirtlernes funktion i løbet af 24 timer. Kontinuert administrering af LH-RH superagonister hæmmer også kønskirtlernes funktion, men det er kun efter adskillige dag stimulering af kønskirtlerne til hyperfunk-15 tion. Sådan superagonistadministrering indfører en række potentielt uønskede kliniske problemer hos patienter med prostata cancer, endometriosis, uterine fibroider såvel som med sex-forbrydere og sådanne, der er underkastet en temporær medicinsk kastrektion. Af disse grunde foreslåes 20 det, at LH-RF antagonister er bedre og mere ønskelige midler end LH-RH agonisterne til at opnå en reversibel tilstand med medicinsk kastrering. På det diagnostiske niveau, som f.eks. differentiering af den anatomiske kilde for steroid sekretion fra binyrerne i modsætning til 25 ovarierne eller for at afsløre graden af calciumudskillelsesafhængigheden af gonadal steroide hormoner, gør en hurtig start for hæmning af den gonadale funktion med LH-RH antagonister dem helt afgørende bedre midler end LH-RH antagonister. Man vil derfor antage at i en hvilken som 30 helst klinisk situation, hvor LH-RH superagonister er blevet anvendt til at hæmme gonadal funktion, vil LH-RH antagonisterne være de midler, der foretrækkes.

Der henvises herved til efterfølgende litteraturliste.

DK 173753 B1 n *4 m S «s * eo n o

S. r»» p** fN O fN H N

S +l 41 4[ *! *1 ♦! *1 tn < <s » 4 en r- f*> rt II % * < » » · * q <fi σ> ro co ^ o h « O <o in ^

u (O <n (η Η Η O N # Ift N

r4 fO Π v * N (N <*> O* «Ο (Π O sO O N ri μ ^ n o* tn r* « ♦! +1 +! +1 +1 ♦ I +1 ♦! +1 *1 ♦! *1 ♦! ♦! c o o»«* «>or*'#nco<NO' r*· r- 'r ® os r*.

c V. |A »»»«»**· »»··*·

Η B CO OOtNOkNlOf'lteOONOtON^N

αβ Ηρ·ΝΝί>'#·-»Λ¥ΗΛΛ·<<,ί,>ι*>^

Η Η H HMHHHHHHHHH

O

Γ4 CM

X +-* w as «Γ 3 t-f 'N.

« leo OII9>Olr4Nlhll9IOtf)OM

Η > O I I O 9» I h 'T > ·^ < I 00 I O N O CO

< < Η H *“« H

I O

o < «4 ' & Ok 0 u>

V W % Otl«nilNO*4rtl*OIIIIII

tf ft, o «Λ I I <# I * C4 <*) <* I m f · I I 1 I

μ V «0 0 « Λ X % 0» kp «ο μ « * x φ —. < >>. a c « · · « « c « « μο>,Μ€μομμ^^Ή^μμι-ϊο-ί

. _ μ« — <C»4X:£OM<<MMMM<<MMM

Φ Q M

ro * w μ o «n 4J ^ mmtommmmmmmmmmmmrnm»

c« *0 tT OOtfOUUOUUUOOOOOOUO

O 4 **» C ι4 Μ Η Μ Ή Η iH τ< 0>U *H 2¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾ « f «-4 irtiiiiriiiiifitii

4J 0) ^ ri OOOQQQOOOQQQQQQQQQ

C * *4 < «O *» ~ o H w v· O) _J % φ ΙΛ # μ ι-f ri «Η U (N « >· <««04 a o *-f u μμμμμμμϋ>εη&ι*>οϊΝ·α.α.α.« < x c u ^^►,^,^,^^μμμβα^^· «

H CL O'— -4 f-f-»l".i-»i-kfr*H<<<S:eMXl*><0<OW

-»c x

ϋ v< I

01 JO o « μ o o T?

* fe V

H 0 Η Η Η Η H ·—f H »H

cn 44444044 44004044«

^ β fePLfefeCUBLfeCLk&OtOt&kfeCL&PMEL

w on i I i i i i i « ^ i i i i 4 I I t I

u o rttnrjfnnnnnHi^rjiOrtrtrtrtrtrt

w H I < I < I I « I I I I I I I t I I I

0 DQaQQO£5QOQQOQOaOQO

C

< 4444444444 «4««««««

ΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΧΖΚΖΧΖΖ H I I I f I I t 1 I I I I f t f I I I

ΝΝ(ΝΝΝΙΝΠ01<Μ<νΑ»ΝΜΝΓ4Γ4ΙΜΓ4 I < I I f I I I I I I I I I I I I I

ροραοορορραρραοοοο

w I I I I I I I I I I I I I I I I I I

OUOUUUUUOUUOOOUOUU <<<<<<<<<<<<<<<<<< i i i i ( i i i i [ t i i i i i r t 2»XX2ZX2X22fc*XXX*a

kørtintAfocoO^Otf'HOniomco^«* oiANr-i4»4'incnvcnco©MF«*OvC£>cO'* øg* nocon^r^o^^^^iniAininfonH

a μ N44444<t41fl4l{>^4Vli>W«n wc ρμννμνγ*γίνν<ν<ννν«γτν<νγι . Γ4Γ<<η^ιηο^<θΦθΗ(Μ<η<(ηΌ(^α>

μ HHHHrfrfHHH

X

DK 173753 B1 H O « ^ ~-t m »h *-< to to <s g in h <*> ό \ r* S 4 J 41 41 41 41 41 +l +* < ^

O W N ft ® H Ό £ SS

w un u> <n <n ft h o «o h «-« in λ m

A A

O' <n cm m Λ , ^ μ Η * ·«» ό η c- r* © μ « r* ο f*> <η γ- in j ' : * ' ^ ^ -Γ ν %<-Ι (») 4 Ο «ώ Ιί> Ρ* Λ 4 3 β ♦! 4| 4| 4| 4( *11.11« Λι SS*« ο>θι ρ*ο·Μβ m α s, * · » * » » » * * Η ΝβΌΐηβ^ΛΟΛ θ' Β gHrlrlrimO Η4<ΛβΗΝΝΗ ^ Η Η ι-4 rf γ4 τ4 H^»^r4f-«r4r4r4 ** ^ I I I I I I I I Μ I I I I I ·

Μ {Mil I I f I ||p«.|llll I

X

X

cr 51 H* μ η (Λ n I O O 9i I O « o O N If*. p * . (A r* ι o © co I O « o m tf> i m f-* < < «Η Η H r4 I o o < *e ft ο» *j2 “l i i o * i o 0!!°!!2! !

« a, Ο I I N 4 I ll^lini I

U « «f> « <0 _ 5 ~ 2 -° " 3 x c- ^ M 4 Μ Ή _ 9C<I a £ Β Β β B 4* Β β β β B · μ μ, ►, K ???.*? jjjj j

* o o J J d |J h H

^ h *0 wSwMHMM *»4 M

r~ o - «*» ** w ’ 5 in' O ? a 4J Β Β Β Β Β B *< _ jj * „ W w j .J .4 ,J .J _ « · _ ^ « 7Ϊ ®

e . «ο u u u u o u Ό cuBSOiJNPO

ο M «4 <H <H Μ β I H *4 ft Μ P T< C jC

S fc ZSESKK β <ηχ«οβ«Λ< v

Μ φ llllll llfllllt A

*» m wsQQoao . αβοαοαοο * C * Ol Λ m ο • " · Λ w — c CBB < βΒΒΒββΒΒΙ· U N · O J 3..

a 9 ^ β u o o p h ϋϋϋϋϋ<25ϋίί K A · *-» *H E ►* >» ftp, OwtnasaftHH 2(5222222^¾

r4 B

0 -w ft Λ 1 u a o « t>« Η H *4 H «4 rl «4 HHHHHrtHH «”*

«— M ft Β Β 0 β O ftftOftØøBØ O

Λ a ft o, |L ft ft ftftftftftftftft ft

w llllll «4111(11 I

μ n in m η η n nn»nmnn<nw <n

wiiiiii i 1 1 * JL 2. JL JL JL

0 Q O A Ο O QOOQOOOQ «

«I

ft A

Η Η H «4 £ ft Κ(4ι4Η«4ι4Η#4 *4 ft ft ft ft fe | ftftftftftBBft · 2 2 2 2 ·”* <S 22222X22 *

^ I I I I O *4 |ΙΙΙΙ(·( I

- d <S fS (S ft u NNNMNNN« W

1 f I I I I i f 1 I i i I i Λ ο ο ο ο Q fi qooqoaoo o

wiiiiii i I I I I I I I I

OOUUOO OOUOUUOU u <<<<«:< <<<4<<<><< k

llllll llilllll I

2 2 2 2 2 2 22222222 X

in n ft Of*© £ •m· <n © h m <*> ft^inmmo©® + K · h n in b m « mutninintninin m

H c N N N IS Ci N <M<SIMMW<SC4M W

« O' Ο Η N f) Μ ΐηΌΝββ'ΟΚΝ <Ή ft Η Π N N N N IMWMMWnm® « e DK 173753 B1 f-l

Η Η CO

β r# S * I +l

< M

|| , α r- fs v w i*> \o *-» is H Ot ri <0 10 <0 * O M in Ό O ΙΠ

Ug» M f* • *\ *\ *1 ♦! ♦! +1 c o ϋι η Ό (S <0 O ® • N · * *

*46 «η Η N *0 O IN

m b *h t-ι rs «ootis

H «4 Η Η H

O

« <41 40 f O

CN N < 4 4 40 t O

X *< z < «Γ s

r4 N

< & o o in n i r i *4 « o <0 eo i r i < < *H «Ν

I O

Q < ·« £U Ot 0 irt P h » I I CO 10 4 v o. o iir* i i U 40 « eo m 0»

« C

A w -H

« *4 S fs. *4 * m m as 3 α> M >t h h x β ~ ae« u J j *4 A ►» >« * · υ υ υ * μ h3 >4 «Η Μ «Η

£qUS> *— Μ Μ Η <«4 Ζ SB SB

m n ~ m U % *4 am o « ~ a a «*< • * ►* * *2 •h w a »j a a c · m *4 <s u u ο» a. >t

o v — <«h a hiiJ

u» u υεα. B < IO M

a a <ii til v m w s a ο a o a a c · Dl < kv o *4 «

Mw C

i a a a < ►a a in o p* ►* ►* U PS « —* I *4 «4 *4

A· *4 ttUUU U t* U

< jC a Μ Μ M *H fe U to to B. Ό w 0 X X X to < to

M C

Ο M

Q, JO

1 u O 0 « fit« *4 p4 *4 Η H *4 *4 ~ m * a * a«« —- a. a. a. a. tu a.

W til III

^ Λ Ο) P) <0 lO <*t

w III III

a a ο ο o A

*4 «4 H *4 H t4 « a a a a a

Z X X XXX

rl III III

—> IN Μ Γ* IS N N

III III

q a o a a a

W lit III

U U V O 0 O

< < < < < <

III III

z x z xxx φ Η 0ί B H ^ vo*·1 v r* n as · a a a r- r- ¢0 a u m »r> m vvv

m c (Nrsrs cs is (N

S to Φ b β O* u a n> <o <*» n rt z DK 173753 B1 wi ·+ 0» ό ·* S *\ *\ < * U ' _ Q O O Ό r< o

M O O O f- O

η «η n h f») v

H OD O Η ^ Η B O (i O

S co^woiOf^Miointo U £ to w S * +1 +| ♦! ♦! + | ♦ I ♦ ! +1 ♦! ♦! C C o

Ot w (Mo><or»oo<oncoo U X g ·»»*♦»*««» •«tø o ιοοη<ν*0Γ-*Λΐ*ώ/ν.-# B) g <H ΝΙΠΗίΠΛ^βΛΛΟ

4J H r< Η Η Η Η Η Η H

a o o * øl I O I o t > i co t i N ro i O I O I I I Η i i

55 Ή r·* W

? o" a ϋ H S Η 0 woe 0*6000^0100»

Η · OtrCOO** (COCO

< «ί «Η Ό »4 r"f H

• O

o <

<« CD

0* 0»

0 Irt C

4J (, * ο Μ I I «0 ¢0 t I I t I

øø, ο ή n i i n o i i i i i

U V

0 CO M

« — 0 C 0 λ ^ a

Xr».' <H tn m m m m K 3 to h H >* >* >· X« ~ U < 0 C J J J j *4,4 0 OinO^ihAiUUUO) a\ u *o w#h <<xomhoxx*^ <*> z ~ w v0 μ

β IA

4J m ·Β·Ν«ΒΒ·ΙΙΝ • ►»>*►·>*>*>»>«>·►»►« •H w- 0> c oc ouuooouuou o^· Μ <H ·Η·Ι^^·ΗΗ<Η^*Η»( tn μ -η xxxzzzzzx*

00 Ή .....I I · I I

«/ο w h aooaaoaaoQ

β *> < r> 0 • m 0 a e a a a •4* f lA ^ ►*►»►«►»►»►· bl N · «· 4 4 4 4 4 4 4 · cap η ο ουυουομβ^μ

K JS # *H H *4 *4 H

HO. ·ϋ w * ΖΧΧ2ΖΖΗΧΜΗ H C *

U 4 Q

0« JQ

1 μ tn

O o O

* u. »

H 0 HHH4H4HHH S

*-«. <*)H ø«øøøøøøø»4 4 0.0,0,0.0,0.0.0.0. ϋ w g i i r r i * * * * *h ta-· Μ «ηΟΛΠΜΠΛΛΑΖ «- * i I i I 1 i i i r i

QaaoøQoaoø *u « s 0

Bi

O

Η HHHHHH444H

ø øøøøøøøøøø

5ZZKZXXZZZZ

i i r i * * * * · *

m N«n«rJNNNNN

I I f I I I I I i i øooøaøoooo w 1 I f I I I * I < * οοσουυυοοο KK<<<<<<<< ill i i i i I * i

ZZZZ2ZZZSCZ

'•Cf-x-iOCNfieOlØOr- « ΐΛΟ»*4ΐηθ»0«ΑΗΗΐη a h M C ΝΝΝΜΝΝΝΝΝΝ ♦ ©ΗΝΛ'^ΙΟΌΓ-βΟσ* μ

X

DK 173753 B1 c* n • «

H <D <0 C*) O O

8 04 m S »i *i *\ *i +i c r- 4J * + O O ΙΛ «Ο Φ O « tt w O r-t o <S <0 m n n Λ Λ N <y> r*- r* r- *-t ^ ιηβ'ηοΝΌΌΑ) o +1 +1 ♦! *1 +1 -»l +1 +1

H

s CO m O O ri C* B · ......

8 πηοησιΦοο

NNyN»CNrtH H r< t4 Η Η Η Η H

O I 00 ( I I I I I

. I t I I I I I

o

H

(S

o I I I I I I f I *

Γ4 % 1*11*91» O

s n r as ^ Λ o o «Η O O I τ-t O f»> O O I tt c v 1 φ » tt O O I Ok pH H HH ^ 1 s a « η* >

0,0* rH m t ( <n O t V t r* ‘O

0 «« it<øoimif-t 8 h · o H tt tt 0. h U · tt c « CO 0 tt

tt — c V

« om

jQ «-» V N 4 9 10 1*1« U

• «Η 4» I «4* 1119 O

X Γ» « β O tt ·« X 3 O tft X « O 0 ** *4 *4 ry *-4 tt « tt *0

l* *0 C C C

O o— «σι<οββ v * it — μ ^ W o \ 0 ^tttttttttttttt »4« 0» tf O UNNKN*N>* Ή 0 lf> Η <— Η ry < r-4 Ό « η ο η y •Η ^ 0 < · C · X X ο Ο «e « · 0> U u U Μ Μ «4 ««Ο 0 · >» » b* « ft V«) Pu fc. *, .-J t*i · J >-.

fi « Ό ^ngi4NO>«^ *H

<<o — ο>,^υα-Η*4υ *e

— ·Η·4ΖΉΝΖΜ·Ι U

ZUMC1. « JE « ft. tt M w up I Ή I I I I I I > ΟΧΟΟΟΟΟΟ

►J . O

w o* m x « a < JC w H ft tt tt

r-f tf> · B >« fl > tt tt C

U 0 — X _J ΪΗ *4 X ►» 0 ft · J J 0 J O .4 «4

1 ry UP*HUCn*HOU C

o c ·— ή «η s; h ^ z ε w ø * *0 ZZwfctfJEjOft r-i C ? —. «Η 0 Λ · *2

4« C

»—« 0 HHHHHHHH «Η (x Λ «tt«««««« J3 — ftftftftøuftftft h I I 1 I I I I I 0

W 114 4 1111 V

QQOBOOOO H

tt •o c « 4* HHHHHHp^H tt 2ZZZZZZZ 0 » I · I I I I I *0 (VtNNNNNNCt > ry I I I I I I f I tt

— οααοοοοο X

i i i r » i r i ϋΟϋϋϋυοο ø

— <<<<<<<< 3C

(41111(1 X

22222X22 « bi m

Ch ft « μ

«ο^'οχιη'οοοο O

ot<n^«a>»om <m

09 Li C

m C fiNiMfgpynryr«» C

C

ø «0 ♦ ΟΗΙΜΛ^ΙΟνΟΓ·* μ u mmmmmmmm fc * DK 173753 B1 *" x" *" *" *" *" *" x” x £ X £ x £ £ £ £

**KfcjB*fcfcX«teSefcSBtee*K

I i «·! iti ΙΪ · I *iiii »-(ΗΗΗΗΗΗΗ·ΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗ K<<<<<<<<<<< <<< * * 4 tiiiiitiiiii'iltli

QfiOOOQPQOOBQflOOOOØ OOOOOOOOOOOOOOOOOfk ρ«ο·ρ«Ρ(θ*ο·αΡ«ο·α«ο·Ρ*Ρ·ο·ο·ο«^α*

fefePUfefeUfeUfeCfefefefefetnfe *J*100»1^0^0>30^hhhh h J HhHHHMHHMHHHHHHH|<H

ρρρρρΗ^ί.ίρ^ρ.οΐοορρ Q 9 9 9 φ«<·Η·τ<ΛΛίΓ^>^^Λ· »4»4»4«4»4>><«<<<<Ι··2£η43»4 fefefefefefefefefefefefefefefefefefe υυυυυυυυυυυυυυυυυυ ^^^^4ν4ν4<«-(ΜΜ·*4·*4<*4*4^Ή«Η«τ«·Η 0,0,0.0.0.0.0.0.0.0.0,0,0.0.0.0.0.0.

I I f I I I I I I I · I I I i I I ooooeQOPoaooaoQoaQ o m fe •4 o ·* *» *f fefefefefefefefefefefefefefefefefefe uuoouooououuuuouuu h ia α.β.β·ο.αα·Ρ*ο·ο·α·β.Β.ο·ο·ο·λθ·Ρ· r-ι m m fe ^ *9 ·*

U O

0 -i < ft.

H U bbhhUbtthhhbhhkhhhh *t 499999499994999499 β øcncnwwwwøtncoCTcntnøtnwM« « « » c O 9

ri > C

5 9 Η H ^ 0 «40«« 4444944444444

Bh o. ·-( o* tuii,p,o.a.o.o.o.o«iha.Ota«eu I i U I h> ' I I t I « I * ' ' ’ < ’ ίη π lll<llflll«l»·*·*·

QQOOaOOPfiOOQPOOOOO

«« 444444444999990 ΑΧί^ΛΛΑΔΔΔΛΛΑΑΑΛΑΑΛ a. a. 40.0.0.0,0.0.0,0.0.0.0.0.0.0.0.

Η NO.HHHHHHHHHHHHHHH

o h i υυυυυυυοοουυνυυ c, u <r> o,aa.P.o«aaa«aD.Afl.ftfiuo.

I I I I I I I I I I I I I I I I I I

οοοοοοααοβοοοοβοοΒ 4

^fcKSR»»*«»***»**** Kitllllllltlttvltlt ONNNNNNNNNN<NNNN(VNN I 1 I I I I I I · I I I I t I I I I

QQQQQQOQQQDQOOOaOQ I 1 I I I I I I · I I I t I t t I I

UUUUOUOOOOUOOUUOOQ <<<<<<<<<<<<<<<<<< Illlll1»llll»fllt< RKXKxrzafcaifczazfczBcfc ti C Ο^4·Ο^(^-«04>0Ο^ΐη4>^θ9»^9Ν OO^riNØHØI^O^r^nflOCQtNI^^ø (4 riØ<*)Wri4i«-(OtriOkW<hOkOtOOØ<h

O eu>iø««ifttoift*Oin4iftkftift44<OiA

M ««WNNNflWWNNNNNNNNN

eDøiOr4r4ø^tA«or^øotOrir*4<n^#ø DK 173753 B1 Λ3ΝΝ<ΝΜΝΜ1ΝΝΓ-ί ΓΊ xxxxxxxxxx *

χχχχχχχχχχ X

i « i t r i t i · i i 3***«*«*«^ *

0 Η Η Η Η Η Η H Hf |j P H

<<<<<<<<<WM<

1 I I I « I I f I I S I

QQOODOQQOOZa 000000000000 α·Ο<Ρ«Ο·^β·Ο·Ο«Ο«0«Ο«&, «<:·««&«· m * m h h S ^ ►» S 6» h ►· ►<

«J (J Η H *H O *“1 *"* I« H iH*H

Khhmhhhm<mhh 333333h*:j:J33 «β€*««*Λ·β«® «««øø*«***

H »-4 Η Η H Η Η H ^ H

<<<<<<<<<< « «υυυυυυυυοο »JjNMNNNNNMNfi Μ Η t t t I 4 1 I I I 1 a.ø.oaoaoaoooa 1 * i i r i i « t i i t ααυυυυυυοουυ •o « >1

Hi

O

0. øøttø·*·««*** O *J^3i4»4iJ«4*4«J*4»J*4*4 υυυυυυουυυοο • ^^^ΉΉ^ΉτΙΉΉΉΉ m tn e,e#A.iu&»{Wft.euft.o*euOu CN hø « >1 ^ Hl h) u υ

O H

< o.

H

libkbhbhWUtth*« v Cif®«©®*·*®*« a mm(/i<nxm(/i<n9><nmx 9 9

®i C

O * H > 9 9 X * h

C C Η Η H < Η Η hI Η Η Η Η H

3 οι ««OH*««***** o,o.ccvo.a*<x>Q.o*o.(ue« I I Η J I » I I I < I » ηοί-ί^ίΠΛΛίηΛίΠΓΟ»*) i i i i i r i r ι i « i

OQQaQODQQOQQ

®ecc«®*«®**c ΛΑΛΛΧ^ΛΔΛΛΔΧίΛ O.fl.P.CL.e.OiOtblkOt&O« υουοοοουυυοο αο>ο·α.ο.ο<ο>&α.α<ο«Ρ< 111111114 114 αβαΟΟΑβΟβαΟΑ

Ηη·4ΗΗΗ«-»«-·η4Μ*“4*-4*-| 00*««******* xxxXXXXXXXXX 11)111111111 Mt4ttNMN<M4N<NNNN I I I I I I I I t I I I

QaCsCjQaOQDDCSCJ I « I I I t I I < I I » οουυυουουυυυ KI<<<<<<I<<<I<I<< i i r ι i i i i i i « «

ZZZZZZZZXXXX

u (K O ^ Π C3 Η P) Cl <*i W f*f A ΟΐΑφΝβΐη^ΟφιΟΌ'Ο'Ο'Ο Η ΓΜίΜΝΝΜΝΜΝΜ^ΝΜ «or^cooi οηοιπ^ιλογ'*

S f"· S Is A A A CO Φ Φ β) (O

DK 173753 B1 * * »" i £ £ £ 2222 * * as 2

I I I I · I I I

0 0 0 0 0 0 0 0

Η Η Η Η Η Η Η H

< * K < Λ << <

I I I I I I I I

Q Q o Q Q Q O O

oooo o o o o kfcbfc u u u u 0, 0. 0, 0. Cl, O, O. C.

· c · « C

►'►'►’S ►>►>►< £

Η Η Η O Η H »-i O

MHMM Μ M *-l M

3 9 3 3 3 3 33*3 ø ,Q *Q 9 9 9X9 ,ϊ < 3 *4 J Λ 2 *4 0 0 pH ,-t < < ø*øø υ w * * h S h S <<►,►«

+4000 M »» O O

υυυυ o, ø* u u •Μ O O O I I Μ Η 0, 0. O* O. 0 0 2 6.

1111 I I « I

0000 *> υ o o «

pH

•O < 0 u tt tn ØH·« pH < fe 0 fe fe fe fe

•4 Μ O fe »4 »4 ^ J

ϋ o, n ** u o o U u ti

__ Ή I o ή >i O O O *H O

Γ0 o. O X O Η O 2222 ^ ό 0

V O

9 E

e s O l< t« h fa tn fa fa fa fa tn c p ø ø o pc««

O OT OT W OT O OT OT 9) OT

H 0

ø C

C << <

H pH pH H pH pH pH H

««0« 0000 0,0,0,(1, 0,0,040,

1 I I I I I I I

<o en h> <*> λ rt λ ø i i i i i i i i 0000 oooo • 099 9990 x x x x x x x x 040.0,0* Q.0,0,0.

H pH H pH O pH H pH

υυυυ υ o o <j 040,00« 0*0*0,01

1 I » 1 I I I I

0000 oooo

p-H pH H pH pH H H pH

øø øø 0000 2222 2222 (III 1111 ΓΗ (N ΓΗ ΓΗ N N N ΓΗ riet i i i f

OQOO OOOO

III« I 1 ( s uuuu υ u u u K K K < K < < <

1 I I I I < I I

2222 2222 O o es «η ιο %o *Λ o CO CD eo to O O 0· O' pH π η (Ί co co ¢0 tn (ØtØtOtO |0 ΙΛ Ό U>

N N Μ N N N N N

CO o O pH n λ ø in co co tn tn tn O' tn tn DK 173753 B1

W N Μ « Μ Μ M

x x x x x * _ _ K

x x x x x x S* S* i i t r < t x X i ø ø ø ø ø l< X X € Η Η Η Η Η (I I * ** < < < < < η h b 4 i < i i i I ø 0 * a a a a a a cn w x oooooo poop wut.ut.fc u u u u xo.xo.xx xxxx • a 0 « » · 0 >» * fc * * »· ?>*»►*

rH W J H U * W

Η Η K < Η H #< Μ Λ M

3 5 3 3 3 3 222*2 h) ^ ^ μ μ J j > « « 0 0 0 «-4 t-Ι *-» Ή >.<«<< < j · υ -< υ υ ο ο υ >.<«<< < «j < -j η νΟ J Κ Ν Ν Ν 0 Ν 0 .-3 χ ο χ χ χ χ χχχυ σ> I g I I I I V ΙΙΙ·Η ο s ο. ο ^ ο ο ο <η ο λ ο 1 i ι ι r ι χ i i i i v> o q o o u u χ a υ a g Ή 0\ ·-» C 43 •H 0 0 0 «

Η Η Η ·η H

<-(«<«< o < ^ » υ u υ *J ►J >-. < < U X <

N U *3 N N O «4 N

•ri O X X U U <M 0> U P> x «η x e i t χ x ^ »j i

''T SXOOHH Λ «CXrfO

^ fc 9 O h

C O

O · H Ή 4> t> 3 0 4J U fc fc U fc W V U U fc fc Ή ««00«« C øøøo * « « co w </i w ►« eo w <n cn ø α Δ

3 U

0 0 Ό o Øj ,H «-<·-< <H >-t 0 r-l Ή Ή Ή 000000 01 00 0

«-* XXXXXX O X X 0 X

η ι i * i r ι h ii.£i o λ η η (η n d ø <·> r*> x <n

Ji ι ι ι ι i i C · i i i ø οααααθ < g a a a t.

o x 000000 0000

£ X JZ J2 £ JZ A A A JZ

XXXXXX XXXX

Η H Η Η Η Η Η Η H

υ o o u o o u o o

XXXXXX XXXX

I I I I I I I I I I

Q O q Q Q O O Q O Q

Η Η Η Η Η H r-f *ri ή øøøøøø øø ø

XXXXXX XX X

% I I » * I I 1 I

W«MC*rMNM ΓΊΙΝ ΓΜ

I I I · I I II I

0 0X000 Q Q 3 o 1 I I · I I I · «Η · uooouu o o o o <<*<<< <<x<

I I I I I i I I I I

XXXXXX X X O X

co c* o f·- e m o N Γ* *H «ri *0 «ο n <*ι "ø r <n ø ø <o ø ø ø

N N N N N N

iø r«. co c> o h n m ø1 in 9 o o o o o o o o

Η Η Η Η Η H

DK 173753 B1 -S ε e w < m 4» • ♦! tn m Λ « cH o r- ^ «6 m w o ^ ^ . .

^ o σι ♦ ! ♦! 4» u a ή « ► o> o -η m m ο <η fi (« Ο «-< Ο f- Μ «4 (kl <S <*» C4

u *ο A

9 · ^ ►»

« .J

P u

H *H

3 α ·ί r*>r4tn«ø<nOktoot(f><#® o o r- ^ o • i ø ·«.·..»%«·« ..... · ^ g o c inr»-»n#n'crM‘0(M^u>0'OkOOi,a<«imo<r>0 ^ * SS «I ♦! 4·) 4| 4 | 41 41 41 4 | 4| 4| 41 41 4| 4| +| 4| 4f 4| 4| v in ø __ _ X h co ΜΟΓ^σιοσιΌσι^οο^ίποΓηΓ-' η* o σ* o « h Ο» H ‘ ‘ ‘ t« »i o s ipokio«nr4f-o»r-«Dr4*H<or»m©en®iAe*<n o» u r4 e «-r^^or^ovv^akr'OkOh-o^v-to^o^o«^

o *< n 6 |4 Η Η Η Η H rf H ri Η Η H

*H O«

O

•Η *σ o ø e

M

M «

H Qi O

o » fOfllOfltt'll'lf’OlO

J r4 W O O O O

MØ Η Η H

n c < < * s s * m • «o* i ir>oor-®kNooot-o i o ® o « o < O m o r- noinajooiSHhO ® to c*·»

g r4 W

m

% i i n i i m i m i ø i ι o o o ι O i i O

O *h 4 4 <n n h in m ooO^h-cir-ifnf^cTkp-næON^^fnwin 8? · r4COmr4*HOkr4Crif-IO««-<<7iOi9kOO®9kOOi 83 U ΟΐΑΌΌΌ^Όΐ^ιΟίηΐΟίηίΑΙΑΦ'βΌνΊΌΐη H C nnnnnmnninnninisninnnnnn

U ΙΡΙΩΌΟΌΌιΟΟ'ΟιΟιΟιΟΓ'Γ^Γ' Γ» Γ* Γ* N

fe DK 173753 B1 o in « tn « >» · >1 4 o «j

U -HU

ιρ ή ir> flu *h JL D> i %

^ P- Q

V , V

« +1 Ό 4) 8 · fi e 41 41 9> CO · 9»

OM 0» O

M O *-t ø *-i ø

C O C

* Π < < mo^c--<N<y*(Ninr-*Op- <n o m in q o < ιθ D'i'inNfrttsiA«« ^ in in in co in «η o ♦ I *1 +| ♦! *1 *\ ♦! ♦! *\ *! * I *1 4-1 + 1 *\ *f «aoøøNøQø« μ η n n «o h ία m ^γ-μ*-4γ-ιο£*μ<7νο p» t n <* <n o*ho*

CDMNOMdi-tttrOM O*<7»«0i-t Μ O H O

HHHHHHHHH r) Η Η ri H

i i i i i i i i i i ir ir ® in i r

ep M

i o o o o i i i i o o i i i f- i i ^ o o o o Ό ø·

»H »H r·! ?H

oM<no(*)O^Mini t^Hr^o iioi M r* m N H ON M iOr4r4 «Η

Oi^P^rHinvOt'-COmP·» O Η N fl tt <0 U> r4 *MPiC0M'0'«'«1BN CO 00 <0 O O O -* O* η <n β3Ηΐ*)ηη)<*)<*)(π η η η φ oo o <*j o* <Oi0lA<O<eO«O0IOtO (O ø 0 <o irt u> <o ui NNISNNISNNIHN N N Μ N N N N « cookOr((Mm^iniOh> ® o» o w m m * in

fs f> OO OO CD CO CO CD OD CD OD CO Λ ® Qk ^ Oi D

DK 173753 B1 >o

Dl 0 tn Øl

C

•H

H

H

«Η

P

a »4 • c o

P

r- s

' P

P

«· Λ 3 a c o> ••4 f-4 »-< «

JK

tt m in ^ O rt o · » · * *4 «φ Μ N r4 Q <*> •o ♦! ♦! 41 ♦! ♦! *1 0) 6 γί nj tn w o * «i vo o m <n tn σ» ο» o m «η «*) οι m

O r-4 i-4 f-t fH

H

a c < W I I s I « σ» h i O i i i a o r-f i o r* n* <n o

Ift N N

«o (s « r* o m o N Μ H *4 » β « w a a <n m a o <o <o a

CM IN CN 4S Π fM

sO h- ® O» O «-«

øt ^ 9t O) O O

H r-4 DK 173753 B1 « tn 0

wA

«

C

«

X

os

X

d

« pH

PX « NtnOO^NttOlA

o C J* ··*****· *h 14¾ m4*«tf>HPin©in* 5 So +1+1+1 +1 +1 +I +1 +1 +1 K G T* 1 σ»"**. tficooOf*ieo«ot^<n O «Ν * pH β OiHrt(nON<hriO» <0 ne »HOONOiNPHoo'

0 HHHHiHHrltH

»4

M

V

Ό · * Ή £

* O U

<n u m K o * * u σ> +1 <n V Ή rH * < * in Η Ή h H ‘ ‘ ' « > *4 β H Irt tf» <i *i* G ί » * I 11 +1 +1 ♦! <*> ^6¾ 1 o

O *> O

æ> · ΙΛ I**· «C »H Ο» ®

M * <ri O « « ¥ Λ N

<N X U

*4 β U JZ ta a,

< pH

i« o O O o a> t n

A » p- o I I I I <0 <N I

I pH pH

o

H

p-4 JJ> e a m o o o r- o X s. i in vi ip « o « i »

I tf O rK

N

I < o o * < in υ in tn r- < » i i i r i r- i i *o I o

X

u in om σ» vi h i i i limit i

U O

C 4J «

pH

9 a V <ø

« ø pH pH

pH pH < 0 < 0

• <<*<«1>phUpH

X OrHOpH<<<<

a <<<<hOhU

•H XUfi.UA<0.< 0> 1 < t < I M I H m

pH > OZOCLQO.OØ.S

O I I I I I I I I

xh aaaaaaaoo O G I C I C » tf I *+ aa«««a««A i

t’O+JO+’U+'UO

0

H

< u < ουυυυυυυ*

HHHHHHHHH

XXCU0.0.0.XX u ΗΝη + ιη«Νβο< • I I I I i I I I l u >>>>>>>>>

x MMMHHMMMM

DK 173753 B1 • 01 0

H

•

C

« se es s

•J

o”

H

0

H

<

O

® 0

Vi

J

H

r1 x *o m v>

H

u

H

0.

i

O

in 0 >·

V

«Η

Ou ^ :> ^ 0 •JO. Ή W I 0 β en c <1> σι o <v o m· p- < I »4 ·····1·

f-. O 0 ^ QIMPI<ØP«16tA<nO

μ S + 1 1! +1 +1 ♦! ♦! +1 +1 +f

0 01 O

jz øh r- σι o øi <n o din h H S ........

h fQ m mor-r^r-wHcne u e cmho'OøiøiøiOP'·

a e r-t r-4 r~t H

Q

* O

H 0

Η H

« 0

X u X

I « U

cm o o1 <n h o h1 I M M H <n cm

0 1> t1 «I

1 M VI «I 11 11 0 ► e <-j

«< VI « (O

1 CBS 1 _ se Høep en o <n p>

%-1 (I 3 Οι O Η P

m cn <m n

V Ή O A

O 1 Ift

CM O

bl u 0 V 0

4> o o O

H · Øl I I I O I I i i

3 gi Η H

0 V1 M ét

0 <in O øi f- O O O O O

X o · o i cor^oooOH

< o H HH

H

σι

H

o tn H (M o o m O A O « α v ^ n ^ η n i i o

H

ø

U

• i H C

30Η0Η030Ο. 0 K ØHHHØSJSMM 1 ^m<s5>S2xh ® ø u ? OHMm'øtfi'OP'-eo ^ • HHHHHHHHH fc u i i t i t i r i · * >>>>>>>>> « DK 173753 B1 ø tn 0 m m s s « s o H » rH « ©ocstocM^tntnr·» m * S «I 4] +| +1 ♦! *1 +| + 1 *| < € i «o o&tocn'øoco'ø Q C W ......*

« S nnHO'HOMCMM

«0 ØM NHØtH»NO»NO

Η Η B HH Η Η H

• « e r- >· <o K ø • ΙΛ m e m tn ø v w «.

>i ko) m <n o r- h

«4 O « . M <*| fN

t> h » +1 , .

m v m 4-1+1+1 +|«|

O. M U M

• > <w a <nc4<n o m eo C*> c s 9 < ri O i1· « .-< c ή tn <s co rsi C Μ β 3 Λ 0. « I *> o 0<*> « in

Ml ·Η A

m > o x ω

W N O O O

eo « cn o o i i i * i ·

< jC O MM

hø.

Η H

Ϊ if i «s. ooor-mr*ooo a * ocnoinecoooo » til Μ Μ Μ Μ Μ < Μ Ο Ο « < % I ο Ο Λ Λ © Λ Ο CM ΙΑ ^ ιη ·Μ· ι ^ I ί*> Γ- *Λ

I CM

Ο I ο υ < i

X

l4 ο ^ øcøeøeoøe b t4 0 ΗΗΗΗΗΗΗΗΗ ** +1 Μ 5 0 ι< φ 9 € X 33ΜΜΜΜ333 0 Η 0040ΜΜΑ«· •Η Ο» Μ Ο •Η α 0 « Μ Μ 4 * υ ο < < ØØØtfØOØMM Μ J J J Μ Μ J I » φ ουνυονοοα υ

X ΜΜΜΜΜΜΜΙΙ C

0.0.0.0.0*0.0,00 V

I I I I I I I Μ «Η U

αααοοααυυ ο %4 Φ

U

« OO'^OINMOOd 0

Η Μ Μ Μ Μ Ν Μ Π U

I I I 1 I I I I 1 fc.

Vi ΜΜΜΜΜΜΜΜΜ ζ >>>>>>>>> ο DK 173753 B1 * v c « 4» JJ v4

V 75 η Η Η Η Η Η H

η μ o rfOOOO HOO ♦ g O 0)000000)000 0 > »IS ♦»»·»* , « « o o o o o o o o o 4» 0« Λ· A Λ Λ Λ A Α Α Α μ 0 μ 4« Μ «Η OhlflOi’t’JOOlflin'fØ'

η fl WØ)m(«><*)N(r>«HØ<r<-COCO

c s ε Η Μ Η Ν Ν g ^ « 4 1 +| ♦ Γ ♦ { 4 I ♦ 1 *1 41 41 4 [ ♦ I 4 ( Ό ο χ 41 «nor-mfioo*r*o®*cn 0) ØØP»rtr)HO)4WØ'Nh * b.

0 N N H «S *4 Ο) Ο »4 μ 0 Ο «Η

C 8 5ί ιΗ Η r« Η rt Η r4«H«H

Η Η 4 *Η μ ο ο ο ο ο ο ο ο ο ,Α Η 4* ff Ο 0)000000)000 “·>0 > *iS««»**55»** ν C4 ο οοοοο οοο J Ρ, Α Λ Λ Α Λ A A Α Λ W Ok 4 β ο rt Η Ο ο Λ •*4 «η <π ** ο r- '•ο e · · · » < θΗΐΛΜ04θθσιΓ*ηΝ Η ^ Η *4

^α \ Γ 4)4(4( 41 41 41 ♦ ϊ ♦ I *1 4 ( +! 4 I

Ο Μ Ο) C 0) ** «η *· c · % * μ χ 41 ο^οοιηοιίηοΗΝίηη c »J r4 0» -y r4 * 01 ·"·

Λ W

μ •Η

► X

ο as *4 m χ

4 |J

0k f*

C CO

0 H

75 0 4 OOOOOOOOOOO

0 «40* iminminininninintniA

j5 ¢- 1 Ο» <n

•Η Ο I

μ o 0 > 3 m •4 <noo<noo«4<*>oo

Μ I I Η (Π Η Π rl W

O

Q

E

C *j μμμμμμμμμμ w a J£ 04)00000000 0) •rlC ΒβΒβββββββ .

**3 4Η44Η*Η4·4ι><4 4 ( χ Ot 0 0 11 « 7) 4 4 *4 4 4 4 4 4 4 4 C <4 øø^DNNMNfSN μ β Η ø lllllllll« 0*0 Ή 4» 4*

Ή C

r~ γ- γ- r- C < 0» Ok 0» øl Øl

0 O O 0 B

%4fe4fc«nioio«n o tn D* ØØØ-Ø’ØØOIOINN C μ o Ό,β'3Γ«ΟΐΝΑ*',·“'*-»*-' G>i

Η I I ·Η -Η Ή I I løøøø ØH

4 μ y ^ Η η H < I 1 1 O ·-» e c CChmw>>>> 5 5J25>>t>MMMW · *= DK 173753 B1 vi

V ri H

14 o N (Ί ri H o ,H

o ocnoowooo© o w « cn cr> ► . i « Ζ Ζ ~ Z Z « · · I * R X X fc o o o o o o o

Q, A A A AAA A

w oNNM©*or“©«o«OiMifti-i<*> e «Nor'ir'ininr'^^ONOHOCDr'^'

V»£ ri r-t «Η Γ* Oi *M

"2 C « ♦[*!♦( «! +1 ♦! *! ♦! ♦! + 1 *1 ♦! *1 ♦ ! ♦ ! +1 ♦ 1 a S + I ©«βΗΟ^ΝΟΙΊΟΝΟΟΦΝΗΟσ*^

0» 0) ^CTteOOiOCDf^MNOOS^MOHN

C h, <ΝΓ'·'*'0»Γ>^ΙΓ>ΙΓ>ηί'’»ΓΝ^Γ*,·ΟΟ»'·ίΓ'* ^ «Η Η Η Η Η

C

Ό* •Η Η •Η 0 Ή C Β Ό η ri ri vi ri ri «Η ri CN O« vi U O O *-t ri O O O O O O Η N ri «Γ» β *j I O OOOOOTOOOO o o o o n ' fi ~ 0 « I . . . . K . * ‘ » I ' * ' ' * Øm <N O O O O O O O O O O o o o

BIS O) A A A A A A A A Λ Λ A A A

*-*· 4 0»

O X

X

9 X

Ό vl t (0 Π <n ¥ *i ·- * · CO »H/norflriO'ør^oo^^iSinOino 1¾ «Η Η p β 's. X «I il i| il il 4| ♦! ♦! *1 +1 ♦! ♦! *\ *1 ♦I +\ ♦! 9 < P 0> W _ u · h c cn 9 a υ u I (η X 4{

H y <0 ^ n H 0 ri N N N W

h a o>

M vi U

> c < •H t «: •j e o 4i

Μ *0 «C

m 9 <n v« rf a c -* t- u ου HH Qv · _ _ øt < w totAtfvtntfiutvtknm iooooop

h ό I Η Η Η Η Η H

O i U Ci vi vi ø H i a «η o • o o

%4 JZ

9 X

rH

tn O B> C cu *

Μ I

C 0 a JÉ I h oooooooo o o o o o UU « llOOOOtH<nOOIIOOOOr4

Η < O H (*> ri cn ri η H m Η H

> I O

X

i» w 4 i %

u S’ø U ti w Η H

«π pfi øøøøøøøø 0 0 0 ø « « η · -η BeeseeeB esses x O y HHH'WHHM'ri Η Η Μ H ii Øl ϋ g 4J *J 4« 4» ^ •vi vi 0» II _

h «aec cofioøi^r«fMr4c<i«fi9eo<ø^M

4 vi *0 vi «0 ΓΝ ΓΝ 4* f IN IN

> f- 0 U f I I < I I * · lllli 4» « vi O «ØQØØØØØ 00400 σ» ^*0·α·σΌΌηίΌ όόόόό- 0 vivivivivivivivi vi vi «Η vi vi 4j y^pyyyyyi iyyyyy

S S S S S S S £ S s s S S S

DK 173753 B1

•H i—I Η »H rd Η Η H

Ό O O O O O CN O O

ρ o oooo o o o ft) v| >,s\ > o oooo o o o Λ ΑΛΛΑ ΑΛΑ α ιηαΐ'ίοΟΌΛ^Νσι η cooocoinco co η co in g O) rd rd d rd

N S

iH Dl W +| +1 +| +| +| +1 +| +1 +1 +1 φ c to v (OritsiD^isiniONOi h æ +1 ^^^00^0000^0101 jG co NonuiWHoidhin Φ lu oo rd d <n > «Η (0

*r| i—{ i—I i—I «Η H i—I H

Ό Φ Ό O OOOO r-lOO

φ E p O OOOO OOO

Jj vd S} v|vvk»|svv

01 P > O OOOO OOO

•ri Λ ΑΛΛΑ ΑΛΑ οι d α I + jCS ”0 m c x < <o M rd VO > JO) OOilll'ilOo'cON^N Ό ω ό «π <y S § ί *6 +| +| +| +| +| +1 +| +! +| +1 f

H ti N S P

3. Dl £3 rd CO 00 ~<D

C CO · * P Ό

<H rdOON'O'.OOindOC··' Φ G

«o as+l „ p >t

•4 rd rd E Ό P

μ ω H P

φ CO W O

JJ <w ίί +1 P ,

> P KOP

•H W S ό -Η Φ p -p o w , h c λ c to

«JO I O) Φ -H

0) 0) P ·—i G Ό P

rd <C 01 vO -ri μ C «J

«J Ή H C Ή B) M

ρ Ό w oooo oooo c na > G > P

o -h -ri i in in in in i in in in in o α ή οι ·· G

P E-ι μ ο>ι<-ιέθφ

Φ 0 ra oo «« $ < O

O. O Q I é, * S S g < ·—> i Φ x

Οι S

PIP g Φ

μ φ φ P P

rn g Ό E Φ O -D

p id Dl d d d P H C

φ G =* rd μ Ρ Ρ Ρ Φ EO Φ * O Ό •H 01 CO P OOO OOO d O Cd Ρ Φ μ ® -rt O I l O O O I ! O O O I + G E μ μ co p d co σι ri η σι 3 h d G 0 Φ ·· .G rd «5

1 < Ό 0. t? ** P

G Φ rd o

*H rd P

P E P Φ (0 S 0) Gi H Dl Ό φφφφφ X C rd Η μ-ρμμ-ΗΡ Φ >« g

φ H rd rd H rd O Dl P

X 0 0 0 0 0 <p «Jprd •Η ΌΌΌΌΌΜΜΦΜΜ C Ό0«·

jC C C C G G η t-> τ-> ό n tn fcO

φ ΦΦΦΦΦΦΦ ΦΦ«} Φ vO

> >>>>>SSSS2 E-< N * DK 173753 B1 * O) •<r -Θ ΙΛ co

tø O

ri Φ a;

CO

"H

u o p <0 Ϊ 5

O P

ri C

P tn (d G C \ (0 ri P ^ CO) VO ri Η Η ri “ri c tø ri ri ri ·« X ffl 0) "“S-V. ^ ri

0) £ H vO Qv 00 O

JO 3 V.^'w'WSw' W ri <#> > Ό

CQP O O 00 00 O C

< G < ri Γ' O «3

Eh rtj O ri ri ϊ> ril CO ·« M-l P <1) to C u to >1 P w (0 <0 <s

P X

ri ri > Ό I ri Ό P β)

X

<0 § H ri

(0 (0 O

tø tø tø ri

O O ri I O O O

tø tøtncn looo -ri

0) <D o Λ OO CO <M

O. fU Q ri * i i i \ DK 173753 B1

•O W ri ri ri *4 ri «4 ri «4 Η Η H

u O N o o m o oo o o ri o o o o s o oooomoMoowooocno en o o o > * · ···'»·*·· 8 ‘ 8 ·» K ‘ ' · o o o o o o OO O o o o o o o

IX A ^ A A A Λ Λ Α A A Λ A AAA

Η ΌΌΛΟι'Οί'ΗΝ'ΟίΛ^Γ'Ο'ΝΗΟΛ'ΟίΛβ'Ο® \ X η Ν Γ4 Μ Η Ν Η Ν Η Η I») »4 *4 ^ <? 5 ♦!♦!+! ♦! ♦! *Ι +! *ϊ ♦! ♦! *Ι ♦ ! +Ι *Ι *1 ♦! *1 *1 + Ι ♦! *1 ♦! ΙΛ

9 X 41 HHaeNHflflftH'remHHNhNNIftOO

tik 0) ο fc* Πlf^^'♦βHfC^OW*COt^^f^,)NI,)«t -4 ΟΙ (4 ri ΟΙ ri ri ri ΟΙ Η ι4 Ν Ν Η

9 C

9 U

« «Η

« Β *β ri ri «4 ri ri ri ri ri Η Η H

m «Η h O <M O O O ri o o o m O O O o v m o οοοηηοηοοηοοβιοο c* o © o •4 ► . i « « * x x * x · · x * · χ * * « * * * * ^ ri OOOO o o o o O O O ooo

(X A AAA A A A A A AA AAA

0» ♦ o 9 Η «0 X «Η ^ 4* Π Ο 4 4 i1 Μ Η «§ <Ni'l»JfHO**0«CiO»iO<,>4NNHIftOO<,l4 α ri ri ri ri ri S *5 β ^ X ♦! ♦! ♦! ♦! ♦ ! ♦! ♦! ♦ ! *1 ♦! ♦! ♦! ♦ ! ♦! ♦ ! ♦ ! ♦ ! ♦ ! *1 ♦ ! ♦! 9 Qi U _ _ i) Ih C W «* οι Π 9 9« « « *> η X i{ «ΗΐηΟίΛΟ'βΗΗ^ΛΛΟίΛΟΟ'βΛΛβ'^Ιή

4 »4 ØVO« OOlftOIft OH OH) Ηβ»44 E

5 S

S _ *i

9 AJ X

* » OS « 9

#4 Ή U X ri "O

9 C « *? im Ϊ ® S

L β I © 9 ** OOO ** ^ C ri c k < C intfliointnmtninioininminintniAOOOOO β Ό -h ** · *«

« IriH'-trtHr-tHHriHHHWi-fHHlAiniftlAtA «4 ri C Ή O I

A. *0 9 C · ► C ri 3 " O O -i · —Ό («9 O 1 ri E ri ri O 9 0> *< 9 ·· * O O ** I < C Η « C © C —' ►» < W I 9 ri tn «d ri U I u c w

9 « h < C

β 43 B 9 > O

u Οι 4 4 4 W » Λ β α h v v *» k υ h B 9 O < 9

«H9U OOOOOOOOOOOOOOO OOOO M © Ot U O U

p 4 o i i<noo<noomooAOO(noo imooo i ♦ C X «4

• li 4 rt «4 0» rim H fl ΗΟ» H0)0 5 _ H

N o c " -c * c i <0 & o e ·*<

C CM

4 ri © 9 »4 β ri v 9 9 * M ri O I O·

Ji ^ C I« ¢4¾

O 999 99990 O 9 X

Ot ΌΌΌ 9 9 9 9 ti 9 X I

9 4 4 4 * * * 4 4 4 4 C 9 4 β 4J *J i-» *> *J O £ w S S S S * ^ " SS5S i S?.

DK 173753 B1 +j m

C

O

t» 4 i« 0 & 3 tt Ή Ό r-4

X I« O N N Η Η O H

ose ii o loncnooøiooo looinnn ros > · i * 2 x * 2 2 · · * i · 2 X «as xx o o o o o o o

•J J α ΛΑ A AAAA

CO

v w ^ «4 η h oot-oio^oe-cOinoeoNift*«« n \ r fH «-i *-i <s n <s <! cd c w +l +Ϊ +1 ♦( +1 ♦! + ( ♦! *t ·*( ♦! *1 *t *1 + 1 +t μ tt o >i x +| co40HO(or^cof)Or^co<OMH<09^o«

Ό J 0) CtO>4X>Q9i'CCOrs>NNOi<&frttOrlfN

m o. rMt'^Oin^ioiOiomM^i^oowr*«

Qt « τ4 Η H ri ri o «o • u H t« ø 0

fil) H8 H r4 p4 H H ri H H

« V« ^3«H o o H ri O O O O O O H N H

rHX »4 P ΟΙΟΟΟΟΛΟΟΟΟΙΟΟΟΟΛ Q, fl i| * t · % » . SS * « » · < · ' i » 2 M * > Π o oooo o o o o o O o o

H *0 lO ♦ Λ A A A A A A A A A A A A

x «η « a P >4 r4 .-9 W 0 o (Q Ο) Ή ·< Ή Z _ Η H > CO Λ Λ ^ *—i <*> · » * *

Ο r-4 r-||^OiSMO^rHOOf-»^ISm»OrOCO

X « rl 2ft xx: 4| 4| +1 +| ♦! ♦! ♦! ♦! ♦! ♦! ♦! + 1 ♦ ! ♦! *! +1 ♦!

CO ft U

^ · c w ^

N

<aø X +1 «nt-i^cootiootOr'iotn'fcotA'fm*-* 0X v4 (N H -ttMMNNtfl > a.

H

0 u n a.

*h a —» v υ e rl * tt <r-< 4jw encnftftftft&ftft ft ft ft ft ft ft tt « ccccncccc c e c c c c tt * s 'Η η ιίοιηιηιηιηιηιηιΛιΑίΟΟΟΟΟΟ a o tt p i i h *-i η «ί d w *j υ ft o « < X o o p z V« *-· > r a

X

« · ΙΙΟΟΟΟΟΟΟΟΙΙΟΟΟΟΟ •H iCOOOOWtnOOItOOOO·-» •H P tt Η Π Η Π Hm H <*>«< m 0 tt 0

*4 -P O

o c u o tt ft Ή 0. 0 4 P »« c o X b 0 0,1« i i co Φ y Ί· »04·^

tt I 1 yifNNNNNN I

TJ g IIIIIICIIIIIIII

«Η -H

f*· V

DK 173753 B1 Γ» O 1·

tf» I N

x 1

O

H O

Ή Ό

Ot U N HH1

« Η · 0)0<Cn0001<nnQMMM

h <? o o o 0. CM Λ Λ %4 m t» c h ro co ø ntou>(»)«otciheri

Γ" c Η fi ri ^ riMriO'CNmi^riiOCI

in λ \ r «Η S C « f I ♦! ♦! ♦! 11 ♦ ! +1 ♦! ♦ ! «1 ♦ ! ♦! 11 ♦!

*♦1 tO1-<MM»OMr1«tOOtlSr^wmiA

Mj (n OkN'OO^Oifl^O'h^CDrt'A X

^ b. £ ^ 5 ø i

S ^ S

"S I <o 1 "Μ X I «Ί 2 as o s 5 w r M O 7 Μ Ό 2

tf o H M

* u 10 ri ri ri W r« ri 1 j e u m O 0014« w O O O 10 HO> 9 lOO<OOOM(qO(AOOO f MM ► I ··»··· X » 1 1 ' 1 1 j

<0 O O O O O O O O O M

H A b A A A A Λ A Λ Λ Λ Ο *3 1 fl ® V ri 1 Λ Μ fl Ο *η ^ Ο Η H1fhrtO^HNN1i Κ Οι Μ ri ri <jj *S c 5 11 11 ♦! +1 11 ♦! + 1 +1 11 +1 +1 11 +1 ♦ ! ^ > x tn 8

•4 oOOØOHfiØf-Or-O^W

« x 1 \ ri«i1COrilft^1ftriHri©®inf-» Λ <^J HHHHHHHrt ^ <1i £ 4J 1 s s 2.

M riiOOOOOOOOOOOO N

0 x I 1,,.».%1»»·2 JJ

ØC I ΟΟΗΛΟΟΛΛΑΛΛΛΛ Λ ? 5 1 " 2 5 5 « o c X O.

5 I » 1 a .

K U 5 2V, 2 > 4/ r c 1 μ « c _ ·

O 2r| ri CO <·> X

M c Μ I I I · I I I O O Η η O O O N

M-H lllllll ·1'·2· ^ O

•q β « GOOOHcnO · ϋ DK 173753 B1 iπ r» w ♦! o tfi «0

IN

H

« • o* *n * n * b » » * * · * « m * « is is o ir> c ♦ ! -*1 +1 +1 *1 +1 *t O) « co <o to m s> o <s H » ' 4 * * ‘ * oa n r· o* jo η n a

N fS O' ri O H

m rt Η H ri ri H

M

O

< <*><*> r*· r* o o o O r» r^· o u> ιλ w> <

Μ N IH N « N N

X * * K x s x Ζ Ζ X Z Z fc fc

I I I I I I I

« « C tt * « «

r4 r4 »-4 r4 r4 r-f H

< ·< * < < * * 111(111

O Q O Q o O G

0 O o o o o o μ U ft u u u μ CL CL ft. CL A Οι A* * tt tt β C « ►» ft» >< ft* ft ft* 0»

P* »4 J »4 o U

Η Η Η Η Η H < 3 «-Ϊ 3 3 3 3 3 C · « C C · -fl

»a > 4 »j J »J

00 m in S ....

« « «

tn H ·—I H rH

N <<.<<»·» . O U « U O tt o N N iJ ft N *1 t4

Ό CL CL U ft. CL U U

O I « «ri I I M *H

► G G CL Ω O & CL

(111(11 * υ υ o u u o o o < « · « μ r-f r-i Q , « < < 44 4 >0 «»UUtttttt

M >1 ft» < «1» ftl ft« S

M ft »1 »4 N H J J ^

« ϋ O 0, CL ϋ O U

►J r-f -r« -»4 I I Η M *1 w <4 cl o. o u a. o. o.

to « rt o μ μ μ μ μ μ μ tn ««««««tt tn <0 M <0 01 W Λ Ό c e * Η Η Η μ Η H ri « « « tt « « tt tt O» o. ft. ft. O. CL CL ft.

O I I I I I I I

H rt Λ Λ Λ ΙΠ Hi Λ tt tt 1111(11

c C G G G G G G G

« « ft X X 4 4 4 4 4 » » o: « ««·«««« tx x w Λ Λ λ λ js .c Λ m

J ft. 0. 0. Du ft. ft, O. *H

H rf Η ri Η H ri «

OUUOUUO V

CL CL & CL CL tL & C

G G O G G G G Ή μ α.

...... o Η Η Η Η Η Η ri β « tt « tt « « Ή * ζ ζ ζ ζ ζ ζ ι ι ι ι ι r ι ft is in in γη γη <\ι <ν tt ι ι ι ι i r ι μ g g o g g g g x 1 t I f 4 I f uouuuou μ <<<<<<< o 1((111( ft« * K z z z z z

HJ

c « . μ μ * «

c r- tn o ό «η <n n> C

σι in co rs co n s· o « co <n H l«> r4 » i«> Di n in o tt <o <o ui o H IS IN IS IN IS IS IN « 59 DK 173753 B1

Litteraturliste 1. Ljungqvist, A., Feng, D.-M., Tang, P.-F.L., Kubota, M., Okamoto, T., Zhang, Y., Bowers, 5 C.Y., Hook, W.A. & Folkers K. (1987) Biochem.

Biophys. Res. Commun. 148 (2), 849-586.

2. Karten, M.D. & Rivier, J.E. (1986) Endocr. Rev.

1, 44-56.

10 3. Hook, W.A., Karten, M. & Siraganian, R.P.

(1985) Fed. Proc. Fed. Am. Soc. Exptl. Biol.

44, 1323.

15 4. Karten, M.D., Hook, W.A., Siraganian, R.P.,

Coy, D.H., Folkers, K., Rivier, J.E. & Roeske, R.w. (1987) in LHRH and its Analogs; Contraceptive and Therapeutic Applications Part 2, udg. Vickerty, B.H. & Nestor, J.J., Jr., 20 (MTP Press Ltd., Lancaster, England) p. 179- 190.

5. Rivier, J.E., Porter, J. Rivier, C.L., Perrin, M., Corrigan, A., Hook, W.A., Siragania, R.P. & 25 Vale, W.W. (1986) J. Med. Chem. 29, 1846-1851.

6. Roeske, R.W., Chaturvedi, N.C., Hrinyo-Pavlina, T., & Kowalczuk, M. (1987) in LHRH and its

Analogs; Contraceptive and Therapeutic 30 Applications Part 2, udg. Vickerty, B.H. &

Nestor, J.J., Jr., (MTP Press Ltd., Lancaster, England) p. 17-24.

60 DK 173753 B1 7· Hocart, S.J., Nekola, M.V. & Coy, D.H. (1987) J. Med. Chem. 30, 739-743.

8· Nestor, J.J., Tahilramani, R., Ho, T.L., McRae, 5 G.I. & Vickery, B.H. (1988) J. Med. Chem. 31, 65-72.

9· Bajusx, S., Kovacs, M., Gazdag, M., Bokser, L·.,

Karashima, T., Csernus, V.J., Janaky, T., 10 Gouth, J. & Schally, A.V (1988) Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 85, 1637-1641.

1°· Rivier, J., Kupryszewski, G., Varga, J.,

Porter, J., Rivier, C., Perrin, M., Hagler, A., 15 Struthers, S., corrigan, A. & Vale, W. (1988) J. Med. Chem. 31, 677-682.

11. Folkers, K., Bowers, C.Y., Shieh, Liu, Y.-Z., Xiao, S.-B., Tang, P.-F.L. & Chu, J.-Y.

20 (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 (3) 1221-1226.

12. Humphries, J., Wan, Y.-P., Folkers, K. & Bowers, C.Y. (1978) J. Med. Chem. 21 (1), 120- 25 123.

13. Miyamoto, K., Hasegawa, Y., Nomura, M., Igarashi, M., Kanagawa, K. S Matsuo, H. (1984)

Proc. natl. Acad. Sci. USA 81, 3874-3878.

30 14. Sherwood, N., Eiden, L., Brownstein, M., Spiess, J., Rivier, J., & Vale, W. (1983) Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 80, 2794-2798.

61 DK 173753 B1 15. Sherwood, N.M., Sower, S. A., Marshak, D.R.,

Fraser, B.A. & Brownstein, M.J. (1986) J. Biol.

Chera. 261, 4812-4819.

5 16. Nekola, M.V., Horvath, A., Ge, L.-J., Coy, D.H.

& Schally, A.V. (1982) Science 218, 160-161.

17. Bernardi, et al., J. Pharm. Pharmacol. 19^, 95 (1967).

10 18. Fife, T.H. and Prsystas, T.J., J. Am. Chem.

Soc. 107, 1041 (1985).

19. Lecher et al., U.S. 2 872 484, Feb. 3, 1959, 15 Chem. Abstr. 53, 11238c.

20. Tjoeng et al., Chem. Ber. 108, 862 (1975).

21. Humphries et al., J. Med. Chem. ,21 (1), 120 20 (1978).

22. Benoiton, L., Can. J., Chem. 4_2, 2043 (1969).

23. Prasad et al., J. Med. Chem. 19^, 492 (1976).

25 24. Zinner, H. and Fiedler, H., Arch, pharm. 291 (63), 330 (1958) .

Ændringer kan foretages i den enkelte aminosyre eller i 30 derivaterne eller i deres samlede forbindelse beskrevet heri eller i trinnene eller rækkefølgen af trinnene ved fremstillingsmåden uden at gå uden for opfindelsens rammer.

Claims (14)

1. LHRH-antagonist med i hovedsagen antiovulatorisk aktivitet og negligerbar histaminfrigørelsesaktivitet som 5 er et decapeptid, kendetegnet ved, at (a) arginin og dets derivater ikke udnyttes, (b) lysin i position 5 og/eller 6 er konverteret til derivater med acylgrupper på e-amino gruppen, og (c) i position 8 er indeholdt en alkyleret lysin 10 eller ornithin.

2. LHRH-antagonist ifølge krav 1, kendetegnet ved, at decapeptidet er baseret på [O1, D-pCIPhe2, D-3-Pal3, Ser4, ()5, ()6, Leu7, ()8, Pro9, D-Ala10]-NH2. 15

3. LHRH-antagonist ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den er [N-Ac-D-2-Nal1, NicLys5, D-NicLys6, Ilys8]-NH2 eller [N-Ac-D-2-Nal1, PicLyss, D-PicLys6, Ilyse]-NH2

4. LHRH-antagonist ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den er valgt blandt [N-Ac-D-2-Nal1, Tyr5, D-NicLys6, ILys8l-NH2; [N-Ac-D-2-Nall, Tyr5, D-NicLys6, Me2Ly s 8 J-NH2; 25 [N-Ac-D-2-Nal1, Tyr5, D-NicLys6, IOrn8J-NH2; [N-Ac-D-2-Nal1, Dpo5, D-NicLys6, ILys8]-NH2; [N-Ac-D-2-Nall, ILys5, D-NicLys6, ILys8]-NH2; iN-Ac-D-2-Nal1, 3-Pal5, D-NicLys6, ILys8]-NH2; [N-Ac-D-2-Nal1, 3-Pal5, D-NicLys6, IOrn8]-NH2; 30 [N-Ac-D-2-Nal1, Ile5, D-NicLys6, ILysa]-NH2; [N-Ac-D-2-Nal1, Ile5, D-NicLys6, IOrn8]-NH2; [N-Ac-D-2-Nal1, NicOrn5, D-NicLys6, IOrn8]-NH2; DK 173753 B1 [N-Ac-D-2-Nal1, DMGlys1, D-NicLys2, ILys3]-NH2; [N-Ac-D-2-Nal1, PicLys1, D-NicLys2, ILysB]-NH2; [N-Ac-D-pCIPhe1, Tyr1, D-NicLys®, ILys3]-NH2; [N-Ac-D-Cl2Phe1, Tyr1, D-NicLys2, ILys3]-NH2;

5 [N-Ac-D-2-Nal1, HicLys1, D-Dpoe, ILys3]-NH2; [N-Ac-D-2-Nal1, NicLys1, D-BzLys2, ILys3]-NH2; [N-Ac-D-2-Nal1, NicLys1, D-PicLys®, ILys3]-NH2; [N-Ac-D-2-Nal1, NicLys1/ D-AnGlu®, ILys3]-NH2; [N-Ac-D-2-Nall, NicLys1, trans-D-NACAla2, ILys3]-NH2; 10 [N-Ac-D-2-Nal1, NicLys1, cis-D-NACAla2, ILyse]-NH2; [N-Ac-D-2-Nal1, NicLys1, D-Me2Lys2, ILys3]-NH2; [N-Ac-D-2-Nal1, NicLys1, D-PzcLys2, ILys3]-NH2; [N-Ac-D-2-Nal1, NicLys1, D-NicLys2, Dpo3]-NH2; [N-Ac-D-2-Nal1, NicLys1, D-NicLys2, IOrn3]-NH2; 15 [N-Ac-D-2-Nal1, NicLys1, D-NicLys2, CypLysB]-NH2; [N-Ac-D-2-Nal1, NicLys1, NicLys2, ILys3]-NH2; [N-Ac-D-2-Nal1, INicLys1, D-INicLys2, ILys3]-NH2; [N-Ac-D-2-Nal1, MNicLys1, D-HNicLys*, ILys3]-NH2; [N-Ac-D-2-Nal1, DMGLys1, D-BzLys2, ILys3]-NH2; og 20 [N-Ac-D-2-Nal1, PzcLys1, D-PzcLys2, ILys3]-NH2; LHRH-antagonist med i hovedsagen antiovulatorisk aktivitet og negligerbar histaminfrigørelsesaktivitet, som er et decapeptid valgt blandt 2 25 3 [N-Ac-D-2-Nal1, D-Cl2Phe2 ,D-3-Pal3, Ser4, PicLys1, D-PicLys2, Leu4 , Hys3, Pro5 ,D-Ala6] -NH2 / 4 [N-Ac-D-Cl2Phel, D-pClPhe2, D-3-Pal1, Ser4, PicLys1, D-PicLys2, Leu4, Hys3, Pro5, D-Ala6 ] -NH2 ; 5 3 0 [N-Ac-D-2 -Nal1, D-3-Pal2, D-pClPhe3, Ser4, PicLys1, D- 6 PicLys2, Leu4, IOrn3, Pro5, D-Ala6 J -NH2; DK 173753 B1 lN-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-PzAla3, Ser4, PicLys5,D-Pi cLys 6, Leu7, IOrn8, Pro9, D-Al a10 ] -NH2; [N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2 ,D-Trp3, Ser4, PicLys5, D-PicLys6, Leu7, IOrn8, Pro9, D-Ala10 ] -NH2; 5 [N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, Ser4 , PicLys5, D- Pi cLys6, Val7, IOrn8, Pro9, D-Ala10 ] -NH2 ; [N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, Ser4 , PicLys5, D-PicLys6, Val7, IOrn8, Pro9, D-Ala10] -NH2 ; [N-Ac-D-2-Nal1/D-pClPhe2,D-3-Pal3/ Ser4, PicLys5,D-10 PicLys6, Aile7, ILys8 , Pro9,D-Ala10] -NH2 ; [N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2,D-3-Pal3, Ser4, PicLys5,D-Pi cLys6, Ai 1 e7, IOr na, Pr o9, D -Al a10 ] -NH2 ; [N-Ac-D-2-Nal1,D-pClPhe2, D-3-Pal3, Ser4 , PicLys5 , D-PicLys6,Abu7, ILys8, Pro9, D-Ala10] -NH2 ; 15 [N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, Ser4, PicLys5 ,D- PicLys6, Abu7, IOrn8, Pro9, D-Ala10 ] -NH2 / [N-Ac-D-2-Nal1,D-pClPhe2,D-3-Pal3,Ser4, PicLys5,D-Pi cLys6, Trp7, ILys8, Pro9, D-Ala10 ] -NH2 ; [N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, Ser4, PicLys5, D-20 Pi cLys6, Nle7, ILys8, Pro9, D-Ala10 ] -NH2; [N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2,D-3-Pal3, Ser4, PicLys5 , D-PicLys6, Nval7, ILys8, Pro9, D-Ala10] -NH2; [N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, Ser4, PicLys5, D-PicLys6, Ile7, ILys8, Pro9, D-Ala10 ] -NH2 ; 25 [N-Ac-D-2-Nal1, D-pCl Phe2, D-3-Pal3, Ser4, PicLys5, D- PicLys6, Ala7, ILys8, Pro9, D-Ala10] -NH2 / [N-Ac-D-2-Nal1,D-pClPhe2 ,D-3-Pal3, Ser4, PicLys5,D-Pi cLys6, Leu7,1 Lys8, Pip9, D-Ala10 ] -NH2 / [N-Ac-D-2-Nal1, D-pCl Phe2, D-3-Pal3, Ser4, PicLys5, D-3 0 PicLys6, Leu7, ILys8, Pro9, D-Abu10 ] -NH2 ; [N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, Ser4, PicLys5, D-PicLys6, Leu7, IOrn8, Pro9, D-Ala10] -NH2; DK 173753 B1 [N-Ac-D -2 -Nal1, D-pCl Phe2, D-Ti nGly3, Ser4, Pi cLys5, c-D -PzACAla6, Leu7,1 Lys8, Pro9, D-Ala10 ] -NH2 ; lN-Ac-D-2-Nal1 , D-pClPhe2, D-PzAla3, Ser4, PicLys5 ,c-D-PzACAla6 , Leu7, ILys8, Pro9 # D-Ala10 ] -NH2 ; 5 [N-Ac-D-2 -Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, Ser4, PicLys5, c-D- PzACAla6, Leu7, ILys8, Pro9,D-Ala10] -NH2 ; [N-Ac-D-2-Nal1, D-pCIPhe2, D-3-Pal3, Ser4, PicLys5, c-D-PzACAla6, Leu7, IOrn8, Pro9, D-Ala10 ] -NH2 ; [N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, Ser4, PicLys5, c-D-10 PzACAla6, Val7, ILys8, Pro9,D-Ala10] -NH2; [N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, Ser4, PicLys5, c-D-PzACAla6, Phe7, ILys8, Pro9,D-Ala10 ] -NH2 ; [N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2 ,D-3-Pal3, Ser4, PicLys5, c-D-PzACAla6, Leu7, ILys8, Pro9 ,D-Ser10] -NH2 ; 15 [N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2,D-3-Pal3, Ser4, PicLys5, c-D- PzACAla6, Leu7, ILys8, Pro9, NHEt10 ]; [N-Ac-D-2 -Nal1, D-pCl Phe2, D-3-Pal3, Ser4, PicLys5, c-D-PmACAl a6, Leu7, ILys8, Pro9, D-Ala10 ] -NH2 ; [N-Ac-D-2-Nal1,0-pClPhe2, D-3-Pal3, Ser4, cPzACAla5, D-2 0 PicLys6, Leu7, ILys®, Pro9, D-Ala10 ] -NH2 ; [N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, Ser4, HOBLys5, D-PicLys6, Abu7, ILys®, Pro9, D-Ala10 ] -NH2 ; [N-Ac-D-2-Nal1, D-pCl Phe2, D-3-Pal3, Ser4 ,Ci t5, D-PicLys6, Abu7, ILys8, Pro9, D-Ala10] -NH2 ; 25 [N-Ac-D-2 -Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, Ser4, Tyr51D- PicLys6, Leu7, IOrn®, Pro9, D-Al a10 ] -NH2 ; [N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2 ,D-3-Pal3, Ser4 ,NicLys5, t-DPzACAla6, Leu7, ILys®, Pro9, D-Ala10 ] -NH2 ; [N-Ac-D-2-Nal1, D-pCl Phe2, D-3-Pal3, Ser4, NicLys5, c-30 DPzACAla6, Leu7, ILys®, Pro9, D-Ala10 ] -NH2 ; [N-Ac-D-2 -Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, Ser4, NicLys5, D-NicLys6, NMeLeu7, ILys®, Pro9, D-Ala10] -NH2; DK 173753 B1 [N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2 ,D-3-Pal3, Ser4, NicLys5, D-PzcLys6, Leu7, IOrn8, Pro9, D-Ala10] -NH2 ; [N-Ac-D-2-Nal1 ,D-pClPhe2 ,D-3-Pal3, Ser4 ,MPicLys5 ,D-M-PicLys6 ,Leu7, ILys8, Pro9, D-Ala10] -NH2; 5 [N-Ac-D-2-Nal1/D-pClPhe2,D-3-Pal3/Ser4 ,PmcLys5,D-PmcLys6, Leu7, ILys8, Pro9,D-Ala10] -NH2; lN-Ac-D-2-Nal1,D-pClPhe2 ,D-3-Pal3 ,Ser4 ,c-PzACAla5, c-D-PzACAla6, Leu7, ILys8, Pro9,D-Ala10] -NH2; [N-Ac-D -2 -Nal1, D-pCIPhe2, D-3-Pal3, Ser4, Tyl5 ,c-D-10 PzACAla6,Leu7, ILys8, Pro9,D-Ala10] -NH2 ; [N-Ac-D-2-Nal1,D-pClPhe2, D-3-Pal3, Ser4, Tyr5 ,c-D-PzACAla6, Leu7, ILys8, Pro9, D-Ser10 ] -NH2 ; [N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2 ,D-3-Pal3, Ser4, PicLys5,c-D-PzACAla6,Leu7, ILys8, Pro9, Sar10] -NH2; 15 [N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2,D-3-Pal3, Ser4, c-PzACAla5 ,D- PicLys6,Val7,1 Lys8, Pro9, D-Ala10] -NH2; [N-Ac-D-2-Nal1,D-pClPhe2,D-3-Pal3,Ser4, PicLys5, t-D-PACAla6, Leu7, ILys8, Pr o9, D-Ala10] -NH2; [N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, Ser4, PicLys5, c-D-20 PACAla4,Leu7, ILys8,Pro9,D-Ala10]-NH2; og [N-Ac-D-2-Nal1, D-pClPhe2, D-3-Pal3, Ser4, PicLys5, t-D-PzACAla6, Leu7, ILys8, Pro9, D-Ala10 ] -NH2.

6. Decapeptid ifølge et hvilket som helst af de 25 foregående krav, kendetegnet ved at have en antiovulatorisk aktivitet på ca. 90 % eller mere ved en dosis på 1 μg ifølge testen af Humphries et al. (J. Med. Chem. 21: 120-123, 1978).

7. Decapeptid ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved at have en histaminfrigørelse korresponderende til en EDso værdi på DK 173753 B1 ca. 86 μg/ml eller mere ifølge testen af Karten et al. {LHRH and its Analogs: Contraceptive and Therapeutic Applications Part 2, pp. 179-190, 1987).

8. Decapeptid ifølge krav 1 eller 5 til anvendelse i medicin og/eller veterinær medicin

9. Anvendelse af decapeptid ifølge krav 1 eller 5 til fremstilling af et medikament til at hæmme ovulering hos 10 et dyr

10. Anvendelse af decapeptid ifølge krav 1 eller 5 til fremstilling af et medikament til at hæmme pubertetstart hos et dyr. 15

11. Anvendelse af decapeptid ifølge krav 1 eller 5 til fremstilling af et medikament til at hæmme seksuel impetus hos et dyr.

12. Anvendelse af decapeptid ifølge krav 1 eller 5 til fremstilling af et medikament til at ændre den gonadale funktion hos et dyr.

13. Anvendelse af decapeptid ifølge krav 1 eller 5 til 25 fremstilling af et medikament til at hæmme vækst af hormonafhængige tumorer i et dyr.

14. Anvendelse af decapeptid ifølge krav 1 eller 5 til fremstilling af et medikament til at sænke LH og FSH 30 niveauer i serum hos en post-menopausal kvinde.