DE69427650T2

DE69427650T2 - Verbindungen mit wachstumshormon-freisetzenden eigenschaften

Info

Publication number: DE69427650T2
Application number: DE69427650T
Authority: DE
Inventors: Birgit Sehested Hansen; Nils Langeland Johansen; Jesper Lau; Behrend Friedrich Lundt; Kjeld Madsen; Henning Thogersen
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Helsinn Therapeutics US Inc
Priority date: 1993-12-23
Filing date: 1994-12-22
Publication date: 2001-11-22
Anticipated expiration: 2014-12-23
Also published as: WO1995017422A1; IL112111A; HU9601740D0; NO962664D0; HUT74820A; HU221092B1; CA2179598A1; ATE202785T1; DE69427650D1; PL181286B1; TW438810B; NO315611B1; AU683121B2; IL112111A0; PL315114A1; CN1138334A; FI962591A0; EP0736038A1; JPH09506873A; CZ291382B6

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Peptidderivate, Zusammensetzungen, welche diese enthalten, und deren Verwendung zur Behandlung medizinischer Störungen, welche die Folge eines Mangels an Wachstumshormon sind.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Wachstumshormon ist ein Hormon, welches das Wachstum aller Gewebe stimuliert, die zum Wachstum in der Lage sind. Darüber hinaus ist bekannt, daß Wachstumshormon eine Reihe von Auswirkungen auf metabolische Prozesse hat, z. B. Stimulierung der Proteinsynthese und Mobilisierung freier Fettsäuren, und eine Umstellung des Energiemetabolismus vom Kohlenhydrat- zum Fettsäuremetabolismus verursacht. Ein Mangel an Wachstumshormon kann zu einer Reihe schwerwiegender medizinischer Störungen, z. B. Zwergwuchs, führen.
Wachstumshormon wird von der Hypophyse freigesetzt. Die Freisetzung steht, entweder direkt oder indirekt, unter der strikten Kontrolle einer Reihe von Hormonen und Neurotransmittern. Die Freisetzung von Wachstumshormon karin durch Wachstumshormon-freisetzendes Hormon (GHRH) stimuliert und durch Somatostatin inhibiert werden. In beiden Fällen werden die Hormone vom Hypothalamus freigesetzt, deren Wirkung wird jedoch primär über spezifische Rezeptoren, die sich in der Hypophyse befinden, vermittelt. Andere Verbindungen, welche die Freisetzung von Wachstumshormon aus der Hypophyse stimulieren, wurden ebenfalls beschrieben. Beispielsweise setzen Arginin, L-3,4-Dihydroxyphenylalanin (L-Dopa), Glucagon, Vasopressin, PACAP (Hypophysenadenylylcyclase-aktivierendes Peptid), Muscarin-Rezeptor-Agonisten und ein synthetisches Hexapeptid, GHRP (Wachstumshormon-freisetzendes Peptid), endogenes Wachstumshormon entweder über eine direkte Wirkung auf die Hypophyse oder durch Bewirkung der Freisetzung von GHRH und/oder Somatostatin aus dem Hypothalamus frei.
Bei Störungen oder Zuständen, bei denen erhöhte Niveaus an Wachstumshormon erwünscht sind, macht die Proteinnatur des Wachstumshormons einen anderen Weg als parenterale Verabreichung unmöglich. Ferner sind andere direkt wirkende natürliche Sekretagoga, z. B. GHRH und PACAP, längere Polypeptide, aus welchem Grunde deren orale Verabreichung nicht möglich ist.
Die Verwendung kürzerer Peptide zur Erhöhung der Niveaus an Wachstumshormon bei Säugern xvurde bereits vorgeschlagen, z. B. in EP 18 072, EP 83 864, WO 89/07110, WO 89/01711, WO 89/10933, WO 88/9780, WO 83/02272, WO 91/18016, WO 92/01711 und WO 93/04081.
J. Med. Chem. 33 (7), 1954-1958, 1990, offenbart Analoga von Wachstumshormon-freisetzendem Faktor (1-29)amid, enthaltend eine reduzierte Peptidbindung. Die Zusammensetzung von Wachstumshormon-freisetzenden Peptiden oder Peptidderivaten ist sowohl für deren Vermögen zur Freisetzung von Wachstumshormon als auch für deren Bioverfügbarkeit von Bedeutung. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Bereitstellung von Peptiden mit Wachstumshormon-freisetzenden Eigenschaften, welche im Vergleich zu bekannten Peptiden dieses Typs verbesserte Eigenschaften aufweisen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel I
A - B - C - D - E (-F)p
worin
p 0 oder 1 ist;
A Imidazolyl-C&sub1;&submin;&sub6;-alkansäure, Imidazolyl-C&sub1;&submin;&sub6;-alkensäure, Amino-C&sub1;&submin;&sub6;-alkansäure oder Amino-C&sub1;&submin;&sub6;-alkensäure oder eine L- oder D-α-Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus H-His, H-Ala, H-D-Ala, H-(β-Alanin), H-Aib, Sarcosin und Gly, ist;
B D-Trp, D-2Nal oder D-Phe ist;
C Ala, Ser oder Gly ist;
D Trp, Phe, β-(2-Thienyl)alanin oder N-Aralkylglycin ist;
E, wenn p 1 ist, D-Phe ist oder, wenn p 0 ist, E -NH-CH(CH&sub2;-R³)-CO-R&sup4; oder -NH-CH(CH&sub2;-R³)-CH&sub2;-R&sup4; ist, worin
R³ Phenyl ist,
und R&sup4; Piperazino, Morpholino, Piperidino, -OH oder -N(R&sup5;)R&sup6;, worin jedes von R&sup5; und R&sup6; unabhängig Wasserstoff oder Niederalkyl ist, darstellt;
F, wenn p 1 ist, -NH-CH(R¹&sup0;)-(CH&sub2;X-R&sup7; ist, worin
v 0 oder eine ganze Zahl zwischen 1 und 8 ist, und
R&sup7; Imidazolyl, Piperazino, Morpholino, Piperidino oder -N(R&sup8;)-R&sup9;, worin jedes von R&sup8; und R&sup9; unabhängig Wasserstoff oder Niederalkyl ist, oder das Amadori-Umlagerungsprodukt aus einer Aminogruppe und einer Hexapyranose oder einer Hexapyranosylhexapyranose der Formel
darstellt, und
R¹&sup0; -H, -COOH, -CO-R¹¹, CH&sub2;-R¹¹ oder -CH&sub2;-OH, worin R¹¹ Piperazino, Morpholino, Piperidino oder -N(R)-R¹³ ist, worin jedes von R und R¹³ unabhängig Wasserstoff oder Niederalkyl ist, darstellt;
mit der Maßgabe, daß mindestens eine Amidbindung zwischen A und B, B und C, C und D, D und E oder, wenn p 1 ist, E und F durch Aminomethylen ersetzt ist oder daß, wenn p 0 ist, E -NH-CH(CH&sub2;-R³)-CH&sub2;-R&sup4; ist, oder daß, wenn p 1 ist, R¹&sup0; CH&sub2;-R¹¹ ist;
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Es wird davon ausgegangen, daß Peptidderivate der Formel I aufgrund des Ersatzes einer Amidbindung (-CONH-) durch Aminomethylen (-CH&sub2;NH) oder durch Einführung eines N-Aralkylglycins eine verbesserte Beständigkeit gegenüber proteolytischem Abbau durch gastrointestinale Enzyme oder Plasmaenzyme aufweisen. Es steht zu erwarten, daß die erhöhte Beständigkeit der Peptidderivate der Erfindung gegenüber proteolytischem Abbau deren Bioverfügbarkeit im Vergleich zu derjenigen der in der früheren Literatur vorgeschlagenen Peptide verbessert.
Im vorliegenden Kontext soll der Begriff "Niederalkyl" Alkyl mit 1-6 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Pentyl oder Hexyl, bedeuten.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

In einer bevorzugten Ausführungsform der Verbindung der Formel I ist p 1. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Verbindung der Formel I ist A His, D-Ala oder Imidazolylpropionsäure. B ist vorzugsweise D-Trp oder D-2Nal. C ist vorzugsweise Ala. D in der Bedeutung von N-Aralkylglycin ist vorzugsweise N-Benzylglycin. D ist vorzugsweise Trp. E ist vorzugsweise D-Phe. Im Rahmen der Bedeutung von F ist v vorzugsweise 3 bis 6 und R&sup7; ist vorzugsweise -NH&sub2;. R¹&sup0; ist vorzugsweise -CONH&sub2;, -CH&sub2;OH.
Beispiele spezieller Verbindungen der Erfindung sind
H-Hisψ(CH&sub2;NH)D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH&sub2;
H-His-D-Trpψ(CH&sub2;NH)Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH&sub2;
H-His-D-Trp-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp-D-Phe-Lys-NH&sub2;
H-His-D-Trp-Ala-Trpψ(CH&sub2;NH)D-Phe-Lys-NH&sub2;
H-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Pheψ(CH&sub2;NH)Lys-NH&sub2;
H-D-Ala-D-2Nal-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp-D-Phe-Lys-NH&sub2;
H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-D-Pheψ(CH&sub2;NH)Lys-NH&sub2;
(3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-2Nal-Ala-Trp-D-Pheψ(CH&sub2;NH)Lys-OH
(3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-2Nal-Ala-Trp-D-Pheψ(CH&sub2;NH)Lys-NH&sub2;
(3-(4-Imidazolyl)acryloyl)-D-2Nal-Ala-Trp-D-Pheψ(CH&sub2;NH)Lys-NH&sub2;
H-D-Ala-D-Phe-Ala-Trp-D-Pheψ(CH&sub2;NH)Lys-NH&sub2;
(2R)-(H-D-Ala-D-Phe-Ala-Trp-NH)-3-Phenylpropylamin
(2S)-(H-D-Ala-D-2Nal-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp-D-Phe-NH)-6-Aminohexanol
H-D-Ala-D-2Nal-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp-D-Phe-NH&sub2;
4-(H-D-Ala-D-2Nal-Alaψi(CH&sub2;NH)Trp-D-Phe-NH)-Butylamin
(2R)-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-NH)-3-Phenylpropylamin
((2R)-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-NH)-3-Phenylpropylamino)hexylamin
(2R)-(H-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-NH)-3-Phenylpropylamin
(2R)-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-NH)-3-Phenylpropylamin
H-Aib-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-D-Pheψ(CH&sub2;NH)Lys-NH&sub2;
(2S)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)ψ(CH&sub2;NH)D-Phe-Ala-Trp-D-Phe-NH)- 6-aminohexanol
(2S)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Pheψ(CH&sub2;NH)Ala-Trp-D-Phe-NH)- 6-aminohexanol
(2S)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Phe-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp-D-Phe-NH)- 6-aminohexanol
(2S)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Phe-Ala-Trpψ(CH&sub2;NH)D-Phe-NH)- -6-aminohexanol
(2S)-(2R)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Phe-Ala-Trp-NH)-3-phenylpropylamino)-6-aminohexanol
3-((3-(4-Imidazolvl)propionyl)-D-Trp-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp-D-Phe-NH)propylamin
(2S)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Phe-Ala-Trp-D-Pheψ(CH&sub2;NH)NH)-6- aminohexanol
(2S)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Trp-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp-D-Phe-NH)-6- aminohexanol
3-((3-(4-Imidazolvl)propionyl)-D-Trp-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp-D-Phe-NH)propylamin
H-D-Ala-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Glv-D-Pheψ(CH&sub2;NH)Lys-NH&sub2;
H-Aib-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-D-Pheψ(CH&sub2;NH&sub2;).

Abkürzung

D-2Nal: D-2-Naphthylalanin
N-Bzl: N-Benzylglycin
H-Aib: H-Aminoisobuttersäure
Verbindungen der Formel I können nach herkömmlichen Verfahren der Peptidsynthese in Lösung oder fester Phase hergestellt werden. Beispielsweise kann eine Festphasensynthese im wesentlichen wie von Stewart und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Auflage, Rockford, Illinois, USA, 1976, beschrieben durchgeführt werden. Peptidsynthese in Lösung kann beispielsweise im wesentlichen wie von Bodansky et al., Peptide Synthesis, 2. Auflage, New York, New York, USA, 1976, beschrieben durchgeführt werden.
Aminomethylen als Ersatz einer Amidbindung kann nach dem von Y. Sasaki und D. H. Coy, Peptides 8(1), 1987, S. 119-121, beschriebenen Verfahren eingeführt werden. Peptidderivate, die eine Mono- oder Dihexapyranose-derivatisierte Aminogruppe enthalten, können mittels einer Amadori-Umlagerung im wesentlichen nach dem von R. Albert et al., Life Sciences 53, 1993, S. 517-525, beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Beispiele geeigneter Mono- oder Dihexapyranosen sind Glucose, Galactose, Maltose, Lactose oder Cellobiose. Derivate, die als Ausgangsmaterialien bei der Synthese eingesetzt werden, können im Handel erhalten werden und können erforderlichenfalls mit geeigneten Schutzgruppen versehen werden.
Pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze von Verbindungen der Formel I schließen diejenigen ein, welche durch Umsetzung des Peptids mit anorganischen oder organischen Säuren, z. B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Phosphorsäure, Milchsäure, Maleinsäure, Phthalsäure, Citronensäure, Glutarsäure, Gluconsäure, Methansulfonsäure, Salicylsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Toluolsulfonsäure, Trifluoressigsäure, Sulfaminsäure und Fumarsäure, gebildet werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktiven Bestandteil eine Verbindung der allgemeinen Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine Verbindung der vorliegenden Erfindung enthalten, können nach herkömmlichen Techniken hergestellt werden, z. B. wie in Remington's Pharmaceutical Sciences, 198, beschrieben. Die Zusammensetzungen können in herkömmlichen Formen vorliegen, beispielsweise Kapseln, Tabletten. Aerosole, Lösungen, Suspensionen oder topische Applikationen.
Der eingesetzte pharmazeutische Träger oder das eingesetzte Verdünnungsmittel kann ein herkömmlicher fester oder flüssiger Träger sein. Beispiele fester Träger sind Lactose, Kaolin. Sucrose, Cyclodextrin, Talkum, Gelatine, Agar, Pectin, Akaziengummi, Magnesiumstearat, Stearinsäure oder Niederalkylether von Cellulose. Beispiele flüssiger Träger sind Sirup, Erdnußöl, Olivenöl, Phospholipide, Fettsäuren, Fettsäureamine, Polyoxyethylen und Wasser.
Gleichermaßen kann der Träger oder das Verdünnungsmittel irgendein im Stand der Technik bekanntes Material zur verzögerten Freisetzung, z. B. Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat, allein oder mit einem Wachs gemischt einschließen. Falls ein fester Träger zur oralen Verabreichung eingesetzt wird, kann die Präparation in Tablettenform vorliegen, in einer Hartgelatinekapsel in Pulver oder Pelletform untergebracht sein, oder kann in Form einer Pastille (Troche, Lozenge) vorliegen. Die Menge des festen Trägers wird in großem Umfang variieren, wird jedoch gewöhnlich etwa 25 mg bis etwa 1 g betragen.
Eine typische Tablette, welche nach herkömmlichen Verfahren zur Tablettenherstellung präpariert werden kann, kann enthalten:

Kern:

Aktive Verbindung (als freie Verbindung oder deren Salz) 100 mg
Kolloidales Siliciumdioxid (Aerosil®) 1,5 mg
Mikrokristalline Cellulose (Avicel®) 70 mg
Modifizierter Cellulosegummi (Ac-Di-Sol) 7,5 mg
Magnesiumstearat
Beschichtung:
HPMC, etwa 9 mg
*MywacettTM9-40 T, etwa 0,9 mg
*Acyliertes Monoglycerid, als Weichmacher für eine Filmbeschichtung eingesetzt
Falls ein flüssiger Träger eingesetzt wird, kann die Präparation in Form eines Sirups, einer Emulsion, Weichgelatinekapsel oder sterilen, injizierbaren Flüssigkeit, z. B. einer wäßrigen oder nicht-wäßrigen Flüssigkeitssuspension oder -lösung, vorliegen.
Zur nasalen Verabreichung kann die Präparation eine Verbindung der Formel I, gelöst oder suspendiert in einem flüssigen Träger, insbesondere in einem wäßrigen Träger, zur Aerosol-Anwendung enthalten. Der Träger kann Additive, wie z. B. Solubilisierungsmittel, z. B. Propylenglycol, Tenside wie Gallensäuresalze oder Polyoxyethylenether höherer Alkohole, Absorptionsverstärker, wie z. B. Lecithin (Phosphatidylcholin) oder Cyclodextrin, oder Konservierungsmittel, wie z. B. Parabene, enthalten.
Im allgemeinen werden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in Dosierungseinheitsform, umfassend 0,0001-100 mg an aktivem Bestandteil zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger pro Dosiseinheit, abgegeben.
Die Dosis der Verbindungen gemäß dieser Erfindung beträgt geeigneterweise 1- 500 mg/Tag, z. B. etwa 100 mg pro Dosis, bei Verabreichung an Patienten, z. B. Menschen, als Medikament.
Es wurde demonstriert, daß Verbindungen der allgemeinen Formel I das Vermögen zur Freisetzung von endogenem Wachstumshormon in vivo besitzen. Die Verbindungen können deshalb zur Behandlung von Zuständen eingesetzt werden, welche erhöhte Wachstumshormonspiegel im Plasma erfordern, wie z. B. bei Menschen mit Wachstumshormonmangel oder bei älteren Patienten oder bei Vieh.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung in einem besonderen Aspekt eine phar- mazeutische Zusammensetzung zur Stimulierung der Freisetzung von Wachstumshormon aus der Hypophyse, wobei die Zusammensetzung als aktiven Bestandteil eine Verbindung der allgemeinen Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfaßt.
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel I oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulation der Freisetzung von Wachstumshormon aus der Hypophyse.
Fachleuten ist wohlbekannt, daß die gegenwärtigen und potentiellen Anwendungen von Wachstumshormon bei Menschen vielfältig und unterschiedlich sind. Es wird angenommen, daß Verbindungen der Formel I für Zwecke der Stimulation der Freisetzung von Wachstumshormon aus der Hypophyse verabreicht werden können und dann ähnliche Wirkungen oder Anwendungen wie Wachstumshormon selbst besitzen würden. Die Anwendungen von Wachstumshormon können wie folgt zusammengefaßt werden: Stimulation der Wachstumshormonfreisetzung bei älteren Leuten; Verhinderung katabolischer Nebenwirkungen von Glucocorticoiden, Behandlung von Osteoporose, Stimulation des Immunsystems, Beschleunigung der Wundheilung, Beschleunigung der Knochenbruchheilung, Behandlung von Wachstumsverzögerung, Behandlung von Nierenversagen oder Niereninsuffizienz aufgrund von Wachstumsverzögerung, Behandlung von physiologischem Minderwuchs einschließlich von Kindern mit Wachstumshormonmangel und mit chronischer Krankheit assoziiertem Minderwuchs, Behandlung von Obesität und mit Obesität assoziierter Wachstumsverzögerung, Behandlung der mit dem Prader-Willi-Syndrom und Turner-Syndrom assoziierten Wachstumsverzögerung; Beschleunigung der Erholung und Verringerung des Klinikaufenthalts von Verbrennungspatienten; Behandlung von intrauteriner Wachstumsverzögerung, Skelettdysplasie, Hypercortisolismus und Cushing-Syndrom; Induktion von pulsatiler Wachstumshormonfreisetzung; Ersatz von Wachstumshormon bei Streßpatienten, Behandlung von Osteochondrodysplasie, Noonan-Syndrom, Schizophrenie, Depressionen, Alzheimer-Krankheit, verzögerter Wundheilung und psychosozialer Deprivation, Behandlung von Lungendysfunktion und Abhängigkeit von einem Beatmungsgerät, Abschwächung von proteinabbauenden Reaktionen nach einem größeren chirurgischen Eingriff Verringerung von Kachexie und Proteinverlust aufgrund einer chronischen Krankheit wie Krebs oder AIDS; Behandlung von Hyperinsulinämie einschließlich Nesidioblastose, adjuvante Behandlung zur Induktion des Eisprungs; zur Stimulation der Thymusentwicklung und Verhinderung des altersbezogenen Abfalls der Thymusfunktion, Behandlung von immunsupprimierten Patienten, Verbesserung der Muskelstärke, Mobilität, Aufrechterhaltung der Hautdicke, metabolischen Homöostase, renalen Homöostase bei älteren Leuten mit schwacher Gesundheit, Stimulation von Osteoblasten, Knochenumbau und Knorpelwachstum, Stimulation des Immunsystems bei Haustieren und Behandlung von Altersstörungen bei Haustieren, Wachstumsförderung bei Vieh und Stimulation des Wollwachstums bei Schafen.
Für die obigen Indikationen wird die Dosierung in Abhängigkeit von der eingesetzten Verbindung der Formel I, dem Verabreichungsmodus und der gewünschten Therapie variieren. Im allgemeinen werden jedoch Dosisniveaus zwischen 0,0001 und 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag Patienten und Tieren verabreicht, um eine effektive Freisetzung von endogenem Wachstumshormon zu erzielen. Gewöhnlich umfassen Dosierungsformen, die sich für die orale oder nasale Verabreichung eignen, etwa 0,0001 mg bis etwa 100 mg, vorzugsweise etwa 0,001 mg bis etwa 50 mg, der Verbindungen der Formel I in Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel.
Die Verbindungen der Formel I können in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalzes oder, wo dies angebracht ist, als Alkalimetall- oder Erdalkalimetall- oder Niederalkylammoniumsalz verabreicht werden. Es wird davon ausgegangen, daß solche Salzformen etwa dieselbe Größenordnung der Aktivität wie die Formen der freien Base aufweisen.
Gegebenenfalls kann die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung eine Verbindung der Formel I in Kombination mit einer oder mehreren Verbindung(en), die eine unterschiedliche Aktivität aufweist/en, z. B. ein Antibiotikum oder ein anderes pharmakologisch aktives Material, umfassen. Dies kann/können ein anderes Sekretagogum, wie z. B. GHRP (1 oder 6) oder GHRH oder Analoga davon, Wachstumshormon oder ein Analagon davon oder Somatomedine, wie z. B. IGF-1 oder IFG-2, sein.
Die Verabreichungsroute kann jede Route sein, welche die aktive Verbindung effektiv an die geeignete oder gewünschte Wirkungsstelle transportiert, z. B. oral, nasal oder parenteral, wobei die orale Route bevorzugt ist.
Neben der pharmazeutischen Verwendung der Verbindungen der Formel I können sie als in vitro-Werkzeuge zur Untersuchung der Regulation der Wachstumshormonfreisetzung geeignet sein.
Die Verbindungen der Formel I können auch geeignete in vivo-Werkzeuge zur Beurteilung des Wachstumshormon-Freisetzungsvermögens der Hypophyse sein. Beispielsweise können Serumproben, die vor und nach Verabreichung dieser Verbindungen an Menschen genommen wurden, auf Wachstumshormon untersucht werden. Ein Vergleich des Wachstumshormons in jeder Serumprobe würde direkt das Vermögen der Hypophyse der Patienten zur Freisetzung von Wachstumshormon bestimmen.
Verbindungen der Formel I können an kommerziell wichtige Tiere verabreicht werden, um deren Geschwindigkeit und Ausmaß des Wachstums zu erhöhen und die Milchproduktion zu erhöhen.

Pharmakologische Verfahren

Verbindungen der Formel I können in vitro hinsichtlich ihrer Wirksamkeit und ihres Vermögens zur Freisetzung von Wachstumshormon in primären somatotrophen Rattenzellen beurteilt werden.
Primäre somatotrophe Rattenzellen können im wesentlichen wie zuvor beschrieben (Chen et al., Endocrinology 1991, 129, 3337-3342, und Chen et al., Endocrinology 1989, 124. 2791-2798) hergestellt werden. In Kürze, Ratten werden durch Enthauptung getötet. Die Hypophyse wird schnell entfent. Die Hypophysen werden mit 0,2%iger Kollagenase und 0,2%iger Hyaluronidase in Hanks ausgewogener Salzlösung verdaut. Die Zellen werden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium, enthaltend 0.37% NaHCO; , 10% Pferdeserum, 2,5% fetales Kalbsserum, 1% nicht-essentielle Aminosäuren, 1% Glutamin und 1% Penicillin/Streptomycin, resuspendiert und auf 1,5 · 10&sup5; Zellen/ml eingestellt. 1 ml dieser Suspension wird in jede Mulde von 24-Mulden-Tabletts eingebracht und 2-3 Tage lang belassen, bevor Freisetzungsexperimente durchgeführt werden.
Am Tag 1 der Experimente werden die Zellen zweimal mit dem obigen Medium, enthaltend 25 mM HEPES, pH 7,4, gewaschen. Freisetzung von Wachstumshormon wird durch Zugabe von Medium, enthaltend 25 mM HEPES und Testverbindung, initiiert. Die Inkubation wird 15 Min. lang bei 37ºC durchgeführt. Nach der Inkubation wird das in das Medium freigesetzte Wachstumshormon mittels eines Standard-RIA gemessen.
Verbindungen der Formel I können hinsichtlich ihrer in vivo-Wirkungen auf die Wachstumshormonfreisetzung in mit Pentobarbital betäubten weiblichen Ratten wie zuvor beschrieben (Bercu et al., Endocrinology 1991, 129, 2592-2598) beurteilt werden. In Kürze, erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten werden mit Pentobarbital 50 mg/kg Pentobarbital intraperitoneal betäubt. Nachdem die Ratten vollständig betäubt wurden, werden den Ratten eine Luftröhrenkanüle und Katheter in die Karotisarterie und die Jugularvene implantiert. Nach 15 Min. Erholung wird eine Blutprobe zum Zeitpunkt 0 entnommen. Die Hypophysen-Sekretagoga werden intravenös verabreicht und Arterienblutproben werden 15 Min. lang auf Eis gestellt und dann 2 Min. lang bei 12.000 · g zentrifugiert. Das Serum wird abdekantiert und die Menge an Wachstumshormon mit Hilfe eines Standard-RIA bestimmt.
Die Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen erläutert, welche den Umfang der beanspruchten Erfindung in keiner Weise beschränken sollen.
In der vorliegenden Beschreibung werden die folgenden Abkürzungen durchgehend verwendet:
Abkürzungen für nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste:
Verwendete Abkürzungen für Substitutionen von Peptidbindungen:
Verwendete Abkürzungen für Schutzgruppen:

Beispiel 1

H-His-D-Trpψ(CH&sub2;NH)Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH&sub2;

Das Peptid-Harz H-Ala-Trp-D-Phe-Lys-Harz wurde nach der Fmoc-Strategie mit einem Applied Biosystems 431A-Peptid-Synthesizer im 0,25-mMol-Maßstab synthetisiert unter Anwendung der vom Hersteller bereitgestellten FastMoc-UV- Protokolle, wobei HBTU (2-(1H-Benzotriazol-1-yl-)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat)-vermittelte Kopplungen in NMP (N-Methylpyrrolidon) und UV-Überwachung der Befreiung von der Fmoc-Schutzgruppe eingesetzt werden. Das zur Synthese verwendete Ausgangsharz war 470 mg 4-(2',4'- Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxy-Harz (Novablochem AG Schweiz, Katalog-Nr.: 01-64-0013) mit einer Substitution von 0,53 mMol/g. Die verwendeten geschützten Aminosäurederivate waren Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc- D-Phe-OH, Fmoc-Trp-OH und Fmoc-Ala-OH.
Das -CH&sub2;NH-Peptidbindungsisoster wurde gemäß Sasaki, Y., und Coy, D. H., Peptides 8(1) 119-121, 1987, eingeführt.
Fmoc-D-Trp-Aldehyd wurde aus 399 mg des entsprechenden N,O-Dimethylhydroxamats gemäß Fehrentz, J.-A., und Castro. B., Synthesis 676-678, 1983, hergestellt. Der rohe Aldehyd wurde in 8 ml 1%iger Essigsäure in DMF (Dimethylformamid) gelöst und in zwei Portionen aufgeteilt. Die erste Portion wurde zu einer gerührten Aufschlämmung von 400 mg (etwa 0,2 mMol) H-Ala-Trp-D-Phe- Lys(Boc)-Harz in 8 ml 1%iger Essigsäure in DMF bei Raumtemperatur zugegeben. Dann wurden 40 mg NaCNBH; (85% rein), gelöst in 1 ml DMF, im Verlauf von 60 Min. zugegeben und das Rühren weitere 60 Min. lang fortgesetzt. Danach wurde das Harz isoliert und mit 1%iger Essigsäure in DMF auf einem Filtertrichter gewaschen. Das Harz wurde erneut in 5 ml 1%iger Essigsäure in DMF suspendiert und die zweite Portion des Fmoc-Ala-Aldehyds zugegeben. Wiederum wurden 40 mg NaCNBH&sub3; (85% rein), gelöst in 1 ml DMF, bei Raumtemperatur im Verlauf von 60 Min. zugegeben und die Mischung wurde 18 h lang gerührt.
Nach diesem reduktiven Alkylierungsschritt wurde das Peptid-Harz isoliert und mit 1%iger Essigsäure in DMF auf einem Filtertrichter gewaschen und die Kettenverlängerung mit Hilfe des Peptid-Synthesizers nach den oben beschriebenen Verfahren unter Verwendung des geschützten Aminosäurederivats Fmoc- His(Trp)-OH abgeschlossen.
Das Peptid wurde von 240 mg des Peptid-Harzes durch Rühren für 240 Min. bei Raumtemperatur mit einer Mischung von 3 ml TFA (Trifluoressigsäure), 225 mg Phenol, 75 ul Ethandithiol, 150 ul Thioanisol und 150 ul H&sub2;O abgespalten. Die Spaltungsmischung wurde filtriert und das Filtrat mittels eines Stickstoffstroms zu einem Öl konzentriert. Das rohe Peptid wurde aus diesem Öl mit 45 ml Diethylether gefällt und 3 · mit 45 ml Diethylether gewaschen.
Das rohe Peptid wurde durch semipräparative HPLC auf einer 25 mm · 250 mm- Säule, gepackt mit 7 u C-18-Silica, gereinigt. Die Säule wurde mit 21%igem CH&sub3;CN in 0,05 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, mit 4 M H&sub2;SO&sub4; auf pH 2,5 eingestellt, äquilibriert.
Nach dem Trocknen wurde das rohe Peptid in 5 ml 70%igem CH&sub3;CN / 0,1%iger TFA in H&sub2;O gelöst und mit H&sub2;O auf 50 ml verdünnt. 20 ml dieser Lösung wurden auf 90 ml verdünnt und in die Säule injiziert, welche dann mit einem Gradienten von 21%-31% CH&sub3;CN in 0,05 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, pH 2,5, mit 10 ml/Min. im Verlauf von 47 Min. bei 40ºC eluiert wurde. Die Peptid-enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und mit 3 Volumina H&sub2;O verdünnt und durch eine Sep- Pak®C18-Kartusche (Waters Teil-Nr.: 51910) geleitet, welche mit 0,1%iger TFA äquilibriert worden war. Es wurde dann mit 70%igem CH&sub3;CN, enthaltend 0,1% TFA, eluiert und das gereinigte Peptid wurde nach Verdünnung des Eluats mit Wasser durch Lyophilisierung isoliert. Die Ausbeute betrug 6,55 mg.
Das erhaltene Endprodukt wurde durch Aminosäureanalyse (Peptidgehalt und Aminosäurezusammensetzung), analytische RP-HPLC (Retentionszeit) und durch PDMS (Plasmadesorptions-Massenspektrometrie) (Molekularmasse) charakteri- siert. Die Aminosäureanalyse und PDMS stimmten mit der erwarteten Struktur innerhalb des Versuchsfehlers der Methode überein (PDMS: ± 0,9 atomare Masseneinheiten, Aminosäureanalyse ± 10%).
Die RP-HPLC-Analyse wurde unter Einsatz eines UV-Nachweises bei 214 nm und einer Vydac 218TP54-Säule mit 5 u C-18-Silica und 4,6 mm · 250 mm (The Separations Group, Hesperia, USA), welche mit 1 mllMin. bei 42ºC eluiert wurde, durchgeführt. Es wurden zwei verschiedene Elutionsbedingungen verwendet:
A1: Äquilibrierung der Säule mit 5% CH&sub3;CN in einem aus 0,1 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; bestehenden Puffer, welcher mit konzentrierter H&sub2;SO&sub4; auf pH 2,5 eingestellt war, und Elution mit einem Gradienten von 5% bis 60% CH&sub3;CN im gleichen Puffer im Verlauf von 50 Min.
B1: Äquilibrierung der Säule mit 5% CH&sub3;CN / 0,1% TFA / H&sub2;O und Elution mit einem Gradienten von 5% CH&sub3;CN / 0,1% TFA / H&sub2;O bis 60% CH; CN / 0,1% TFA / H&sub2;O im Verlauf von 50 Min.
Die Retentionszeit bei Verwendung der Elutionsbedingungen A1 und B1 wurde als 22,01 Min. bzw. 23,08 Min. befunden.

Beispiel 2

H-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Pheψ(CH&sub2;NH)Lys-NH&sub2;

H-Lys(2-C1-Z)-Harz wurde aus 660 mg 4-Methyl-BHA-Harz (Bissendorf Biochemicals, Hannover, Deutschland, Katalog-Nr.: RMIS50) mit einer Substitution von 0,72 mMoflg und Boc-Lys(C1-Z)-OH nach der Boc-Strategie mit einem Applied Biosystems 430A-Peptid-Synthesizer im 0,5-mMol-Maßstab unter Anwendung der vom Hersteller bereitgestellten Einzelkopplungsprotokolle, bei denen Einzelkopplungen mit vorgebildeten symmetrischen Anhydriden in DMF eingesetzt werden, synthetisiert. Die Protokolle wurden modifiziert, um 60 Min. Kopplungszeit zu ergeben.
Das -CH&sub2;NH-Peptidbindungsisoster wurde unter Verwendung einer ähnlichen Prozedur wie in Beispiel 1 beschrieben eingeführt. 675 mg H-Lys(C1-Z)-Harz und Boc-D-Phe-Aldehyd, hergestellt aus 616 mg des entsprechenden N,O- Dimethylhvdroxamats, wurden eingesetzt.
Nach diesem reduktiven Alkylierungsschritt wurde das Harz isoliert und mit 1%iger Essigsäure in DMF auf einem Filtertrichter gewaschen und die Kettenverlängerung mit Hilfe des Peptid-Synthesizers nach den oben beschriebenen Verfahren unter Verwendung der geschützten Aminosäurederivate Boc-Trp(For)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-D-Trp(For)-OH und Boc-His(Bom)-OH abgeschlossen.
Das Peptid wurde von 391 mg des Peptid-Harzes durch Rühren für 75 Min. mit einer Mischung von 5 ml HF und 500 ul m-Kresol abgespalten. Die HF wurde bei 0ºC mit einem Stickstoffstrom verdampft. Das Peptid wurde aus dem verbleibenden Öl zusammen mit dem Harz mit 50 ml Diethylether gefällt und 2 · mit 50 ml Diethylether gewaschen und aus dem Harz mit 2 · 2 ml TFA extrahiert und aus dem vereinigten TFA-Extrakt mit 50 ml Diethylether gefällt und 2 · mit 50 ml Diethylether gewaschen.
Nach dem Trocknen wurden die Formylgruppen auf den Tryptophanen durch Lösen und Rühren des Peptids in 64 ml 6 M Guanidinium-Hydrochlorid, enthaltend 4 ml Ethanolamin, bei 0ºC für 5 Min. abgespalten. Danach wurde die Mischung durch Zugabe von 4 ml Essigsäure neutralisiert und dann mit 140 ml H&sub2;O verdünnt.
Das rohe Peptid wurde mittels semipräparativer HPLC durch direkte Injektion dieser Reaktionsmischung in die Säule unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens wie in Beispiel 1 beschrieben gereinigt. Die Ausbeute betrug 20,6 mg. Das Endprodukt wurde wie in Beispiel 1 beschrieben charakterisiert.
Eine RP-HPLC-Analyse unter Verwendung der Bedingungen A1 und B 1 ergab die Retentionszeiten 21,28 Min. bzw. 23,17 Min. Beispiele 3-5

Beispiel 6

(2R)-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-NH)-3-Phenylpropylamin

Fmoc-D-Phe-Aldehyd wurde aus 385 mg des entsprechenden N,O- Dimethylhydroxamats nach Fehrentz, J.-A., und Castro. B., Synthesis 676-678, 1983, hergestellt. Der Rohaldehyd wurde in 20 ml 1%iger Essigsäure in DMF gelöst und in zwei Portionen aufgeteilt.
580 mg 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxy-Harz (Novablochem AG, Schweiz, Katalog-Nr.: 01-64-0013) mit einer Substitution von 0,43 mMol/g wurden mit 20% Piperidin in DMF 20 Min. lang von der Schutzgruppe befreit und mit DMF und mit 1%iger Essigsäure in DMF gewaschen.
Die erste Portion Fmoc-D-Phe-Aldehyd und 58 mg NaCNBH&sub3; (85% rein), gelöst in 1 ml DMF, wurde dem von der Schutzgruppe befreiten Harz zugegeben und die Aufschlämmung bei Raumtemperatur 75 Min. lang gerührt. Danach wurde das Harz auf einem Filtertrichter isoliert und mit 1%iger Essigsäure in DMF gewaschen. Die zweite Portion des Fmoc-D-Phe-Aldehyds, zusammen mit 58 mg NaCNBH&sub3; (85% rein) in 1 ml DMF gelöst, wurde dem Harz zugegeben und die Mischung bei Raumtemperatur 18 h lang gerührt und das Harz wurde auf einem Filtertrichter isoliert und mit 1%iger Essigsäure in DMF, mit DMF, mit DCM/Methanol 6 : 4 und mit DCM (Dichlormethan) gewaschen.
Unter Verwendung dieses Harzes wurde die Kettenverlängerung unter Einsatz des Peptid-Synthesizers nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren und den Beschützen Aminosäurederivaten Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-D-2Nal-OH und Fmoc-D-Ala-OH abgeschlossen.
Das Peptid wurde von 600 mg des resultierenden Peptid-Harzes abgespalten. Das resultierende Rohpeptid wurde in 50 ml H&sub2;O gelöst und 25 ml davon wurden durch semipräparative HPLC gereinigt und unter Anwendung von ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben charakterisiert. Die Ausbeute betrug 10,9 mg.
RP-HPLC-Analyse unter Verwendung der Bedingungen A1 und B1 ergab die Retentionszeiten 27,98 Min. bzw. 29,45 Min. Beispiele 7-12

Beispiel 13

(2S)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Trp-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp-D-Phe-NH)-6- aminohexanol

Das Peptid-Harz 3-(1-Adoc-4-imidazolyl)propionyl-D-Trp-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp-D- Phe-Lys(Boc)-Sasrin®-Harz (Adoc ist eine Abkürzung von 1-Adamantyloxycarbonyl) wurde im 1-mMol-Maßstab unter Anwendung eines ähnlichen Verfahrens wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert, mit der Ausnahme, daß 1020 mg Sasrin®-Harz (2-Methoxy-4-alkoxybenzylalkohol-Harz) (Bachem, Bubendorf, Schweiz, Katalog-Nr.: D-1295) mit einer Substitutionskapazität von 0,87 mMol/g eingesetzt wurde und das zur Kopplung des ersten Aminosäurerests an das Harz verwendete Protokoll die vom Hersteller bereitgestellte 4-Dimethylaminopyridinkatalysierte Kopplung des vorgebildeten symmetrischen Anhydrids, gefolgt vom Schützen der verbleibenden -OH-Gruppen auf dem Harz mit Benzoesäureanhydrid, war.
Das geschützte Peptid (2S)-((3-(1-Adoc-4-imidazolyl)propionyl)-D-Trp-Alaψ- (CH&sub2;NH)Trp-D-Phe-NH)-6-(Boc-amino)hexanol wurde von 1800 mg des 3-(1- Adoc-4-imidazolvl)propionyl-D-Trp-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp-D-Phe-Lys(Boc)-Sasrin- Harzes durch Rühren des Peptid-Harzes für 24 h bei Raumtemperatur mit einer Mischung von 10,8 ml THF (Tetrahydrofuran), 1,8 ml Ethanol, 211 mg LiBr und 92 mg NaBH&sub4; abgespalten. Dann wurden 2 ml H&sub2;O und 2 ml Essigsäure tropfenweise zugegeben. Die Harzperlen wurden durch Filtration entfernt und mit 25 ml Ethanol gewaschen. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert und das verbleibende Öl mit 50 ml H&sub2;O verdünnt und lyophilisiert. Das resultierende Pulver wurde einer TFA-Spaltung wie in Beispiel 1 beschrieben unterworfen. 1/5 des resultierenden Rohpeptids wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gereinigt. Die Ausbeute betrug 28,54 mg.
Das Endprodukt wurde charakterisiert wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Retentionszeit unter Verwendung der Elutionsbedingungen A1 wurde als 20,4 Min. befunden.

Beispiel 14

3-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Trp-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp-D-Phe-NH)- propylainin

Das Peptid-Harz (3-(1-Adoc-4-imidazolyl)propionyl)-D-Trp-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp- D-Phe-Sasrin-Harz wurde im 1-mMol-Maßstab unter Anwendung eines ähnlichen Verfahrens wie im Beispiel 1 beschrieben synthetisiert, mit der Ausnahme, daß 1000 mg Sasrin-Harz (2-Methoxy-4-alkoxybenzylalkohol-Harz) (Bachem, Bubendorf, Schweiz, Katalog-Nr.: D-1295) mit einer Substitutionskapazität von 0,87 mMol/g eingesetzt wurde und das zur Kopplung des ersten Aminosäurerests an das Harz verwendete Protokoll die vom Hersteller bereitgestellte 4- Dimethylaminopyridinkatalysierte Kopplung des vorgebildeten symmetrischen Anhydrids, gefolgt vom Schützen der verbleibenden -OH-Gruppen auf dem Harz mit Benzoesäureanhydrid, war.
Das Peptid 3-((3-(1-Adoc-4-imidazolyl)propionyl)-D-Trp-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp-D- Phe-NH)propylamin wurde von 1000 mg des (3-(1-Adoc-4-imidazolyl)propionyl)- D-Trp-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp-D-Phe-Sasrins durch Rühren für 20 h bei Raumtemperatur mit 10 ml 1,3-Diaminopropan abgespalten. Das verbrauchte Harz wurde abfiltriert und mit 5 ml DMF extrahiert. Die Vereinigung von Filtrat und Extrakt wurde langsam zu 240 ml 1 M Salzsäure unter Rühren zugegeben. Die Mischung wurde dann mit H&sub2;O auf 500 ml verdünnt und filtriert.
Das Rohpeptid wurde durch semipräparative HPLC in 9 Läufen durch direkte Injektion von 9 · 1/9 dieses Filtrats in die Säule unter Anwendung eines ähnlichen Verfahrens wie in Beispiel 1 beschrieben gereinigt. Die Ausbeute betrug 73,53 mg.
Das Endprodukt wurde wie in Beispiel 1 beschrieben charakterisiert. Die Retentionszeit unter Anwendung der Elutionsbedingungen A1 und B1 wurde als 21,5 Min. bzw. 22,7 Min. befunden. Beispiele 15-18
Die Strukturen von repräsentativen Verbindungen der Erfindung sind im folgenden gezeigt: 3-((3-(4-Imidazolvl)propionyl)-D-Trp-Alaψ(CFLNH)Trp-D-Phe-NH)propylamin (2S)-((2R)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Phe-Ala-Trp-NH)-3-phenylpropylamino)-6-aminohexanol H-Aib-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-D-Pheψ(CH&sub2;NH&sub2;)

Beispiel 19

Ein in vitro-Assav unter Verwendung von Ratten-Hypophysenzellen wurde etabliert, um die Wirkung verschiedener GH-Sekretagoga zu untersuchen. Die gemischte Hypophvsenzellkultur wurde aus dem Hypophysenvorderlappen von männlichen Ratten isoliert und drei Tage lang kultiviert. Nach dem Waschen wurden die Zellen 15 Min. lang stimuliert und die Menge des sekretierten GH im Kulturüberstand gemessen.
Die Isolierung der Ratten-Hypophysenzellen war eine Modifikation von Sartor, O. et al., Endocrinoloev 116, 1985, S. 952-957. Die Hypophysen wurden männlichen Sprague-Dawley-Ratten von 250 g nach Enthauptung entnommen. Die Hypophysenzwischenlhinterlappen wurden entfernt und der Rest in Gey's-Medium, ergänzt mit 0,25% Glucose, 2 x-nichtessentiellen Aminosäuren und 1% BSA, (Isolierungspuffer) eingebracht. Die Drüsen wurden in kleine Stücke geschnitten und in einen Kolben überführt, der 3 ml Isolierungspuffer + 11,5 mg Trypsin und 1000 ug DNase enthielt, und 35 Min. lang bei 37ºC, 95% O&sub2; und 70 Umdrehungen pro Min. inkubiert. Die Fragmente wurden dreimal durch Sedimentation in Isolierungspuffer gewaschen und mit Hilfe einer Pasteurpipette in einzelne Zellen gesaugt. Nach Dispersion wurden die Zellen durch einen Nylonfilter (160 um) filtriert, um unverdautes Gewebe zu entfernen. Die Zellen wurden 3 · mit Isolierungspuffer, ergänzt mit Trypsin-Inhibitor (0,75 mg/ml), gewaschen und in Kulturmedium (DMEM, ergänzt mit 25 mM HEPES, 4 mM Glutamin, 0,75% Natriumbicarbonat, 2,5% FCS, 3% Pferdeserum, 10% Rattenserum, 1 nM T&sub3; und 40 ug/l Dexamethason) auf eine Dichte von 2 · 10&sup5; Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden auf Mikrotiterplatten, 200 ul/Mulde, ausgesät und 3 Tage lang bei 37ºC und 8% CO&sub2; kultiviert.
Nach der Kultivierungsperiode wurden die Zellen zweimal mit Stimulationspuffer (HBSS, ergänzt mit 1% BSA, 0,25% D-Glucose und 25 mM HEPES) gewaschen und 1 h lang vorinkubiert. Der Puffer wurde dann entfernt und neuer Stimulationspuffer, enthaltend eine Verbindung der Erfindung, wurde zugegeben und die Platten wurden 15 Min, lang bei 37ºC und 5% CO&sub2; inkubiert. Der Puffer wurde gewonnen und auf den Gehalt an Rattenwachstumshormon (rGH) in einem Szintillations-Proximitätsassay (SPA) wie folgt analysiert (SPA, im wesentlichen wie in US 4,68,649. Hart und Greenwalt, Mol. Immunol. 16, 1979, S. 265-269, oder Udenfriend et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82, 1985, S. 8672-8676, beschrieben). Der rGH-Assay wurde in OptiPlates (96-Mulden-Platten), geeignet zur direkten Zählung in einem Packards TopCount (β-Szintillationszähler), durchgeführt.

Assay-Protokoll:

40 ul Puffer
10 ul Probe (inkubiert in Stimulationspuffer)
50 ul ¹²&sup5;I-rGH
50 ul Kaninchen-Anti-rGH
50 ul SPA-Reagens (Anti-Kaninchen-Antikörper, gebunden an Fluomicrosphären)
Die Platten werden versiegelt und 30 Min. lang auf einen Plattenschüttler plaziert, gefolgt von 10 h Inkubation, Stehenlassen bei 10-15ºC und Zählung.
Bei dem SPA wird an einen Anti-GH-Kaninchenantikörper (primärer Antikörper) gebundenes rGH mit einem zweiten Antikörper umgesetzt, der an Fluomicrosphären (SPA Typ II RIA, erhältlich von Amersham) gebunden ist. Etwaiges radioaktiv markiertes rGH, welches an den primären Antikörper gebunden ist, wird auf den Fluomicrosphären immobilisiert werden, welche dann Licht erzeugen werden. Die Messung in einem β-Szintillationszähler ermöglicht es, die Menge an radioaktiv markiertem rGH zu berechnen. Die Menge an radioaktiv markiertem rGH, welche an die Fluomicrosphären gebunden ist, nimmt mit zunehmendem Gehalt an rGH in der Probe ab.

Claims

1. Verbindung der allgemeinen Formel I

A - B - C - D - E (-F)p

worin

p 0 oder I ist;

A Imidazolyl-C&sub1;&submin;&sub6;-alkansäure, Imidazolyl-C&sub1;&submin;&sub6;-alkensäure, Amino-C&sub1;&submin;&sub6;- alkansäure oder Amino-C&sub1;&submin;&sub6;-Alkensäure oder eine L- oder D-α- Aminosäure, ausuewählt aus der Gruppe, bestehend aus H-His, H-Ala, H- D-Ala, H-(β-Alanin), H-Aminoisobuttersäure, Sarcosin und Gly, ist; B D-Trp. D-2Nal oder D-Phe ist;

C Ala, Ser oder Gly ist;

D Trp, Phe, β-(2-Thienyl)alanin oder N-Aralkylglycin ist;

E, wenn p 1 ist, D-Phe ist oder, wenn p 0 ist, E -NH-CH(CH&sub2;-R³)-CO-R&sup4; oder -NH-CH(CH&sub2;-R³)-CH&sub2;-R&sup4; ist, worin

R Phenyl ist,

und R&sup4; Piperazino, Morpholino, Piperidino, -OH oder -N(R&sup5;)R&sup6;, worin jedes von R&sup5; und R&sup6; unabhängig Wasserstoff oder Niederalkyl ist, darstellt;

F, wenn p 1 ist, -NH-CH(R¹&sup0;)-(CH&sub2;)v-R&sup7; ist, worin

v 0 oder eine ganze Zahl zwischen 1 und 8 ist, und

R&sup7; Imidazolyl, Piperazino, Morpholino, Piperidino oder -N(R&sup8;)-R&sup9;, worin jedes von R&sup8; und R&sup9; unabhängig Wasserstoff oder Niederalled ist, oder das Amadori-Umlagerungsprodukt aus einer Aminogruppe und einer Hexapyranose oder einer Hexapyranosylhexapyranose

darstellt, und

R¹&sup0; -H, -COOH, -CO-R¹¹, CH&sub2;-R¹¹ oder -CH&sub2;-OH, worin R¹¹ Piperazino, Morpholino, Piperidino oder -N(R¹²)-R¹³ ist, worin jedes von R¹² und R¹³ unabhängig Wasserstoff oder Niederalkyl ist, darstellt;

mit der Maßgabe. daß mindestens eine Amidbindung zwischen A und B, B · und C, C und D, D und E oder, wenn p 1 ist, E und F durch Aminomethylen ersetzt ist oder daß, wenn p 0 ist, E -NH-CH(CH&sub2;-R³)-CH&sub2;-R&sup4; ist, oder daß, wenn p 1 ist, R¹&sup0; CH&sub2;-R¹¹ ist;

oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin p 1 ist.

3. Verbindung nach Anspruch 1, worin A His, D-Ala oder Imidazolylpropionsäure ist.

4. Verbindung nach Anspruch 1, worin B D-Trp oder D-2Nal ist.

5. Verbindung nach Anspruch 1, worin C Ala ist.

6. Verbindung nach Anspruch 1, worin D N-Benzylglycin oder Trp ist.

7. Verbindung nach Anspruch 1, worin E D-Phe ist.

8. Verbindung nach Anspruch 1, worin v = 6 und R&sup7; = -NW ist.

9. Verbindung nach Anspruch 1, worin R¹&sup0; -CONH&sub2;, -CH&sub2;-OH ist.

10. Verbindung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, welche aus der Gruppe, bestehend aus

H-Hisψ(CH&sub2;NH)D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH&sub2;

H-His-D-Trpψ(CH&sub2;NH)Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH&sub2;

H-His-D-Trp-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp-D-Phe-Lys-NH&sub2;

H-His-D-Trp-Ala-Trpψ(CH&sub2;NH)D-Phe-Lys-NH&sub2;

H-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Pheψ(CH&sub2;NH)Lys-NH&sub2;

H-D-Ala-D-2Nal-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp-D-Phe-Lys-NH&sub2;

H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-D-Pheψ(CH&sub2;NH)Lys-NH&sub2;

(3-(4-Imidazolyl)propionyI)-D-2Nal-Ala-Trp-D-Pheψ(CH&sub2;NH)Lys-OH

(3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-2Nal-Ala-Trp-D-Pheψ(CH&sub2;NH)Lys-NH&sub2;

(3-(4-Imidazolyl)acryloyl)-D-2Nal-Ala-Trp-D-Pheψ(CH&sub2;NH)Lys-NH&sub2;

H-D-Ala-D-Phe-Ala-Trp-D-Pheψ(CH&sub2;NH)Lys-NH&sub2;

(2R)-(H-D-Ala-D-Phe-Ala-Trp-NH)-3-Phenylpropylamin

(2S)-(H-D-Ala-D-2Nal-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp-D-Phe-NH)-6-Aminohexanol

H-D-Ala-D-2Nal-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp-D-Phe-NH&sub2;

4-(H-D-Ala-D-2Nal-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp-D-Phe-NH)-Butylamin

(2R)-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-NH)-3-Phenylpropylamin

((2R)-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-NH)-3-Phenylpropylamino)hexylamin

(2R)-(H-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-NH)-3-Phenylpropylamin

(2R)-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-NH)-3-Phenylpropylamin

H-Aib-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-D-Pheψ(CH&sub2;NH)Lys-NH&sub2;

(2S)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)ψ(CH&sub2;NH)D-Phe-Ala-Trp-D-Phe-NH)- 6-aminohexanol

(2S)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Pheψ(CH&sub2;NH)Ala-Trp-D-Phe-NH)- 6-aminohexanol

(2S)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Phe-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp-D-Phe-NH)- 6-aminohexanol

(2S)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Phe-Ala-Trpψ(CH&sub2;NH)D-Phe-NH)- 6-aminohexanol

(2S)-(2R)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Phe-Ala-Trp-NH)-3-phenylpropylamino)-6-aminohexanol

3-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Trp-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp-D-Phe-NH)- propylamin

(2S)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Phe-Ala-Trp-D-Pheψ(CH&sub2;NH)NH)- 6-aminohexanol

(2S)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Trp-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp-D-Phe-NH)- 6-aminohexanol

3-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Trp-Alaψ(CH&sub2;NH)Trp-D-Phe-NH)- propylamin

H-D-Ala-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-D-Pheψ(CH&sub2;NH)Lys-NH&sub2;

H-Aib-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-D-Pheψ(CH&sub2;NH&sub2;),

ausgewählt ist.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als aktiven Bestandteil eine Verbindung der allgemeinen Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11 in Dosierungseinheitsform, umfassend etwa 10 bis etwa 200 mg der Verbindung der allgemeinen Formel I oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Stimulierung der Freisetzung von Wachstumshormon aus der Hypophyse, wobei die Zusammensetzung als aktiven Bestandteil eine Verbindung der allgemeinen Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfaßt.

14. Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel I oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung der Freisetzung von Wachstumshormon aus der Hypophyse.