DE60013912T2

DE60013912T2 - Vip-analoge

Info

Publication number: DE60013912T2
Application number: DE60013912T
Authority: DE
Inventors: Anand C. Ghaziabad 201 010 BURMAN; Sudhanand Ghaziabad 201 010 PRASAD; Rama Ghaziabad 201 010 MUKHERJEE; Anu T. Ghaziabad 201 010 SINGH; Archna Ghaziabad 201 010 MATHUR; Neena Ghaziabad 201 010 GUPTA
Original assignee: Dabur Research Foundation
Current assignee: Dabur Research Foundation
Priority date: 2000-02-18
Filing date: 2000-07-31
Publication date: 2005-09-29
Anticipated expiration: 2020-08-01
Also published as: ATE276273T1; CA2405689A1; DE60013912D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfasst neuartige Analogstoffe von vasoaktivem Intestinalpeptid (VIP), die an geeignet ausgewählten Aminosäuren Substitutionen enthalten. Die Erfindung betrifft speziell den Aufbau und die Synthese neuartiger, biologisch wirksamer VIP-Analoga, die α,α-dialkylierte Aminosäuren in einer stellungspezifischen Form enthalten. Speziell betrifft die Erfindung die Synthese von VIP-Peptidderivaten, die selektiv an VIP-Rezeptoren auf Targetzellen binden. Die Erfindung umfasst Verfahren zum Erzeugen dieser Peptide, Zusammensetzungen, die die Peptide enthalten, und die pharmakologischen Anwendungen dieser Peptide speziell in der Behandlung und Verhütung von Krebs.
Hintergrund der Erfindung
Von einem vasoaktiven Intestinalpeptid ist bekannt, dass es eine entscheidende Rolle beim Modulieren intrazellularer und extrazellularer Ereignisse in Verbindung mit der Homöostase spielt und eng verbunden ist mit allen größeren kognitiven und nicht kognitiven homöostatischen Systemen (Schofl et al., 1994). Die mehrfachen biologischen Aktivitäten von Peptiden haben zu einer umfangreichen Forschung geführt, die sich auf die Nutzung dieser Peptidhormone als therapeutische Medikamente konzentriert. Es sind mehrfache Substitutionen verwendet worden, um die Anfälligkeit der Amidbindung gegenüber proteolytischer Spaltung zu verhindern. Diese schließen die Verwendung von nicht standardgemäßen Aminosäuren ein, wie D-Aminosäuren, N-Alkyl- und N-Hydroxyaminosäuren, α-Azaaminosäuren, Thioamid-Verknüpfungen, den Aufbau von Peptidmimetika und Arzneimittelvorstufen sowie Amidbindungsmodifikationen unter der Rubrik der Pseudopeptid-Verknüpfung (Dutta, 1993; Pastemak et al., 1999). Eine andere Vorgehensweise war die Blockierung des N-Terminus oder C-Terminus des Peptids durch Acylierung oder Amidierung.
Vasoaktives Intestinalpeptid ist ein 28-Aminosäure-Neuropeptid, das zuerst aus porcinalem Eingeweide isoliert wurde (Said und Mutt, 1970). Es zeigt eine ausgeprägte Homologie zu Sekretin, Peptid-Histidin-Isoleucin (PHI) und Glucagon. Die Aminosäuresequenz für VIP lautet:
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gin-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ (SEQ ID NR:1).
VIP ist dafür bekannt, dass es eine große Vielzahl von biologischen Aktivitäten in den autokrinen, endokrinen und parakrinen Funktionen in lebenden Organismen zeigt (Said, 1984). Es ist dafür bekannt, dass es im gastrointestinalen Trakt pankreatische und biliäre Sekretionen, hepatische Glykogenese sowie die Sekretion von Insulin und Glucagon stimuliert (Kerrins und Said, 1972; Domschke et al., 1977). In dem Nervensystem wirkt es als ein Neurotransmitter und Neuromodulator, indem es die Freisetzung und Sekretion mehrerer Schlüsselhormone reguliert (Said, 1984). In den letzten Jahren hat sich die Aufmerksamkeit auf die Funktion von VIP in bestimmten Bereichen des ZNS sowie auf seine Bedeutung in der Entwicklung und Bekämpfung von neoplastischen Erkrankungen konzentriert (Reubi, 1995).
Die Bedeutung von Peptid-Wachstumsfaktoren und regulatorischen Hormonen in der Äthiologie und Pathogenese verschiedener Karzinoma ist seit langem bekannt. Daten von epidemiologischen und endokrinologischen Untersuchungen legen nahe, dass Neuropeptide wie VIP, die für das normale Gewebewachstum wie das des Pankreas verantwortlich sind, auch Voraussetzungen für deren neoplastische Transformation hervorrufen können (Sporn et al., 1980). Mehrere Reihen von Unterlagen zeigen, dass VIP als Wachstumsfaktor wirkt und eine dominante autokrine und parakrine Rolle in der fortgesetzten Proliferation von Krebszellen spielt (Said, 1984). Die stimulatorische Wirkung von VIP auf Tumorwachstum kann direkt über deren Rezeptoren auf Zellmembranen oder indirekt durch Potenzierung der Aktivitäten anderer Wachstumsfaktoren in Tumorzellen vermittelt werden (Scholar et al., 1991). Die synergistische Wirkung von VIP und das verwandte pituitäre Adenylatcyclase-aktivierende Polypeptid (PACAP) in Glioblastomen veranschaulichen die vorgenannte Tatsache (Moody et al., 1996).
Die mehrfachen physiologischen und pharmakologischen Aktivitäten von VIP werden durch Hochaffinitäts-G-Protein-gekuppelten Transmembranrezeptoren auf Targetzellen vermittelt (Reubi et al., 1996). Die VIP-Rezeptoren sind über Adenylcyclase-Aktivität an cellularen Effektorsystemen gekoppelt (Xia et al., 1996). Von dem VIP-Rezeptor, von dem festgestellt wurde, dass er in neoplastischen Zellen stark überexprimiert ist, wird angenommen, dass er einer der Biomarker im Krebs des Menschen ist (Reubi et al., 1996). Hochaffinitäts-VIP-Rezeptoren sind lokalisiert und charakterisiert worden in neoplastischen Zellen der meisten Brustkarzinome, Brust- und Prostatakrebsmetastasen, Ovarien-, Darm- und Pankreas-Adenokarzinomen, Endometriumkarzinomen und Plattenepithelkarzinomen, nichtkleinzelligem Lungenkrebs, Lymphoma, Glioblastoma, Astroblastoma, Meningioma und Tumore mit mesenchymalem Ursprung. Unter den neuroendokrinen Tumoren wurde von allen differenzierten und nicht differenzierten gastroenteropankreatischen Tumoren, Phäochromocytomen, kleinzelligen Lungenkarzinomen, Neuroblastoma, pituitären Adenoma sowie Tumoren in Verbindung mit hypersekretorischen Zuständen, wie dem Verner-Morrison-Syndrom, festgestellt, dass sie Rezeptoren für vasoaktives Intestinalpeptid überexprimieren (Tang et al., 1997 a & b; Moody et al., 1998 a & b; Oka et al., 1998). Diese Ergebnisse legen nahe, dass neuartige Vorgehensweisen zur Diagnose und Behandlung dieser Karzinome auf der Grundlage funktioneller Manipulation der VIP-Aktivität beruhen können, indem geeignete Peptidderivate derselben aufgebaut werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft die antineoplastische Aktivität neuartiger VIP-Peptidanaloga unter Verwendung ausgewählter beschränkter Aminosäuren. Von diesen neuartigen VIP-Analoga wurde festgestellt, dass sie an einem VIP-Rezeptor auf Zellmembranen binden. Die antineoplastische Aktivität der vorgenannten Peptide wurde ebenfalls ermittelt.
Der Aufbau von strukturbeschränkten bioaktiven Peptidderivaten war eine der verbreitet angewendeten Vorgehensweisen zur Entwicklung von therapeutischen Mitteln auf Peptidbasis. Nicht standardgemäße Aminosäuren mit starken Strukturpräferenzen können verwendet werden, um den Ablauf der Polypeptid-Kettenfaltung zu lenken, indem in neuartigen Vorgehensweisen des Peptidaufbaus lokale, stereochemische Beschränkungen aufgeprägt werden. Die Konformationscharakteristik von α,α-dialkylierten Aminosäuren ist gründlich untersucht worden. Der Einbau dieser Aminosäuren beschränkt die Rotation der φ,ψ-Winkel im Inneren des Moleküls und stabilisiert dadurch die angestrebte Peptid-Konformation. Von dem prototypischen Vertreter von α,α-dialkylierten Aminosäuren, α-Aminoisobuttersäure (Aib) oder α,α-Dimethylglycin, ist nachgewiesen worden, dass er eine β-Drehung oder helikale Konformation induziert, wenn er in eine Peptidsequenz eingebaut ist (Prasad und Balaram, 1984, Karle und Balaram, 1990). Die Konformationseigenschaften der höheren Homologe von α,α-dialkylierten Aminosäuren, wie beispielsweise Diethylglycin (Deg), Di-n-propylglycin (Dpg), Di-n-butylglycin (Dbg) sowie die cyclischen Seitenketten-Analoga von α,α-dialkylierten Aminosäuren, wie beispielsweise 1-Aminocyclopentancarbonsäure (Ac5c), 1-Aminocyclohexancarbonsäure (Ac6c), 1-Aminocycloheptancarbonsäure (Ac7c) und 1-Aminocyclooctancarbonsäure (Ac8c) haben ebenfalls gezeigt, dass sie eine gefaltete Konformation induzieren (Prasad et al., 1995; Karle et al., 1995). Die α,α-dialkylierten Aminosäuren sind in dem Aufbau von besonders starken chemotaktischen Peptid-Analoga verwendet worden (Prasad et al., 1996). Den Erfindern ist aus dem Stand der Technik keine Synthese von neuartigen Peptid-Analoga bekannt, die die vorliegende Erfindung umfassen. Die vorliegende Erfindung nutzt die Konformationseigenschaften von α,α-dialkylierten Aminosäuren für den Aufbau von biologisch aktiven Peptidderivaten, indem VIP als Modellsystem in Betracht gezogen wird.
Literatur

Domschke, S. et al., (1977), Gastroenterology, 73, 478–480.
Dutta, A. S. (1993), Small Peptides: Chemistry, Biology and Clinical Studies, Elsevier, Pharmacochemistry Library, 19, S. 293–350.
Karle, I. L. et al., (1995) J. Amer. Chem. Soc., 117, 9632–9637.
Karle, I. L. und Balaram, P. (1990) Biochemistry, 29, 6747–6756.
Kerrins, C. und Said, S. I. (1972) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 142, 1014–1017.
Oka, H. et al., (1998) Am. J. Pathol., 153, 1787–1796.
Pasternak, A. et al., (1999) Biorg. Med. Chem., 9, 491–496.
Prasad, BW und Balaram, P., (1984) CRC Crit. Rev. Biochem., 16, 307–347.
Prasad, S. et al., (1995) Biopolymers, 35, I 1–20.
Prasad, S. et al., (1996) Int. J. Peptide Protein Res., 48, 312–318.
Reubi, J. C. et al., Cancer Res., 56 (8), 1922–1931, 1996.
Said, S. I. und Mutt, V. (1970) Science, 169, 1217–1218.
Said, S. I., (1984) Peptides, 5, 143–150.
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Sporn, M. B. und Todaro, G. J. (1980), N. Engl. J. Med., 303, 378–379.
Stewart, J. und Young, Y. D., (1969) Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman & Co.
Tang, C. et al., (1997a) Gut, 40, 267–271.
Tang, C. et al., (1997b) Br. J. Cancer, 75, 1467–1473.
Xia, M. et al., J. Clin. Immunol., 16(1), 21–30, 1996.

In der gesamten Patentbeschreibung und in den Patentansprüchen sind die folgenden Abkürzungen mit den folgenden Bedeutungen verwendet worden:

BOP:: Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorphosphat
PyBOP:: Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidin-phosphonium hexafluorphosphat
HBTU:: O-Benzotriazol-N,N,N',N'-tetramethyl-uronium hexafluorphosphat
TBTU:: 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetra methyluroniumtetrafluorborat
HOBt:: 1-Hydroxybenzotriazol
DCC:: Dicyclohexylcarbodiimid
DIPCDI:: Diisopropylcarbodiimid
DIEA:: Diisopropylethylamin
DMF:: Dimethylformamid
DCM:: Dichlormethan
NMP:: N-Methyl-2-pyrrolidinon
TFA:: Trifluoressigsäure

In der gesamten Patentbeschreibung und den Patentansprüchen werden die Aminosäure-Reste mit ihren Standardabkürzungen bezeichnet. Sofern nicht anders angegeben, indem ein D oder DL vor dem Symbol und davon mit einem Bindestrich getrennt ist, sind Aminosäuren in der L-Konfiguration angegeben.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfasst VIP-Antagonisten der folgenden allgemeinen Formel, worin entsprechende Aminosäuren in VIP in einer speziellen Form durch α,α-dialkylierte Aminosäuren ersetzt worden sind. Die Erfindung umfasst außerdem die pharmazeutisch zulässigen Salze der Antagonisten der folgenden allgemeinen Formel:
His-Ser-Asp-R1-Val-R2-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-R3-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ worin sind:
R1 Aib, Deg oder Ac5c,
R2 Phe oder 4-CI-D-Phe,
R3 Met, Leu oder Dpg,
oder pharmazeutisch zulässige Salze der Antagonisten.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfasst VIP-Antagonisten der folgenden allgemeinen Formeln, worin entsprechende Aminosäuren in VIP durch α,α-dialkylierte Aminosäuren in spezieller Weise ersetzt worden sind. Die Erfindung umfasst außerdem die pharmazeutisch zulässigen Salze der Antagonisten der folgenden allgemeinen Formel:
His-Ser-Asp-R1-Val-R2-Thr-Asp-Asn-Tyr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-R3-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ worin sind:
R1 Aib, Deg oder Ac5c,
R2 Phe oder 4-CI-D-Phe,
R3 Met, Leu oder Dpg,
oder ein pharmazeutisch zulässiges Salz der Antagonisten.
Salze, die in den Begriff "pharmazeutisch zulässige Salze" einbezogen sind, beziehen sich auf nichttoxische Salze der Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Repräsentative Salze und Ester schließen die Folgenden ein:
Acetat, Ascorbat, Benzolsulfonat, Benzoat, Hydrogencarbonat, Hydrogensulfat, Bitartrat, Borat, Camsylat, Carbonat, Citrat, Dihydrochlorid, Methansulfonat, Ethansulfonat p-Toluolsulfonat, Cyclohexylsulfamat, Chinat, EDTA-Salz, Edisylat, Estolat, Esylat, Fumarat, Gluconat, Glutamat, Glycerophosphate, Hydrobromid, Hydrochlorid, Hydroxynaphthoat, Lactat; Lactobionat, Laurat, Malat, Maleat, Mandelat, Mesylat, Mucat, Napsylat, Nitrat, n-Methylglucamin, Oleat, Oxalat, Palmoate, Pamoat (Embonat), Palmitat, Pantothenat, Perchlorate, Phosphat/Diphosphat, Polygalacturonat, Salicylat, Stearat, Succinate, Sulfat, Sulfamat, Subacetat, Succinat, Tannat, Tartrat, Tosylat, Trifluoracetat und Valerat.
Andere Salze schließen ein: Ca-, Li-, Mg-, Na- und K-Salze; Salze von Aminosäuren, wie beispielsweise Lysin oder Arginin; Guanidin, Diethanolamin oder Cholin; Ammonium, substituierte Ammoniumsalze oder Aluminiumsalze.
Die Salze werden mit Hilfe konventioneller Verfahren hergestellt.
Die bevorzugten VIP-Antagonisten der vorliegenden Erfindung sind Folgende:
(R1=Aib, R2=4-D-CI-Phe und R3=Leu):
His-Ser-Asp-Aib-Val-4-CI-D-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ (SEQ ID NR: 2);
(R1=Deg, R2=4-CI-D-Phe und R3=Leu):
His-Ser-Asp-Deg-Val-4-CI-D-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ (SEQ ID NR: 3);
(R1=Ac5c, R2=4-CI-D-Phe und R3=Leu):
His-Ser-Asp-Ac5c-Val-4-CI-D-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂(SEQ ID NR: 4);
(R1=Aib, R2=Phe und R3=Met):
His-Ser-Asp-Aib-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ (SEQ ID NR: 5);
(R1=Aib, R2=Phe und R3=Leu):
His-Ser-Asp-Aib-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg- Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ (SEQ ID NR: 6);
(R1=Ac5c, R2=Phe und R3=Leu):
His-Ser-Asp-Ac5c-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-
Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ (SEQ ID NR: 7);
(R1=Deg, R2=Phe und R3=Leu):
His-Ser-Asp-Deg-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ (SEQ ID NR: 8);
(R1=Aib, R2=Phe und R3=Dpg):
His-Ser-Asp-Aib-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Dpg-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ (SEQ ID NR: 9);
(R1=Aib, R2=4-CI-D-Phe und R3=Dpg):
His-Ser-Asp-Aib-Val-4-CI-D-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Dpg-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ (SEQ ID NR: 10);
(R1=Deg, R2=Phe und R3=Dpg):
His-Ser-Asp-Deg-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Dpg-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ (SEQ ID NR: 11);
(R1=Ac5c, R2=Phe und R3=Dpg):
His-Ser-Asp-Ac5c-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Dpg-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ (SEQ ID NR: 12).
Die neuartigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung haben bedeutende pharmakologische Anwendungen. Bei ihnen handelt es sich um starke antineoplastische Mittel, wodurch sie über ein therapeutisches Potential in einer Reihe von Humankarzinomen verfügen.
Geeignete Wege der Verabreichung sind solche, wie sie auf dem Gebiet bekannt sind und einschließen: oral, rektal, transdermal, vaginal, transmucosal oder intestinal; parenterale Zuführung, einschließlich intramuskulär, subcutan, intramedullare Injektion sowie intrathekale, direkte intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale, intranasale oder intraoculare Injektionen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen Zusammensetzungen ein, worin die Wirkstoffe in einer wirksamen Menge enthalten sind, um die vorgesehene Auf gabe zu lösen. Der Begriff "eine wirksame Menge" bedeutet diejenige Menge eines Medikaments oder eines Pharmazeutikums, die die biologische oder medizinische Antwort eines Gewebes, Systems, Tieres oder Menschen hervorruft, nach der gesucht wird.
Zusätzlich zu den Wirkstoffen können diese pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch zulässige Träger, Bindemittel, Streckmittel, Lösemittel, Geschmackmittel, Farbmittel, usw. enthalten. Die Präparate können in jeder beliebigen Form formuliert werden, einschließlich Tabletten, Dragees, Kapseln, Pulver, Sirupe, Suspensionen, Aufschlämmungen, Formulierungen mit Freisetzung zu einem bestimmten Zeitpunkt, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung, Pillen, Granalien, Emulsionen, Pflastern, Injektionen, Lösungen, Liposomen und Nanopartikeln, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Die exakte Formulierung, der Verabreichungsweg und die Dosierung können vom jeweiligen Arzt unter Berücksichtigung des Zustandes des Patienten ausgewählt werden.
Eine chemotherapeutische Verbindung lässt sich mit einem Peptid der vorliegenden Erfindung verabreichen.
Die Toxizität und therapeutische Wirkung der Peptide der vorliegenden Erfindung können mit Hilfe von pharmazeutischen Standardprozeduren in Zellkulturen oder Versuchstieren ermittelt werden.
Die neuartigen Peptid-Analoga, die die vorliegende Erfindung umfassen, enthalten Aminosäuren, nämlich α,α-dialkylierte Aminosäuren, von denen bekannt ist, dass sie hochspezifische Beschränkungen in dem Peptid-Grundgerüst induzieren.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten α,α-dialkylierten Aminosäuren werden aus den entsprechenden Ketonen synthetisch dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden zunächst Ketone in die entsprechenden Hydantoine umgewandelt, die unter Verwendung einer starken Säure oder Base und vorzugsweise H₂SO₄, HCl, NaOH oder Na₂CO₃ hydrolysiert werden, um die vorgenannten Aminosäuren zu ergeben. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist 60%ige Schwefelsäure als das hydrolysierende Mittel eingesetzt worden. Die Umwandlung der Ketone zu ihren entsprechenden α,α-dialkylierten Aminosäuren ist in Beispiel 1 gezeigt.
Die neuartigen Peptide in der vorliegenden Erfindung sind unter Anwendung von Methoden in fester Phase oder mit Hilfe einer Kombination von Prozeduren in Lösungsphase und Methoden in fester Phase oder durch Fragmentkondensation erzeugt worden (Stewart und Young, 1969).
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurden die Peptide unter Anwendung der Fmoc-Strategie auf einem halbautomatischen Peptidsyntheseapparat (CS Bio, Modell 536) unter Verwendung eines optimalen Nebenkettenschutzes synthetisch hergestellt worden. Die Peptide sind vom C-Terminus bis zum N-Terminus zusammengefügt worden. Am Carboxy-Terminus amidierte Peptide wurden unter Verwendung des "Rink Amide"-Harz synthetisiert. Die Beladung der ersten Fmoc-geschützten Aminosäure wurde über die Erzeugung einer Amid-Bindung mit dem festen Träger erreicht, vermittelt durch Diisopropylcarbodiimid (DIPCDI) und HOBt. Die Substitutionsgrade für die automatische Synthese betrugen bevorzugt zwischen 0,2 und 0,6 mMol Aminosäure pro Gramm Harz. Die Schritte umfassen die Synthese der VIP-Analoga unter Einsatz des folgenden Protokolls:
Tabelle 1
Das für die Synthese von Carboxy-terminalen, amidierten Peptid-Analoga eingesetzte Harz war 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxymethyl-derivatisiertes Polystyrol mit 1% Divinylbenzol (Rink Amide)-Harz (100–200 Mesh), erworben von der Calbioichem-Novabiochem Corp., La Jolla, USA (0,47 mval NH₂/g Harz).
Die vorliegende Erfindung gewährt außerdem einen Festphase-Syntheseprozess für die Herstellung eines Peptid-Analogs der Formel (I):
His-Ser-Asp-R1-Val-R2-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-R3-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn- Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂
worin sind:
R1 Aib, Deg oder Ac5c,
R2 Phe oder 4-CI-D-Phe,
R3 Met, Leu oder Dpg,
was das sequentielle Beladen der entsprechenden geschützten α,α-dialkylierten Aminosäuren in sequentiellen Zyklen zu dem Amino-Terminus eines Festphasenharzes umfasst, das Koppeln der Aminosäuren in Gegenwart konventioneller Lösemittel und Reagenzien zum Zusammenfügen einer Peptid-Harzgruppe, Entfernen der Schutzgruppen und Abspalten des Peptids von dem Harz, um ein rohes Peptid-Analog zu erhalten.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die folgenden chemischen Teilgruppen verwendet, um die reaktionsfähigen Seitenketten der Peptide während der Syntheseprozedur zu schützen.
Die N-terminale Amino-Gruppe wurde durch eine 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe geschützt. Die bevorzugten Schutzgruppen für die Imidazol-Gruppe des Histidin-Restes war Trityl (trt) oder tert-Butyloxycarbonyl (Boc). Die Hydroxyl-Gruppen von Serin, Threonin und Tyrosin waren bevorzugt geschützt durch eine tert-Butyl-Gruppe (tBu) 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc) oder 2,2,4,7-Pentamethyldihydrobenzolfuran-5-sulfonyl (Pbf), die die bevorzugten Schutzgruppen für die Guanidin-Gruppe von Arginin waren. Die bevorzugte Schutzgruppe für Asparagin und Glutamin war Trityl und die tert-Butyl-Gruppe (tBu) war die bevorzugte Schutzgruppe für Asparaginsäure und Glutaminsäure. Der Tryptophan-Rest wurde entweder ungeschützt gelassen oder unter Boc-Schutz verwendet. Die Amino-Gruppe als Seitenkette des Lysins war bevorzugt unter Verwendung der Boc-Gruppe geschützt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wurden 2 bis 8 val Fmoc geschützte Aminosäure pro val Harz-Stickstoff verwendet. Die aktivierenden Reagenzien, die zum Koppeln der Aminosäuren an dem Harz in einer Festphase-Peptidsynthese verwendet wurden, sind auf dem Gebiet gut bekannt. Diese schließen ein: DCC, DIPCDI, DIEA, BOP, PyBOP, HBTU, TBTU und HOBt. Als aktivierende Reagenzien in den Kopplungsreaktionen wurden bevorzugt DCC oder DIPCDI/HOBt der HBTU/HOBT und DIEA verwendet.
Die geschützten Aminosäuren waren entweder in situ aktiviert oder wurden in Form voraktivierter Ester zugesetzt, wie auf dem Gebiet bekannt ist, beispielsweise als NHS-Ester, Opfp-Ester usw. Siehe hierzu: Atherton, E. et al., 1988, J. Chem. Soc., Perkin Trans. I, 2887; Bodansky, M. in "The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology" (E. Gross, J., Meienhofer, Herausg.) Bd. 1, Academic Press, New York, 1979, 106.
Die Kopplungsreaktion wurde in DMF, DCM oder NMP oder einer Mischung dieser Lösemittel ausgeführt und mit Hilfe eines Kaiser-Tests (Kaiser et al., Anal. Biochem., 34, 595–598 (1970)) überwacht. Im Falle eines positiven Kaiser-Tests wurde die entsprechende Aminosäure unter Verwendung frisch hergestellter aktivierter Reagenzien erneut gekoppelt.
Nach dem beendeten Zusammenbau des Peptid-Analogs wurde die terminale Fmoc-Gruppe unter Anwendung der Schritte 1 bis 6 nach dem vorgenannten Protokoll entfernt und das Peptid-Harz anschließend mit Methanol gewaschen und getrocknet. Sodann wurden die Analogsubstanzen deprotektioniert und von dem Harzträger durch Behandlung mit einer Mischung zum Abspalten aus Trifluoressigsäure, kristallinem Phenol, Ethandithiol, Thioanisol und deionisiertem Wasser für 1,5 bis 5 Stunden bei Raumtemperatur abgespalten. Das Roh-Peptid wurde durch Ausfällung mit kaltem wasserfreien Ether erhalten, filtriert, aufgelöst und lyophilisiert.
Das resultierende Roh-Peptid wurde durch präparative Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer LiChrOCART^® C₁₈ (250-fach, 10) Umkehrphasensäule (Merck, Darmstadt, Deutschland) auf einem System der präparativen HPLC (Shimadzu Corporation, Japan) unter Anwendung eines Gradienten von 0,1 % TFA in Acetonitril und Wasser gereinigt. Die eluierten Fraktionen wurden erneut auf einem HPLC-Analysesystem (Shimadzu Corporation, Japan) unter Verwendung einer C₁₈LiChrospher^®, WP-300 (300 × 4) Umkehrphasensäule analysiert. Acetonitril wurde abgedampft und die Fraktionen lyophilisiert, um das reine Peptid zu erhalten. Die Identität jedes Peptids wurde mit Hilfe der Elektronenstrahl-Massenspektroskopie bestätigt.
Eine Analogsubstanz der vorliegenden Erfindung lässt sich ausschließlich mit Hilfe der Festphasen-Methoden, durch partielle Festphasen/Lösungsphasen-Methoden und/oder Fragmentkondensation herstellen. Bevorzugte, halbautomatische, schrittweise Festphase-Methoden zur Synthese der Peptide der Erfindung werden in den Beispielen gewährt, die in dem nachfolgenden Abschnitt der vorliegenden Patentbeschreibung diskutiert werden.
Die vorliegende Erfindung wird in den Einzelheiten unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele weiter beschrieben die von dem Fachmann auf dem Gebiet als lediglich veranschaulichend erkannt werden und nicht als einschränkend auszulegen sind. Es sind zahlreiche andere Modifikationen der Erfindung möglich, ohne vom Grundgedanken und dem Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
Synthese von Aminosäuren
Es wurden α,α-dialkylierte Aminosäuren aus den entsprechenden Ketonen synthetisch dargestellt. Diese Ketone wurden zunächst in ihre entsprechenden Hydantoine umgewandelt, die bei Hydrolyse mit starker Säure oder Alkali, wie beispielsweise H₂SO₄, HCl, NaOH oder Na₂CO₃, die entsprechenden Aminosäuren ergaben.
Beispiel 1
Es wurden Cyclopentanon (0,1 Mol), KCN (0,3 Mol) und (NH₄)₂CO₃ in 300 ml 50%igem wässrigen Methanol aufgelöst und die Mischung für 4 bis 6 Stunden auf dem Wasserbad refluxiert. Danach wurde die Lösung bis zur Hälfte ihres Volumens eingeengt und in einem Eisbad gekühlt. Die gekühlte Lösung wurde mit 2 N HCl angesäuert. Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag wurde filtriert und mehrmals mit kaltem Wasser gewaschen, um die Spuren von Cyanid zu entfernen. Der Feststoff wurde danach getrocknet und aus wässriger alkoholischer Lösung umkristallisiert. Die Ausbeute des Produktes in der vorgenannten Reaktion wurde mit 86% ermittelt. Das so erhaltene 5,5'-Spirocyclopentan-hydantoin wurde mit Hilfe der I.R.-Spektroskopie charakterisiert (Valenzschwingungsbande, die für die Carbonyl-Gruppe charakteristisch sind, wurden bei 1710–1740 cm^–1 bzw. 1760–1780 cm^–1 beobachtet).
Das 5,5'-Spirocyclopentan-hydantoin (0,05 Mol) wurde in 45 ml 60%iger H₂SO₄ aufgelöst und für etwa 28 Stunden bei 150 bis 160°C refluxiert. Das Reaktionsgemisch wurde bis zu Raumtemperatur gekühlt und mit Wasser (150 ml) verdünnt. Die verdünnte Lösung wurde filtriert, um verkohlte Partikel zu entfernen. Die klare Lösung wurde in eiskaltem Wasser gekühlt und mit Ammoniak-Lösung neutralisiert. Die Lösung wurde weiter eingeengt und gekühlt. Es wurde ein glänzender weißer Niederschlag erhalten. Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag wurde filtriert und getrocknet. Die Aminosäure, d.h. 1-Aminocyclopentan-carbonsäure (Ac5c) wurde mit Hilfe der I.R.-Spektroskopie bestätigt (1610–1640 cm^–1 für die COO^-Gruppe und 3060–3090 cm^–1 für die NH₃ ⁺-Gruppe).
Beispiel 2
Herstellung von Fmoc-Asn(trt)-Harz
Es wurde eine typische Herstellung des Fmoc-Asn(trt)-Harzes unter Verwendung von 0,5 g 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxymethylderivatisiertem Polystyrol-1% Divinylbenzol (Rink Amide)-Harz (0,47 mM/g) (100–200 Mesh), erworben von Calbiochem-Novabiochem Corp., La Jolla, USA ausgeführt. Das Quellen des Harzes wurde typischerweise in Dichlormethan vorgenommen das zu einem Volumen von 10 bis 40 ml/g Harz eingemessen wurde. Das Harz ließ man in Dichlormethan quellen (2 × 25 ml für 10 min). Dieses wurde 1 Mal in Dimethylformamid (DMF) für 1 min gewaschen. Sämtliche Lösemittel in dem Protokoll wurden in 20 ml-Portionen pro Zyklus zugesetzt. Die Fmoc-Schutzgruppe auf dem Harz wurde mit Hilfe der folgenden Schritte 3 bis 7 in dem Protokoll entfernt. Die Deprotektion der Fmoc-Gruppe wurde mit Hilfe der Anwesenheit blauer Perlen in dem Kaiser-Test kontrolliert. Zum Laden der ersten Aminosäure auf die freie Amino-Gruppe (NH₂)-Gruppe des Harzes wurde die erste Aminosäure, Fmoc-Asn(trt)OH in einem vierfachen Überschuss zusammen mit einem Überschuss in ähnlicher Größe von HOBt in den Aminosäurebehälter des Peptid-Syntheseapparat eingewogen. Dieses wurde in Dimethylformamid (A.C.S.-Reinheit) (J.T. Baker, Phillipsburg, New Jersey, USA) und mit DIPCDI unmittelbar vor der Zugabe zu dem Harz in den Reaktionsbehälter des Peptid-Syntheseapparates aktiviert. HOBt wurde in allen Kopplungsreaktionen und speziell im Fall von Arg, Asn, Gln und His zugesetzt. Die Kopplungsreaktion wurde für eine Dauer im Bereich von 1 bis 3 Stunden ausgeführt. Das Laden der Aminosäure auf das Harz wurde mit Hilfe des Vorhandenseins von farbigen Perlen im Kaiser-Test bestätigt. Der Wirkungsgrad des Ladens wurde durch Erhöhung des Harzgewichtes nach der Zugabe der Aminosäure bestätigt.
Beispiel 3
Synthese von SEQ ID NR:2
(Aib⁴, 4-CI-D-Phe⁶, Leu¹⁷,)-VIP
His-Ser-Asp-Aib-Val-4-CI-D-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-N₂
Die Synthese von (Aib⁴, 4-CI-D-Phe⁶, Leu¹⁷,)-VIP, das am Carboxy-Terminus amidiert ist, wurde unter Verwendung des gesamten mit Fmoc-Asn(trt)-OH beladenen Harzes iniziiert, das im vorangegangenen Beispiel 2 hergestellt wurde. Dieses wurde einer schrittweisen Deprotektionierung und in Kopplungsschritten in Schritt 1 bis 10 des Synthesezyklus unterworfen. In jeder Kopplungsreaktion wurde der vierfache Überschuss von Aminosäure, DIPCDI und HOBt verwendet.
Nach Beendigung der Synthese und der Entfernung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe (Schritte 1 bis 6 des Synthesezyklus) wurde das Peptid-Harz 2 Mal mit Methanol gewaschen, getrocknet und gewogen, um 0,649 g zu erhalten. Dieses wurde einer Abspaltung in einer Abspaltmischung, bestehend aus Trifluoressigsäure und Radikalfängern, kristallinem Phenol, Ethanthiol, Thioanisol und Wasser, für eine Dauer von 3 bis 5 Stunden bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Rühren unterworfen. Das Peptid wurde unter Verwendung von kaltem, wasserfreiem Ether ausgefällt, um etwa 330 mg Roh-Peptid zu erhalten. Das Roh-Peptid wurde auf einer präparativen C₁₈-Umkehrphasen-HPLC-Säule (250 × 10) auf einem Gradientensystem gereinigt, das Acetonitril und Wasser in 0,1 %TFA entsprechend der früheren Beschreibung auf dem Gebiet aufwies. Die ausgeprägten Peaks wurden aufgenommen und lyophilisiert, erneut analysiert auf einer analytischen HPLC und einer Massenspektrometrie unterworfen. Es bestand eine gute Übereinstimmung zwischen der beobachteten Molmasse und der berechneten Molmasse. Das reine Peptid wurde sodann für Bioassays genutzt.
Beispiel 4
Synthese von SEQ ID NR:5 [Aib⁴]-VIP
His-Ser-Asp-Aib-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lvs-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂
Es wurde eine 0,255 g-Portion von Fmoc-Asn(trt)-Rink Amid-Harz von Beispiel 2 einer Festphasensynthese unter Anwendung des Protokolls unterworfen, wie es in der "detaillierten Beschreibung der Erfindung" ausgeführt wurde. Alle Kopplungen wurden unter Anwendung des entsprechenden molaren Überschusses der erforderlichen Fmoc-Aminosäuren ausgeführt. Es wurden Kopplungsmittel und Additive verwendet, wie sie der Fachwelt gut bekannt sind. Nach beendetem Zusammenbau des Peptids wurde die Fmoc-Gruppe von dem Harz entfernt, wie bereits ausgeführt wurde. Das Peptid wurde abgespalten, lyophilisiert, gereinigt und entsprechend den im vorangegangenen Abschnitt beschriebenen Protokollen charakterisiert.
Beispiel 5
Synthese von Analog y SEQ ID NR:9 [Aib⁴, Dpg¹⁷] 1-VIP
His-Ser-Asp-Aib-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tvr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Dpg-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂
Es wurde eine 0,255 g-Portion von Fmoc-Asn(trt)-Rink Amid-Harz von Beispiel 2 einer Festphasensynthese unter Anwendung des Protokolls unterworfen, wie es in der "detaillierten Beschreibung der Erfindung" ausgeführt wurde. Alle Kopplungen wurden unter Anwendung des entsprechenden molaren Überschusses der erforderlichen Fmoc-Aminosäuren ausgeführt. Es wurden Kopplungsreagenzien und Additive verwendet, wie sie der Fachwelt gut bekannt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wurden 27 Kopplungszyklen unter Verwendung der entsprechend geschützten Aminosäuren entsprechend der vorgenannten Sequenz ausgeführt. Nach beendetem Zusammenbau des Peptids wurde die Fmoc-Gruppe von dem Harz entfernt, wie bereits ausgeführt wurde. Das Peptid wurde abgespalten, lyophilisiert, gereinigt und entsprechend den im vorangegangenen Abschnitt beschriebenen Protokollen charakterisiert.
Beispiel 6
Es wurde die cytotoxische Aktivität der synthetisierten Peptide an 6 Humantumor-Zelllinien getestet, nämlich PA-1 (Ovarien), SW620 (Colon), HuTu80 (Zwölffingerdarm), L132 (Lunge), U87MG (Glioblastom), KB (oral), MIAPaCa2 (Pankreas), A549 (nicht kleinzellige Lunge) und HT-29 (Colon). Die Tumorzellen wurden in der exponentiellen Wachstumsphase gesammelt und erneut in Medium suspendiert (1,5 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI 1640 mit einem Gehalt von 10% FBS). Es wurden 150 μl Medium in die Mulden einer 96-Gewebekultur-Titerplatte (Nunc, Dänemark) gegeben, gefolgt von 30 μm Zell-Suspension. Die Platte ließ man über Nacht (37°C, 5% CO₂) im Inkubator. Den markierten Mulden in der 96-Titerplatte wurden 20 μl Peptid (100 pM bis 1 μM-Konzentration) zugesetzt. Jede Konzentration wurde dreifach ausgestrichen. In Kontrollmulden wurden 20 μl Medium allein gegeben, während Mulden ohne Zellen als Blindproben dienten. Es wurde ein Gesamtvolumen von 200 μl in jeder Mulde gewährleistet und die Platte im Inkubator (37°C, 5% CO₂) belassen. Nach einer Inkubation von 72 Stunden wurde ein MTT-Assay ausgeführt und die prozentuale Cytotoxizität im Bezug auf die Kontrollzellen berechnet. Die folgenden Tabellen zeigen die maximale Cytotoxizität, die an den verschiedenen Zelllinien erreicht wurde.
His-Ser-Asp-Aib-Val-4-CI-D-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn- NH₂ (SEQ ID NR:2)
His-Ser-Asp-Deg-Val-4-CI-D-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn- NH₂ (SEQ ID NR:3
His-Ser-Asp-AcSc-Val-4-CI-D-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn- NH₂ (SEQ ID NR:4)
His-Ser-Asp-Aib-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Dpg-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn- NH₂ (SEQ ID NR:9)
His-Ser-Asp-Aib-Val-4-CI-D-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Dpg-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn- NH₂ (SEQ ID NR:10)
Sequenzliste

Claims

Vasoaktives Intestinalpeptid-Analog der Formel (I): His-Ser-Asp-RI-Val-R2-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-R3-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ worin sind: R1 Aib, Deg oder Ac5c, R2 Phe oder 4-CI-D-Phe, R3 Met, Leu oder Dpg, oder ein pharmazeutisch zulässiges Salz davon, worin Aib α-Aminoisobuttersäure ist, Deg ist 1-Diethylglycin, Ac5c ist 1-Aminocyclopentan-carbonsäure und Dpg ist Di-n-propylglycin.
Peptid nach Anspruch 1, worin R1 Aib ist, R2 ist 4-D-CI-Phe und R3 ist Leu und das Peptid lautet: His-Ser-Asp-Aib-Val-4-CI-D-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ (SEQ ID NR:2), oder ein pharmazeutisch zulässiges Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1, worin R1 Deg ist, R2 ist 4-CI-D-Phe und R3 ist Leu und das Peptid lautet: His-Ser-Asp-Deg-Val-4-CI-D-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ (SEQ ID NR:3) oder ein pharmazeutisch zulässiges Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1, worin R1 Ac5c ist, R2 ist 4-CI-D-Phe und R3 ist Leu und das Peptid lautet: His-Ser-Asp-Ac5c-Val-4-CI-D-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ (SEQ ID NR:4), oder ein pharmazeutisch zulässiges Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1, worin R1 Aib ist, R2 ist Phe und R3 ist Met und das Peptid lautet: His-Ser-Asp-Aib-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ (SEQ ID NR:5), oder ein pharmazeutisch zulässiges Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1, worin R1 Aib ist, R2 ist Phe und R3 ist Leu und das Peptid lautet: His-Ser-Asp-Aib-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ (SEQ ID NR:6), oder ein pharmazeutisch zulässiges Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1, worin R1 Ac5c ist, R2 ist Phe und R3 ist Leu und das Peptid lautet: His-Ser-Asp-Ac5c-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ (SEQ ID NR:7), oder ein pharmazeutisch zulässiges Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1, worin R1 Deg ist, R2 ist Phe und R3 ist Leu und das Peptid lautet: His-Ser-Asp-Aib-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Dpg-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ (SEQ ID NR:9), oder ein pharmazeutisch zulässiges Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1, worin R1 Aib ist, R2 ist Phe und R3 ist Dpg und das Peptid lautet: His-Ser-Asp-Aib-Val-4-CI-D-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Dpg-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ (SEQ ID NR:10), oder ein pharmazeutisch zulässiges Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1, worin R1 Aib ist, R2 ist 4-CI-D-Phe und R3 ist Dpg und das Peptid lautet: His-Ser-Asp-Aib-Val-4-CI-D-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Dpg-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ (SEQ ID NR:10), oder ein pharmazeutisch zulässiges Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1, worin R1 Deg ist, R2 ist Phe und R3 ist Dpg und das Peptid lautet: His-Ser-Asp-Deg-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Dpg-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ (SEQ ID NR:11), oder ein pharmazeutisch zulässiges Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1, worin R1 Ac5c ist, R2 ist Phe und R3 ist Dpg und das Peptid lautet: His-Ser-Asp-AcSc-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Dpg-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂ (SEQ ID NR:12), oder ein pharmazeutisch zulässiges Salz davon.
Festphase-Syntheseprozess für die Herstellung eines Peptid-Analogs der Formel (I): His-Ser-Asp-R1-Val-R2-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-R3-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH₂, worin sind: R1 Aib, Deg oder AcSc, R2 Phe oder 4-CI-D-Phe, R3 Met, Leu oder Dpg, worin sind: A1b ist α-Aminoisobuttersäure, Deg ist 1-Diethylglycin, Ac5c ist 1-Aminocyclopentan-carbonsäure und Dpg ist Di-n-propylglycin, wobei der Prozess das sequentielle Beladen von geschützten α,α-dialkylierten Aminosäuren in sequentiellen Zyklen zum Amino-Terminus eines Festphaseharzes umfasst, Koppeln der Aminosäuren zum Zusammenbau einer Peptidharz-Anordnung, Entfernen der Schutzgruppen und Abspalten des Peptids von dem Harz, um ein Peptid-Analog zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 13, bei welchen die α,α-dialkylierten Aminosäuren an ihren α-Amino-Gruppen durch eine 9-Fluorenyl-methoxy-carbonyl (Fmoc)-Gruppe geschützt sind.
Verfahren nach Anspruch 13, bei welchem das Koppeln in Gegenwart aktivierten Mittels ausgeführt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus DCC, DIPCDI, DIEA, BOP, PyBOP, HBTU, TBTU und HOBt.
Verfahren nach Anspruch 13, bei welchem das Koppeln in Gegenwart eines Lösemittels ausgeführt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus DMF, DCM und NMP oder einer Mischung davon.
Verfahren nach Anspruch 13, bei welchem das Peptid von der Peptidharz-Anordnung durch Behandeln mit Trifluoressigsäure, kristallinem Phenol, Ethandithiol, Thioanisol und Wasser für 1,5 bis 5 Stunden bei Raumtemperatur abgespalten wird.
Verfahren nach Anspruch 13, bei welchem α,α-dialkylierte Aminosäure durch Umwandeln eines entsprechenden Ketons zu einem Hydantoin und Hydrolyse dieses Hydantoins hergestellt wird.
Zusammensetzung, aufweisend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und einem pharmazeutisch zulässigen Träger.
Zusammensetzung nach Anspruch 19 zum Behandeln von Krebs in Mammalia.
Vasoaktives Intestinalpeptid-Analog nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zum Behandeln von Krebs in Mammalia.
Verwendung eines vasoaktiven Intestinalpeptid-Analogs nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln von Krebs in Mammalia.
Verwendung eines vasoaktiven Intestinalpeptid-Analogs nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zum Herstellen eines Medikaments zur Verwendung in der Behandlung von Krebs in Mammalia in Kombination mit einer chemotherapeutischen Verbindung.