DE69115878T2

DE69115878T2 - Neue polypeptide und damit hergestellte anti-hiv medikamente

Info

Publication number: DE69115878T2
Application number: DE69115878T
Authority: DE
Inventors: Nobutaka 10-13-504 Nakamiyakita-Machi Osaka 573 Fujii; Naoki Haramachi Jutaku 501 Tokyo 150 Yamamoto
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1990-09-11
Filing date: 1991-09-10
Publication date: 1996-06-05
Anticipated expiration: 2011-09-11
Also published as: CA2068327A1; US5571892A; HU9201540D0; RU2073685C1; AU8448091A; ATE132163T1; NO921829D0; BG96323A; FI922044A; BR9105902A; EP0502198A1; HUT61579A; ES2081491T3; FI922044A0; JP3178835B2; OA10030A; GR3018879T3; NO921829L; EP0502198A4; CS139492A3

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft neue Polypeptide oder die Salze davon. Die Erfindung betrifft insbesondere neue Polypeptide, die eine starke Affinität gegenüber Lipopolysacchariden, insbesondere Endotoxinen, aufweisen, und die eine verbesserte antibakterielle Aktivität und eine verbesserte antivirale Aktivität besitzen, die pharmazeutisch annehmbaren Salze davon, und ein Anti- HIV-Mittel, welches diese als wirksame Bestandteile enthält.

Hintergrund der Erfindung

In der Vergangenheit wurden, wie in folgenden Literaturstellen angegeben, von Nakamura, Iwanaga, Niwa et al., Polypeptide (Tachyplesin und Polyphemusin) beschrieben, die gegenüber Endotoxinen Affinität zeigen und die sich von Hufeisenkrabben ableiten. Weiterhin wurden ihre pharmakologischen Eigenschaften beschrieben.
(i) J. Biol. Chem., 263, 16709 - 16713 (1988)
(ii) Published Searched Application 500194/1990
(iii) Chem. Pharm. Bull., 37, 2661 - 2664 (1989)
(iv) Japanische offengelegte Patentpublikation Nr. 53799/1990
(v) Japanische offengelegte Patentpublikation Nr. 152987/1990
(vi) Japanische offengelegte Patentpublikation Nr. 167230/1990
(vii) J. Biochem. 106, 663 - 668 (1989)
(viii) Taisha (Metabolism), 26, 301 - 311 (1989)
Hinsichtlich der Polypeptide, die eine Affinität gegenüber Endotoxinen besitzen und die aus Hufeisenkrabben (dem Genus Tachyleus, dem Genus Lumulus und dem Genus Carcinoscorpius), isoliert wurden, existieren 5 strukturelle Analoga, soweit den Forschern bekannt ist, und jedes von ihnen ist ein Polypeptid mit cyclischer Struktur, enthaltend 17 oder 18 natürliche Aminosäuren. Diese Polypeptide zeigen untereinander extrem analoge Eigenschaften und ein solches Polypeptid ist von großem Interesse als eine der Schlüsselsubstanzen, da Hufeisenkrabben in der Lage sind, sich Änderungen in ihrer äußeren Umgebung anzupassen und ihre Spezies von altertümlichen Zeiten bis zur heutigen Zeit als lebendes Fossil erhalten haben.
Andererseits besteht im Hinblick auf die Erhaltung der Existenz der Menschen, die stark differenziert sind, ein Bedarf für Arzneimittel, von denen erwartet werden kann, daß sie eine prophylaktische oder therapeutische Wirkung auf das erworbene Immundefektsyndrom (acquired immunodeficiency syndrome), nämlich AIDS, besitzen, welches durch Infektion mit menschlichem Immundefektvirus verursacht wird.
Die genannten Erfinder haben ihre Aufmerksamkeit auf die obigen Polypeptide mit Endotoxin-Affinität gerichtet, von denen gesagt wird, daß sie eine Beziehung zu der starken Konservierbarkeit von Spezies bei Hufeisenkrabben besitzen und die Korrelation zwischen Strukturänderungen dieser Substanzen und dem antihumanen Immundefektvirus-(HIV)-Aktivität untersucht. Als Ergebnisse haben sie neue Polypeptide gefunden, die sich von der üblichen Struktur bekannter Polypeptide mit Endotoxin-Affinität der Hufeisenkrabben grundlegend unterscheiden, und zur Überraschung wurde festgestellt, daß diese neuen Polypeptide eine ausgezeichnete Wirkung besitzen, da ihre Anti-HIV-Aktivitätswerte um das zehnfache oder darüberliegend, so groß sind, wie die be kannter Polypeptide mit Endotoxin-Affinität.

Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft neue Polypeptide, die durch die folgende Formel (I) dargestellt werden
[worin
A1 ein Wasserstoffatom oder einen oder zwei Aminoreste von Aminosäuren, ausgewählt aus Lysin und Arginin, bedeutet,
A2 unabhängig einen Tyrosin-, Phenylalanin- oder Tryptophanrest bedeutet,
A3 unabhängig einen Arginin- oder Lysinrest bedeutet,
A4 unabhängig einen Alanin-, Valin-, Leucin-, Isoleucin-, Serin-, Cystein- oder Methioninrest bedeutet,
A&sub5; -OH (welches sich von einer Carboxylgruppe ableitet) oder -NH&sub2; (welches sich von einer Säureamidgruppe ableitet), bedeutet,
Cys einen Gysteinrest bedeutet,
Gly einen Glycinrest bedeutet,
Lys einen Lysinrest bedeutet,
Arg einen Argininrest bedeutet, und
Trp einen Tryptophanrest bedeutet, und wobei die Cysteinreste in den 3- und 16-Stellungen über eine Disulfidbindung (-S-S-) gebunden sein können und wobei, wenn die 7- und 12-Stellungen beide Cysteinreste bedeuten, diese über eine Disulfidbindung (-S-S-) gebunden sein können] oder die Salze davon.
Die neuen erfindungsgemäßen Polypeptide besitzen die grundsätzlich wichtige Eigenschaft, daß ihre 6-Stellung ein Lysin-(Lys)-Rest ist, ein basischer Aminosäurerest, der vollkommen unterschiedliche Eigenschaften besitzt, verglichen mit dem Valinrest, der in den bekannten Polypeptiden, die sich von Hufeisenkrabben ableiten, vorhanden ist, wo der Aminosäurerest in der 6-Stellung üblicherweise ein Valin-(Val)-Rest ist.
Die neuen erfindungsgemäßen Polypeptide oder ihre Salze werden im folgenden in Einzelheiten erläutert. Die erfindungsgemäßen neuen Polypeptide können nach einem per se bekannten Verfahren, beispielsweise nach einem synthetischen Festphasensyntheseverfahren, hergestellt werden. Ein erfindungsgemäß geradkettiges Polypeptid der obigen Formel (I) kann nämlich durch Verbinden der Carboxylgruppe eines N-geschützten Arginins an ein unlösliches Harz mit Aminogruppen direkt gebunden oder in einigen Fällen über Spacer mit einer funktionellen Gruppe, die an die Carboxylgruppe binden kann und einer Carboxylgruppe, danachfolgendes Verbinden, gemäß dem synthetischen Festphasenverfahren der entsprechenden geschützten Aminosäuren in der 16-Stellung an die 1-Stellung der Aminosäuresequenz, die durch die folgende Formel (I)
dargestellt wird, [worin A&sub1;, A&sub2;, A&sub3;, A&sub4;, Cys, Gly, Lys, Arg und Trp die bei der obigen Formel (I) gegebenen Bedeutungen besitzen] und anschließender Eliminierung (Entfernung) des unlöslichen Harzes und der Schutzgruppen der Aminosäuren hergestellt werden. In diesem Fall kann der Carboxylterminus des Aminosäurerests in der 17-Stellung entweder frei (A&sub5; entsprechend -OH) oder umgewandelt in ein Säureamid (A&sub5; entsprechend -NH&sub2;) sein. Weiterhin können in dem erhaltenen Polypeptid die beiden erhaltenen Cysteine in den 3- und 16- Stellungen eine Disulfidbindung (-S-S-) über die Mercaptogruppen bilden.
Wenn die 7-Stellung und die 12-Stellung beide Cysteinreste bedeuten, können diese Cysteine ähnlich eine Disulfidbindung bilden.
Hinsichtlich der Bildung dieser Disulfidbindung können beide zwei Paare der Gysteingruppen in eine Disulfidbindung überführt werden, beispielsweise durch Luftoxidation, oder jede Disulfidbindung kann entsprechend dem Verfahren von Atherton, E., et al.; J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1985, 2065, gebildet werden, nämlich über die Stufen eines selektiven Vorabschutzes der Mercaptogruppen von irgendeinem Paar der Cysteine in den 3- und 16-Stellungen und den 7- und 12-Stellungen mit einer Schutzgruppe, tert.-BuS (tert.- Butylthio) und der Mercaptogruppen des anderen Paares der Cysteine mit einer Schutzgruppe, Acm (Acetamidomethyl), Abspaltung von tert.-BuS, teilweise Oxidation der Mercaptogruppen und dann Schutzgruppenabspaltung von Acm gemäß einem bekannten Verfahren.
Die entsprechenden Aminosäuren, die bei dem synthetischen Festphasenverfahren verwendet werden, können übliche L-Formen oder übliche D-Formen bilden.
Als unlösliche Harze mit Aminogruppen, die bei der Synthese der erfindungsgemäßen neuen Polypeptide verwendet werden, können irgendwelche Harze verwendet werden, solange sie über ihre Aminogruppen und die Carboxylgruppe des N-geschützten Arginins an den C-Terminus, oder in einigen Fällen, an die Carboxylgruppe des Spacers, der daran gebunden ist, gebunden werden können und anschließend eliminiert (entfernt) werden können.
Beispiele solcher unlöslicher Harze sind Aminomethylharze (aminomethylierte Styrol-Divinylbenzol-Copolymere), Benzhydrylaminharze, Methylbenzhydrylaminharze und Aminomethylphenoxymethylharze und ihre Derivate, usw. Wenn ein Benzhydrylaminharz, ein Methylbenzhydrylaminharz, ein dimethoxybenzhydrylamin-(DMBHA)-Harz oder ein Aminomethylphenoxymethylharz verwendet wird, wird das Amid direkt bei der Spaltung erhalten, aber ein Aminomethylharz ist im Hinblick auf die Ausbeute bevorzugt.
Als Spacer mit funktionellen Gruppen, die an die Carboxylgruppe und eine Carboxylgruppe binden können, können beispielsweise die erwähnt werden, die die Carboxylgruppe von Arginin in einen p-Carboxymethylbenzylester überführen können, aber es gibt hinsichtlich des Spacers keine besondere Beschränkung.
Die geschützte Aminosäure ist eine Aminosäure, deren funktionelle Gruppen mit einer Schutzgruppe nach einem bekannten Verfahren geschützt sind, und verschiedene geschützte Aminosäuren werden im Handel verkauft.
Bei der Synthese der erfindungsgemäßen Polypeptide sind bevorzugt irgendeine der folgenden Schutzgruppen auszuwählen. Eine Schutzgruppe für die α-Aminogruppe einer Aminosäure ist Boc (tert.-Butyloxycarbonyl) oder Fmoc (9- Fluorenylmethyloxycarbonyl). Eine Schutzgruppe für die Guanidinogruppe von Arginin (Arg) ist Tos (Tosyl), NO&sub2; (Nitro), Mtr (4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl) oder Pmc (2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl). Als Schutzgruppe für die Mercaptogruppe von Cystein (Cys) können Bzl (Benzyl), MBzl (4-Methoxybenzyl), 4-MeBzl (4-Methylbenzyl), Acm (Acetamidomethyl), Trt (Trityl), Npys (3-Nitro-2-Pyridinsulfenyl), tert.-Bu (tert.-Butyl) oder tert.-BuS (tert.-Butylthio) erwähnt werden, und MBzl, 4-MeBzl, Trt, Acm und Npys sind bevorzugt. Eine Schutzgruppe für die Hydroxylgruppe von Tyrosin (Tyr) ist Bzl, Cl&sub2;Bzl (2,6-Dichlorbenzyl) oder tert.-Bu, aber die Gruppe kann ungeschützt sein. Eine Schutzgruppe für die &epsi;-Aminogruppe von Lysin ( Lys) ist Z (Benzyloxycarbonyl), ClZ (2-chlorbenzyloxycarbonyl), Boc oder Npys. Es ist bevorzugt, aus jeder Schutzgruppe eine geeignete von den per se bekannten entsprechend den Synthesebedingungen für das Peptid auszuwählen.
Die Kupplung der geschützten Aminosäuren kann nach einem üblichen Kondensationsverfahren, beispielsweise dem DCC-(Dicyclohexylcarbodiimid)-Verfahren, DIPCDI-(Diisopropylcarbodiimid)-Verfahren [Tartar, A. et al., J. Org. Chem., 44 5000 (1979)], dem aktiven Esterverfahren, dem gemischten oder symmetrischen Säureanhydridverfahren, dem Carbonyldiimidazolverfahren, dem DCC- HOBt-(1-Hydroxybenzotriazol)-Verfahren [König, W. et al.; Chem. Ber., 103, 788, 2024, 2034, (1970)] oder dem Diphenylphosphorylazidverfahren durchgeführt werden. Bevorzugt sind das DCC-Verfahren, das DCC-HOBt-Verfahren, das DIPCDI-HOBt-Verfahren und das symmetrische Säureanhydridverfahren. Diese Kondensationsreaktionen werden üblicherweise in einem organischen Lösungsmittel, wie Dichlormethan oder Dimethylformamid, oder in einer Lösungsmittelmischung davon durchgeführt. Als Entblockierungsreagens für die Schutzgruppe einer α- Aminogruppe wird Trifluoressigsäure/Dichlormethan, HCL/Dioxan, Piperidin/Dimethylformamid oder ein ähnliches Mittel verwendet und die geeignete Auswahl erfolgt entsprechend der Art der Schutzgruppe. Der Grad des Fortschreitens der Kondensationsreaktion jeder Stufe der Synthese wird gemäß dem Verfahren von E. Kaiser et al. [Anal. Biochem., 34, 595 (1970) (das Ninhydrinreaktionsverfahren) verfolgt.
Entsprechend den obigen Ausführungen kann ein geschütztes Peptidharz mit einer gewünschten Aminosäuresequenz erhalten werden.
Wenn ein Aminomethylharzderivat als unlösliches Harz verwendet wird, kann das Harz beispielsweise durch Behandlung des geschützten Peptidharzes mit Ammoniak in einem geeigneten Lösungsmittel entfernt werden. Das entstehende geschützte Peptid wird dann mit Fluorwasserstoff behandelt, wobei ein Polypeptidamid, das durch die obige Formel dargestellt wird und von allen Schutzgruppen befreit ist, erhalten wird. Wenn ein Benzhydrylaminharz, Methylbenzhydrylaminharz, Aminomethylphenoxymethylharz oder DMBHA-Harz [Funakoshi S. et al.; J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1988 382] als unlösliches Harz verwendet wird, können das Harz und die Schutzgruppen gleichzeitig durch Behandlung des geschützten Peptidharzes mit Fluorwasserstoff, TFMSA (Trifluormethansulfonsäure) [publiziert von Academic Press, herausgegeben von E. Gross; Yajima, H. et al.; "The Peptides", Band 5, Seite 65 (1983)], TMSOTf (Trimethylsilyltriflat) [Fujii, N. et al; J. Chem Soc., Chem. Commun., 1987, 274] oder TMSBR (Trimethylsilylbromid) [Fujii, N. et al.; Chem. Pharm. Bull., 35, 3880 (1987)] oder einer ähnlichen Verbindung entfernt werden.
Dann kann gewünschtenfalls das resultierende Polypeptid mit 2-Mercaptoethanol, DTT (Dithiothreit) oder einer ähnlichen Verbindung entfernt werden, so daß die Mercaptogruppen der Cysteine tatsächlich in reduzierter Form vorliegen und dann erfolgt eine Oxidation zur Herstellung eines erfindungsgemäßen cyclischen Polypeptids.
Die Oxidationsbehandlung kann nach einem bekannten Verfahren erfolgen. Üblicherweise werden solche Oxidationsmittel wie Sauerstoff in Luft oder Ferricyanat (z.B. Kaliumferricyanid) verwendet.
Das so erhaltene Polypeptid kann nach per se für Polypeptide bekannte Verfahren isoliert und gereinigt werden, beispielsweise durch Extraktion, Umkristallisation, verschiedene Chromatographien (Gelfiltration, Ionenaustausch, Verteilung, Adsorption, Umkehrphase), Elektrophorese, Gegenstromverteilung, usw., wobei die Umkehrphasen(Reversed phase)hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie am wirksamsten ist.
Als spezifische Beispiele für die erfindungsgemäßen Polypeptide der Formel (I) können die Verbindungen der folgenden Formeln (1) bis (22) erwähnt werden. In den folgenden Formeln (1) bis (22) bedeutet jedes Symbol den entsprechenden Aminosäurerest gemäß der international zugelassenen Dreibuchstabenbezeichnung. Jedes Symbol bedeutet nämlich den Rest der folgenden Aminosäure.
Arg: Arginin
Cys: Cystein
Lys: Lysin
Phe: Phenylalanin
Ser: Serin
Met: Methionin
Ala: Alanin
Trp: Tryptophan
Tyr: Tyrosin
Gly: Glycin
Ile: Isoleucin
Leu: Leucin
Val: Valin
Die erfindungsgemäßen Polypeptide, die so erhalten werden, die durch die Formel (I) dargestellt werden, besitzen, ähnlich wie die bekannten Polypeptide, die sich von Hufeisenkrabben ableiten, die Fähigkeit, an Endotoxine zu binden, eine antibakterielle Aktivität, eine Aktivität für die Hämolyse von Endotoxin-sensibilisierten Hämozyten und eine antivirale Aktivität und insbesondere eine gute antivirale Aktivität gegenüber humanen Immunodefektviren (HIV). Diese Polypeptide zeigen nämlich eine zehnfache oder noch darüber liegende Anti-HIV-Aktivität als es Tachyplesin I, ein bekanntes Polypeptid, zeigt, und einige der Polypeptide zeigen eine Anti-HIV-Aktivität, die um das mehrere tausendfache höher ist als sie Tachyplesin I zeigt.
Die bekannten Polypeptide, die sich von Hufeisenkrabben ableiten, zeigen strukturelle Charakteristika. Bedingt durch die Existenz von 4 Cys-Resten in den 3-, 7-, 12- und 16-Stellungen, nehmen sie eine β-Lagenstruktur an, so daß der Teil in den 9- und 10-Stellungen ein Drehteil durch β-Drehung ist und der Peptidteil der 3-Stellung bis zur 8-Stellung und der Peptidteil der 11-Stellung bis zur 16-Stellung sich gegenseitig gegenüberliegen. Die 4 Cys-Reste in den 3- und 16-Stellungen und in den 7- und 12-Stellungen sind über die entsprechenden zwei Disuifidbindungen (-S-S-) verbunden. Für die Festlegung der antiviralen Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptidverbindungen, deren 6-Stellung in Lys umgewandelt wurde, ist es ein strukturelles Merkmal, daß die Existenz von strukturellen Teilen, deren konstitutive Aminosäuresequenzen einander sehr ähnlich sind, wie es aus ³Cys &sup4;A&sub2; &sup5;A&sub3; &sup6;Lys, die ¹³A&sub2; ¹&sup4;A&sub3; ¹&sup5;A&sub3; ¹&sup6;Cys gegenüberliegen, erkennbar ist, grundsätzlich erforderlich ist, und ²Trp und ¹&sup7;Arg unverzichtbar sind. Es ist charakteristisch, daß durch Verbindung der basischen Aminosäure, die in A&sub1; vorgeschrieben wird, an die Strukturteile der 1-Stellung eine Struktur entsteht, deren Anti-HIV-Aktivität extrem hoch ist.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide, die durch die Formel (I) dargestellt werden, zeigen eine basische Eigenschaft, bedingt durch die konstitutiven Aminosäuren, und sie bilden durch Säureaddition ein Salz. Beispielsweise bilden die Polypeptide mit einer anorganischen Säure (Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure oder einer ähnlichen Säure), oder mit einer organischen Carbonsäure (Essigsäure, Propionsäure, Maleinsäure, Bemsteinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Salicylsäure oder einer ähnlichen Säure) oder einer organischen Sulfonsäure (Methansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure oder einer ähnlichen Säure) ein Salz. Die erfindungsgemäßen Polypeptide, welche durch die Formel (I) dargestellt werden, können als solch ein pharmazeutisch annehmbares Salz verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel wird als pharmazeutische Zusammensetzung hergestellt, die ein Polypeptid, das durch die Formel (I) dargestellt wird, oder ein Salz davon als wirksamen Bestandteil, und einen pharmakologisch annehmbaren Träger, ausgewählt entsprechend dem Verabreichungsverfahren und der Verabreichungsform des Arzneimittels, enthält. Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann oral oder parenteral verabreicht werden entsprechend dem Ziel der Behandlung oder Desinfektion einer viralen Krankheit in vivo oder einem viralen Infektionsteil in vitro und sie können als Präparate, wie als Pulver, Granulate, als Lösung für die Injektion, oder orale Verabreichung als Tabletten, Suppositorien, Pessarien, Salben, Creme oder Aerosole, hergestellt werden, wobei geeignete pharmazeutische Träger entsprechend dem Verabreichungsverfahren ausgewählt werden.
Wenn das erfindungsgemäße Arzneimittel direkt als Injektion dem lebenden Körper verabreicht wird, kann das erfindungsgemäße Polypeptid oder sein Salz kontinuierlich oder periodisch verabreicht werden in einer Menge von 10 bis 5000 mg pro kg humanem Körpergewicht und einmal täglich und durch intravenöse Infusion als Lösung in physiologischer Salzlösung.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Die Zeichnung zeigt eine schematische Darstellung der Stufen für die Synthese des erfindungsgemäßen neuen Polypeptids.

Bestes Verfahren für die Durchführung der Erfindung

Die folgenden Beispiele, die keine Beschränkung darstellen sollen, erläutern die Erfindung.
Die Vorrichtungen und Reagentien, die in den folgenden Beispielen verwendet werden, sind wie folgt:
HPLC-Vorrichtung: Waters Co. (USA) Modell 600
Säule der Vorrichtung: Asahipak ODP-90 (Asahi Chemical Industry Co., Ltd.)
Fmoc-Aminosäure: hergestellt von Kokusan Kagaku Co., Ltd.
Aminoharz und Kondensationsmittel: hergestellt von Peptide Kenkyusho Co., Ltd.
FAB-MS (FAB-Massenspektrograph): VG Co. (USA), Modell ZAB-SE

Beispiel 1

Synthese des Polypeptids (A) der folgenden Formel

In der obigen Formel (A) bedeuten Arg, Trp, Cys, Tyr, Lys, Gly und Ile die zuvor angegebenen Aminosäurereste, und die Cys-Reste in den 3- und 16-Stellungen und in den 7- und 12-Stellungen sind entsprechend über Disulfidbindungen gebunden.

(1) Einführung eines Aminomethylharzes von Fmoc-DMBHA-CH&sub2;-CH&sub2;COOH

[(3-(α-Fmoc-Amino-4-methoxybenzyl)-4-methoxyphenyl)propionsäure]

270 mg (0,2 mmol) Aminomethylharz (0,74 mäq/g) und 268,5 mg (0,5 mmol, 2,5 äq) Fmoc-DMBHA-CH&sub2;CH&sub2;COOH (MW 537) werden in eine Festphasensynthesesäule gegeben, und die Kondensationsreaktion wird während 2 Stunden gemäß dem Verfahren von DIPCDI-HOBt in DMF entsprechend dem Verfahren von Guo, L. et al [Chem. Pharm. Bull., 36, 4989 (1988)] durchgeführt.
Nach Beendigung der Kondensationsreaktion erfolgt die Kupplung für den Schutz der freien Aminogruppen unter Verwendung von Essigsäureanhydrid (DMBHA-Harz).

(2) Einführung von Arginin in die 17-Stellung des DMBHA-Harzes

Nach Entfernung der Fmoc-Gruppen von dem DMBHA-Harz, hergestellt gemäß (1), mit 20%igem Piperidin/DMF, werden 2,5 äq Fmoc-Arg(Mtr)-OH, bezogen auf das DMBHA-Harz, zugegeben, und die Kondensationsreaktion wird in DMF gemäß dem DIPCDI-HOBt-Verfahren durchgeführt.
Das Fortschreiten der Kondensationsreaktion wird durch Messung entsprechend dem Ninhydrintest von Kaiser, E. et al [And. Biochem., 34, 595 (1970)] verfolgt.

(3) Einführung des Cysteins in die 16-Stellung

Nach Entfernung der Fmoc-Gruppen vom DMBHA-Harz, hergestellt gemäß (2), in welches Arginin eingeführt wurde, mit 20%igem Piperidin/DMF, werden 2,5 äq Fmoc-Cys(MBzl)-OH, bezogen auf das DMBHA-Harz, zugegeben, und die Kondensationsreaktion wird in DMF gemäß dem DIPCDI-HOBt-Verfahren durchgeführt. Der Grad des Fortschreitens der Kondensationsreaktion wird ähnlich wie in (2) durch Messung entsprechend dem Ninhydrintest festgestellt.

(4) Einführung der Aminosäuren in die 15- bis 1-Stellungen

Ähnlich wie oben werden die Lys(Boc)-, Arg(Mtr)-, Tyr(tert.-Bu)-, Cys(MBzl)-, Ile-, Gly-, Arg(Mtr)-, Tyr(tert.-Bu)-, Cys(MBzl)-, Lys(Boc)-, Arg(Mtr)-, Tyr(tert.-Bu), Cys(MBzl), Trp- und Arg(Mtr)-Reste entsprechend der Sequenz von der C-terminalen Aminosäure nacheinander in das DMBHA-Harz eingeführt, wobei ein mit Schutzgruppen geschütztes Peptid-(A)-Harz erhalten wurde.
Jede Aminosäure-Kondensationsreaktion bei der Festphasensynthese erfolgte entsprechend den Verfahrensbedingungen, wie sie in der folgenden Tabelle angegeben sind. Tabelle 1 Verfahren Reagens Lösungsmittel Zeit x Wiederholungszahl Entfernung der Fmoc-Gruppe Waschen Kondensationsreaktion % Piperidin/DMF Fmoc-Aminosäure ( äq) + DIPCDI + HOBt Minuten Stunden

(5) Herstellung des Peptids (A) durch Entfernung der Schutzgruppen und Verfahren für die Entfernung des Harzes und Partialreinigung

Das mit Schutzgruppen geschützte Peptid-(A)-Harz, hergestellt gemäß den Verfahrensstufen (1) bis (4), wurde einer 20%igen Piperidin/DMF-Behandlung zur Entfernung der Fmoc-Gruppe unterworfen und dann bei 25ºC während 2 Stunden in einem 1 M TMSOTf-Thioanisol/TFA-System (10 ml Trifluoressigsäure in Anwesenheit von m-Cresol (100 äq) und Ethanethiol (300 äq)) pro 100 mg Harz umgesetzt. Das Harz wurde von dem Reaktionsgemisch abfiltriert und zweimal mit 1 ml Trifluoressigsäure gewaschen. Zu dem Gemisch aus Filtrat und den Waschlösungen wurden 100 ml eisgekühlter trockener Ether zugegeben. Der gebildete Niederschlag wurde zentrifugiert, und der Rückstand wurde von dem Überstand durch Dekantieren abgetrennt. Der entstehende Rückstand wurde mit kaltem Ether gewaschen, in 10 ml 4N AcOH gelöst, 830 mg, 80 äq Dithiothreit wurden zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht geruhrt.
Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert, der Überstand wurde mit Sephadex G-10 (3,7 x 50 cm) behandelt, mit 4N AcOH gelfiltriert, und die Fraktion, welche durch das Sephadex ohne Aufhören hindurchging, wurde als Haupteluatteil gesammelt und lyophilisiert, wobei ein Pulver aus teilweise gereinigtem, nicht cyclisiertem Polypeptid (A) erhalten wurde.

(6) Herstellung des Polypeptids (A) durch Luftoxidation

Andererseits wurde der pH von der Hälfte der Menge der Fraktion, welche durch Sephadex ohne Aufhören bei der Gelfiltration hindurchging, mit konzentriertem wäßrigem Ammoniak auf 7,5 eingestellt, und dann erfolgte eine Luftoxidation durch Belüftung, um die Cyclisierungsreaktion durchzuführen. Nach Beendigung der Luftoxidation wurde das cyclisierte Peptid (A) an 10 g Diaion-HP-20-Harz adsorbiert und mit 60%igem CH&sub3;CN (in 1N AcOH) desorbiert und eluiert, und das Eluat wurde bei Raumtemperatur bei verringertem Druck zur Entfernung von CH&sub3;CN konzentriert und dann lyophilisiert, wobei ein Pulver erhalten wurde. Das Pulver wurde in einer geringen Menge Wasser gelöst, und die Lösung wurde auf ein Asahipak gegossen und durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC-Modell 600, hergestellt von Waters Co.) unter Verwendung von Gradienteneluierung mit CH&sub3;CN gereinigt, wobei das Peptid (A) als einziger Peak in einer Ausbeute von 27% erhalten wurde (ein Wert berechnet auf dem Schutzgruppen-geschützten Peptid-(A)-Harz).

(7) Analyse des Polypeptids

Der Wert für die Aminosäurezusammensetzung bei der Leucin-Aminopeptidase-Spaltung des Polypeptids, gereinigt wie bei (6) oben beschrieben, steht in guter Übereinstimmung mit dem berechneten Wert der Zusammensetzung, bezogen auf die Aminosäuresequenz der Formel (A).
Der Wert für das Molekulargewicht gemäß FAB-MS, der berechnete Wert von (M+H&spplus;) betrug 2309,786, und andererseits wurde ein Wert von 2310,048 gefunden.
Die spezifische Drehung [α]D²&sup0; des erhaltenen Polypeptids betrug +14,2º (C = 0,3, 1N Essigsäure).

Beispiel 2 und Vergleichsbeispiele 1 und 2

Antivirale Aktivität gegenüber humanem Immundefektvirus (HIV)

Die antivirale Aktivität des Polypeptids (A), synthetisiert gemäß Beispiel 1, gegenüber HIV, wurde entsprechend dem folgenden Verfahren geprüft und bewertet.
HIV-infizierte MT-4-Zellen (2,5 x 10&sup4; Zellen/Vertiefung, Multiplizität der Infektion (MOI): 0,001) wurden unmittelbar nach der Infektion zusammen mit der Testsubstanz mit verschiedenen Änderungen der Konzentration auf eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben. Nach der Inkubation bei 7ºC während 5 Tagen in einem CO&sub2;-Inkubator wurde die Zahl der überlebenden Zellen gemäß dem MTT-Verfahren [Pauwels et al; J. Virol Methods, 20, 309-321 (1988)] gemessen. Die antivirale Aktivität wird als Konzentration ausgedrückt, bei der die zelluläre Affektion, bedingt durch HIV-Infektion, um 50% inhibiert wird (EC 50 : 50% wirksame Konzentration). Um andererseits die Zytotoxizität der Testsubstanz an MT-4-Zellen zu prüfen, wurden nicht mit dem Virus infizierte Zellen ähnlich wie oben zusammen mit der Testverbindung mit verschiedenen Änderungen der Konzentration inkubiert. Die Zytotoxizität wird als 50%ige zytotoxische Konzentration (CC 50), bedingt durch die Testsubstanz, angegeben. Das Rohverhältnis von CC 50 zu EC 50 (CC 50/EC 50) wird als wirksames Verhältnis (SI) angegeben.
In der Tabelle 2 sind die EC 50-, CC 50- und SI-Werte des Polypeptids (A) und von Tachyplesin I, einem bekannten Polypeptid mit einer Affinität für Endotoxine und Azidothymidin, einem Anti-HIV-Mittel, die beide zum Vergleich verwendet wurden, angegeben. Tabelle 2 Testarzneimittel Beispiel Vergleichsbeispiel Polypeptid (A) Tachyplesin I Azidothymidin (AZT)
Aus der obigen Tabelle ist erkennbar, daß das erfindungsgemäße Polypeptid (A) eine etwas stärkere Zytotoxizität besitzt als Tachyplesin I, dessen Anti-HIV-Aktivität vorher angegeben wurde. Es zeigt jedoch eine antivirale Aktivität bei einer Konzentration von 1/50. Im Vergleich mit Azidothymidin besitzt das Polypeptid (A) einen EC 50-Wert mit höherer Konzentration, aber es besitzt eine um das 60fach höhere CC 50, was eine niedrige Zytotoxizität anzeigt.

Beispiel 3

In der Tabelle 3 sind die Strukturformeln und die physikalischen Eigenschaften der verschiedenen erfindungsgemäßen Polypeptide, die auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt wurden, und ihre antiviralen Aktivitäten gegenüber HIV, die auf ähnliche Weise wie in Beispiel 2 geprüft und bewertet wurden, angegeben.
In den Verbindungen dieses Beispiels in der obigen Tabelle sind die Cys-Reste in den 3-, 7-, 12- und 16-Stellungen über Disulfidbindungen zwischen den 3- und 16-Stellungen und den 7- und 12-Stellungen, sofern nicht an ders angegeben, gebunden.
In der obigen Tabelle bedeutet "AZT" Azidothymidin (üblicherweise: Zidovudin).

Industrielle Verwendbarkeit

Erfindungsgemäß werden neue Polypeptide oder ihre Salze mit antiviraler Aktivität gegenüber humanem Immundefektvirus (HIV) und ein Anti-HIV- Mittel, welches diese als wirksamen Bestandteil enthält, zur Verfügung gestellt. Tabelle 3 Symbol Verbindung Physikalische Eigenschaften Anti-HIV-Aktivität Vergleichsbeispiel (3H) ist die reduzierte Form von (3)

Claims

1. Neues Polypeptid, dargestellt durch die folgende Formel (I)

[worin

A&sub1; ein Wasserstoffatom oder einen oder zwei Aminosäurereste von Aminosäuren, ausgewählt aus Lysin und Arginin, bedeutet,

A&sub2; unabhängig einen Tyrosin-, Phenylalanin- oder Tryptophanrest bedeutet,

A&sub3; unabhängig einen Arginin- oder Lysinrest bedeutet,

A&sub4; unabhängig einen Alanin-, Valin-, Leucin-, Isoleucin-, Serin-, Cystein- oder Methioninrest bedeutet,

A&sub5; -OH (welches sich von einer Carboxylgruppe ableitet) oder -NH&sub2; (welches sich von einer Säure-Amid- Gruppe ableitet) bedeutet,

Cys einen Cysteinrest bedeutet,

Gly einen Glycinrest bedeutet,

Lys einen Lysinrest bedeutet,

Arg einen Argininrest bedeutet, und

Trp einen Tryptophanrest bedeutet; und wobei die Cysteinreste in den 3- und 16-Stellungen über eine Disul fidbindung (-S-S-) gebunden sein können, und wenn die 7- und 12-Stellungen beide Cysteinreste bedeuten, diese über eine Disulfidbindung (-S-S-) gebunden sein können],

oder ein Salz davon.

2. Anti-HIV-Mittel, welches als wirksamen Bestandteil ein neues Polypeptid, das durch die folgende Formel (I)

dargestellt wird,