DE69217763T2

DE69217763T2 - Hexapeptide

Info

Publication number: DE69217763T2
Application number: DE69217763T
Authority: DE
Inventors: Masaki Aburada; Sakae Amagaya; Tadami Fujiwara; Michio Nagasawa; Tsutomu Oyama
Original assignee: Tsumura and Co
Current assignee: Tsumura and Co
Priority date: 1991-07-30
Filing date: 1992-07-30
Publication date: 1997-07-10
Anticipated expiration: 2012-07-31
Also published as: GR3023058T3; ATE149518T1; DE69217763D1; CA2074967A1; KR100251496B1; EP0526192B1; KR930002373A; ES2101037T3; US5393740A; AU661003B2; JPH05194590A; DK0526192T3; AU2065792A; EP0526192A3; JP2803477B2; EP0526192A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Hexapeptid und ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon. Das Hexapeptid hat eine zunehmende vasculäre Permeabilität unterdrückende Wirkung, eine anti-ödematische Wirkung, entzündungshemmende Wirkung, eine verbessernde Wirkung auf pathologische Zustände von Gefäßendothelien, eine blutdrucksenkende Wirkung, eine Protease inhibierende Wirkung, ene Wirkung gegen disseminierte intravasale Gerinnungen (DIC-Syndrom) und eine wundheilende Wirkung. Das Hexapeptid kann als medizinisches Produkt eingesetzt werden, wie z.B. als ein anti-ödematisches Mittel, ein Antischockmittel, ein anti-thrombotisches Mittel, ein anti-arterio-sclerotisches Mittel, ein anti-allergisches Mittel, ein blutdrucksenkendes Mittel, ein Wundheilungsmittel und ein entzündungshemmendes Mittel.
Bei einer herkömmlichen Ödem-Therapie, wie z.B. einem Cerebral-Ödem, wird weit verbreitet ein therapeutisches Verfahren angewendet, bei dem ein osmotisches diuretisches Mittel eingesetzt wird, um den hydrostatischen Druck des Blutes zu verringern und Wasser in das Blut einzuführen. Bei diesem Verfahren wird eine hypertonische Lösung des diuretischen Mittels, wie z.B. Glycerin oder Manitol schnell intravenös drei- oder viermal täglich injiziert. Jede Injektionszeit benötigt etwa 30 Minuten bis eine Stunde.
Dieses Verfahren erfordert jedoch eine komplizierte Verabreichungssteuerung. Die Dosen des osmotischen diuretischen Mittels müssen entsprechend der Pathologie und dem Zustand des Patienten geändert werden. Weiterhin muß die Verabreichung des oben genannten osmotischen diuretischen Mittels sorgfältig kontrolliert werden, da das Mittel Nebenwirkungen verursacht, wie Elektrolytstörung und Dehydratisierung.
Bei der herkömmlichen Therapie für Septikämie werden hauptsächlich Antibiotika eingesetzt. Da jedoch die Antibiotika die wachsende vasculäre Permeabilität nicht unterdrücken können, können bei der Therapie mit den Antibiotika Schocks häufig nicht befriedigend medikamentiert werden. Zusammen mit den oben genannten Antibiotika werden auch Nebennierenrindenhormone zur Unterdrückung der wachsenden vasculären Permeabilität eingesetzt. Eine große Dosis von Steroiden, wie Nebennierenrindenhormonen, verursacht jedoch Nebenwirkungen, wie z.B. Immun-Suppression, Elektrolyt-Abnormalitäten und Rückfälle.
Wie oben beschrieben, ist bislang noch kein Medikament gefunden worden, das zunehmende vasculäre Permeabilität bei Ödemen und Septikämie unterdrücken kann, wenig Nebenwirkungen verursachen kann und welches für die Dosierung keine komplizierte Verabreichung erfordert.
Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue Verbindung bereitzustellen, die eine unterdrükkende Wirkung gegenüber zunehmender vasculärer Permeabilität hat und bei Verabreichung wenig Nebeneffekte verursacht.
Eine andere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein pharmazeutisches Mittel zur Verfügung zu stellen, welches keine komplizierte Steuerung der Verabreichung erfordert.
EP-A-0 333 071 und Eur. J. Biochem. (1982, 124, Seiten 117-125) beschreiben beide die Synthese verschiedener Neurotensin- Analoger und die pharmazeutische Verwendung solcher Verbindungen.
Die vorliegende Erfindung gibt ein Hexapeptid an, das wiedergegeben wird durch Formel (I):
A-B-Pro-C-D-E ... (I)
wobei A die L- oder D-Form von Arginin oder Lysin ist, dessen N-terminale Aminogruppe deaminiert ist, B die L- oder D- Form von Arginin, Lysin oder Histidin ist, Pro die L- oder D- Form von Prolin ist, C die L- oder D-Form von Tyrosin, Tryptophan oder Phenylalanin ist, D die L-oder D-Form von Valin, Isoleucin oder Leucin ist, und E die L- oder D-Form von Valin, Isoleucin oder Leucin ist, wobei eines der Wasserstoffatome der Aminogruppe durch eine C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylgruppe ersetzt sein kann, und dessen C-terminale Carboxylgruppe durch -CH&sub2;OR ersetzt ist, worin R ein Wasserstoffatom oder eine C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylgruppe ist; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz des Hexapeptides.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Hexapeptid, wiedergegeben durch die Formel (II), bereit:
A-B-Pro-C-D-E ... (II)
worin A die L- oder D-Form von Arginin oder Lysin ist, dessen N-terminale Aminogruppe alkyliert oder acyliert ist, B die L- oder D-Form von Arginin, Lysin oder Hisdidin ist, Pro die L- oder D-Form von Prolin ist, C die L- oder D-Form von Tyrosin, Tryptophan oder Phenylalanin ist, D die L-oder D-Form von Valin, Isoleucin oder Leucin ist und E die L- oder D-Form von Valin, Isoleucin oder Leucin ist, wobei eines der Wasserstoffatome der Aminogruppe durch eine C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylgruppe ersetzt sein kann, und dessen C-terminale Carboxylgruppe durch -CH&sub2;OR ersetzt ist, worin R ein Wasserstoffatom oder eine C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylgruppe ist; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz des Hexapeptides.
Das Hexapeptid oder sein Salz nach der Erfindung hat, zusätzlich zu der oben genannten unterdrückenden Wirkung gegenüber beschleunigter vasculärer Permeabilität, eine anti-ödematische Wirkung, eine entzündungshemmende Wirkung, eine Gefäßendothelkrankheiten abmindernde Wirkung, eine blutdrucksenkende Wirkung, eine Protease inhibierende Wirkung, eine Anti-DIC-Wirkung und eine wundheilende Wirkung. Das Hexapeptid nach der Erfindung oder sein Salz kann daher als ein aktiver Bestandteil für ein 30 pharmazeutisches Mittel, wie ein anti-ödematisches Mittel, ein Anti-Schockmittel, ein anti-thrombotisches Mittel, ein antiarteriosclerotisches Mittel, ein anti-allergisches Mittel, ein blutdrucksenkendes Mittel, ein wundheilendes Mittel oder ein entzündungshemmendes Mittel einsetzbar sein.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend im einzelnen beschrieben.
Auf das durch Formeln (I) und (II) wiedergegebene Hexapeptid und pharmazeutisch annehmbare Salze von diesem wird im weiteren gelegentlich als auf die Hexapeptid-Verbindung der vorliegenden Erfindung Bezug genommen.
In dieser Beschreibung verwendete Aminosäuren werden auch gemäß einer in einem IUPAC-IVB-Komitee für biochemische Nomenklatur (CBN) angewendeten Methode abgekürzt und beispielhaft wie folgt angegeben:
Arg: L-Arginin His: L-Histidin
Ile: L-Isoleucin Leu: L-Leucin
Lys: L-Lysin Phe: L-Phenylalanin
Pro: L-Prolin Tyr: L-Tyrosin
Trp: L-Tryptophan Val: L-Valin
D-Arg: D-Arginin D-His: D-Histidin
D-Ile: D-Isoleucin D-Leu: D-Leucin
D-Lys: D-Lysin D-Phe: D-Phenylalanin
D-Pro: D-Prolin D-Tyr: D-Tyrosin
D-Trp: D-Tryptophan D-Val: D-Valin
Die sechs Aminosäuren, aus denen sich das Hexapeptid der vorliegenden Erfindung zusammensetzt, können entweder vom L-Typ oder vom D-Typ sein.
In den Formeln (I) und (II) ist die erste Aminosäure vom N- Ende des Hexapeptids aus, die durch A wiedergegeben wird, ein Argenin oder Lysin, dessen N-terminale Aminogruppe deaminiert (Formel (I)), oder alkyliert oder acyliert (Formel (II)) ist.
Was die Deaminierung der N-terminalen Aminogruppe der Aminosäure A angeht, wird z.B., wenn das deaminierte Argenin hergestellt wird, 5-Amino-Valeriansäure in einer 2n-Natriumhidroxydlösung gelöst, dann wird S-Methylthiocarbamid zu der Lösung zugegeben, wodurch das deaminierte Arginin erhalten wird.
Die Alkylgruppe, die an der N-terminalen Aminogruppe der Aminosäure A eingeführt wird, kann z.B. Methyl, Ethyl, Propyl und Buthyl sein. Die Alkylierung der N-terminalen Aminogruppe kann z.B. ausgeführt werden, indem die Aminosäure A mit einem entsprechenden Alkyljodid, wie z.B. Methyljodid oder Ethyljodid in einem organischen Lösungsmittel, wie Aceton zur Reaktion gebracht wird.
Die Acylgruppe, die an der N-terminalen Aminogruppe der Aminosäure A eingeführt wird, kann z.B. Formyl, Acetyl, Propionyl, Benzoyl oder b-Tolnolsulfonyl sein. Die Acylierung der N- terminalen Aminogruppe kann z.B. ausgeführt werden, indem die Aminosäure A mit einem Säureanhydrid wie z.B. Essigsäureanhydrid oder einem Säurechlorid wie z.B. Acetylchlorid in einem organischen Lösungsmittel wie z.B. Methylchlorid oder Pyridin zur Reaktion gebracht wird.
In den Formeln (I) und (II) wird die Peptidbindung zwischen der fünften Aminosäure (wiedergegeben durch D) und der sechsten Aminosäure (wiedergegeben durch E) vom N-Ende des Hexapeptids durch Formel (III) repräsentiert:
worin X ein Wasserstoffatom oder eine C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylgruppe darstellt.
In der Formel (III) kann die Alkylgruppe Methyl, Ethyl, n- Propyl, t-Propyl, n-Butyl, i-Butyl oder t-Butyl sein.
In den Formeln (I) und (II) ist die sechste Aminosäure vom N-Ende des Hexapeptids, dargestellt durch E, Valin, Isoleucin oder Leucin. Wenn die erste Aminosäure A deaminiert wird, wird die C-terminale Carboxylgruppe der sechsten Aminosäure E mit -CH&sub2;OR substituiert, worin R ein Wasserstoffatom oder eine C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylgruppe (Formel (I)) darstellt. Die Alkylgruppe kann z.B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, t-Propyl, n-Butyl, i-Butyl und t- Butyl sein. Wenn die erste Aminosäure A alkyliert oder acyliert ist, wird die C-terminale Carboxylgruppe der sechsten Aminosäure E mit -CH&sub2;OR substituiert, wie oben angegeben (Formel (II)).
Die Einführung der substituierenden Gruppe an der C-terminalen Carboxylgruppe kann z.B. durch die Alkylierung wie oben beschrieben erreicht werden.
Die Hexapeptide nach der vorliegenden Erfindung können mit einer Flüssig- oder Festphasentechnik synthetisiert werden, was in der Peptidsynthese bekannte Verfahren sind. Eine Peptidsynthese, die die Festphasenmethode verwendet, wird nachfolgend im einzelnen beschrieben.
Bei der Festphasenmethode werden die sechs Aminosäuren sequentiell kondensiert, wobei ein in organischem Lösungsmittel unlösliches Harz verwendet wird, indem von der Aminosäure des C- Endes des Hexapeptids begonnen wird, die dann mit Säure behandelt wird, wodurch das Hexapeptid in freier Form erhalten wird.
Das in organischen Lösungsmitteln unlösliche Harz ist vorzugsweise in organischem Lösungsmittel chemisch stabil und hat gute Quelleigenschaften. Das im organischen Lösungsmittel unlösliche Harz ist beispielsweise ein Harz, das durch Einführen einer funktionellen Seitengruppe, wie einer Chlormethylgruppe oder einer Hydroxymethylgruppe, in ein Styrol-Bivinylbenzolcopolymer erhalten wird. Vor der Synthese des Hexapeptids wird die funktionelle Gruppe aktiviert. Die Carboxylgruppe der Aminosäure E wird an die aktivierte funktionelle Gruppe des Harzes gebunden.
Bei der Festphasensynthese wird entweder nur eine α-Amino gruppe oder sowohl die α-Aminogruppe als auch eine funktionlle Gruppe in der Seitenkette der Aminosäuren, die das Hexapeptid der vorliegenden Erfindung bilden, durch eine Schutzgruppe geschützt, und die geschützten Aminosäuren werden bei der Synthese des Hexapeptids verwendet. Beispiele für die Schutzgruppe für die α-Aminogruppe sind eine t-Butyloxycarbonylgruppe (Boc), eine 9-Fluorenylmethyloxycarbonylgruppe (Fmoc), oder zu diesen äquivalenten Gruppen. Beispiele einer Schutzgruppe für eine Phenolhydroxylgruppe des Tyrosins sind eine Benzylgruppe (Bzl), eine 2,6-Dichlorbenzylgruppe (Cl&sub2;-Bzl) als Derivat hiervon, eine o- Brombenzyloxycarbonylgruppe (Br-Z), und deren äquivalente Gruppen. Leucin und Isoleucin können generell mit Boc oder Fmoc geschützt eingesetzt werden. Diese geschützten Aminosäuren können im Handel erhältliche Produkte sein.
Die Synthese des Hexapeptids gemäß der vorliegenden Erfindung wird nachfolgend in größerem Detail beschrieben.

(1) Einführung beteiligter Aminosäuren

Vor der Peptidsynthese muß, wie oben erwähnt, ein in organischem Lösungsmittel unlösliches Harz (Harz) aktiviert werden. Diese Aktivierung kann wie folgt durchgeführt werden.
Das Harz wird in ein Reaktionsgefäß für die Peptid-Festphasentechnik vorlegt und Methylenchlorid wird dem zugegeben. Dann wird insgesamt ein- bis dreimal eine 10%-ige Lösung aus einer Mischung aus Triethylamin (TEA)/Methylenchlorid dazugegeben. Jedesmal, wenn das 10%-ige TEA/Methylenchlorid zugegeben wird, wird die erhaltene Mischung 5 bis 10 Minuten gerührt. Die Mischung wird dann abfiltriert und das Harz gewaschen. In diesem aktivierten Harz ist TEA (Aminogruppe) an die funktionelle Gruppe des Harzes gebunden.
Das oben beschriebene Reaktionsgefäß kann einen Zufüllstutzen für die Zugabe eines Reagenzes einschließlich der geschützten Aminosäuren, eines Lösungsmittels und dergleichen haben, sowie einen Filter zum Filtrieren des Lösungsmittels und kann eine Reaktion des Harzes und des Reagenzes durch Schütteln des Gefäßes oder Rühren des Inhalts ermöglichen. Das Reaktionsgefäß ist vorzugsweise aus Glas oder Teflon (Markenname) hergestellt und erlaubt das Abfiltrieren durch Druckerhöhung oder erniedrigung in dem Reaktionsgefäß.
Etwa 2 bis 20 ml eines Lösungsmittels wie Methylenchlorid, Chloroform, Dimethylformamid (DMF), oder Benzol, welches das Harz quellen kann, werden zu einem Gramm des wie oben beschrieben aktivierten Harzes zugegeben, wodurch man eine Suspension erhält. Etwa 1 bis 6 Äquivalentgewichte einer C-terminalen Aminosäure, deren α-Aminogruppe bezogen auf ein Äquivalentgewicht der aktivierten funktionellen Gruppe des Harzes mit der Schutzgruppe geschützt ist, wird der erhaltenen Suspension zugegeben. Die C-terminale Aminosäure entspricht der sechsten Aminosäure vom N-Ende des Hexapeptids der vorliegenden Erfindung und wird in Formeln (I) und (II) durch E wiedergegeben. Die erhaltene Mischung wird etwa 1 bis 20 Minuten gerührt oder geschüttelt.
Etwa 0,5 bis 2 Äquivalentgewicht eines Kopplungsreagenzes, das die C-terminale Aminosäure an die funktionelle Gruppe des Harzes koppelt, wird je Äquivalentgewicht der C-terminalen Aminosäure der Suspension zugegeben, und die Suspension wird gerührt oder geschüttelt, wobei die C-terminale Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure an das aktivierte Harz angekoppelt wird.
Beispiele für das Kopplungsreagenz sind Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), wasserlösliches Carbodiimid, Carbonyldiimidazol, ein Woodward-Reagenz "K", N-Ethyl-2-Hydroxybenzisoxazol-Trifluoroborat, 1-Ethoxycarbonyl-2-Ethoxy-1-2-Dihydroxychinolin, ein "Bop-Reagenz", und Diphenylphosphorylazido.
Der Grad des Fortschreitens der Kopplungsreaktion kann mit einem Ninhydrin-Reagenz oder einem Fluoreszamin-Test überwacht werden. Wenn die Reaktion nicht vollständig ist, wird die Kopplung wiederholt.
Alternativ kann die Aminosäure, deren α-Aminogruppe geschützt ist, auch mit dem Harz gemäß einem aktiven Veresterungsverfahren oder einem symmetrischen Anhydridverfahren anstelle des Verfahrens, das wie oben beschrieben den Koppler verwendet, angebunden werden.
Nach Abschluß der Reaktion wird das mit der C-terminalen Aminosäure gekoppelte Harz (C-terminales Aminosäureharz) ein oder mehrere Male mit 2 bis 50 ml eines Waschlösungsmittels in bezug auf 1 g des Harzes, das aktiviert aber nicht mit der Aminosäure gekoppelt ist, d.h. dem original aktivierten Harz, gewaschen. Als Waschlösungsmittel kann z.B. wenigstens eines der Lösungsmittel Methylenchlorid, Chloroform, Methanol, Ethanol, DMF, Benzol und Essigsäure verwendet werden. Das Reaktionsprodukt wird dann filtriert.
Die nicht reagierten aktivierten funktionellen Gruppen oder Aminogruppen des gewaschenen Harzes werden dann mit einem Terminierungsreagenz abgeblockt, um weitere Reaktionen zu verhindern, 20 und dann wiederum gewaschen. Beispielsweise werden etwa 0,5 bis 5 Äquivalentgewicht des Terminierungsreagenzes bezogen auf 1 Äquivalentgewicht der funktionellen Gruppe des Harzes zugegeben und mit dem Harz etwa 10 Minuten bis 18 Stunden reagieren gelassen.
Beispiele für das Terminierungsreagenz sind Essigsäureanhydrid/TEA/Methylenchlorid, Essigsäureanhydrid/TEA/Chloroform, Acetylimidazol/DMF und Fluoreszamin/Diisopropylmethylamin/Methylenchlorid.
Danach wird die Schutzgruppe der α-Aminogruppe am C-terminalen Aminosäureharz für die Kopplung mit der nächsten Aminosäure eliminiert.
Beispielsweise ist Trifluoressigsäure (TFA) als ein Eliminierungsreagenz für Boc geeignet. 100 v/v% TFA oder TFA verdünnt auf 10 v/v% oder mehr mit Methylenchlorid, Chloroform oder hierzu Äquivalentem können verwendet werden, z.B. wie folgt:
Etwa 2 bis 50 ml einer TFA-Lösung bezogen auf 1 g des originalen aktivierten Harzes werden vorzugsweise zu dem C-terminalen Aminosäureharz zugegeben und 5 bis 60 Minuten reagieren gelassen. Nach der Reaktion wird die Reaktionsmischung filtriert und das C-terminale Aminosäureharz mit dem Waschlösungsmittel gewaschen. Etwa 2 bis 50 ml einer Lösung aus etwa 5 bis 30% TFA in Methylenchlorid, Chloroform, oder hierzu Äquivalentem werden in bezug auf 1 g des original aktivierten Harzes zu dem C-terminalen Aminosäureharz zugegeben, wodurch das Rest-TFA neutralisiert wird. Danach wird das Reaktionsprodukt mit dem Waschlösungsmittel gewaschen.
Weiterhin ist Piperidin als ein Eliminierungsmittel für Fmoc geeignet und wird verwendet nach Verdünnung mit Methylenchlorid, DMF, Chloroform oder deren Äquivalenten auf eine Konzentration von 5 bis 50%, z.B. wie folgt:
Etwa 2 bis 100 ml der Piperidin-Lösung bezogen auf 1 g des originalen aktivierten Harzes werden zu dem C-terminalen Aminosäureharz zugegeben und etwa 5 bis 60 Minuten reagieren gelassen. Nach der Reaktion wird die Reaktionslösung filtriert und das C-terminale Aminosäureharz mit dem Waschlösungsmittel gewaschen.
Dann wird die fünfte Aminosäure vom N-Ende des Hexapeptides der vorliegenden Erfindung (dargestellt durch D in den Fomeln (I) und (II)) an die nun freie α-Aminogruppe der an das Harz gebundenen C-terminalen Aminosäure wie folgt gekoppelt.
Das zum Quellen des Harzes geeignete oben genannte Lösungsmittel wird dem erhaltenen C-terminalen Aminosäureharz zugegeben, um es zu suspendieren. Etwa 1 bis 6 Äquivalentgewichte der geschützten fünften Säure D, bezogen auf 1 Äquivalent der funktionellen Gruppe auf dem Harz, wird der Suspension zugegeben, und der Koppler wird dann wie oben beschrieben zu der erhaltenen Mischung gegeben.
Der Grad des Fortschritts der Kopplungsreaktion kann mit einem Ninhydrinreagenz oder einem Fluoreszamintest überwacht werden. Nach der Reaktion wird das Reaktionsprodukt mit dem Waschlösungsmittel gewaschen. Wenn die Reaktion nicht vollständig ist, wird der obige Kopplungsschritt wiederholt oder es wird ein Blocken von Überschüssigen α-Aminogruppen der C-terminalen Aminosäuren gegen nachfolgende Reaktionen mit dem oben genannten Terminierungsreagenz durchgeführt.
Danach wird die Eliminierung der Schutzgruppe, Waschen, Neutralisieren, Waschen, Koppeln und Waschen in den aufeinanderfolgenden Schritten nach den gleichen Verfahren wie oben beschrieben wiederholt durchgeführt, außer daß jede geschützte Aminosäure entsprechend jeder konstituierenden Aminosäure nacheinander verwendet wird, wodurch allmählich die vierte Aminosäure (C) an die erste Aminosäure A an die Aminosäure-Einheit auf dem Harz kondensiert wird. Als Ergebnis hiervon kann eine Peptidkette entsprechend dem Hexapeptid der vorliegenden Erfindung erhalten werden.

(2) Eliminierung der Peptidkette von dem Harz und Eliminierung der Schutzgruppe

Das mit der Peptidkette gekoppelte Harz (d.h. Peptidharz) wird mit Fluorwasserstoff (HF) behandelt, um eine Aminobindung zwischen dem Peptid und dem Harz zu spalten, und gleichzeitig wird die Schutzgruppe eliminiert, um ein freies Peptid zu erhalten.
Für die HF-Behandlung ist ein Spezialgefäß erforderlich und kommerziell erhältlich.
Genauer wird das getrocknete Peptidharz in einem Gefäß vorgelegt, 0,5 bis 5 ml Anisol bezogen auf 1 g des Peptidharzes werden dem zugegeben, um eine Nebenreaktion zu verhindern, und die Mischung wird gerührt. 2 bis 50 ml flüssiges HF werden der Mischung zugegeben, bezogen auf 1 g des Peptidharzes, um das Peptidharz bei -20 bis 0 ºC 0,5 bis 2 Stunden zu behandeln. Hierbei wird dem Anisol vorzugsweise Dimethylsulfid oder Ethandithiol zugegeben.
Nach der Reaktion wird HF unter verringertem Druck entfernt und restliches HF, eine Schutzgruppe, Anisol und andere Additive werden durch ein Lösungsmittel wie Ethylacetat, Diethylether oder Benzol elimimiert. Das Peptid wird mit einer wässrigen sauren Lösung wie einer wässrigen Essigsäurelösung extrahiert, und das Harz, von dem das Peptid eliminiert wurde, wird durch Filtrieren entfernt.

(3) Reinigung des Rohpeptids

Der in dem oben genannten Schritt erhaltene Extrakt enthält zusätzlich zu dem gewünschten Peptid Nebenprodukte, wie z.B. während der Synthese gebildete defekte Peptide, und muß gereinigt werden.
Genauer gesagt, wird der Extrakt, der das Peptid und die Nebenprodukte enthält, durch Ultrafiltration konzentriert. Danach werden Ionenaustausch, Einfrieren und Trocknen durchgeführt, wodurch ein getrocknetes Produkt erhalten wird. Das getrocknete Produkt wird mit einer fraktionierten Umkehrphasen- HPLC gereinigt. Schließlich werden Ionenaustausch und Gelfiltration einer Fraktion, die das gewünschte Peptid enthält, durchgeführt, um ein gereinigtes Hexapeptid gemäß der vorliegenden Erfindung zu erhalten.
Beispiele eines pharmazeutisch annehmbaren nicht toxischen Salzes des Hexapeptides gemäß der vorliegenden Erfindung sind Salze mit einem Alkalimetall wie Natrium oder Kalium oder mit einem Erdalkalimetall wie Calcium und Magnesium, und Säureadditionssalze mit einer anorganischen Säure wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure oder Carbonsäure oder mit einer organischen Säure wie Essigsäure, Propionsäure, Weinsäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, Asparaginsäure oder Glutaminsäure.
Das pharmazeutisch annehmbare Salz des Hexapeptides gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt auch ein komplexes Salz mit einer Metallverbindung wie einer Zink-, einer Nickel- oder einer Kobaltverbindung, und mit einer Polyamsäure wie Poly-L-Glutaminsäure.
Da die Hexapeptidverbindung gemäß der vorliegenden Erfindung direkt auf die vasculären Endothelzellen wirkt, ist sie wirksam und kann ein mit der zunehmenden Endothelgefäßkrankheiten verbundenes Ödem stark unterdrücken. Die Hexapeptidverbindung kann Ödeme unterdrücken, die auf vasculären Endothelkrankheiten und verschiedenen Gewebekrankheiten beruhen, zusätzlich zu der Unterdrückung eines Cerebralödems.
Die Hexapeptidverbindung nach der vorliegenden Erfindung hat auch einen Anti-Endotoxinschockeffekt, Protease inhibierende Wirkung (eine Anti-Thombinwirkung, eine Anti-Plasminwirkung), eine blutdrucksenkende Wirkung, eine Anti-DIC-Wirkung, eine anit-allergische Wirkung und eine wundheilende Wirkung.
Insbesondere können die Hexapeptidverbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung wachsende vasculäre Permeabilität unterdrücken und zeigen keine Nebenwirkungen in bezug auf Steroide. Die Hexapeptidverbindung ist daher verwendbar für Krankheiten wie Cerebralödem, Lungenödem, Tracheaödem, Thrombus, Arteriosklerose, Verbrennung, Bluthochdruck und allergische Krankheiten wie Bronchialasthma und Heuschnupfen.
Insbesondere ist die Hexapeptidverbindung nach der vorliegenden Erfindung verwendbar als Mittel zur Verminderung der Blutung aus einer Schnittwunde, wie einem verletzten Gewebebereich während einer chirurgischen Operation, einer lazerierten Wunde des Gehirns oder anderer Gewebe, verursacht durch einen Verkehrsunfall oder dergleichen, und zur Relaxierung und Heilung von Schwellungen, Schmerzen und Entzündungen, die durch die Wunden verursacht sind. Die Hexapeptidverbindung nach der vorliegenden Erfindung kann auch verwendet werden zur Unterdrückung innerer Blutungen, die durch stumpfe Wunden verursacht sind, und Ödeme und Entzündungen, die mit den inneren Blutungen verbunden sind.
Die Hexapeptidverbindung nach der vorliegenden Erfindung ergibt auch ausgezeichnete Wirkungen bei der Suppression und Verbesserung von Cerebralödemen durch Unterdrückung des bei cerebralen ischämischen Krankheiten gefundenen Austretens von Blutkomponenten in die Gewebematrix, was Hirninfarkte (z.B. einen Hirnthrombus und eine Hirnembolie), intrakranielle Hämorrhagie (z.B. eine Hirnblutung und eine Subarachnoidalblutung), eine transiente ischämische Hirnattacke und akute cerebrale Blutgefäßkrankheiten bei einer Hypertensionsenzephalopathie einschließt.
Zusätzlich bewirkt die Hexapeptidverbindung nach der vorliegenden Erfindung Effekte bei der Unterdrückung und Besserung von Verbrennungen, Frostbeulen, anderen Hautentzündungen und -schwellungen, Entzündung der oberen Luftröhre, Asthma, Nasenkongestion, Lungenödem und entzündlichen Krankheiten, die durch endogene und exogene Faktoren verursacht sind, die das vasculäre Endothel und Schleimhäute direkt schädigen, wie z.B. Umweltchemikalien, Chemotherapeutika für Krebs, ein Endotoxin und Entzündungsvermittler.
Insbesondere kann die Hexapeptidverbindung nach der vorliegenden Erfindung die Blutung, Entzündung, Schwellung und Schmerzen einer scharfen Wunde, d.h. des durch eine chirurgische Operation und einen Verkehrsunfall verletzten Gewebebereiches, reduzieren. Die Hexapeptidverbindung unterdrückt auch durch eine stumpfe Wunde verursachte innere Blutungen und Ödeme und Entzündungen, die mit der inneren Blutung verbunden sind. Außerdem ist die Hexapeptidverbindung nach der vorliegenden Erfindung wirksam bei der Behandlung von cerebralen ischämischen Krankheiten, die Hirninfarkte (z.B. einen Hirnthrombus und eine Hirnembolie) intrakranielle Hämorrhagien (z.B. eine Hirnblutung und eine Subarachnoidalblutung), eine transiente ischämische Hirnattacke, und akkute cerebrale Blutgefäßkrankheiten bei einer Hypertensionsenzephalopathie umfassen. Da während dieser akuten cerebralen Blutgefäßkrankheiten Hirnödeme entstehen, beeinflußt insbesondere die Unterdrückung der Ödeme in hohem Maße die Wiederherstellung nach der Heilung dieser Krankheit.
Das pharmazeutische Mittel nach der Erfindung, welches eine Hexapeptidverbindung als einen Wirkstoff enthält, kann als Medizin bei der Therapie der oben genannten Krankheiten eingesetzt werden. Das pharmazeutische Mittel nach der Erfindung ist besonders gut für ein anti-ödematisches Mittel, ein Anti-Schockmittel, ein anti-thrombotisches Mittel, ein anti-arteriosclerotisches Mittel, ein anti-allergisches Mitte, ein blutdrucksenkendes Mittel, ein wundheilendes Mittel und ein entzündungshemmendes Mittel.
Die Hexapeptidverbindung nach der vorliegenden Erfindung und die pharmatzeutischen Mittel können entweder oral oder parenteral in einer für die Therapie wirksamen Menge verabreicht werden. Für Erwachsene liegt die wirksame Menge der Hexapeptid verbindung der Erfindung pro Tag zwischen 0,1 und 150 nmol/kg. Innerhalb dieses Bereiches sollte die verabreichte Menge der Hexapeptidverbindung in Abhängigkeit von einer Vielzahl von Faktoren wie dem Krankheitsgrad, dem Gewicht und Alter des Patienten, ermittelt werden.
Das pharmazeutische Mittel der Erfindung kann ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel oder einen Träger enthalten, in Form einer Flüssigkeit, eines Gels oder eines von der Hexapeptidverbindung verschiedenen Feststoffs. Sofern erforderlich kann das Mittel weiterhin ein Additiv enthalten, das allgemein in einer Arzneimittelzusammensetzung verwendet werden kann, wie z.B. ein allgemein antiseptisch wirkendes Mittel, ein Antioxidationsmittel oder dergleichen.
Das pharmazeutische Mittel der Erfindung kann als ein oral oder parenteral zu verabreichendes Arzneimittel verwendet werden. Das oral zu verabreichende Arzneimittel erhält beispielsweise die Form einer normalen Tablette, einer Kapsel, eines Puders, einer Lösung oder einer Suspension, während das Arzneimittel für parenterale Verabreichung beispielsweise in Form einer normalen Injektionslösung, einer Injektionssuspension, von Suppositorien oder Nasenschleimhaut-Spray vorliegt. Es sollte erwähnt werden, daß das Mittel vorzugsweise durch intravenöse oder subkutane Injektion verabreicht wird. Weiterhin kann die Form des Mittels in Abhängigkeit von der Verfassung des Patienten, seinem Alter und dem Grad der Krankheit ausgewählt werden.
Die vorliegende Erfindung wird im einzelnen mit Hilfe ihrer Beispiele beschrieben werden. Die vorliegende Erfindung ist jedoch durch diese erläuternden Beispiele nicht beschränkt. Beispiele 1, 13 und 15 der folgenden Beispiele fallen außerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, sind jedoch zu Vergleichszwecken eingeschlossen.
Zunächst werden unten Beispiele für die Sythese des Hexapeptids nach der vorliegenden Erfindung beschrieben.
In den Beispielen entsprechen die Hexapeptidnummern den in Tabellen 1 und 2 gezeigten Hexapeptiden.
In Tabelle 1 und 2 steht Desamino-Arg für ω-Guanidinopentansäure. N-Acetyl- und N-Butyl- repräsentieren jeweils acetylierte bzw. butylierte Derivate einer N-terminalen Aminosäure des Hexapeptids. -OH zeigt an, daß eine Carboxylgruppe einer C- terminalen Aminosäure frei ist und -NH&sub2; zeigt an, daß die Carboxylgruppe in ein Carbamoyl überführt ist. Leucinol ist eine Alkoholform von Leucin, d.h. eine -CH&sub2;OH-Gruppe ersetzt die Carboxylgruppe von Leucin. Tabelle 1 Tabelle 2

Beispiel 1 (Synthese von Peptid Nr. 1)

Vorbehandlung; Aktivierung des Harzes

150 g eines in organischem Lösungsmittel unlöslichen Harzes (erhältlich von Peninsula Lab.; 1% Divinylbenol; 100 bis 200 mesh) wurden in einem Reaktionsgefäß für die Peptid-Festphasensynthese vorgelegt (erhältlich von Peninsula Lab.), und die folgenden Lösungsmittel wurden jeweils zweimal fünf Minuten lang zugegeben und gerührt und die Lösungsmittel abfiltriert, um ein aktiviertes Harz zu erhalten.
(i) Methylenchlorid: 1 l
(ii) 10% TEA/Methylenchlorid: 420 ml
Als ein Waschvorgang wurden 1,5 l Methylenchlorid, 1,5 l Methanol, und 1,5 l Methylenchlorid in der genannten Reihenfolge dem aktivierten Harz zugegeben und zwei Minuten lang gerührt. Der oben genannte Vorgang wurde zweimal wiederholt und die erhaltene Lösung wurde abfiltriert (auf diesen Waschvorgang wird im folgenden als Waschvorgang I Bezug genommen).

Schritt 1; Ankoppeln der Aminosäure an das Harz

Die folgenden Materialien wurden der Reihe nach zu dem gesamten bei der Vorbehandlung erhaltenen Harz zugegeben und gerührt, und die erhaltene Mischung wurde abfiltriert.
(1) DMF: 1,5 l
(2) Boc-Leu H&sub2;O: 38,2 g
(3) 1M DCC/DMF-CH&sub2;Cl&sub2;: 120 ml (20 Stunden rühren)
Hierbei gibt Boc- an, daß die α-Aminogruppe einer Aminosäure durch eine Schutzgruppe Boc geschützt ist.
Anschließend wurde der Waschvorgang I durchgeführt.
Das Ergebnis eines Ninhydrintests an dem behandelten Harz war negativ.

Schritt 2; Eliminierung der Schutzgruppe

Das folgende Lösungsmittel wurde zu dem gesamten in Schritt 1 erhaltenen Harz zugegeben, und die Mischung wurde gerührt und filtriert.
50% TFA/Methylenchlorid (je 1,8 1, 5 und 25 Minuten gerührt)
Danach wurde der Waschvorgang 1 durchgeführt.

Schritte 3-7; Verlängerung der Peptidkette

Mit dem gesamten in Schritt 2 erhaltenen Harz wurde das Ankoppeln von Aminosäuren, die Eliminierung von Schutzgruppen, Neutralisieren und Waschen durchgeführt, wobei denselben Verfahrensweisen wie in Schritten 1 und 2 gefolgt wurde, außer das unten in Tabelle 3 Gezeigte durch Schutzgruppen geschützte Aminosäuren (geschützte Aminosäuren) nacheinander an das Leu auf dem Harz gekoppelt wurden, wobei die in Tabelle 3 gezeigten Koppler und Kopplungsbedingungen verwendet wurden.
In Tabelle 3 bedeutet HOBt 1-Hydroxybenzotriazol. Tabelle 3
Nachdem die Ankopplung von Desamino-Arg und das Waschen in Schritt 7 abgeschlossen waren, wurde aus dem Reaktionsgefäß ein Peptidharz entnommen und getrocknet.
Die in Schritt 7 verwendete Deaminierung von Arg wurde wie folgt durchgeführt. Zunächst wurden 0,1 mol 5-Aminovaleriansäure-Hydrochlorid in 50 ml einer 2n-Natriumhydroxydlösung aufgelöst. Hierzu wurden 0,1 mol S-Methylthiocarbamid gegeben, und die erhaltene Lösung wurde bei Raumtemperatur zwei Tage gerührt und reagieren gelassen. Die Reaktionsmischung wurde säulenchromatografisch konzentriert und gereinigt. Das gereinigte Produkt wurde in ein Hydrochlorid überführt. Das wie oben beschrieben erhaltene Desamino-Arg-Hydrochlorid wurde in Schritt 7 verwendet.

Schritt 8; Eliminierung des Peptids von dem Harz und Eliminierung der Schutzgruppe

4 g des in Schritt 7 erhaltenen Peptidharzes wurden in einen HF-Reaktor eingebracht und 4 ml Anisol und 1 ml Methylsulfid wurden dem zugegeben und gerührt. Danach wurde der HF-Reaktor in einen HF-Reaktionsapparat (erhältlich von Peptide Lab.) gesetzt. Der HF-Reaktor wurde in einem Trockeneis-Aceton-Bad gekühlt und mit etwa 35 ml HF beladen. Der Inhalt des Reaktionsgefäßes wurde unter Kühlen in einem Eiswasserbad 45 Minuten lang gerührt und reagieren gelassen. Nach Abschluß der Reaktion wurde HF mit einer Vakuumpumpe 15 Minuten lang abdestilliert. Nachdem der HF-Reaktor von dem Eiswasserbad in ein Wasserbad umgesetzt worden war, wurde die Evakuierung von HF weitere 15 Minuten fortgesetzt.
Der Lösung wurde Äther zugegeben, und die sich ergebende Lösung wurde gut gerührt und mit einem Glasfilter filtriert. Das auf dem Filter zurückbleibende Produkt wurde mit Äther (insgesamt etwa 300 ml) gewaschen, und es wurde ein von dem Harz eliminiertes Peptid extrahiert, indem viermal 100 ml einer 0,1 n wässrigen Essigsäurelösung verwendet wurden.

Schritt 9; Reinigung

Der pH-Wert des in Schritt 8 erhaltenen Extraktes wurde mit Essigsäureanhydrid auf 5,0 eingestellt, und es wurde mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewicht von 1.000 abfiltriert. Die erhaltene Lösung wurde auf eine Kationen-Austauscherharzsäule (erhältlich von Whatman) aufgegeben. Mit einem Ammoniumacetatpuffer als mobiler Phase wurde die auf dem Harz absorbierte Komponente eluiert. Die eluierte Komponente wurde gefriergetrocknet.
Das getrocknete Produkt wurde mit einer fraktionierten Umkehrphasen HPLC gereinigt. Bei dieser Chromatografie wurde eine ODP-90 (erhältlich von ASAHI CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD.) als Säule und ein aus Phosphatpuffer/Acetonitril gernischtes Lösungsmittel als Gradienten-Eluierungsmittel verwendet.
Eine mit der oben genannten Chromatografie erhaltene Fraktion des Hauptpeaks wurde mit der Ultrafiltrationsmembran wie oben erwähnt konzentriert. Das erhaltene Konzentrat wurde auf eine Säule aus Kationen-Austauscherharz SP-Sephadex (erhältlich von Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) aufgegeben. Mit einer wässrigen Natriumchloridlösung als mobiler Phase wurde die auf dem Harz absorbierte Komponente eluiert. Die eluierte Komponente wurde wiederum auf eine Sephadex G-25-Säule (erhältlich von Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) aufgegeben. Danach wurde die auf dem Harz absorbierte Komponente mit einer wässrigen Essigsäurelösung als mobiler Phase eluiert und gefriergetrocknet. Das erhaltene Produkt ergab in einer Dünnschichtchromatografie mit drei entwickelnden Lösungsmitteln und Elektromigration (Whatman 3MM, pH 3,5; 1.500 V. ihr.) einen einzelnen Punkt.
Die Aminosäurenanalyse des gereinigten Produkts wird wie folgt zusammengefaßt. Die Werte in Klammern geben die theoretischen Werte an.

Beispiel 1 (Peptid Nr. 1)

Arg: 0,89 (1); Pro: 1,02 (1);
Tyr: 0,98 (1); Ile: 0,97 (1);
Leu: 1,01 (1); Desamino-Arg NH&sub3;: - (1)
Das Ergebnis der Aminosäurenanalyse zeigt, daß das gereinigte mit dem oben genannten Verfahren erhaltene Produkt das Peptid Nr. 1 mit der Aminosäurenzusammensetzung, die oben in Tabelle 1 angegeben ist, war.

Beispiele 2 bis 11 (Synthese von Peptiden Nrn. 2 bis 11)

Entsprechend den Peptiden Nrn. 2 bis 11 wurden jeweils fünf Aminosäuren außer Leucinol nacheinander mit denselben Verfahren wie in Beispiel 1 kondensiert. Die synthetisierten Peptidketten, die jeweils aus fünf Aminosäuren bestanden, wurden nach den gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 von den Harzen eliminiert.
Um an jeder Peptidkette eine α-Aminogruppe einer N-terminalen Aminosäure mit Boc zu schützen, wurde jede Peptidkette (0,02 mol) in einer Lösungsmittelmischung aus 30 ml Wasser und 30 ml Dioxan aufgelöst, und Natriumbicarbonat (0,048 mol) und Boc-N&sub3; (0,024 mol) wurden dem zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde bei 40 bis 45 ºC 24 Stunden gerührt und reagieren gelassen.
Nach der Reaktion wurde die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck konzentriert, 50 ml Wasser wurden zugegeben und die erhaltene Mischung wurde mit 50 ml Ethylacetat gewaschen. Die wässrige Schicht wurde gesammelt und 70 ml 0,5m Zitronensäure wurden dem unter Vereisen zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde mit Natriumchlorid gesättigt. Das Reaktionsprodukt wurde mit 100 ml Ethylacetat dreimal extrahiert und wurde dann mit Natriumsulfat getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde unter vermindertem Druck konzentriert.
Die Peptidketten (0,005 mol) wurden in 10 ml THF gelöst, und 0,45 ml N-Methylformiat und 0,35 ml Ethylchlorcarbonat wurden dem zugegeben, während die Lösung auf -20ºC gekühlt wurde. Nach einem Zeitraum von 5 Minuten wurden zu der oben genannten Lösung 5 ml einer Leucinol-Hydrochlorid (0,005 mol) enthaltenden DMF-Lösung und N-Methylformiat (0,45 ml) zugegeben, und die erhaltene Mischung wurde bei -70ºC zwei Stunden gerührt und reagieren gelassen. Als Ergebnis dessen wurde Leucinol an die Peptidkette kondensiert.
Nach der Reaktion wurde der Niederschlag abfiltriert, und das Filtrat wurde konzentriert, getrocknet und erstarren gelassen. Danach wurden 50 ml Ethylacetat zu dem Feststoff gegeben, um den Feststoff aufzulösen, und die Mischung wurde nacheinander zweimal mit 50 ml 5% Natriumbicarbonat und dreimal 50 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die gewaschene Ethylacetat-Esterschicht wurde konzentriert und fest werden gelassen, und die Schutzgruppe wurde mit demselben Verfahren wie in Beispiel 1 eliminiert. Das so erhaltene Rohprodukt wurde mit HPLC gereinigt, um jeweils das gewünschte Hexapeptid zu erhalten.
Unten sind Ergebnisse der Aminosäureanalyse der gereinigten Produkte gezeigt. Werte in Klammern geben die theoretischen Werte an.

Beispiel 2 (Peptid Nr. 2)

Arg: 2,02 (2); Pro: 0,97 (1);
Tyr: 1,02 (1); Ile: 0,98 (1);
Leucinol: - (1)

Beispiel 3 (Peptid Nr. 3)

Arg: 1,98 (2); Pro: 1,04 (1);
Tyr: 0,96 (1); Ile: 1,02 (1);
Leucinol: - (1)

Beispiel 4 (Peptid Nr. 4)

Arg: 0,95 (1); Lys: 0,97 (1);
Pro: 0,99 (1); Tyr: 0,96 (1);
Ile: 1,02 (1); Leucinol: - (1)

Beispiel 5 (Peptid Nr. 5)

Arg: 2,05 (2); Pro: 0,98 (1);
Trp: 1,02 (1); Ile: 0,97 (1);
Leucinol: - (1)

Beispiel 6 (Peptid Nr. 6)

Arg: 1,97 (2); Pro: 1,03 (1);
Trp: 0,98 (1); Ile: 1,02 (1);
Leucinol: - (1)

Beispiel 7 (Peptid Nr. 7)

Arg: 2,04 (2); Pro: 0,98 (1);
Tyr: 1,02 (1); Ile: 0,96 (1);
Leucinol: - (1); NCH&sub3;: anwesend

Beispiel 8 (Peptid Nr. 8)

Arg: 1,04 (1); Lys: 1,03 (1);
Pro: 0,97 (1); Trp: 0,98 (1);
Ile: 0,97 (1); Leucinol: - (1)

Beispiel 9 (Peptid Nr. 9)

Arg: 1,02 (1); Lys: 0,98 (1);
Pro: 1,02 (1); Tyr: 1,01 (1);
Ile: 1,05 (1); Leucinol: - (1);
NCH&sub3;: anwesend

Beispiel 10 (Peptid Nr. 10)

Arg: 2,03 (2); Pro: 1,02 (1);
Trp: 0,98 (1); Ile: 0,96 (1);
Leucinol: - (1)

Beispiel 11 (Peptid Nr. 11)

Arg: 1,02 (1); Lys: 0,97 (1);
Pro: 0,96 (1); Trp: 1,01 (1);
Ile: 0,97 (1); Leucinol: - (1);
NCH&sub3;: anwesend
Hierin stellt "NCH&sub3;" eine Peptidbindung dar, bei der ein Wasserstoffatom durch eine Methylgruppe substituiert ist.
Diese Ergebnisse der Aminosäureanalyse bestätigten, daß die gereinigten, nach der oben angegebenen Methode erhaltenen Produkte die Peptide Nrn. 2 bis 12 waren, die jeweils die in Tabelle 2 gezeigte Aminosäurezusammensetzung besaßen.

Beispiel 12 (Peptid Nr. 12)

Fünf Aminosäuren, außer Leucinol, entsprechend dem Peptid Nr. 12, wurden nacheinander mit dem Syntheseverfahren nach denselben Verfahrensweisen wie in Beispiel 2 auf das Harz kondensiert. Danach wurde mit einem bekannten Verfahren eine Acetylgruppe in eine N-α-Aminogruppe der so erhaltenen Peptidketten eingeführt.
Die synthetisierte Peptidkette wurde von dem Harz eliminiert, und die Schutzgruppe wurde von der Peptidkette wie in Beispiel 1 eliminiert. Das Harz wurde mit einem Waschlösungsmittel gewaschen. Die Waschlösung und das Filtrat wurden konzentriert und das erhaltene Konzentrat wurde gefriergetrocknet. Die α-Aminogruppe der in dem trockenen Produkt enthaltenen Peptidkette wurde mit Boc geschützt. Dann wurde Leucinol an die Peptidkette kondensiert, und die Schutzgruppe von dem so erhaltenen Hexapeptid elimimiert. Das Rohprodukt wurde mit HPLC gereinigt.
Das Ergebnis einer Aminosäurenanalyse dieses gereinigten Produktes ist unten angegeben. Werte in Klammern geben theoretische Werte an.
Arg: 1,99 (2); Pro: 1,02 (1);
Tyr: 0,91 (1); Ile: 0,99 (1);
Leucinol: - (1)
Die Massenanalyse dieses Hexapeptides wurde mit einer Fast- Atom-Bombardement-Massenspektroskopie (FAB-Massenspektroskopie) durchgeführt. Als Ergebnis wurde ein Molekülionenpeak von m/z=846 beobachtet, was bestätigte, daß die Synthese des Ziel- Hexapeptides vollständig war.

Beispiel 13 (Peptid Nr. 13)

Mit einer Benzohydrylamin (BHA)-Harzunterlage oder einer Paramethylbenzohydrylamin (MBHA)-Harzunterlage wurden nacheinanderfolgend dem Peptid Nr. 13 entsprechende Aminosäuren an das Harz kondensiert, wobei den Verfahrensweisen wie in Beispiel 1 gefolgt wurde. Nach Abschluß der Synthese wurde die N-terminale Aminosäure acetyliert, und die so erhaltene Peptidkette wurde von den Harzen eliminiert, und die Schutzgruppe wurde von der Peptidkette eliminiert.
Ein Aminosäuren-Analysenergebnis dieses gereinigten Produkts ist unten angegeben. Werte in Klammern geben theoretische Werte an.
Arg: 2,02 (2); Pro: 0,99 (1);
Tyr: 1,03 (1); Ile: 0,97 (1);
Leu: 1,06 (1); NH&sub3;: 1,12 (1)
Das Ergebnis bestätigte, daß das mit dem oben genannten Verfahren erhaltene Endprodukt Peptid Nr. 13 mit der in Tabelle 2 gezeigten Aminosäurezusammensetzung war.

Beispiel 14 (Peptid Nr. 14)

Fünf Aminosäuren außer Leucinol, entsprechend dem Peptid Nr. 14, wurden nacheinander mit der denselben Verfahrensweisen wie in Beispiel 12 folgenden Synthesemethode kondensiert, und eine Butylgruppe wurde mit einem bekannten Verfahren unter Verwendung von Butylchlorid in eine N-α-Aminogruppe der N-terminalen Aminosäure eingeführt. Leucinol wurde mit dem denselben Verfahrensweisen wie in Beispiel 12 folgenden Verfahren ankondensiert, die Schutzgruppe wurde von der so erhaltenen Peptidkette eliminiert und das das Hexapeptid enthaltende Rohprodukt wurde mit HPLC gereinigt.
Ein Aminosäurenanalysenergebnis dieses gereinigten Produkts ist unten angegeben. Werte in Klammern geben theoretische Werte an.
Arg: 1,97 (2); Pro: 0,96 (1);
Tyr: 1,04 (1); Ile: 0,98 (1);
Leucinol: - (1)
Das Ergebnis bestätigte, daß das mit dem oben genannten Verfahren erhaltene Endprodukt Peptid Nr. 14 mit der Aminosäurezusammensetzung in Tabelle 2 war.

Beispiel 15 (Peptid Nr. 15)

Aminosäuren entsprechend dem Peptid Nr. 15 wurden nacheinanderfolgend kondensiert, indem denselben Verfahrensschritten wie in Beispiel 13 gefolgt wurde. Nach Abschluß der Synthese wurde eine Butylgruppe mit einem bekannten Verfahren an einer N- terminalen Aminosäure eingeführt. Die erhaltene Peptidkette wurde von dem Harz eliminiert, und die Schutzgruppe wurde von der Peptidkette gemäß dem Verfahren, folgend denselben Verfahrensschritten wie in Beispiel 13, eliminiert. Das das Hexapeptid enthaltende Rohprodukt wurde mit HPLC gereinigt.
Ein Aminosäureanalysenergebnis dieses gereinigten Produkts ist unten gezeigt. Werte in Klammern geben theoretische Werte an.
Arg: 2,03 (2); Pro: 0,98 (1);
Tyr: 0,94 (1); Ile: 0,98 (1);
Leu: 1,01 (1); NH&sub3;: 1,09 (1)
Die Massenanalyse dieses Peptids wurde mit FAB durchgeführt und es wurde ein Molekülionenpeak m/z=871,5 beobachtet, was bestätigte, daß die Synthese des gewünschten Hexapeptides vollständig war.

Test der pharmakologischen Wirkung

Um eine steigende vasculäre Permeabilität unterdrückende Wirkung, eine Gefäßendothelienkrankheiten verbessernde Wirkung, eine anti-ödematische Wirkung, eine entzündungshemmende Wirkung, eine Anti-Schockwirkung, eine Anti-DIC-Wirkung, eine Protease inhibierende Wirkung, eine anti-allergische Wirkung, eine blutdrucksenkende Wirkung und eine wundheilende Wirkung der Hexapeptidverbindung nach der vorliegenden Erfindung zu bestätigen, wurden die folgenden experimentellen Beispiele 1 bis 8 durchgeführt.
Experimentelles Beispiel 1: Supressionswirkung auf Beschleunigung der vasculären Permeabilität
Nachdem sechs Wochen alte männliche Sprague-Dawley (SD)- Ratten (jede Gruppe bestand aus zehn Ratten) eine Woche gefüttert worden waren, wurden sie in diesem Experiment verwendet.
Die Probenkonzentrationen der Hexapeptide (Peptide Nrn. 1 bis 11) wurden in einer Essigsäure-Pufferlösung, versetzt mit einem 1%igen Rinder-Serumalbumin (BSA), gelöst.
Ein Aliquot von 1 ml/kg jedes der Peptide Nrn. 1 bis 11 wurde in die Oberschenkelvene (Femoralis) des rechten Beines jeder Ratte injiziert, die mit 50 mg/kg Nembutalnatrium anästhesiert war (erhältlich von Dainippon Pharmaceutical Co., Ldt.). Nach 10 Minuten wurde das nicht behandelte linke Bein der Ratte eine Minute lang in 58ºC heißes Wasser getaucht, um ein Ödem zu bilden. Jede Ratte wurde 29 Minuten bei Raumtemperatur belassen, und die Vulumina beider Beine jeder Ratte wurden gemessen.
Als Kontrollversuch wurde das Experiment nach derselben Verfahrensweise wie oben beschrieben durchgeführt, außer daß 1 ml/kg einer Natriumacetat gepufferten Lösung mit 1% BSA anstelle des Hexapeptides der vorliegenden Erfindung in die Ratten injiziert wurde.
Aus dem Ergebnis der oben genannten Messungen wurde mit Gleichung (1), unten, eine Zunahmerate (%) des Beinvolumens errechnet:
Zunahmerate des Beinvolumens (%)
= (Volumen des erwärmten Beines) - (Volumen des nicht erwärmten Beines)/(Volumen des erwärmten Beines) (1)
Die Raten wurden mit denen des Kontrollversuchs verglichen.
Die Ergebnisse sind als Suppressionsraten (%) zusammengefaßt, die aus Gleichung (2) erhalten wurden und in Tabelle 4 gezeigt sind. Tabelle 4
X: Rate für die Zunahme des Beinvolumens (%) nach der vorliegenden Erfindung.
X&sub0;: Rate für die Zunahme des Beinvolumens (%) im Kontrollversuch.
Wie in Tabelle 4 gezeigt, wurde für die Peptide Nrn. 1 bis 11 bestätigt, daß sie eine Suppressionswirkung für die Beschleunigung der vasculären Permeabilität besitzen und Ödeme unterdrücken konnten.
Eine Wirkung der Hexapeptidverbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung (Peptide Nrn. 2 bis 11) zur Unterdrückung der wachsenden vasculären Permeabilität besteht in einer Herabsetzung der Permeabilität von Gefäßendothelzellen, um einen Zwischenraum zwischen den Gefäßendothelzellen zu schließen. Wie in einem Hypercholesterinämie-Modell eines Affen, das von R.Ross (S. 103 - 108, 1990, Elsevier Science Publishers B.V., Niederlande), gezeigt werden konnte, sind bei arteriosklerotischen Krankheiten Monozyten, T-Lyphozyten und denaturierte Cholesterine an die Zwischenräume zwischen den Gefäßendothelzellen gebunden und dringen unter den vasculären Endothelzellen durch die Zwischenräume ein und bilden hierdurch schließlich Fettpunkte als eine anfängliche Veränderung zu einem Krankheitszustand bei einer Arteriosklerose hin. Die vasculären Endothelzellen werden unter Zunahme der Fettpunkte dünner, werden schließlich getrennt und offen. Danach fließen die meisten Xanthomzellen aus und Plättchen lagern sich an und verursachen einen Thrombus. Durch einen PDGF (Platelet-Derived Growth Factor, plättchengesteuerter Wachstumsfaktor), der von den Plättchen produziert wird, wachsen glatte Muskelzellen und die Wanddicke der Arterie nimmt zu und führt zu einer Arteriusklerose.
Wenn der Zwischenraum zwischen den Gefäßendothelzellen durch ein Hexapeptid gemäß der vorliegenden Erfindung verringert wird, kann das Eindringen eines LD-Lipoproteins (Lipoprotein niedriger Dichte, LDL) und von Monozyten unter die Gefäßendothelien verhindert werden. Aufgrund dessen kann Arteriosklerose verhindert werden.

Experimentelles Beispiel 2: Anti-Schockwirkung

Bei diesem Experiment wurden männliche ICR-Mäuse (jede Gruppe bestand aus 10 Mäusen), jeweils mit einem Gewicht von 25 bis 35 g verwendet. Jedes der Peptide Nrn. 1, 12 und 13 wurde in einer natriumacetat-gepufferten Lösung (pH 6,0) mit 1% BSA versetzt oder in einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst.
Ein Endotoxin zur Auslösung eines Schocks wurde durch Auflösen von Lipopolysaccharid (E.coli; 0127B8 (Difco)) in einer physiologischen Kochsalzlösung erhalten.
Jedes der Peptide Nrn. 1, 12 und 13 wurde intravenös in einer Dosis von 5 ml/kg pro Maus injiziert, und das Endotoxin wurde in einer Konzentration von 10 mg/kg in einer Dosis von 5 ml/kg nach 10 Minuten injiziert. Die Letalraten (%) dieser Mäuse innerhalb 24 Stunden wurden gemessen. Als Kontrollversuch wurden 5 ml/kg der natriumacetat-gepufferten Lösung versetzt mit 1% BSA anstelle des Hexapeptides der vorliegenden Erfindung injiziert.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefaßt. Tabelle 5
In diesem Experiment ist ein septischer Schock ein Hauptgrund für den Tod der Maus. Der septische Schock ist eine akute Kreislaufstörung, die einen Schockzustand zeigt, so daß ein pathologischer Zustand der Endothelgefäße durch eine bakterielle Infektion mittels eines Endoxins, das als bakterielle Zellwandkomponente dient, auftritt, wobei zunehmende vasculäre Permeabilität den Austritt von Blutkomponenten aus dem Blutgefäß hinaus bewirkt.
Es ist daher wie in Tabelle 5 gezeigt offensichtlich, daß die Peptide Nrn. 1, 12 und 13 die wachsende vasculäre Permeabilität unterdrücken können und es wurde bestätigt, daß sie als Anti-Schock-Arzneimittel verwendbar sind.

Experimentelles Beispiel 3: Anti-ödematische Wirkung

Bei diesem Experiment wurden acht Wochen alte männliche Wistar-Ratten verwendet und die Peptide Nrn. 1, 12 und 13, gelöst in einer mit 1% BSA versetzten Salzlösung, wurden eingesetzt.
Eine Eisensäule, deren Durchmesser 5 mm betrug, gekühlt mit Trockeneis-Aceton, wurde auf den linken Epiduralbereich jeder Ratte aufgelegt, um ein Hirngefäßödem zu verursachen. Es wurde ein Einfrieren durchgeführt, um nach einer Stunde einen verletzten Bereich zu erhalten, und das Gehirn jeder Ratte wurde herausgenommen. Das Hirn wurde aufgeteilt in rechten und linken Cortix cerebralis, und die Gewichte der linken Cortices wurde gemessen. Die linken Hirnschalen wurden bei 105ºC 24 Stunden getrocknet und die Gewichte der getrockneten linken Cortices wurden gemessen, um den Wassergehalt (%) zu bestimmen.
Bei diesem Vorgang wurden die Peptide Nrn. 1, 12 und 13 in den in Tabelle 6 gezeigten Konzentrationen jeder Ratte 10 Minuten vor und 20 Minuten nach dem Einfrieren injiziert. Als Kontrollversuch wurden 1 ml/kg der mit 1% BSA versetzten Salzlösung anstelle der Peptide gemäß denselben Verfahrensweisen wie oben beschrieben in die Ratte injiziert.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefaßt. Tabelle 6
Wie in Tabelle 6 gezeigt, wurde für die Peptide Nrn. 1, 12 und 13 bestätigt, daß sie Suppressionswirkung bei wachsender vasculärer Permeabilität haben und die Ödeme unterdrücken.

Experimentelles Beispiel 4: Blutdrucksenkende Wirkung

In diesem Experiment wurden Mischlingshunde (jede Gruppe bestand aus sechs Hunden) verwendet. Peptid Nr. 1 wurde in einer natriumacetat-gepufferten Lösung, versetzt mit einer 1%igen BSA, gelöst. Jedem Hund wurden 25 mg/kg Natriumpentobarbital intravenös injiziert. Der Blutdruck der Oberschenkelartene und die Blutströmungsgeschwindigkeit der aufsteigenden Aorta jedes Hundes wurden gemessen, während die künstliche Beatmung durchgeführt wurde. 2 nmol/kg des Peptids Nr. 1 wurden intravenös injiziert. Danach wurden der Blutdruck und der Blutfluß wiederum gemessen.
Obwohl der durchschnittliche Blutdruck vor der Hexapeptid- Injektion 84 mmHg betrug, war das Ergebnis für Peptid Nr. 1, daß der durchschnittliche Blutdruck nach der Peptid-Injektion auf 48 mmHg gesenkt wurde.
Die Blutströmungsgeschwindigkeit wurde durch die Injektion von 0,95 l/min auf 0,75 l/min gesenkt.
Die Hexapeptidverbindungen nach der vorliegenden Erfindung haben eine blutdrucksenkende Wirkung und können als nützliche blutdrucksenkende Mittel durch Verringerung des Widerstands in den peripheren Blutgefäßen dienen.

Experimentelles Beispiel 5: Anti-DIC-Wirkung

In diesem Experiment wurden Mischlingshunde verwendet (jede Gruppe bestand aus sechs Hunden). 30 mg/kg Pentobarbital wurden intravenös injiziert, um jeden Hund zu anästhesieren. Es erfolgte eine intravenöse Injektion von 32 nmol/kg von jedem der Peptide Nrn. 1, 12 und 13. Nach 30 Minuten wurden 3 mg/kg eines aus Escherichia Coli abgeleiteten Endotoxins intravenös injiziert, während die künstliche Beatmung mit Luft durchgeführt wurde.
Von jedem Hund wurden Blutproben genommen, unmittelbar vor der Injektion der Peptide und 120 Minuten nach der Injektion des Endotoxins.
Als Kontrollversuch wurde ein Experiment gemäß der gleichen Verfahrensweise wie oben beschrieben durchgeführt, außer daß das Hexapeptid nicht injiziert wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefaßt. Die Blutplättchenzahl ist die Anzahl pro 1 mm³ (1 µl) des Bluts in Tabelle 7. Tabelle 7
Wie aus den Ergebnissen oben ersichtlich, wurde für die Hexapeptide gemäß der vorliegenden Erfindung bestätigt, daß sie einen Zustand beschleunigter Blutkoagulation unterdrücken sowie eine Abnahme in der Blutplättchenzahl.

Experimentelles Bespiel 6: Protease Inhibierungswirkung

Jedes der Peptide Nrn. 1 und 12 bis 15 wurde in verschiedenen Volumina mit Thrombin (Endkonzentration 10 U/ml) gemischt, und die erhaltene Mischung wurde bei 37ºC fünf Minuten präincubiert. Eine synthetische Farbbase (Test Team S-2238, erhältlich von Daiichi Kagaku Yakuhin) wurde zu der oben genannten vorincubierten Mischung zugegeben und bei 37ºC 15 Minuten reagieren gelassen.
Zu obiger Mischung wurden 2% Zitronensäure gegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die Hydrolyse wurde mit Restthrombin durchgeführt, und der synthetischen Farbbase entzogenes freies p-Nitroanilin wurde einer colorimetrischen Bestimmung bei einer Wellenlänge von 405 nm unterzogen, woraus die Inhibierungsfähigkeit, bezogen auf 0,1 m Trispuffer, erhalten wurde. Auf Basis der so erhaltenen Inhibierungsfähigkeit wurde eine Peptidkonzentration, bei der jedes Peptid die Aktivität von Thrombin zu 50% inhibierte, d.h. IC&sub5;&sub0;, berechnet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengefaßt. Tabelle 8
Wie aus den oben angegebenen Ergebnissen ersichtlich, wurde für die Hexapeptidverbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung bestätigt, daß sie eine Anti-Thrombinwirkung als eine Inhibierungswirkung gegen eine Protease besitzen.

Experimentelles Beispiel 7: Anti-allergische Wirkung

Bei diesem Experiment wurden sechs Wochen alte männliche Wistar-Ratten (jede Gruppe bestand aus zehn Ratten) verwendet, und die Rücken dieser Ratten wurden rasiert.
Ein Anti-Eialbumin-Rattenserum wurde mit Salzlösung auf das 40-fache seines Volumens verdünnt, wodurch eine Anti-Eialbumin- Rattenserumlösung erhalten wurde. 1 ml der Anti-Eialbumin-Rattenserumlösung wurde intradermal in beide Seitenbereiche gegen die Medianlinie in der rasierten Zone injiziert, wodurch die Ratten passiv sensitiviert wurden. Nach 48 Stunden wurden jeder Ratte 1 ml einer 0,5 %igen "Evans"-Blau-Lösung intravenös injiziert, die 10 mg eines Hühnereialbumins enthielt, wodurch eine passive kutane Anaphylaxie (PCA)-Reaktion produziert wurde.
Nach 30 Minuten wurden die Ratten geköpft, wodurch sie ausbluteten und starben. Die Häute wurden von den Ratten abgezogen, und ein langer und ein kurzer Durchmesser der verursacht durch die PCA-Reaktion blau gefärbten Bereiche bei jeder Ratte wurde gemessen, und auf Basis der erhaltenen Daten wurde die Fläche der blaugefärbten Bereiche berechnet.
Bei diesen Vorgängen war jedes der Peptide Nrn. 1, 31 und 32 in einer natriumacetat-gepufferten Lösung, die 1% BSA enthielt, aufgelöst und jeder Ratte 10 Minuten vor der Provozierung der PCA-Reaktion intravenös injiziert worden. Als Kontrollversuch wurde die 1% BSA enthaltende Natriumacetatpufferlösung anstelle der Peptidlösung entsprechend derselben Prozedur wie oben beschrieben injiziert.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 zusammengefaßt. Tabelle 9
Wie in Tabelle 9 gezeigt, wurde von der Hexapeptidverbindung nach der vorliegenden Erfindung bestätigt, daß sie eine anti-allergische Wirkung besitzt und für ein anti-allergisches Mittel einsetzbar ist.
Ebenso sind Hexapeptidverbindungen nach der vorliegenden Erfindung verwendbar als entzündungshemmende Mittel, da die Entzündung ihren Ursprung in pathologischen Zuständen des vasculären Endothels und der Mucosamembranen hat, verursacht z.B. durch verschiedene Parameter, die durch Unterdrückung der zunehmenden vasculären Permeabilität elimimiert wurden.

Experimentelles Beispiel 8: Wundheilende Wirkung

Die männlichen SD-Ratten (jede Gruppe bestand aus zehn Ratten) wurden mit Äther anästhesiert und der Rücken jeder Ratte wurde rasiert und der anesthesierte Bereich wurde in einer Länge von 30 mm entlang der Medianlinie gebildet, indem ein entfettetes, sterilisiertes Rasiermesser verwendet wurde. Die Wunde wurde sofort an drei equidistanten Stellen genäht und die Nähte wurden nach drei Tagen gezogen. Die Ratten wurden am achten Tag ausgeblutet und getötet, und die Häute wurden von den Ratten abgezogen.
Ein Hautstreifen mit einer Größe von 1 cm x 4 cm wurde aus einem verwundeten Bereich jeder Ratte gebildet. Beide Enden dieses Streifens wurden in ein Zugmeßinstrument zur Messung der Wundheilung (TK-251, erhältlich von Unicom) eingesetzt und die Zugkraft (Zugspannung: g/cm), die erforderlich war, um den Wundbereich zu trennen, wurde gemessen.
Jede Hexapeptidverbindung wurde in einer 1% BSA enthaltenden Essigsäure-Pufferlösung gelöst und wurde acht Tage lang (einmal am Tag) vom Tag der Wunderzeugung an jeder Ratte intravenös injiziert. Als Kontrollversuch wurde anstelle der Hexapeptidlösung 1 ml/kg der 1% BSA enthaltenden Natriumacetat-Pufferlösung injiziert, gemäß derselben Prozedur wie oben beschrieben.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 zusammengefaßt. Tabelle 10
Wie aus den oben angegebenen Ergebnissen ersichtlich, wurde gefunden, daß die Hexapeptidverbindung der Erfindung die Wundheilung der Haut der Ratten beschleunigt.

Toxizitäts-Test

Ein Test der akuten Toxizität von Peptiden Nrn. 1, 12 und 13 wurde unter Verwendung von ddY-Mäusen durchgeführt. Nach intravenöser Injektion mit dem 2.000-fachen der wirksamen Menge (64 µmol/kg) starb keine Maus. Es wurde demnach keine toxische Expression beobachtet.
Verschiedene pharmazeutische Mittel, die Peptidverbindungen als aktiven Wirkstoff enthalten, werden unten beschrieben. Diese Mittel fallen nicht in den Umfang der vorliegenden Erfindung, weil der Wirkstoff nicht ist, wie gemäß der vorliegenden Erfindung definiert. Die nachfolgenden pharmazeutischen Mittel illustrieren jedoch, wie Peptidverbindungen der Erfindung als pharmazeutische Mittel formuliert werden können.
Die Peptide, die in Beispielen 17 bis 26 angegeben werden, können den gleichen Verfahrensweisen wie in Beispiel 1 beschrieben folgend sythetisiert und gereinigt werden, außer daß die Startaminosäuren geändert werden.

Beispiel 16

Peptid Nr. 1, erhalten in Beispiel 1, destilliertes Wasser für die Injektion, Natriumchlorid und Gelatine wurden verwendet, um eine Injektion gemäß einem herkömmlichen Injektions-Herstellungsverfahren zu erhalten.

Beispiel 17

Desamino-Arg-D-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH, destilliertes Wasser für die Injektion, Natriumchlorid, Natriumacetat, Benzylalkohol und Gelatine wurden verwendet, um eine Injektion gemäß einem herkömmlichen Injektions-Herstellungsverfahren zu erhalten.

Beispiel 18

Desamino-Arg-D-Lys-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH, destilliertes Wasser für die Injektion, Natriumchlorid, Natriumacetat, Gelatine und Phenol wurden verwendet, um eine Injektion gemäß einem herkömmlichen Injektions-Herstellungsverfahren zu erhalten.

Beispiel 19

Desamino-Arg-Arg-Pro-Trp-Ile-Leu-OH, destilliertes Wasser für die Injektion, Natriumchlorid, Natriumacetat, Methylparahydroxybenzoat, Ethylparahydroxybenzoat, Propylparahydroxybenzonat und Butylparahydroxybenzonat-wurden verwendet, um eine Injektion gemäß einem herkömmlichen Injektions-Herstellungsverfahren zu erhalten.

Beispiel 20

Desamino-Arg-Arg-Pro-D-Trp-Ile-Leu-OH, Natriumchlorid, Natriumacetat, Salzsäure, Methylparahydroxybenzoat, Ethylparahydroxybenzoat, Propylparahydroxybenzoat, und Butylparahydroxyben zoat wurden verwendet, um eine Injektion gemäß einem herkömmlichen Injektions-Herstellungsverfahren zu erhalten.

Beispiel 21

Eine wässrige Lösung, die Desamino-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile(NCH&sub3;)Leu-OH und Manitol enthielt, wurde gefriergetrocknet. Eine wässrige Lösung, enthaltend Gelatine und Phenol, wurde zu dem getrockneten Produkt zugegeben, um eine Injektion zu erhalten.

Beispiel 22

Eine wässrige Lösung, die Desamino-Arg-D-Lys-Pro-Trp-Ile- Leu-OH, Natriumacetat und Humanalbumin enthielt, wurde gefriergetrocknet. Destilliertes Wasser für die Injektion wurde zu dem getrockneten Produkt zugegeben, um eine Injektion zu erhalten.

Beispiel 23

Desamino-Arg-D-Lys-Pro-Tyr-Ile-(NCH&sub3;)Leu-OH und Kakaobutter oder Whitepsole wurden verwendet, um ein Zäpfchen gemäß einem herkömmlichen Zäpfchen-Herstellungsverfahrens zu erhalten.

Beispiel 24

Eine wässrige Lösung, die Desamino-Arg-Arg-Pro-Trp-Ile- (NCH&sub3;)Leu-OH, Eisessig, Natriumacetat und Benzalkoniumchlorid enthielt, wurde mit einem Nasenspray-Applikator in eine Nasenhöhle gesprüht, um ein auf Nasenschleimhäute angewendetes Arzneimittel zu erhalten.

Beispiel 25

Eine wässrige Lösung, die Desamino-Arg-D-Lys-Pro-Trp-Ile- (NCH&sub3;)Leu-OH, Eisessig, Natriumacetat und Salz der Gallensäure enthielt, wurde mit einem Nasenspray-Applikator in eine Nasenhöhle gesprüht, um eine auf Nasenschleimhäute angewendete Arznei zu erhalten.

Beispiel 26

Desamino-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OEt und Gavakisatmethansulfonat wurden verwendet, um eine Kapsel gemäß einem herkömmlichen Kapsel-Herstellungsverfahren herzustellen.

SEQUENZ-LISTE

INFORMATION ZU SEQ ID NR: 1
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäuren
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 5
Xaa Arg Pro Trp Ile Leu
1 5
Xaa in Position 1 ist w-Guanidinopentansäure.
Xaa in Position 6 ist Leucinol (d.h. -CH&sub2;OH-Gruppe ersetzt die Carboxylgruppe von Leucin).
Xaa ist ω-Guanidinopentansäure.

INFORMATION ZU SEQ ID NR: 2

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäuren
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 7
Xaa Arg Pro Tyr Ile Xaa
1 5
Xaa in Position 1 ist ω-Guanidinopentansäure.
Xaa in Position 6 ist Leucinol (d.h. -CH&sub2;OH-Gruppe ersetzt die Carboxylgruppe von Leucin).
INFORMATION ZU SEQ ID NR: 5
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäuren
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 10
Xaa Arg Pro Trp Ile Xaa
1 5
Xaa in Position 1 ist ω-Guanidinopentansäure.
Xaa in Position 6 ist Leucinol (d.h. -CH&sub2;OH-Gruppe ersetzt die Carboxylgruppe von Leucin).
INFORMATION ZU SEQ ID NR: 7
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäuren
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 7
Xaa Arg Pro Tyr Ile Xaa
1 5
Xaa in Position 1 ist ω-Guanidinopentansäure.
Xaa in Position 6 ist Leucinol (d.h. -CH&sub2;OH-Gruppe ersetzt die Carboxylgruppe von Leucin), wobei ein Wasserstoffatom der Aminogruppe durch eine Methylgruppe substituiert ist.
INFORMATION ZU SEQ ID NR: 10
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäuren
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 10
Xaa Arg Pro Trp Ile Xaa
1 5
Xaa in Position 1 ist ω-Guanidinopentansäure.
Xaa in Position 6 ist Leucinol (d.h. -CH&sub2;OH-Gruppe ersetzt die Carboxylgruppe von Leucin), wobei ein Wasserstoffatom der Aminogruppe durch eine Methylgruppe substituiert ist.
INFORMATION ZU SEQ ID NR: 12
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäuren
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 12
Xaa Arg Pro Tyr Ile Xaa
1 5
Xaa in Position 1 ist ein acetyliertes Derivat von Arginin.
Xaa in Position 6 ist Leucinol (d.h. -CH&sub2;OH-Gruppe ersetzt die Carboxylgruppe von Leucin).
INFORMATION ZU SEQ ID NR: 13
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäuren
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 13
Xaa Arg Pro Tyr Ile Xaa
1 5
Xaa in Position 1 ist ein acetyliertes Derivat von Arginin.
Xaa in Position 6 ist Leucin, dessen Carboxylgruppe in eine Carbamoylgruppe überführt wurde.
INFORMATION ZU SEQ ID NR: 14
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäuren
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 14
Xaa Arg Pro Tyr Ile Xaa
1 5
Xaa in Position 1 ist ein butyliertes Derivat von Arginin.
Xaa in Position 6 ist Leucinol (d.h. -CH&sub2;OH- Gruppe ersetzt die Carboxylgruppe von Leucin).
INFORMATION ZU SEQ ID NR: 15
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäuren
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 15
Xaa Arg Pro Tyr Ile Xaa
1 5
Xaa in Position 1 ist ein butyliertes Derivat von Arginin.
Xaa in Position 6 ist Leucin, dessen Carboxylgruppe in eine Carbamoylgruppe überführt wurde.

Claims

1. Ein Hexapeptid der Formel I:

A-B-Pro-C-D-E ... (I)

wobei A die L- oder D-Form von Arginin oder Lysin ist, dessen N- terminale Aminogruppe deaminiert ist, B die L- oder D-Form von Arginin, Lysin oder Histidin ist, Pro die L- oder D-Form von Prolin ist, C die L- oder D-Form von Tyrosin, Tryptophan oder Phenylalanin ist, D die L- oder D-Form von Valin, Isoleucin oder Leucin ist und E die L- oder D-Form von Valin, Isoleucin oder Leucin ist, wobei eines der Wasserstoffatome der Aminogruppe durch eine C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylgruppe ersetzt sein kann und dessen C- terminale Carboxylgruppe durch -CH&sub2;OR ersetzt ist, worin R ein Wasserstoffatom oder eine C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylgruppe ist; oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz des Hexapeptides.

2. Ein Hexapeptid der Formel (II)

A-B-Pro-C-D-E ...(II)

worin A die L- oder D-Form von Arginin oder Lysin ist, dessen N- terminale Aminogruppe alkyliert oder acyliert ist, B die L- oder D-Form von Arginin, Lysin oder Histidin ist, Pro die L- oder D- Form von Prolin ist, C die L- oder D-Form von Tyrosin, Tryptophan oder Phenylalanin ist, D die L- oder D-Form von Valin, Isoleucin oder Leucin ist und E die L- oder D-Form von Valin, Isoleucin oder Leucin ist, wobei eines der Wasserstoffatome der Aminogruppe durch eine C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylgruppe ersetzt ist und dessen C-terminale Carboxylgruppe durch -CH&sub2;OR ersetzt ist, worin R ein Wasserstoffatom oder eine C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylgruppe ist; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz des Hexapeptides.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als einen darin enthaltenen aktiven Wirkstoff ein Hexapeptid der Formel (I), wie in Anspruch 1 angegeben, oder Formel (II), wie in Anspruch 2 angegeben, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon enthält.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, weiter enthaltend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3 oder 4, die ein anti-ödematisches Mittel, ein Antischock-Mittel, ein antithrombotisches Mittel, ein anti-arteriosclerotisches Mittel, ein anti-allergisches Mittel, ein Hyposensibilisierungsmittel, ein Wundheilungsmittel oder ein entzündungshemmendes Mittel ist.

6. Verwendung eines Hexapeptides der Formel (I), wie in Anspruch 1 angegeben, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes dieses Hexapeptides oder einer pharmazeutischen Zubereitung hiervon zur Herstellung eines Medikaments zur Erzielung eines anti-ödematischen, Antischock-, anti-thrombotischen, anti-arte riosclerotischen, anti-allergischen, Wundheilungs- oder entzündungshemmenden Effekts in einem Patienten.

7. Verwendung eines Hexapeptides der Formel (II), wie in Anspruch 2 angegeben, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes dieses Hexapeptides oder einer pharmazeutischen Zubereitung hiervon zur Herstellung eines Medikaments zur Erzielung eines anti-ödematischen, Antischock-, anti-thrombotischen, anti-arteriosclerotischen, anti-allergischen, Wundheilungs- oder entzündungshemmenden Effekts in einem Patienten.