DE3875765T2

DE3875765T2 - Fluor enthaltende atriale natriuretische peptide.

Info

Publication number: DE3875765T2
Application number: DE8888104365T
Authority: DE
Inventors: Mahesh H Goghari; Sumanas Rakhit
Original assignee: Bio Mega Inc
Current assignee: Bio Mega Boehringer Ingelheim Research Inc
Priority date: 1987-03-25
Filing date: 1988-03-18
Publication date: 1993-03-25
Anticipated expiration: 2008-03-19
Also published as: NZ223885A; JPS646296A; IL85728A0; AU605259B2; EP0283956A2; DE3875765D1; US5095004A; EP0283956B1; AU1316788A; EP0283956A3; IL85728A

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft Derivate von atrialen natriuretischen Peptiden (ANP's) mit diuretischen, natriuretischen und den Blutdruck verringernden Wirkungen. Insbesondere betrifft diese Erfindung Fluor-haltige Derivate von atrialen natriuretischen Peptiden, Verfahren zur ihrer Herstellung, pharmazeutische Zusammensetzungen der Derivate und Methoden zur Verwendung der Derivate zur Behandlung von Bluthochdruck und zur Behandlung von pathologischen Zuständen, die durch ein Ungleichgewicht von Körperflüssigkeiten und/oder Elektrolyten gekennzeichnet sind, wie etwa kongestive Herzinsuffizenz, Ödem und Leberzirrhose.

Hintergrund der Erfindung

Seit A.J. de Bold et al., Life Sciences, 28, 89 (1981) berichteten, daß eine Injektion eines Rohextrakts eines atrialen Herzmuskels der Ratte eine sofortige und starke diuretische Reaktion in der Ratte hervorrief, ist der Aufklärung des für diesen Effekt verantwortlichen Wirkungsprinzips und dem Verständnis der Rolle des Wirkungsprinzips in der natürlichen Regulation des Körperflüssigkeitvolumens und des Blutdrucks eine große Aufmerksamkeit gegeben worden. Für eine Zusammenfassung dieser Entwicklungen, siehe M. Cantin und J. Genest, Endocrine Reviews, 6, 107 (1985). Als Ergebnis wurde gefunden, daß das Wirkungsprinzip im Rattenatrium von einem Prohormon stammte, das 152 Aminosäuren enthält. Im humanen Atrium wurde ein entsprechendes Prohormon identifiziert, das 151 Aminosäuren enthält. Anschließende Untersuchungen haben gezeigt, daß Fragmente der Prohormone, die von etwa 20 bis 33 Aminosäuren enthalten, wirksamer als die Prohormone selbst sind, unter der Voraussetzung, daß die Fragmente noch den C- terminalen Anteil und die zyklische Struktur des Prohormons enthalten. Die zyklische Struktur resultiert aus einer intramolekularen Disulfidbrücke, die zwischen 2 halben Cystinresten an den Positionen 105 und 121 der Peptidsequenz gebildet wird. Ein Beispiel eines solchen Fragments des Rattenprohormons ist rANP(101-126), das die folgende Struktur aufweist:
Das entsprechende Fragment des humanen Prohormons hANP-(101-126) hat dieselbe Struktur, außer daß der Isoleucylrest an 110 durch einen Methionylrest ersetzt ist.
Chemiker haben jetzt die kleineren, aktiveren atrialen Peptide (d. h. die Fragmente) synthetisiert, wodurch sie für gründliche biologische Untersuchungen und für die mögliche Entwicklung als diuretische und antihypertonische Mittel leicht verfügbar gemacht wurden. Die Entwicklung der natürlichen Peptide wird jedoch durch ihre rasche Zersetzung in vivo durch enzymatische Prozesse behindert. Demgemäß suchen jetzt mehrere Forscher nach Derivaten oder Analoga der natürlichen atrialen Peptide als Quelle für mögliche Arzneimittel mit verbesserter Stabilität, Wirksamkeit und Wirkungsdauer gegenüber den natürlichen Peptiden. Beispielsweise, siehe L. Johnson et al., PCT-Patentanmeldung WO85/04870, veröffentlicht am 07. November 1985; J. Rivier und F. Edouard, PCT- Patentanmeldung WO85/04872, veröffentlicht am 07. November 1985; S. Sakakibara, europäische Patentanmeldung 173557, veröffentlicht am 05. März 1986 und J.D. Mogannam et al., Abstracts of the First World Congress on Biologically Active Atrial Peptides, American Society of Hypertension, 31. Mai - 01. Juni 1986, New York, N.Y., S. 108A; japanische Patentanmeldung 61161299, veröffentlicht am 21. Juli 1986; japanische Patentanmeldung 61233698, veröffentlicht am 17. Oktober 1986 und japanische Patentanmeldung 61243100, veröffentlicht am 29. Oktober 1986.
Die vorliegende Anmeldung offenbart neue atriale Peptidderivate mit einem günstigen biologischen Profil, das sie als diuretische und antihypertonische Mittel geeignet macht.

Zusammenfassung der Erfindung

Die erfindungsgemäßen atrialen natriuretischen Peptidderivate werden durch Formel 1 dargestellt:
worin R¹ Phe, 2FPhe, 3FPhe, 4FPhe, 2CF&sub3;Phe, 3CF&sub3;Phe oder 4CF&sub3;Phe ist;
R² Gly, Ala oder D-Ala ist;
R³ Ile oder Met ist;
R&sup4; Phe, 2FPhe, 3FPhe, 4FPhe, 2CF&sub3;Phe, 3CF&sub3;Phe oder 4CF&sub3;Phe ist;
R&sup5; Tyr oder des-R&sup5; ist;
Y- S-(niederes Alkylen)-CO oder R&sup6;-Cys- ist, worin R&sup6; H-Ser-Ser, H-Arg-Ser-Ser, H-Arg-Arg-Ser-Ser, H- Leu-Arg-Arg-Ser-Ser oder H-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser ist und
Z Hydroxy, Amino oder niederes Alkylamino ist, unter der Voraussetzung, daß wenn R¹ Phe ist, R&sup4; nicht Phe ist; oder ein therapeutisch verträgliches Salz davon.
Eine bevorzugte Gruppe der erfindungsgemäßen Peptidderivate wird durch Formel 1 dargestellt, worin R¹ , R², R³ und R&sup4; und R&sup5; wie zuvor definiert sind, Y- S-CH&sub2;CO-, S-CH&sub2;CH&sub2;CO-, S- CH(CH&sub3;)CH&sub2;CO-, S-CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CO- oder R&sup6; Cys- ist, worin R&sup6; wie zuvor definiert ist und Z Hydroxy oder Amino ist; oder ein therapeutisch verträgliches Salz davon.
Eine besonders bevorzugte Gruppe der Peptidderivate wird durch Formel 1 dargestellt, worin R¹ Phe, 2FPhe, 3FPhe, 4FPhe oder 4CF&sub3;Phe ist, R² Gly oder D-Ala ist, R³ Ile oder Met ist, R&sup4; Phe, 2FPhe, 3FPhe, 4FPhe oder 4CF&sub3;Phe ist, R&sup5; Tyr oder des-R&sup5; ist, Y- S-CH&sub2;CO-, S-CH&sub2;CH&sub2;CO-, S-CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CO- oder R&sup6;-Cys- ist, worin R&sup6; wie hier oben definiert ist, und Z Hydroxy oder Amino ist, vorausgesetzt, daß wenn R¹ Phe ist, R&sup4; nicht Phe ist; oder ein therapeutisch verträgliches Salz davon.
Eine am meisten bevorzugte Gruppe der Peptidderivate wird durch Formel 1 dargestellt, worin R¹ Phe, 3FPhe, 4FPhe oder 4CF&sub3;Phe ist; R² Gly ist, R³ Ile oder Met ist, R&sup4; Phe, 3FPhe, 4FPhe oder 4CF&sub3;Phe ist, R&sup5; Tyr oder des-R&sup5; ist, Y- S-CH&sub2;CH&sub2;CO-, S-CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CO- oder R&sup6;-Cys- ist, worin R&sup6; wie hier oben definiert ist und Z Hydroxy oder Amino ist, vorausgesetzt, daß wenn R¹ Phe ist, R&sup4; nicht Phe ist, oder ein therapeutisch verträgliches Salz davon.
Die oben genannte Voraussetzung für die atrialen Peptide der Formel 1, d. h. wenn R¹ Phe ist, daß dann R&sup4; nicht Phe ist, gilt für die gesamte Anmeldung. Mit anderen Worten, wenn R¹ von Formel 1 Phe ist, dann ist R&sup4; 2FPhe, 3FPhe, 4FPhe, 2CF&sub3;Phe, 3CF&sub3;Phe oder 4CF&sub3;Phe.
Der Gegenstand dieser Erfindung umfaßt eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Peptidderivat von Formel 1 oder ein therapeutisch verträgliches Salz davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.
Die erfindungsgemäße Verabreichung der Peptidderivate oder pharmazeutisch verträglichen Additionssalzen davon an Säuger reguliert die Urinerzeugung, entspannt intestinale glatte Muskeln, senkt Bluthochdruck und wirkt gegen pathologische Zustände, die mit Leberzirrhose und kongestiver Herzinsuffizienz assoziiert sind. Der Gegenstand dieser Erfindung umfaßt somit die Peptidderivate von Formel 1, verwendet bei einem Verfahren zur Durchführung von Diurese und/oder Natriurese in einem Säuger, worin man dem Säuger eine therapeutisch wirksame Menge eines Peptidderivats von Formel 1 oder eines therapeutisch verträglichen Salzes davon verabreicht.
Ebenso umfaßt sind die Peptidderivate von Formel 1, verwendet in einem Verfahren zur Behandlung von Bluthochdruck in einem hypertonischen Säuger, wobei dem Säuger eine antihypertonisch wirksame Menge eines Peptidderivats von Formel 1 oder eines therapeutisch verträglichen Salzes davon verabreicht wird.
Verfahren zur Herstellung der Peptidderivate von Formel 1 werden im folgenden beschrieben.

Einzelheiten der Erfindung

Zur Vereinfachung werden die Peptidderivate dieser Anmeldung im folgenden einfach als Peptide bezeichnet.
Die Bezeichnung "Rest" bedeutet, bezogen auf eine Aminosäure, eine Gruppe, die von der entsprechenden α-Aminosäure durch Eliminierung des Hydroxyls der Carboxylgruppe und eines Wasserstoffs der α-Aminogruppe stammt.
Im allgemeinen beruhen die hier verwendeten Abkürzungen zur Bezeichnung der Aminosäuren und der Schutzgruppen auf Empfehlungen der IUPAC-IUB Kommission zur biochemischen Nomenklatur, siehe Biochemistry 11, 1726-1732 (1972). Met, Met(O), Gln, Ala, Gly, Ile, Arg, Asp, Phe, Ser, Leu, Cys, Asn und Tyr stellen beispielsweise die "Reste" von L-Methionin, L-Methioninsulfoxid, L-Glutamin, L-Alanin, Glycin, L-Isoleucin, L- Arginin, L-Asparaginsäure, L-Phenylalanin, L-Serin, L-Leucin, L-Cystein, L-Asparagin bzw. L-Tyrosin dar.
Das Symbol "2FPhe" bedeutet den "Rest" 2-Fluor-L-Phenylalanyl, d. h. (S)-α-Amino-β-(2-fluorphenyl)propanoyl. Dementsprechend stellen 3FPhe, 4FPhe, 2CF&sub3;Phe, 3CF&sub3;Phe und 4CF&sub3;Phe die Reste 3-Fluor-L-Phenylalanyl, 4-Fluor-L-Phenylalanyl, 2-(Trifluormethyl)-L-phenylalanyl, 3-(Trifluormethyl)-L-phenylalanyl bzw. 4-(Trifluormethyl)-L-phenylalanyl dar.
Ebenfalls zur Vereinfachung werden die atrialen natriuretischen Peptide und die Peptidderivate hier in in einer abgekürzten Form bezeichnet. Dies bedeutet zunächst hinsichtlich natürlich vorkommender atrialer natriuretischer Peptide, daß die Sequenz der Aminosäurereste in den Peptiden durch Angabe der Positionsnummern der ersten und letzten Aminosäurereste der Sequenz in Klammern nach der Bezeichnung "ANP" bezeichnet wird. Die jeweilige Spezies (z. B. Mensch oder Ratte), aus der die Sequenz stammt, wird durch ein Präfix ausgedrückt. Somit wird das von der Ratte stammende atriale natriuretische Peptid mit einem freien C-terminalen Carboxyl, das aus der 28 Aminosäuren langen Sequenz am C-Terminus stammt, als "rANP(99-126)" bezeichnet und das entsprechende Peptid mit einem C-terminalen primären Amid wird als "rANP(99-126)NH&sub2;" bezeichnet. Für die entsprechenden Peptide menschlichen Ursprungs wird das Präfix "h" verwendet, nämlich hANP(99-126) und hANP(99-126)NH&sub2;. Derivate, in denen ein bestimmter Aminosäurerest durch einen unterschiedlichen Rest ersetzt worden ist, werden durch Angabe des Symbols für das Ersetzen in Klammern als zusätzliches Präfix bezeichnet. Somit bedeutet (Ala¹&sup0;&sup7;)rANP(99-126) das entsprechende Derivat von rANP(99-126), in dem das Gly an Position 107 durch Ala ersetzt worden ist. Bezogen auf ein Peptid gemäß vorliegender Erfindung bedeutet (SCH&sub2;CH&sub2;CO¹&sup0;&sup5;, 4FPhe¹²&sup4;)hANP(105-126) das entsprechende hANP(105-126), in dem das Cys an Position 105 durch die Gruppe SCH&sub2;CH&sub2;CO ersetzt worden ist, wobei der Schwefel an den Schwefel des Cysteinylrests an Position 121 gebunden und das Carbonyl der Gruppe eine Amidbindung mit der Aminogruppe des Aminosäurerests an Position 106 bildet, und das Phe an Position 124 durch einen 4-Fluorphenylalanylrest ersetzt worden ist.
Die Bezeichnung "niederes Alkyl" bedeutet - wie hier verwendet - geradkettige Alkylreste, die 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten und verzweigtkettige Alkylreste, die 3 oder 4 Kohlenstoffatome enthalten, und umfaßt Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, 1-Methylethyl, 2-Methylpropyl und 1,1-Dimethylethyl.
Die Bezeichnung "niederes Alkylen" - wie hier verwendet - bedeutet sowohl gerad- als auch verzweigtkettige divalente Alkylenreste, die aus entsprechenden aliphatischen Kohlenwasserstoffen, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthalten, durch Entfernung von 2 Wasserstoffatomen erhalten werden, und umfaßt beispielsweise CH&sub2;, CH&sub2;CH&sub2;, CH(CH&sub3;)CH&sub2;, CH&sub2;CH(CH&sub3;), CH(C&sub2; H&sub5;)CH&sub2;, CH&sub2; CH&sub2; CH&sub2; und CH&sub2; CH(n-C&sub3; H&sub7;)CH&sub2;. Die Enantiomere dieser niederen Alkylene enthalten 1 oder 2 asymmetrische Kohlenstoffatome und werden durch die Bedeutung von niederem Alkylen umfaßt.
Die Bezeichnung "pharmazeutisch verträglicher Träger" - wie hier verwendet - bedeutet einen nicht toxischen, im allgemeinen inerten Träger für den aktiven Inhaltsstoff, der den Inhaltsstoff nicht beeinträchtigt.
Die Peptide von Formel 1 können durch Bildung eines linearen, geschützten Zwischenprodukts von Formel 2
hergestellt werden, worin R¹, R² und R&sup4; wie hier definiert sind, X¹ eine Schutzgruppe für ein Sulfhydryl, vorzugsweise Benzyl, 4-Methylbenzyl, Acetamidomethyl oder 2,6-Dichlorbenzyl ist, X² eine Schutzgruppe für die Guanidinogruppe von Arg, vorzugsweise Tosyl oder Nitro ist, X³ eine Schutzgruppe für das ω-Carboxyl von Asp, vorzugsweise Benzyl, Cyclohexyl oder 2,6-Dichlorbenzyl ist, X&sup4; eine Schutzgruppe für die Hydroxygruppe von Ser, vorzugsweise Benzyl ist, Y¹ S-(niederes Alkylen)-CO oder R&sup7;-Cys ist, worin R&sup7; H-Ser(X&sup4;)-Ser(X&sup4;), H-Arg(X²)-Ser(X&sup4;)-Ser(X&sup4;), H-Arg(X²)-Arg(X²)-Ser(X&sup4;)-Ser(X&sup4;), H-Leu-Arg(X²)-Arg(X²)-Ser(X&sup4;)-Ser(X&sup4;) oder H-Ser(X&sup4;)-Leu- Arg(X²)-Arg(X²)-Ser(X&sup4;)-Ser(X&sup4;) ist, worin X² und X&sup4; Schutzgruppen wie oben definiert sind, R3A Ile, Met oder Met(O) ist, R5A des-R5A oder Tyr(X&sup5;) ist, worin X&sup5; eine Schutzgruppe für das Hydroxyl von Tyr, vorzugsweise Benzyl oder 2-Brombenzyloxycarbonyl ist und Z¹ Hydroxy, Amino, niederes Alkylamino oder eine Linkergruppe ist, die in der Festphasensynthese verwendet wird und mit einem festen Trägerharz verknüpft ist, vorzugsweise:
OCH&sub2;-(Trägerharz) oder NH-(Trägerharz).
Das lineare geschützte Zwischenprodukt von Formel 2 kann durch eine geeignete Methode hergestellt werden, wie etwa ausschließlich durch Festphasentechniken, teilweise durch Festphasentechniken und/oder durch Fragmentkondensierung oder durch klassische Kopplungen in Lösung. Die Techniken der ausschließlichen Festphasensynthese sind z. B. von J.M. Steward und J.D. Young im Lehrbuch "Solid Phase Peptide Synthesisll, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1969, S. 40-49 beschrieben. Die Fragmentkondensationsmethode wird beispielhaft durch die Offenbarung des kanadischen Patents 1,178,950, erteilt am 04. Dezember 1984, dargestellt. Andere verfügbare Synthesen sind beispielhaft durch das US-Patent 3,842,067, erteilt am 15. Oktober 1974, und das US-Patent 3,862,925, erteilt am 28. Januar 1975, dargestellt.
Die Offenbarungen der zuvor genannten Veröffentlichung von Steward und Young, das kanadische Patent 1,178,950 und die US-Patente 3,842,067 und 3,862,925 sind hier durch Bezugnahme umfaßt.
Der ω-Mercaptoalkanoylrest S-(niederes Alkylen)-CO des Zwischenprodukts von Formel 2 wird, obwohl er kein Aminosäurerest ist, in das Zwischenprodukt auf dieselbe Weise wie einer der Aminosäurereste eingebaut. Durch Verwendung einer geschützten ω-Mercaptoalkansäure beim entsprechenden Schritt des Verfahrens entsteht somit das lineare Zwischenprodukt von Formel 2, worin Y¹ S-(niederes Alkylen)-CO ist.
Die geschützten oder ungeschützten ω-Mercaptoalkansäuren sind kommerziell erhältlich, wohlbekannt oder können durch bekannte Methoden hergestellt werden. 3-Methyl-3-(benzylthio)butansäure ist beispielsweise von H. Schulz und V. du Vigneaud, J.Med.Chem. 9, 647 (1966) beschrieben worden.
Die verschiedenen Fluor-haltigen Aminosäuren, beispielsweise 4-Fluor-L-phenylalanin sind kommerziell erhältlich (Asahi Glass Co. Ltd., Tokio, Japan).
Kommt man wieder zu den allgemeinen Verfahren für das Zwischenprodukt von Formel 2 zurück, ist ein gemeinsames Merkmal dieser Verfahren der Schutz der labilen Seitenkettengruppen der verschiedenen Aminosäurereste und, sofern vorhanden, der Sulfhydrylgruppe des ω-Mercaptoalkanoylrests mit geeigneten Schutzgruppen, die das Auftreten einer chemischen Reaktion an dieser Stelle verhindern, bis die Schutzgruppe endgültig entfernt wird. Üblicherweise ist auch der Schutz einer α- Aminogruppe einer Aminosäure oder eines Fragments gebräuchlich, während diese Einheit an der Carboxylgruppe reagiert, gefolgt von der selektiven Entfernung der α- Aminoschutzgruppe, um das Stattfinden einer nachfolgenden Reaktion an dieser Stelle zu ermöglichen.
Wenn man die Peptide von Formel 1 herstellt, worin R³ Met ist, kann gegebenenfalls ein Methioninsulfoxid-Reaktant zum Einbau des Methionylrests in das assemblierte Peptid verwendet werden. Nach Assemblierung der Aminosäurereste und, sofern erforderlich, des ω-Mercaptoalkanoylrests zur gewünschten Sequenz kann in diesem Fall der Methioninsulfoxidrest zu dem entsprechenden Methionylrest reduziert werden. Eine gebräuchliche Methode zur Durchführung dieser Reduktion ist es, das Zwischenprodukt von Formel 2, worin R3A Met(O) ist, mit dem Fluorwasserstoff-Dimethylsulfid-Reagenz von J.P. Tam et al., J.Amer.Chem.Soc. 105, 6442 (1983) zu behandeln um das entsprechende Zwischenprodukt von Formel 2 zu erhalten, worin R3A Met ist. In einem weiteren Sinn stellt daher der Sauerstoff des Sulfoxids eine fakultative Seitenketten-Schutzgruppe dar.
In einer Ausführungsform der ausschließlichen Festphasenmethode wird ein lineares geschütztes Zwischenprodukt von Formel 2 wie folgt hergestellt: α-Amino-geschütztes Tyrosin, das mit einem Schutz seiner Hydroxylgruppe versehen ist, vorzugsweise Nα-(t-Butyloxycarbonyl)-O-(2-brombenzyloxycarbonyl)tyrosin, wird an ein α-(Phenylacetamido)-benzylbenzhydrylaminharz in Gegenwart von Kaliumfluorid oder Cäsiumchlorid gekoppelt, um das entsprechende feste Trägerharz mit der ersten Aminosäuren (in geschützter Form) daran gekoppelt zu ergeben. Andererseits kann ein oxymethyliertes festes Trägerharz mit der angelagerten geschützten Aminosäure kommerziell bezogen werden und als Ausgangsmaterial verwendet werden. Bei beiden Fällen ist der nächste Schritt die Entfernung der α-Aminoschutzgruppe der angelagerten Aminosäure, um die freie α-Aminogruppe zu ergeben. Im Falle, wenn die α- Aminoschutzgruppe ein t-Butyloxycarbonyl ist, wird Trifluoressigsäure in Methylenchlorid oder Chloroform oder Salzsäure in Dioxan zur Abspaltung der Schutzgruppe verwendet. Die Entfernung der Schutzgruppe wird bei einer Temperatur zwischen etwa 0ºC und Raumtemperatur durchgeführt. Andere Standard-Spaltreagenzien und Bedingungen zur Entfernung von spezifischen a-Aminoschutzgruppen können gemäß der Beschreibung von E. Schröder und K. Lübke in "The Peptides", Vol.1, Academic Press, New York, 1965, S. 72-75 verwendet werden. Nach Entfernung der α-Aminoschutzgruppe von dem zuletzt genannten Zwischenprodukt werden die restlichen α-Amino-geschützten Aminosäuren und, sofern erforderlich, die geschützte ω-Mercaptoalkansäure schrittweise in der gewünschten Reihenfolge gekoppelt, um das lineare geschützte Zwischenprodukt von Formel 2 zu erhalten. Jede geschützte Aminosäure oder die geschützte ω-Mercaptoalkansäure wird dem Reaktionssystem in einem ein- bis vierfachen Überschuß zugesetzt und die Kopplung wird in einem Medium aus Methylenchlorid, Dimethylformamid oder Gemischen von Dimethylformamid und Methylenchlorid durchgeführt. In Fällen, wo unvollständige Kopplung aufgetreten ist, wird die Kopplungsprozedur vor Entfernung der α-Aminoschutzgruppe wiederholt, bevor die Kopplung der nächsten geschützten Aminosäure oder der geschützten ω-Mercaptoalkansäure erfolgt. Der Erfolg der Kopplungsreaktion in jeder Stufe der Synthese wird durch die Ninhydrinreaktion, wie von E. Kaiser et al., Anal.Biochem. 34, 595 (1970) beschrieben, überwacht.
Das wie oben beschrieben erhaltene Zwischenprodukt von Formel 2 wird anschließend durch Schutzgruppenabspaltungs- und Oxidationsschritte, die heute für die Peptidsynthese wohlbekannt sind, umgesetzt, um die gewünschten Peptide von Formel 1 zu ergeben. Insbesondere können die Schutzgruppen des Zwischenprodukts von Formel 2 unter Bedingungen entfernt werden, bei denen alle Seitenketten-Schutzgruppen und, sofern vorhanden, das feste Trägerharz mit seinem nicht mehr benötigten Teil der Linkergruppe abgespalten werden, um die entsprechende lineare Form des Endprodukts, d. h. die ungeschützte lineare Verbindung von Formel 3
zu erhalten, worin R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5;, Y und Z wie hier zuvor definiert sind.
Das in der voranstehenden Ausführungsform erhaltene Zwischenprodukt von Formel 2 wird beispielsweise vom Trägerharz durch Behandlung mit Fluorwasserstoff entfernt, um die entsprechende ungeschützte lineare Verbindung von Formel 3 zu ergeben, worin Z Hydroxy ist. Das Zwischenprodukt von Formel 2 kann auch vom Harz durch Umesterung mit einem niederen Alkanol, vorzugsweise Methanol oder Ethanol, in Gegenwart von Triethylamin abgetrennt werden. Danach wird der gewonnene Ester durch Chromatographie gereinigt. Die gesammelte Fraktion kann einer Behandlung mit Ammoniak oder einem (niederem Alkyl) Amin unterzogen werden, um den niederen Alkylester in das carboxyterminale Amid (Verbindung 3, Z = Amino) oder (niedere Alkyl) Amid (Verbindung 3, Z = niederes Alkylamino) zu überführen. Die zurückbleibenden Schutzgruppen werden dann durch oben beschriebene Prozeduren abgespalten, beispielsweise durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak oder durch Fluorwasserstoff. Die Entfernung des geschützten linearen Zwischenprodukts gemäß Formel 2 vom Trägerharz kann auch mit Ammoniak durchgeführt werden, um das entsprechende Amid zu ergeben, d. h. die lineare ungeschützte Verbindung von Formel 3, worin Z Amino ist.
Andererseits kann die lineare ungeschützte Verbindung von Formel 3 (Z = Amino) durch eine Festphasenmethode hergestellt werden, wobei 1% quervernetztes Benzhydrylamin (BHA) oder 4- Methylbenzhydrylamin (MBHA) Harz verwendet wird, gefolgt von der Spaltung des linearen geschützten Zwischenproduktharzes und jeder erforderlichen Schutzgruppenentfernung gemäß bekannten Prozeduren: siehe z. B. G.R. Matsueda und J.M. Stewart, Peptides 2, 45 (1981).
Danach wird die lineare ungeschützte Verbindung von Formel 3, worin Z Hydroxy, Amino oder niederes Alkylamino ist, oxidiert, um das entsprechende gewünschte Peptid von Formel 1 zu ergeben. Man kann jedes der bekannten Oxidationsmittel verwenden, die Sulfhydrylgruppen zu Disulfiden überführen können, beispielsweise Sauerstoff, Thiocyan, 1,2-D&ijlig;odethan oder vorzugsweise Kaliumferricyanid oder Jod. Auf diese Weise gehen die zwei Sulfhydrylgruppen der Verbindung von Formel 3 eine intramolekulare Kopplung ein, um die Disulfidbrücke zu bilden, welche für die Peptide von Formel 1 charakteristisch ist.
In noch einer weiteren alternativen Ausführungsform der Schutzgruppenentfernungs- und Oxidationsschritte wird Acetamidomethyl (Acm) als Schutzgruppe (X¹) für die Sulfhydrylgruppe verwendet. Diese Säure- und Basen-stabile Gruppe übersteht die üblichen Schutzgruppenentfernungsbedingungen, worauf man in der Lage ist, ein Derivat der linearen Verbindung von Formel 3 zu erhalten, worin alle Schutzgruppen außer den Acetamidomethyl-Schutzgruppen auf den Sulfhydrylen entfernt sind, um die entsprechende lineare Verbindung von Formel 3a zu ergeben,
worin R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5;, Y und Z wie hier zuvor definiert sind und X¹ Acm ist.
Eine anschließende Oxidation dieses letztgenannten Derivats mit Jod, gefolgt von einem Aufarbeiten mit Zink, siehe beispielsweise P.W. Schiller et al., Biochem.Biophys.Res.Commun. 138, 880 (1986) entfernt die Schutzgruppen an den Sulfhydrylen und bewirkt die gewünschte intramolekulare Disulfidbildung, um das gewünschte Peptid von Formel 1 zu ergeben.
Das erfindungsgemäße Peptid von Formel 1 kann in Form therapeutisch verträglicher Salze erhalten werden.
Im Falle, wenn ein bestimmtes Peptid einen Rest aufweist, der als Base wirkt, sind Beispiele derartiger Salze solche mit organischen Säuren, z. B. Essig-, Milch-, Bernstein-, Benzoe-, Salicyl-, Methansulfon- oder p-Toluolsulfonsäure, sowie mit polymeren Säuren, wie etwa Tannin oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie etwa Wasserstoffhalogensäuren, z. B. Salzsäure, oder Schwefelsäure oder Phosphorsäure. Sofern gewünscht, wird ein bestimmtes saures Additionssalz durch Behandlung mit dem geeigneten Ionenaustauscherharz auf die von R.A. Boissonnas et al., Helv.Chim.Acta, 43, 1849 (1960) beschriebenen Weise in ein anderes saures Additionssalz, wie etwa ein nichttoxisches, pharmazeutisch verträgliches Salz überführt.
Im Falle, wo ein bestimmtes Peptid eine oder mehrere freie Carboxylgruppen aufweist, sind Beispiele derartiger Salze solche mit den Natrium-, Kalium- oder Calciumkationen oder mit starken organischen Basen, beispielsweise Triethylamin oder N-Ethylmorpholin.
Im allgemeinen sind die therapeutischen verträglichen Salze der Peptide von Formel 1 den Peptiden selbst biologisch vollständig äquivalent.
Die diuretischen, natriuretischen und antihypertonischen Eigenschaften der vorliegenden atrialen Peptide oder ihrer therapeutisch verträglichen Salze können in pharmakologischen Standardtests, wie etwa solchen von Cantin und Genest, supra beschrieben, gezeigt werden.
Die diuretische und natriuretische Wirksamkeit der vorliegenden Peptide wurde beispielsweise in vivo in dem experimentellen Modell unter Verwendung der Ratte bei Bewußtsein und mit normalem Blutdruck in einem diuretischen Test gezeigt. Hierzu wurden männliche Ratten (300 bis 325 g) mit normalem Blutdruck mit Halothan anästhesiert. Die femorale Arterie wurde für Messungen des Blutdrucks und des Herzschlags und die femorale Vene wurde zur Verabreichung der Testverbindungen mit Kanülen versehen. Auch die Blase wurde zur Messung des Urinflusses mit einer Kanüle versehen. Nach Beendigung des Eingriffs wurden die Tiere in Rückhaltekäfige gesetzt und es wurde ihnen erlaubt, sich für eine Dauer von 1 Stunde von der Anästhesie zu erholen. Es wurde eine Infusion einer Ringer- Lösung mit einer Rate von 1,2 ml/Stunde gestartet. Es wurden 3 Kontroll-Urinproben bei 10minütigen-Intervallen gesammelt. Dann wurde die Testverbindung mit einer Rate eingeführt, die über 30 Minuten von 0,5 bis 3 kg/kg/min reichte. Während der Infusion der Verbindung wurden 3 Testproben von Urin bei 10- minütigen Intervallen gesammelt. Nachdem die Testverbindung für 30 Minuten eingeführt worden war, wurde erneut eine Ringer-Lösung über 30 Minuten eingeführt und 3 weitere Urinproben wurden gesammelt. Das Volumen jeder Urinprobe wurde bestimmt und die Elektrolytenkonzentration wurde unter Verwendung eines biomedizinischen Elektrolytenanalysators gemessen. Die Tiere dienten als ihre eigenen Kontrollen. Die systolischen und diastolischen Blutdrücke und der Herzschlag wurden während jeder Urinsammelperiode bestimmt.
Tabelle I zeigt die Ergebnisse, die in dem voranstehenden Test mit beispielhaften erfindungsgemäßen Peptiden, hauptsächlich mit 3 Peptiden von Formel 1 erhalten wurden, worin R¹ 3FPhe, 4FPhe bzw. 4CF&sub3;Phe ist, R² Gly ist, R³ Ile ist, R&sup4; Phe ist, R&sup5; des-R&sup5; ist,
ist, worin R&sup6; H-Ser-Ser und
Z Hydroxy ist, und dem Peptid von Formel 1, worin R¹ Phe ist, R² Gly ist, R³ Met ist, R&sup4; 4FPhe ist, R&sup5; Tyr ist,
ist, worin R&sup6; H-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser ist und Z Hydroxy ist. Zur Vereinfachung sind diese vier Peptide in Tabelle 1 und in der folgenden Tabelle 11 als (3FPhe¹&sup0;&sup6;)rANP(103-125), (4FPhe¹&sup0;&sup6;)rANP(103-125), (4CF&sub3;Phe¹&sup0;&sup6;)rANP(103-125) bzw. (4FPhe¹²&sup4;)hANP(99-126) bezeichnet. Für Vergleichszwecke ist das bekannte humane ANP, hANP(99-126), das von K. Kangawa und H. Matsuo, Biochem. Biophys. Res. Commun. 118, 131 (1984) als α-hANP bezeichnet wurde, in den Tabellen enthalten. Tabelle I Diuretischer Test Verbindunga Dosis Urinvolumenb Kontrolle behandelt Elektrolytenausscheidungc
a) Alle Dosierungen auf Basis des Peptidgehalts der Testverbindung
b) Angegeben in ml pro 10minütiger Sammelperiode - Mittelwert von 3 aufeinanderfolgenden Sammlungen
c) Angegeben in umol pro 10minütiger Sammelperiode - Mittelwert von 3 aufeinanderfolgenden Sammlungen
Die blutdrucksenkende Wirksamkeit der Peptide wurde durch Überwachung des Blutdrucks in hypertonischen Modellen, wie etwa in renal oder DOCA-Saline behandelten hypertonischen Ratten gezeigt. Bei Verwendung des DOCA-Saline behandelten Rattenmodells wurde Bluthochdruck in Ratten durch Verabreichung einer wöchentlichen subkutanen Injektion von 25 mg/kg Desoxycorticosteronacetat, DOCA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) für einen Monat und Ersetzen des Trinkwassers durch eine 1%ige Salzlösung induziert. Danach wurden die Tiere mit Halothan anästhesiert. Nach Infiltration der Haut mit 2%iger Lidocain-Lösung wurden die linke femorale Arterie und Vene geöffnet und mit einem zuvor gefüllten Ethylenschlauch punktiert. Beide Kanülen wurden an einem Punkt nahe dem Schwanz herausgeführt und die Hauptwunde wurde genäht. Die Tiere wurden für mindestens 30 Minuten erholen gelassen. Es wurde der arterielle Blutdruck überwacht. Die Testverbindung wurde für 20-minütige Intervalle bei ansteigenden Mengen (0,2, 0,5, 1, 2 etc. ug/kg/min) nach einer Kontrollperiode mit Salzlösung eingeführt. Eine 20-minütige Infusion von Hydralazin (100 uq/kg/min) wurde als Standard verwendet. Nach Erreichen einer wohldefinierten blutdrucksenkenden Wirkung wurde es den Tieren erlaubt, sich zu erholen. Die Peptide von Formel 1, die gemäß dieser Prozedur bei 0,2 bis 4 ug/kg/mingetestet wurden, erzeugten signifikante blutdrucksenkende Wirkungen. (4FPhe¹²&sup4;)hANP(99-126) zeigte beispielsweise eine relative Wirksamkeit von 2,7 auf molarer Basis im Vergleich zu hANP(99-126) in diesem Test.
Die vasorelaxierende Wirksamkeit der Peptide von Formel 1 kann in vitro mittels des Kaninchenaorta-Tests gezeigt werden. Die absteigende Körperschlagader von neuseeländischen Albinokaninchen wurde beispielsweise herausgeschnitten und in eine Krebs-Lösung bei Raumtemperatur gegeben. Die Zusammensetzung dieser Lösung war (g/l): NaCl 6,9; KCl 0,35; CaCl&sub2;·2H&sub2;O 0,07; MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,29) NaHCO&sub3; 2,1; KHPO&sub4; 0,16; D-Glucose 2,0. Die Lösung wurde mit 5% Kohlendioxid in Sauerstoff (v/v) gespült, um ihren pH bei 7,4 zu halten. Die entfernte Aorta wurde von äußerem Gewebe gereinigt und quer durchschnitten, um sechs 4 mm breite Ringe zu erhalten. Die Ringe wurden gemäß der von C.S. Hooker et al., Blood Vessels 14, 1 (1977) beschriebenen Methode vertikal angebracht. Ein Ring wurde im wesentlichen auf zwei L-förmige Träger aus rostfreiem Stahl (Draht mit 0,4 mm Durchmesser) aufgezogen. Der untere wurde an einem befestigten Gewebehalter angebracht. Der höhere Träger wurde durch einen Faden an einen Kraftaufnehmer (Modell FT.03 Grass Intstruments, Quincy, Mass, USA) gebunden, der mit einem Polygraph zur isometrischen Spannungsaufzeichnung verbunden war. Durch Anheben des Aufnehmers wurde der Ring unter Spannung gesetzt und wurde dann bei Entspannung des Gewebes erneut eingestellt, bis eine stabile Ruhespannung von 10 g erreicht war. Während dieser 30 bis 45 Minuten dauernden Äquilibrierungsperiode wurden die Ringe mit gewärmter Krebs-Lösung überspült, so daß die Temperatur der Überspüllösung 37 bis 38ºC bei Erreichen des Gewebes war. Die Überspülungsrate wurde unter Verwendung einer peristaltischen Mehrkanalpumpe auf 15 ml/Minute eingestellt. Für den restlichen Test wurde Phenylephrin HCl (Sigma Chemical) zur Überspüllösung bei einer Konzentration 1·10&supmin;&sup7;M gegeben. In Kontrollexperimenten verursachte diese Konzentration von Phenylephrin einen Spannungsanstieg in den Ringen, der 40 bis 60% ihrer maximalen Reaktion entsprach. Dieser induzierte Spannungsanstieg wurde während der Dauer des Tests beibehalten.
Der Test wurde durchgeführt, indem 50 ul Lösung der erwünschten Konzentration der Testverbindung 3 bis 4 cm überhalb eines Aortarings zu der tröpfelnden Überspüllösung gegeben wurden. Es wurden mehrere Dosen mit ansteigender Konzentrationshöhe verabreicht, wobei mindestens 3 der ausgewählten Dosen 15 bis 85% Entspannung des Gewebes verursachten. Die durch diese Dosen verursachten Prozent Entspannung in den sechs Ringen aus jedem Kaninchen wurden gemittelt und die Regressionsgerade wurde bestimmt. Für den Test wurden fünf Kaninchen verwendet. Die Dosis der Testverbindung, die eine Entspannung von 50% (ECSO) der durch Phenylephrin induzierten Spannung verursachte, wurde aus jeder der fünflinearen Dosis-Reaktion-Regressionen ermittelt. Die ECSO-Werte wurden gemittelt und dieser Wert wurde zusammen mit seiner Standardabweichung (S.E.M.) als Abschätzung der Wirksamkeit einer Testverbindung erachtet.
Die relativen Wirksamkeiten und die Dauer der Wirkung im Kaninchenaortatest für bestimmte erfindungsgemäße Peptide im Vergleich zu hANP(99-126) und rANP(103-126) sind in den Tabellen II bzw. III gezeigt. Tabelle II Kaninchenaortatest Peptid Relative Wirksamkeita Dauerb
a Erhalten durch Vergleich der mittleren wirksamen Konzentrationen (ECSO)
b Zeit vom Anfang bis 50% Entspannung bei ECSO Tabelle III Kaninchenaortatest Peptid Relative Wirksamkeita Dauerb
a Erhalten durch Vergleich der mittleren wirksamen Konzentrationen (ECSO)
b Zeit vom Anfang bis 50% Entspannung bei EC50
Wenn man die erfindungsgemäßen Peptide oder ihre therapeutisch verträglichen Salze als diuretische und/oder natriuretische Mittel oder als antihypertonische Mittel verwendet, werden sie üblicherweise warmblütigen Lebewesen, z. B. Menschen, Pferden oder Hunden in Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Trägern, deren Anteil durch die Löslichkeit und die chemische Natur des Peptids, den gewählten Verabreichungsweg und die biologische Standardpraxis bestimmt ist, systemisch verabreicht.
Zur systemischen Verabreichung werden die Peptide von Formel 1 entweder durch intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Injektion in Zusammensetzungen mit pharmazeutisch verträglichen Vehikeln oder Trägern verabreicht. Zur Verabareichung durch Injektion ist es bevorzugt, die Peptide in Lösung in einem sterilen wäßrigen Vehikel zu verwenden, das auch andere Solute, wie etwa Puffer oder Schutzmittel sowie ausreichende Mengen an pharmazeutisch verträglichen Salzen oder von Glucose enthalten kann, um die Lösung isotonisch zu machen.
Beispiele von geeigneten Füllmitteln oder Trägern findet man in pharmazeutischen Standardtexten, z. B. in "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16. Auflage, Mack Publishing Company, Easton, Penn., 1980.
Die Dosierung der Peptide variiert mit der Form der Verabreichung und der jeweils gewählten Verbindung. Weiterhin variiert sie mit dem jeweils behandelten Patienten. Im allgemeinen wird die Behandlung mit kleinen Dosierungen begonnen, die erheblich geringer als die optimale Dosis der Verbindung sind. Danach wird die Dosierung in kleinen Schritten erhöht, bis die optimale Wirkung unter den Umständen erreicht wird. Im allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Peptide am günstigsten in einem Konzentrationsspiegel verabreicht, der im allgemeinen diuretisch und/oder natriuretisch wirksame Ergebnisse oder antihypertonische Ergebnisse zeigt, ohne gefährliche oder schädliche Nebenwirkungen zu erzeugen.
Bei systemischer Anwendung, um Diurese und/oder Natriurese oder Verringerung von Bluthochdruck zu bewirken, wird das Peptid von Formel 1 in einer Dosis von 0,05 mcg bis 20 mcg pro kg Körpergewicht pro Tag verabreicht, obwohl die zuvor genannten Variationen auftreten. Eine Dosierungshöhe, die im Bereich von etwa 0,1 mcg bis 10 mcg pro kg Körpergewicht pro Tag ist, wird jedoch am günstigsten verwendet, um wirksame Ergebnisse zu erzielen.
Manchmal ist es wünschenswert, die erfindungsgemäßen Peptide kontinuierlich über längere Zeitperioden in lange wirksamen, langsam freigesetzten oder Depot-Dosierungsformen zu verabreichen. Solche Dosierungsformen können entweder ein pharmazeutisch verträgliches Salz des jeweiligen Peptids mit einem geringen Löslichkeitsgrad in Körperflüssigkeiten aufweisen, beispielsweise eines der oben beschriebenen Salze, oder sie können das Peptid in Form eines wasserlöslichen Salzes zusammen mit einem Schutzträger enthalten, der schnelle Freisetzung und Zersetzung des Peptids verhindert. Beispiele solcher Formulierungen findet man in pharmazeutischen Standardtexten, z. B. in "Remington's Pharmaceutical Sciences", oben zitiert. Lange wirksame, langsam freigesetzte Präparate der erfindungsgemäßen Peptide können auch durch Mikroverkapselung in einem pharmazeutisch verträglichen Beschichtungsmaterial, beispielsweise Gelatine, Polyvinylalkohol oder Ethylcellulose erhalten werden. Weitere Beispiele von Beschichtungsmaterialien und der zur Mikroverkapselung verwendeten Verfahren sind von J.A. Herbig in "Encyclopedia of Chemical Technology", Vol. 13, 2. Auflage, Wiley, New York, 1967, S. 436-456 beschrieben. Solche Formulierungen sowie Suspensionen von Salzen des Peptids, die in Körperflüssigkeiten nur schwer löslich sind, sind vorgesehen, um von etwa 0,1 mcg bis 20 mcg des Peptids pro kg Körpergewicht pro Tag freizusetzen und werden vorzugsweise durch intramuskuläre Injektion verabreicht.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen weiter diese Erfindung. Die in den Beispielen verwendeten Abkürzungen umfassen BOC: t-Butyloxycarbonyl, TFA: Trifluoressigsäure, DCC: N,N'- Dicyclohexylcarbodiimid, HOBT: 1-Hydroxybenzotriazol-monohydrat, HF: Fluorwasserstoffsäure und HPLC: Hochauflösende Flüssigkeitschromatorgraphie. Prozentangaben von Lösungen sind auf einer Volumen/Volumen-Basis berechnet, sofern nicht anders angegeben. Die folgenden Bezeichnungen sind Warenzeichen: Pharmacia, Vydac, Whatman, Waters und Michel-Miller.

Beispiel 1

Herstellung von (4FPhe¹²&sup4;)hANP(99-126) mit der Formel:
Die obige Verbindung wurde durch die Festphasentechnik von R.B. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149 (1963) synthetisiert. Die Synthese des voll geschützten linearen Peptids mit der richtigen Sequenz von Aminosäuren wurde auf einem α- (Phenylacetamido)benzyl-benzhydrylamin-Harz (PAB-Harz), Substitution: 0,406 mM/g, durchgeführt, an das Nα-(t-Butyloxycarbonyl)-O-(2-brombenzyloxycarbonyl)tyrosin in Gegenwart von Kaliumfluorid gemäß der Prozedur von E. Giralt et al., Tetrahedron 37, 2007 (1981), gekoppelt worden war, d. h. an einem BOC-Tyr(2-Br-Z)-PAB-benzhydrylaminharz. Es wurde das folgende Protokoll verwendet: (a) BOC-Schutzgruppenentfernung: 25% TFA in Chloroform (2 mal, zuerst für 2 Minuten, dann für 25 Minuten), (b) Waschen: Chloroform (3 mal für jeweils 2 Minuten), (c) Neutralisierung: 10% Triethylamin in Chloroform (2 mal, zuerst für 2 Minuten, dann für 10 Minuten), (d) Aminosäurekopplung: DCC-HOBT und Aktivester vermittelte Methoden und Verwendung eines 3-fach molaren Überschusses der zuvor gebildeten symmetrischen Anhydride und eine Reaktionszeit von 3 bis 5 Stunden und (e) Waschen: Methylendichlorid (3 mal für jeweils 2 Minuten). Bezüglich der Aminosäurekopplung wurde jeder Asp- und Ile-Rest durch die symmetrische Anhydridmethode doppelt gekoppelt. Der Arg-Rest wurde in Methylendichlorid/Dimethylformamid nach Aktivierung der entsprechenden Aminosäure mit DCC-HOBT doppelt gekoppelt. Die Gln- und Asp- Reste wurden in Dimethylformamid über ihre entsprechenden 4- Nitrophenylester doppelt gekoppelt. Zur Einführung des 4FPhe- Rests wurde mit DCC-HOBT aktiviertes N-(t-butyloxycarbonyl)- 4-fluor-L-phenylalanin verwendet.
Die BOC-Gruppe gab für alle Aminosäuren einen Nα-Schutz. Der Seitenkettenschutz war wie folgt: 2-Brombenzyloxycarbonyl für Tyrosin, Tosyl für Arginin, Acetamidomethyl (Acm) für Cystein, Cyclohexyl für Asparaginsäure, das entsprechende Sulfoxid für Methionin und Benzyl für Serin. Nach jeder Kopplung wurde während der Synthese ein Harzprobe für einen Ninhydrintest entfernt. Nach Beendigung der Synthese wurde das geschützte Peptidharz aus dem Reaktionsgefäß entfernt und im Vakuum über Phosphorpentoxid und dann Natriumhydroxid getrocknet.
Das geschützte Peptid wurde zuerst mit HF, Dimethylsulfoxid, p-Cresol und p-Thiocresol (5 : 20 : 1 : 1, v/v/v/v) für eine Stunde bei 0ºC behandelt, um den Sauerstoffaus dem Methioninsulfoxidrest zu entfernen. Das Gemisch wurde unter Vakuum bei 0ºC konzentriert. Der Rückstand wurde mit HF, p-Cresol und p- Thiocresol (39 : 3 : 1, v/v/v) für 1 Stunde bei 0ºC behandelt. Nach schneller Entfernung des HF-Reagenz unter Vakuum wurde der resultierende Rückstand mit TFA trituriert. Das suspendierte Harz wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Der Rückstand wurde mit Diethylether trituriert und die Festsubstanz durch Filtration gesammelt. Die Festsubstanz wurde in 5%iger wäßriger Essigsäure gelöst. Die Lösung wurde durch Zentrifugation geklärt und dann lyophilisiert, um das lineare Zwischenprodukt von Formel 3a zu ergeben, worin alle Schutzgruppen, außer den beiden Acm entfernt worden waren.
Die Reinigung der letztgenannten Verbindung wurde durch Reversed-Phase-Chromatographie auf einer Pharmacia-Octadecasilyl-Silica (ODS) Säule (2,5·40 cm, C-18, Vydac, 30 u Teilchengröße) unter Verwendung eines Gradienten aus 0,06% TFA in H&sub2;O und 0,06% TFA in MeOH bewirkt. Die den Hauptpeptidpeak (UV-Nachweis bei 254 nm) enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet. Anschließend wurde das Produkt auf einer Ionenaustauschersäule (CM-23, Whatman) unter Verwendung eines linearen Gradienten aus 500 ml 0,01 M Ammoniumacetat zu 500 ml 0,5 M Ammoniumacetat chromatographiert. Die Reinheit von Materialien in den Fraktionen wurde durch Verwendung analytischer Reversed-Phase-HPLC (Waters) geprüft. Brauchbare Fraktionen wurden vereinigt und auf einer ODS-Säule (Michel-Miller, 20 mm·300 mm, C-18, Vydac, 20 u) entsalzt, um die gereinigte lineare Verbindung zu ergeben, worin nur die Cys-Reste geschützt (mit Acm) blieben.
Die lineare Verbindung von Formel 3a wurde unter den folgenden Bedingungen zum Endprodukt cyclisiert. Eine 5 mM Lösung der Verbindung in 90%iger wäßriger Essigsäure wurde tropfenweise innerhalb 30 Minuten zu einer 50 mM Lösung Jod (50 Äquivalente bezüglich der linearen Verbindung) in 90%iger wäßriger Essigsäure gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 5 Stunden heftig gerührt. Überschüssiges Jod wurde mit 1 N wäßrigem Natriumthiosulfat entfernt. Das Gemisch wurde mit 3 Volumina Wasser verdünnt und dann gefriergetrocknet.
Das rohe oxidierte (cyclisierte) Peptid wurde entsalzt und durch Reversed-Phase-Niederdruck-HPLC auf einer ODS-Säule (Michel-Miller, 20 mm·300 mm, C-18, Vydac, 20 u) unter Verwendung eines linearen Gradienten gereinigt, der durch Mischung gleicher Volumina (500 ml) von 0,06% TFA in H&sub2;O und 0,06% TFA in MeOH gebildet wurde. Die Reinheit der gesammelten Fraktionen wurde unter Verwendung analytischer Reversed- Phase-HPLC (Waters) überprüft. Reine Fraktionen wurden vereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben. Reversed-Phase- HPLC in zwei unterschiedlichen Puffersystemen und Aminosäureanalyse bestätigte, daß das gewünschte Peptid in einer reinen Form erhalten wurde.

Beispiel 2

Gemäß der Prozedur von Beispiel 1, aber unter Verwendung von N-(t-Butyloxycarbonyl)-3-fluor-L-phenylalanin anstelle von N- (t-Butyloxycarbonyl)-4-fluor-L-phenylalanin wurde (3FPhe¹²&sup4;)hANP(99-126) mit der Formel
erhalten.

Beispiel 3

Gemäß der Prozedur von Beispiel 1, aber unter Verwendung von N-(t-Butyloxycarbonyl)-4-(trifluormethyl)-L-phenylalanin anstelle von N-(t-Butyloxycarbonyl)-4-fluor-L-phenylalanin wurde (4CF&sub3;Phe¹²&sup4;)hANP(99-126) mit der Formel
erhalten.

Beispiel 4

Gemäß der Prozedur von Beispiel 1 und unter Verwendung der geeigneten Aminosäuren und zuletzt 3-(Acetamidomethylthio)propansäure wurde (SCH&sub2;CH&sub2;CO¹&sup0;&sup5;,4FPhe¹²&sup4;)hANP(105-126) mit der Formel
erhalten.

Beispiel 5

Gemäß der Prozedur von Beispiel 1, aber unter Verwendung von BOC-Arg-(Tos)-PAB-benzhydrylaminharz als festes Trägerharz und den geeigneten Aminosäuren wurde (4FPhe¹&sup0;&sup6;)rANP(103-125) mit der Formel
erhalten. Es ist anzumerken, daß in diesem Beispiel eines Peptids von Formel 1, worin R³ Ile ist, die Behandlung des entsprechenden Zwischenprodukts von Formel 2 mit Fluorwasserstoff-Dimethylsulfid-Reagenz (siehe Beispiel 1) weggelassen wird, weil Methionin keine der eingebauten Aminosäuren ist.

Beispiel 6

Gemäß der Prozedur von Beispiel 1, unter Weglassen des Fluorwasserstoff-Dimethylsulfid-Reagenz und unter Verwendung der geeigneten Aminosäuren und schließlich von 3-(4-Methylbenzylthio)propionsäure wurde (SCH&sub2; CH&sub2; CO¹&sup0;&sup5;, 4FPhe¹&sup0;&sup6;)rANP(105-126) mit der Formel
erhalten.
Andere Beispiele von Peptiden innerhalb des Umfangs der Erfindung umfassen (3FPhe¹&sup0;&sup6;)rANP(103 5), (4CF&sub3;- Phe¹&sup0;&sup6;)rANP(103-125, (SCH&sub2;CH&sub2;CO¹&sup0;&sup5;,2FPhe¹&sup0;&sup6;)rANP(105-126), (SCH&sub2;CH&sub2;CO¹&sup0;&sup5;),4FPhe¹&sup0;&sup6;)rANP(105- 126), (SCH&sub2;CH&sub2;CO¹&sup0;&sup5;,4FPhe¹&sup0;&sup6;,D-Ala¹&sup0;&sup7;)rANP(105- 126). (SCH&sub2;CH&sub2;CO¹&sup0;&sup5;,4FPhe106,124)rANP(105-126), und (SCH&sub2;CH&sub2;CO¹&sup0;&sup5;, 4FPhe106,124,D-Ala¹&sup0;&sup7;)rANP(105- 126).
Noch weitere Beispiele von Peptiden innerhalb des Umfangs dieser Erfindung umfassen (4FPhe¹&sup0;&sup6;,D-Ala¹&sup0;&sup7;)rANP(103-125), (4CF&sub3;Phe¹&sup0;&sup6;)hANP(99-126),(SCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CO¹&sup0;&sup5;,- 4FPhe¹&sup0;&sup6;,Ala¹&sup0;&sup7;)hANP(105-126),(SCH&sub2;CH&sub2;CO¹&sup0;&sup5;,- 2FPhe¹&sup0;&sup6;)rANP(105-126),(SCH&sub2;CH&sub2;CO¹&sup0;&sup5;,3FPhe¹&sup0;&sup6;)rANP(105-126), (SCH&sub2;CH&sub2;CO¹&sup0;&sup5;,4CF&sub3;Phe¹&sup0;&sup6;)rANP- (105-126), (SCH&sub2;CH&sub2;CO¹&sup0;&sup5;,4FPhe¹&sup0;&sup6;,D-Ala¹&sup0;&sup7;)rANP(105-125), (4FPhe¹&sup0;&sup6;,D-Ala¹&sup0;&sup7;)rANP(103-126), (2F- Phe¹&sup0;&sup6;)rANP(103-125), (4FPhe106,124)hANP(103-126)NH&sub2;, (4FPhe¹²&sup4;,D-Ala¹&sup0;&sup7;)rANP(103-126), (3CF&sub3;Phe¹²&sup4;)hANP(99-126), (SCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CO¹&sup0;&sup5;,Ala¹&sup0;&sup7;)4F- Phe¹²&sup4;)hANP(105-126), (SCH&sub2;CH&sub2;CO¹&sup0;&sup5;,2FPhe¹&sup0;&sup6;)rANP(105-126), (SCH&sub2;CH&sub2;CO¹&sup0;&sup5;,3FPhe¹²&sup4;)rANP(105-126)- NH(C&sub2;H&sub5;), (SCH&sub2;CH&sub2;CO¹&sup0;&sup5;,4FPhe106,124)hANP(105- 126), (SCH&sub2;CH&sub2;CO¹&sup0;&sup5;,4FPhe¹&sup0;&sup6;,D-Ala¹&sup0;&sup7;,3CF&sub3;- Phe¹²&sup4;)rANP(105-126), (D-Ala¹&sup0;&sup7;,4FPhe¹²&sup4;)hANP(103- 126), und (2FPhe¹²&sup4;)rANP(103-126)NH(CH&sub3;).

Claims

1. Peptid der Formel 1

worin R¹ Phe, 2FPhe, 3FPhe, 4FPhe, 2CF&sub3;Phe, 3CF&sub3;Phe oder 4CF&sub3;Phe ist;

R&sup5; Tyr oder des-R&sup5; ist;

R² Gly, Ala oder D-Ala ist;

R³ Ile oder Met ist;

R&sup4; Phe, 2FPhe, 3FPhe, 4FPhe, 2CF&sub3;Phe, 3CF&sub3;Phe oder 4CF&sub3;Phe ist,

Y- S-(niederes Alkylen)-CO- oder R&sup6;-Cys-, worin R&sup6; H- Ser-Ser, H-Arg-Ser-Ser, H-Arg-Arg-Ser-Ser, H-Leu-Arg- Arg-Ser-Ser oder H-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser bedeutet, ist, und Z Hydroxy, Amino oder niederes Alkylamino ist, mit der Maßgabe, daß, wenn R¹ Phe ist, R&sup4; nicht Phe ist, oder ein therapeutisch annehmbares Salz hiervon.

2. Peptid der Formel 1 nach Anspruch 1, worin R¹, R², R³, R&sup4; und R&sup5; die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, Y- S-CH&sub2;CO-, S-CH&sub2;CH&sub2;CO-, S-CH(CH&sub3;)CH&sub2;CO-, S- CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CO- oder R&sup6;-Cys ist, worin R&sup6; die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat, und Z Hydroxy oder Amino ist; oder ein therapeutisch annehmbares Salz hiervon.

3. Peptid der Formel 1 nach Anspruch 1, worin R¹ Phe, 2FPhe, 3FPhe, 4FPhe oder 4CF&sub3;Phe ist, R² Gly oder D- Ala ist, R³ Ile oder Met ist, R&sup4; Phe, 2FPhe, 3FPhe, 4FPhe oder 4CF&sub3;Phe ist, R&sup5; Tyr oder des-R&sup5; ist, Y- S- CH&sub2;CO-, S-CH&sub2;CH&sub2;CO-, S-CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CO- oder R&sup6;-Cys- ist, worin R&sup6; die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat, und Z Hydroxy oder Amino ist; mit der Maßgabe, daß, wenn R¹ Phe ist, R&sup4; nicht Phe ist; oder ein therapeutisch annehmbares Salz hiervon.

4. Peptid der Formel 1 nach Anspruch 1, worin R¹ Phe, 3FPhe, 4FPhe oder 4CF&sub3;Phe ist, R² Gly ist, R³ Ile oder Met ist, R&sup4; Phe, 3FPhe, 4FPhe oder 4CF&sub3;Phe ist, R&sup5; Tyr oder des-R&sup5; ist, Y- S-CH&sub2;CH&sub2;CO-, S-CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CO- oder R&sup6;-Cys- ist, worin R&sup6; die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat, und Z Hydroxy oder Amino ist, mit der Maßgabe, daß, wenn R¹ Phe ist, R&sup4; nicht Phe ist; oder ein therapeutisch annehmbares Salz hiervon.

5. Peptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(4FPhe¹²&sup4;)hANP(99-126), (3FPhe¹²&sup4;)hANP(99-126), (4CF&sub3;Phe¹²&sup4;)hANP(99-126), (SCH&sub2;CH&sub2;CO¹&sup0;&sup5;, 4FPhe¹²&sup4;)hANP(105-126), (4FFhe¹&sup0;&sup6;)rANP(103-125), (SCH&sub2;CH&sub2;CO¹&sup0;&sup5;, 4FPhe¹&sup0;&sup6;)rANP(105-126), (3Fphe¹&sup0;&sup6;)rANP(103-125), (4CF&sub3;Phe¹&sup0;&sup6;)rANP(103-125), (SCH&sub2;CH&sub2;CO¹&sup0;&sup5;,2FPhe¹&sup0;&sup6;)rANP(105-126), (SCH&sub2;CH&sub2;- CO¹&sup0;&sup5;,4FPhe¹&sup0;&sup6;)rANP(105-126), (SCH&sub2;CH&sub2;CO¹&sup0;&sup5;,- 4FPhe¹&sup0;&sup6;,D-Ala¹&sup0;&sup7;)rANP(105-126), (SCH&sub2;CH&sub2;- CO¹&sup0;&sup5;,4FPhe106,124)rANP(105-126), and (SCH&sub2;CH&sub2;- CO,4FPhe106,124,D-Alah)rANP(105, 126).

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder ein therapeutisch annehmbares Salz hiervon und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.

7. Verwendung eines Peptids oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Anwendung als diuretisches oder natriuretisches Mittel.

8. Verwendung eines Peptids oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Anwendung gegen Bluthochdruck.

9. Verfahren zur Herstellung eines Peptids der Formel 1 nach Anspruch 1, welches umfaßt: die Bildung eines geschützten Peptids der Formel 2:

worin X¹, X², X³ und X&sup4; Schutzgruppen sind, R¹ , R² und R&sup4; die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, R3A Ile, Met oder Met(O) ist, R5A des-R5A oder Tyr(R&sup5;) ist, worin R&sup5; eine Schutzgruppe ist, Y¹ S-(niederes Alkylen)-CO oder R&sup7;-Cys ist, worin R&sup7; H-Ser(X&sup4;)- Ser(X&sup4;), H-Arg(X²)-Ser(X&sup4;)-Ser(X&sup4;), H-Arg(X²)-Arg(X²)- Ser(X&sup4;)-Ser(X&sup4;), H-Leu-Arg(X²)-Arg(X²)-Ser(X&sup4;)-Ser(X&sup4;) oder H-Ser(X&sup4;)-Leu-Arg(X²)-Arg(X²)-Ser(X&sup4;)-Ser(X&sup4;) ist, wobei x² und X&sup4; Schutzgruppen sind, und Z¹ Hydroxy, Amino, niederes Alkylamino oder eine Linkergruppe ist, die an einen festen Harzträger gekoppelt ist;

gefolgt von der Entfernung der Schutzgruppen und Oxidation des Zwischenproduktes der Formel 2 nach bekannten Arbeitsweisen zur Bildung des entsprechenden Peptids der Formel 1; und gegebenenfalls Umwandlung des Peptids der Formel 1 in ein therapeutisch annehmbares Salz.

10. Verfahren zur Herstellung des linearen geschützten Zwischenproduktes der Formel 2 nach Anspruch 9, worin Z Hydroxy oder Amino ist, welches umfaßt:

stufenweise Kupplung der geschützten Aminosäurereste oder Peptidfragmente und, falls erforderlich, des geeigneten geschützten ω-Mercaptoalkanoylrestes in der Reihenfolge der Sequenz des Zwischenproduktes, worin:

(i) labile Seitenkettengruppen der Reste oder Fragmente mit geeigneten Schutzgruppen zur Vermeidung des Auftretens von chemischen Reaktionen an dieser Stelle, bis die Schutzgruppe letztlich nach dem Abschluß der stufenweisen Kupplung entfernt wird, geschützt werden, und

(ii) eine α-Aminogruppe eines Kupplungsreaktanden durch eine α-Aminoschutzgruppe geschützt wird, während die freie Carbonylgruppe dieses Reaktanden mit der freien α-Aminogruppe des zweiten Reaktanden kuppelt, wobei die α-Aminoschutzgruppe eine Gruppe ist, welche selektiv entfernt werden kann, um das Stattfinden der nachfolgenden Kupplungsstufe an dieser α-Aminogruppe zu ermöglichen,

um das lineare geschützte Zwischenprodukt der Formel 2 zu erhalten.