DE3782010T2

DE3782010T2 - Vom calcitonin-gen abgeleitete peptidderivate.

Info

Publication number: DE3782010T2
Application number: DE8787310695T
Authority: DE
Inventors: Masayuki Hori; Kaoru Morita; Toshiharu Noda; Toyonobu Uzawa
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1986-12-04
Filing date: 1987-12-04
Publication date: 1993-02-18
Anticipated expiration: 2007-12-05
Also published as: ES2052583T3; EP0270376B1; EP0270376A3; DE3782010D1; EP0270376A2; US5049654A

Description

Die Erfindung betrifft mit Kalzitonin-Gen verwandte Peptidderivate, deren Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen.
Kürzlich wurde durch Analyse der DNA-Sequenz von Hühnern die Aminosäuresequenz von mit Kalzitonin-Gen verwandtem Peptid (chicken calcitonin gene-related peptide, c- CGRP) ermittelt [FEBS Letters, Vol. 203, Nr. 1, 07. bis 10. 20 Juli, 1986]. Es wurde jedoch nicht über die Isolierung und Synthese von c-CGRP berichtet. Die Aktivität und Wirkung von c-CGRP sind deshalb unbekannt.
Wir haben Derivate von c-CGRP synthetisiert und vergleichende Studien zu ihren biologischen Aktivitäten durchgeführt. Wir haben gefunden, daß sie eine stärkere Aktivität zur Verminderung von Serumcalcium und Aktivität zur Verminderung von Serumphosphat mit besserer Langzeitwirkung im Vergleich zu menschlichem c-CGRP aufweisen (human CGRP, h-CGRP gemäß Offenbarung in Nature, 308 (19):746-748 (1984); Neuropeptides, 4:425-434 (1985); und Nature, 313 (3):54-56 (1984)).
Die vorliegende Erfindung stellt dementsprechend c- CGRP-Derivate der Formel (1) zur Verfügung:
wobei Y die Bedeutung Schwefel oder Methylen und A die Bedeutung Asn oder Asp hat, oder ein physiologisch verträgliches Salz davon.
Für die vorliegende Erfindung wird ein Peptid (1), bei dem Y die Bedeutung Schwefel und A die Bedeutung Asn hat, als Desalanyl-deamino-c-CGRP bezeichnet. Ein Peptid (1), bei dem Y die Bedeutung Schwefel und A die Bedeutung Asp hat, wird als Desalanyl-deamino-[Asp³]-c-CGRP bezeichnet. Ein Peptid (1), bei dem Y die Bedeutung Methylen und A die Bedeutung Asn hat, wird als Desalanyl-[Asu2,7]-c-CGRP bezeichnet. Ein Peptid (1), bei dem Y die Bedeutung Methylen und A die Bedeutung Asp hat, wird als Desalanyl-[Asp³, Asu2,7]-c-CGRP bezeichnet. Die Salze sind typische physiologisch verträgliche Salze.
Die Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung, die als Wirkstoff ein Peptid der Formel (1) oder ein physiologisch verträgliches Salz davon und einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel enthalten.
Die Zeichnungen der Beschreibung stellen folgendes dar:
Fig. 1: den Effekt der Calciumverminderung in Rattenserum von h-CGRP, c-CGRP und erfindungsgemäßem Desalanyl-deamino-c-CGRP;
Fig. 2: den Effekt der Verminderung von anorganischem Phosphat in Rattenserum von h-CGRP, c- CGRP und Desalanyl-deamino-c-CGRP;
Fig. 3: den Effekt der Calciumverminderung in Rattenserum von h-CGRP, c-CGRP und erfindungsgemäßem Desalanyl-[Asu2,7]-c-CGRP und Desalanyl-[Asp³, Asu2,7]-c-CGRP;
Fig. 4: den Effekt der Verminderung von anorganischem Phosphat in Rattenserum von h-CGRP, c- CGRP und erfindungsgemäßem Desalanyl- [Asu2,7]-c-CGRP und Desalanyl-[Asp³, Asu2,7)-c-CGRP;
Fig. 5 und 6: Verfahrensschema zur Synthese des intermediären Peptidfragments (3-8).
Bevorzugte Verbindungen sind Peptide der folgenden drei Formeln oder physiologisch verträgliche Salze davon:
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Herstellen einer Verbindung der Formel (1), wobei Y die Bedeutung Schwefel und A die Bedeutung Asn oder Asp hat, oder eines physiologisch verträglichen Salzes davon zur Verfügung, wobei man
(i) ein Peptid synthetisiert, welches eine Kettenstruktur der Formel
Q&sub1;-S-(CH&sub2;)&sub2;-CO-A-Thr-Ala-Thr-Cys-Val-Thr-His-Arg- Leu-Ala-Asp-Phe-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Val-Gly- Lys-Asn-Asn-Phe-Val-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys- Ala-Phe-Q&sub2;
aufweist, wobei A die Bedeutung Asn oder Asp hat, Q&sub1; die Bedeutung Wasserstoff oder die einer mercaptoschützenden Gruppe hat und Q&sub2; wahlweise ist, jedoch - falls vorhanden - die Bedeutung -NH&sub2; hat oder zusammen mit der Carboxylgruppe von -Phe- eine geschützte Amidgruppe bedeutet, und wobei funktionelle Seitenkettengruppen wahlweise geschützt sind;
(ii) wenn Q eine mercaptoschützende Gruppe bedeutet und/oder wenn die Seitenketten-Mercaptogruppe von Cys geschützt ist, die oder jede dieser schützenden Gruppen entfernt;
(iii) die freien Mercaptogruppen zur Bildung einer Disulfidbrücke oxidiert;
(iv) alle wahlweise vorhandenen funktionellen gruppenschützenden Gruppen in Seitenketten entfernt und, wenn Q&sub2; nicht -NH&sub2; bedeutet, die terminalen Carboxygruppen von Phe in eine Amidgruppe umwandelt; und
(v) falls gewünscht, die entstehende Verbindung der Formel (1) in ein phyisologisch verträgliches Salz davon umwandelt.
Das in Schritt (i) eingesetzte Peptid kann beispielsweise hergestellt werden durch Festphasensynthese oder Lösungsphasensynthese.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Herstellen einer Verbindung der Formel (1), wobei Y die Bedeutung Methylen hat oder eines physiologisch verträglichen Salzes davon zur Verfügung, bei dem man
(i) entweder ein Peptid synthetisiert, welches eine Kettenstruktur der Formel
A-Thr-Ala-Thr-Asu-Val-Thr-His-Arg-Leu-Ala-Asp- Phe-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Val-Gly-Lys-Asn-Asn- Phe-Val-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-Q&sub2; aufweist, wobei A und Q&sub2; die vorstehend definierte Bedeutung haben, und wobei Seitenkettengruppen wahlweise geschützt sind, oder einen Teil davon, der die Sequenz
A-Thr-Ala-Thr-Asu-
enthält;
(ii) die Sequenz A-Thr-Ala-Thr-Asu zur Bildung der Einheit
zyklisiert;
(iii) den Rest der Sequenz des Peptids der Formel (1) synthetisiert, wenn er nicht in Schritt (i) synthetisiert wurde;
(iv) alle wahlweise vorhandenen funktionellen gruppenschützenden Gruppen in Seitenketten entfernt und, wenn Q&sub2; nicht -NH&sub2; bedeutet, die terminalen Carboxygruppen von Phe in eine Amidgruppe umwandelt; und
(v) falls gewünscht, die entstehende Verbindung der Formel (1) in ein phyisologisch verträgliches Salz davon umwandelt.
Die Erfindung stellt weiter ein Verfahren zum Herstellen einer Verbindung der Formel (1), wobei Y die Bedeutung Methylen hat, oder eines physiologisch verträglichen Salzes davon zur Verfügung, bei dem man:
(i) einen Teil der Verbindung der Formel (1) synthetisiert, der die Struktur
aufweist, wobei A die vorstehend definierte Bedeutung hat und wobei die funktionellen Seitengruppenketten wahlweise geschützt sind;
(ii) den anderen Teil der Verbindung der Formel (1) synthetisiert und dabei wahlweise Schutzgruppen für funktionelle Seitenkettengruppen vorsieht;
(iii) die in Schritt (i) und (ii) synthetisierten Teile kondensiert;
(iv) alle wahlweise vorhandenen funktionellen gruppenschützenden Gruppen in Seitenketten entfernt und, wenn die carboxyterminale -Phe-Carboxylgruppe nicht in eine Amidgruppe umgewandelt worden ist, die Umwandlung bewirkt; und
(v) falls gewünscht, die entstehende Verbindung der Formel (1) in ein phyisologisch verträgliches Salz davon umwandelt.
Ein erfindungsgemäßes Peptid (1) kann mit bekannten herkömmlichen Verfahren der Peptidsynthese synthetisiert werden.

(1) Ein Verfahren mit Flüssigphasensynthese:

Ein Peptid [1], bei dem Y die Bedeutung Schwefel hat, wird hergestellt durch Umwandeln eines C-terminalen Carboxyls in Phenylalanyl in ein Amid, nachfolgendes Kondensieren einer geschützten Aminosäure und/oder eines geschützten niederen Peptids in der Reihenfolge der in Formel [1] gezeigten Aminosäuresequenz, Entfernen der Schutzgruppen für L-Cystinyl und Mercapto in β-Mercaptopropionsäure und der Schutzgruppen für funktionelle Gruppen in den anderen Seitenketten durch saure Hydrolyse, und Oxidieren von Mercapto zum Bilden einer Disulfidbrücke als abschließender Schritt der Kondensationsreaktion.
Ein Peptid [1], bei dem Y die Bedeutung Methylen hat, wird hergestellt durch Umwandeln eines C-terminalen Carboxyls in Phenylalanyl in ein Amid, nachfolgendes Kondensieren einer geschützten Aminosäure und/oder eines geschützten niederen Amids in der Reihenfolge der in Formel [1] gezeigten Aminosäuresequenz, Unterwerfen der Konstruktionseinheit, die das Fragment der Formel
enthält, wobei R einen aktivierten Esterrest bedeutet und A die vorstehend definierte Bedeutung hat, einer Zyklisierungsreaktion in einem erforderlichen Stadium der obigen Kondensationsreaktion, und Entfernen der Schutzgruppen von aktiven Gruppen durch saure Hydrolyse und Oxidieren von Mercapto zum Bilden einer Disulfidbrücke als abschließender Schritt der Kondensationsreaktion.
Die Kondensationsreaktion kann als wiederholtes Entfernen und Addieren einer Schutzgruppe durchgeführt werden und kann eine Reaktion sein, die für herkömmliche Peptidsynthese verwendet wird. Die in dem Verfahren für ein Ausgangsmaterial und für Zwischenstufen verwendete Schutzgruppe ist eine in der Peptidchemie bekannte Schutzgruppe, beispielsweise ein Peptid, welches mit einem bekannten Verfahren leicht entfernbar ist wie beispielsweise Hydrolyse, saure Zersetzung, Reduktion, Aminolyse oder Hydrazinolyse. Diese Schutzgruppen finden sich in der Primär- oder Sekundärliteratur der Peptidchemie.
Beispiele für bevorzugte Schutzgruppen sind Butyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl oder p-Methoxybenzyloxycarbonyl für eine α-Aminogruppe, Benzyloxycarbonyl oder p-Chlorbenzyloxycarbonyl für eine Seitenkettenaminogruppe wie beispielsweise &epsi;-Amino in Lysin, Methylester oder Benzylester für eine α-Carboxylgruppe, Benzylester für eine Seitenkettencarboxylgruppe wie beispielsweise ein Seitenkettencarboxyl in Asparginsäure, t-Butylester für ein Seitenkettencarboxyl in α-Aminosuberinsäure, Benzyl für eine Hydroxylgruppe in Serin und Threonin und Methylen-2-sulfonyl oder Tosyl für eine Aminogruppe von Guazinino in Arginin.
Bei der Synthese eines erfindungsgemäßen Peptids [1] kann die Kondensation jeder Aminosäure und/oder des niederen Peptids erfolgen durch Umsetzen einer Aminosäure oder eines niederen Peptids, welche(s) eine geschützte α-Amino- und aktivierte terminale α-Carboxylgruppe aufweist, mit einer Aminosäure oder einem niederen Peptid, welches eine freie α-Amino- und geschützte terminale Carboxylgruppe hat, oder alternativ durch Umsetzen einer Aminosäure oder eines niederen Peptids, welches ein aktiviertes α-Amino und geschütztes terminales Carboxyl hat, mit einer Aminosäure oder einem niederen Peptid, welches eine geschützte terminale Carboxylgruppe hat.
Die Carboxylgruppe kann aktiviert werden durch deren Umwandlung in beispielsweise ein Säureacid, Säureanhydrid, Säureimidazolid oder in einen aktivierten Ester wie beispielsweise den Cyanomethylester, p-Nitrophenylester oder N-Hydroxysuccinimidester Sie kann auch durch Verwendung eines Kondensationsmittels aktiviert werden, beispielsweise Carbodiimid wie z.B. N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCCD), N-Ethyl-N'-3-dimethylaminopropylcarbodiimid oder N,N'-Carbonyldiimidazol.
Beispiele für die bevorzugten Verfahren der Kondensationsreaktion sind das Azidverfahren, das Verfahren mit aktivierten Estern, das Verfahren mit gemischten Anhydriden und das Carbodiimidverfahren. Bei den Verfahren zur Kondensationsreaktion ist es bevorzugt, zu Racematen führende Reaktionen zu vermeiden oder wenigstens zu minimieren; ein bevorzugtes Verfahren ist ein Azidverfahren, Verfahren mit aktiviertem Ester, Wunsch-Verfahren [Z. Naturforsch., 21b, 426 (1966)] oder Geiger-Verfahren [Chem. Ber., 103, 788 (1970)].
Ein Peptid [1] kann in jeder Sequenzreihenfolge synthetisiert werden. Es ist jedoch bevorzugt, eine Aminosäuresequenz dadurch zu konstruieren, daß Aminosäuren und/oder niedere Peptide in der Reihenfolge vom C-Terminal verbunden werden.
Ein weiteres Verfahren zum Erhalten des Peptids [1] aus der so synthetisierten geschützten Peptidkette hängt von der Struktur des Peptids [1] ab, bei dem Y die Bedeutung Schwefel oder Y die Bedeutung Methylen hat.
Ein Peptid [1], bei dem Y die Bedeutung Schwefel hat, kann man erhalten durch Entfernen der Schutzgruppen von der geschützten Peptidkette, nämlich β-Mercaptopropionylpentatriaconta-peptidamid Gruppen mit geschütztem omega-Amino, Seitenkettencarboxyl-, Hydroxyl-, Guanidino- und Mercaptogruppen. Die Schutzgruppen werden bevorzugt in einem Schritt durch saure Hydrolyse unter Verwendung von beispielsweise Trifluoromethansulfonsäure oder wasserfreiem Fluorwasserstoff entfernt, um β-Mercaptopropionyl-pentatriaconta-peptidamid zu erhalten, welches eine freie Mercaptogruppe aufweist.
Bei diesem Peptidamid wird eine innermolekulare Disulfidverknüpfung durch Oxidation gebildet, um das Peptid [1] zu erhalten. Eine Disulfidverknüpfung kann allgemein hergestellt werden durch Oxidation mit Sauerstoff in Wasser, Diiodoethan in einem organischen Lösemittel, Iod in wasserfreier Essigsäure oder Kaliumferricyanid in Wasser.
Wenn man ein Peptid [1] erhalten will, bei dem Y die Bedeutung Methylen hat, wird die Konstruktionseinheit der Formel
wobei R und A die vorstehend definierte Bedeutung haben, einer Zyklisierungsreaktion bei einer beliebigen Stufe der Kondensationsreaktion bei der Stufe der Synthese der geschützten Peptidkette unterworfen. Die Zyklisierung kann durchgeführt werden mit einer Kondensationsreaktion mit einer omega-Carboxylgruppe in α-Aminosuberinsäure und einer freien Aminogruppe in einer N-terminalen Aminosäure. Bei der Reaktion werden bevorzugt Hydroxyl in Threonin und das Seitenkettencarboxyl in Asparginsäure geschützt.
Das so erhaltene zyklische Peptid, welches eine geschützte oder ungeschützte aktivierte Gruppe aufweist und ein großes Peptid, welches eine geschützte oder ungeschützte aktivierte Gruppe aufweist, werden kondensiert, und wenn eine geschützte Gruppe vorhanden ist, wird die Schutzgruppe entfernt.
Es kann also Pentatriacontapeptidamid erhalten werden, welches geschützte &epsi;-Amino-, Seitenkettencarboxyl-, Guanidino- und Hydroxylgruppen aufweist. Diese Schutzgruppen werden zum Herstellen des Peptids [1] bevorzugt durch saure Hydrolyse in einem Einschrittverfahren entfernt, beispielsweise unter Verwendung von Trifluoromethansulfonat und wasserfreiem Fluorwasserstoff.

(2) Ein Verfahren mit Festphasensynthese:

Bei der Synthese von Peptid [1] kann teilweise oder vollständig ein Verfahren der Festphasen-Peptidsynthese angewandt werden. Beispielsweise bei der Synthese eines Peptids [1], bei dem Y die Bedeutung Schwefel hat, wird ein Peptidfragment (3-37) [nachfolgend wird ein Peptid, welches eine Aminosäuresequenz hat, die aus den Aminosäuren Nr. 3 bis Nr. 37 aufgebaut ist, als Peptidfragment (3-37) oder als Peptid (3-37) bezeichnet] mit einem Festphasenverfahren synthetisiert, und eine α-Aminogruppe in dem Peptid wird mit β-Mercaptopropionsäure acyliert, um ein an geschütztes Pentatriaconta-petid gebundenes Harz zu erhalten. Diese Schutzgruppen und das Harz werden mit einem bekannten Verfahren in einem Schritt entfernt, beispielsweise unter Verwendung von Trifluoromethansulfonsäure oder wasserfreiem Fluorwasserstoff, um β-Mercaptopropionyl-pentatriacontapeptid-amid zu erhalten, welches eine freie Mercaptogruppe aufweist. Ein Peptid [1] kann erhalten werden durch Herstellen einer innermolekularen Disulfidbrücke, wie es vorstehend für die Festphasensynthese (1) erläutert wurde.
Bei der Synthese eines Peptids [1], bei dem Y die Bedeutung Methylen hat, wird mit einem Festphasenverfahren ein Peptidfragment (9-37) synthetisiert, und es wird ein zyklisches Peptidfragment mit einem Flüssigphasenverfahren synthetisiert, welches N-terminale α-Aminosuberinsäure enthält. Nachfolgend werden die obigen zwei Peptidfragmente mit einem Festphasenverfahren kondensiert, um ein an geschütztes Pentatriaconta-peptid gebundenes Harz zu erhalten. Diese Schutzgruppen und das Harz werden in einem Schritt mit einem bekannten Verfahren entfernt, beispielsweise unter Verwendung von Trifluoromethansulfonsäure oder wasserfreiem Fluorwasserstoff, um das Peptid [1] zu erhalten.
Beispiele für beim Festphasenverfahren verwendete Harze sind herkömmliche Harze wie beispielsweise Benzhydrylaminharz oder p-Methylbenzhydrylaminharz. Ein Harz mit gewünschter funktioneller Äquivalenz oder Vernetzung kann erhalten werden oder ist im Handel erhältlich.
Beim Festphasenverfahren werden Aminosäuren nacheinander in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz der Formel 1 kondensiert und zwar von der C-terminalen Aminosäure bis zur dritten Aminosäure (Aminosäure Nr. 3) (im Falle eines Peptids, bei dem Y die Bedeutung Schwefel hat) oder von der C-terminalen Aminosäure zur neunten Aminosäure (Aminosäure Nr. 9) (im Falle eines Peptids, bei dem Y die Bedeutung Methylen hat). Die funktionellen Gruppen in den Aminosäuren werden mit bekannten Verfahren geschützt. Beispiele für Schutzgruppen sind die vorstehend erläuterten.
Bei der Festphasenreaktion wird ein Harz in einem Reaktionsgefäß gequollen, indem man Dichlormethan, Chloroform, Dimethylformamid, Benzol oder ein Lösemittel zum Quellen des Harzes zugibt, und zwar in einer Menge von 2 bis 20 ml Lösemittel pro 1 g Harz. In einem weiteren Reaktionsgefäß werden vorher 1 bis 6 Äquivalente t-Butyloxycarbonyl- (nachfolgend als Boc- bezeichnet) -aminosäure pro Äquivalent der Aminogruppe im Harz mit DCC umgesetzt, und das erhaltene Säureanhydrid, welches vom Nebenprodukt Dicyclohexylharnstoff (nachfolgend als DCU bezeichnet) abgetrennt wird, wird obigem Harz zugesetzt. Die Menge an Kondensationsmittel (DCC) beträgt 0,5 bis 3 Äquivalente pro Äquivalent Boc-Aminosäure. Die Reaktion läuft normalerweise in 5 bs 60 Minuten ab.
Die Kupplungsmenge an Aminosäure oder Peptid kann mit einem herkömmlichen Verfahren bestimmt werden [T. Fairwell et al, Biochemistry, 22:2691 (1983)], indem man nach Probennahme des in jedem Verfahren erhaltenen Boc-Aminosäure- Harzes oder Boc-Peptid-Harzes die Menge an Boc-Aminosäure bestimmt.
Die Schutzgruppe für die α-Aminogruppe, Boc, wird mit einer Säure wie beispielweise Trifluoressigsäure entfernt, und die Kondensationsreaktion wird durchgeführt. Gewöhnlich wird ein automatischer Festphasen-Synthetisierer verwendet, man kann jedoch auch eine manuelle Arbeitsweise anwenden. Alle Arbeitsschritte werden bevorzugt unter Stickstoffatmosphäre durchgeführt.
Es kann ein an ein Harz gebundenes Peptidfragment (3- 37) oder (9-37) erhalten werden.
Ein an ein Peptidfragment (3-37) gebundenes Harz wird im letzten Schritt mit β-Mercaptopropionsäure acyliert, um ein an β-Mercaptopropionyl-geschütztes Pentatriacontapeptidamid gebundenes Harz zu erhalten.
Das so an geschütztes Pentatriacontapeptidamid gebundene Harz wird wie vorstehend erläutert mit wasserfreiem Fluorwasserstoff behandelt, um in einem Schritt die Schutzgruppe und das Harz zu entfernen; es kann β-Mercaptopropionylpentatriacontapeptidamid erhalten werden, welches eine freie Mercaptogruppe aufweist.
Ein Peptid [1], bei dem Y die Bedeutung Schwefel hat, kann erhalten werden durch Bilden einer innermolekularen Disulfidbrücke in dem obigen β-Mercaptopropionylpentatriacontapeptidamid, welches eine freie Mercaptogruppe aufweist.
Bei der Synthese eines Peptids [1], bei dem Y die Bedeutung Methylen hat, wird ein an ein Peptidfragment (9-37) gebundenes Harz mit einem zyklischen Peptidfragment kondensiert, welches α-Aminosuberinsäure enthält.
Das so erhaltene, an geschütztes Pentatriaconta gebundene Harz, welches α-Aminosuberinsäure enthält, wird mit wasserfreiem Fluorwasserstoff behandelt, um in einem Schritt die Schutzgruppe und das Harz zu entfernen; man erhält das Peptid [1], bei dem Y die Bedeutung Methylen hat.

(3) Isolieren und Reinigen:

Das Peptid [1] kann mit einem bekannten herkömmlichen Reinigungsverfahren der Peptid- oder Proteinchemie gereinigt werden. Beispielsweise kann man das Verfahren der Gelfiltration, beispielweise unter Verwendung von Sephadex G- 25, Sephadex G-50 oder Sephadex LH-20 (Warenzeichen), die Säulenchromatographie unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen oder Carboxymethylzellulose oder die HPLC einsetzen.
Ein erfindungsgemäßes Peptid [1] kann gemäß dem Verfahren in Form einer freien Base oder eines Salzes erhalten werden. Beispielsweise kann man mit einer bekannten organischen Säure wie beispielweise Essigsäure ein Salz herstellen.
Die in der Beschreibung und in den Zeichnungen verwendeten Abbkürzungen sind die folgenden:
Asu: L-α-Aminosuberinsäure
Asn: L-Asparagin
Asp: L-Asparginsäure
Ala: L-Alanin
Thr: L-Threonin
Val: L-Valin
His: L-Histidin
Arg: L-Arginin
Leu: L-Leucin
Phe: L-Phenylalanin
Ser: L-Serin
Gly: Glycin
Lys: L-Lysin
Pro: L-Prolin
Boc: t-Butyloxycarbonyl
Z: Benzyloxycarbonyl
Cl-Z: p-Chlorbenzyloxycarbonyl
Bzl: Benzyl
OSu: N-Hydroxysuccinimidester
ONp: p-Nitrophenylester
OMe: Methylester
OBut: t-Butylester
OBzl: Benzylester
TFA: Trifluoressigsäure
Ether: Diethylether
DMF: N,N'-Dimethylformamid
MeOH: Methanol
DCM: Dichlormethan
DIEA: Diisopropylethylamin
HOBt: 1-Hydroxybenzotriazol
MBHA-Harz: p-Methylbenzhydrylaminharz
Die Aktivitäten der erfindungsgemäßen Verbindungen in bezug auf die Verminderung von Serumcalcium und Serumphosphat können wie folgt gezeigt werden:

[Bestimmungsverfahren]

Desalanyl-deamino-c-CGRP, Desalanyl-[Asu2,7]-c-CGRP und Desalanyl-[Asp³,Asu2,7]-c-CGRP (jeweils 80 ug), c-CGRP (JP-A-61-273581) und bekanntes h-CGRP (jeweils 80 ug für Kontrollgruppe), gelöst in Citratpuffer, pH=6,5, enthaltend 0,1 % Rinderserumalbumin (nachfolgend bezeichnet als lösendes Medium) (1 ml) wurden intravenös eingegeben in die Schwanzvenen von Wistar-Ratten, Körpergewicht 80 bis 90 g, bis 6 Ratten in einer Gruppe, mit 20 oder 80 ug/kg. 30 und 60 Minuten nach der Gabe wurden der abdominal absteigenden Aorta Blutproben entnommen. Die Konzentration des Serumcalciums wurde mit Hilfe der Atomadsortions-Spektrophotometrie gemessen. Serumphosphat wurde mit dem Verfahren nach Goldenberg et al bestimmt [Clin. Chem., 12:872-882 (1966)].

[Ergebnisse]

Wie in Fig. 1 und Fig. 2 gezeigt ist, waren die Konzentrationen an Serumcalcium und -phosphat bei der Gruppe, der Desalanyl-deamino-c-CGRP verabreicht wurde (20 ug/kg) (-o-) verglichen mit der Vergleichsgruppe (Gruppe, der lösendes Medium verabreicht wurde) (-X-) um mehr als 30 % geringer, und es wurde beobachtet, daß diese Aktivitäten nach 2 Stunden noch andauerten. Diese Aktivitäten waren stärker als diejenige von in vierfachen Mengen verabreichtem h-CGRP (- -), 80 ug/kg) und waren in ihrer Stärke so signifikant wie die von in äquivalenten Dosen verabreichtem c-CGRP (-Δ-, 20 ug/kg), und die Wirkungen wurden signifikant verlängert.
Wie weiterhin in Fig. 1 und Fig. 2 gezeigt ist, waren die Konzentrationen an Serumcalcium und -phosphat bei der Gruppe, der Desalanyl-deamino-c-CGRP verabreicht wurde (80 ug/kg) (- -) verglichen mit der Vergleichsgruppe (Gruppe, der lösendes Medium verabreicht wurde) (-X-) um mehr als 30 % geringer, und es wurde beobachtet, daß diese Aktivitäten nach 2 Stunden noch andauerten. Daneben war die Aktivität zum Herabsetzen von Serumcalcium weiter vergrößert. Diese Aktivitäten waren stärker als diejenige von in äquivalenter Dosis gegebenem h-CGRP (- -, 80 ug/kg) und c-CGRP (- -, 80 ug/kg) und die Wirkungen wurden signifikant verlängert.
Wie in Fig. 3 und Fig. 4 gezeigt ist, waren die Konzentrationen an Serumcalcium und -phosphat bei den Gruppen, denen Desalanyl-[Asu2,7]-c-CGRP, (80 ug/kg) (- -) und des Desalanyl-[Asp³,Asu2,7]-c-CGRP, 80 ug/kg (- -) verabreicht wurden, verglichen mit der Vergleichsgruppe (Gruppe, der lösendes Medium verabreicht wurde) (-X-) um mehr als 30 % geringer, und es wurde beobachtet, daß diese Aktivitäten nach 2 Stunden noch andauerten. Diese Aktivitäten waren stärker als diejenige von in äquivalente Mengen verabreichtem h-CGRP (- -, 80 ug/kg) und waren in ihrer Stärke so signifikant wie die von in äquivalenten Dosen verabreichtem c-CGRP (-Δ-, 20 ug/kg), und die Wirkungen wurden signifikant verlängert.
Wie vorstehend erläutert, hat das erfindungsgemäße Peptid [1] bei Vergleich mit bekanntem h-CGRP eine höhere Aktivität zum Herabsetzen von Serumcalcium und zum Herabsetzen von Serumphosphat. Daneben zeigt es im Vergleich zu c-CGRP eine bessere Langzeitwirkung und eine höhere biologische Aktivität bei längerer Langzeitwirkung. Schließlich ist es stabil gegen die Wirkung von Aminopeptidase in vivo und somit nützlich zur Behandlung von Störungen des Calciummetabolismus, Herzkrankheiten und Geschwüren oder für Verbesserungen im Hirn-Kreislaufsystem.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
In den Beispielen bedeutet PF ( ) das Peptidfragment, welches die Aminosäuresequenz der in den Klammern stehenden Zahlen aufweist.
Wenn nichts anderes angegeben ist, sind die für die Dünnschichtchromatographie (TLC) verwendeten Träger und Entwickler und die Hydrolysebedingungen bei der Aminosäureanalyse die folgenden.

< TLC>

Träger: Silicagel (Merck, Art. 5715) Entwickler: 1; Chloroform:Methanol:Essigsäure (95:5:3)
2; Chloroform:Methanol:Essigsäure (85:15:5)

< Hydrolyse>

Die Proben wurden 24 bis 48 Stunden lang mit HCl bei 110 ºC in einem verschlossenen Rohr hydrolisiert.

Beispiel 1

Herstellen von Desalanyl-[Asu2,7]-c-CGRP:

Anisol (1 ml) wurde zu Desalanyl-[Asu2,7]-geschütztem c-CGRP (3-37)-MBHA-Harz der folgenden Formel gegeben:
-MBHA-Harz (1,09 g). Es wurde wasserfreier Fluorwasserstoff (25 ml) zugegeben und 1 Stunde lang bei 0 ºC gerührt. Nach Abdestillieren des wasserfreien Fluorwasserstoffs im Vakuum wurde der Rückstand mit Ether gewaschen, und es wurde zum Extrahieren des Peptids 0,1 M Essigsäure zugegeben (20 ml). Das Extrakt wurde durch eine Dowex WGR-Säule (2,8 x 15 cm) (Warenzeichen) geleitet und mit 0,1 M Essigsäure eluiert (60 ml). Dag Eluat wurde gefriergetrocknet, und es wurde ein weißes Pulver erhalten (370 mg). Das Pulver wurde auf eine Säule aus Carboxymethylzellulose (2,8 x 13 cm) aufgegeben und einer Elution mit linearem Gradienten mit 0,01 M wäßrigem Ammoniumacetat (pH=4,5, 300 ml) 0,5 M wäßrigem Ammoniumacetat pH=5, 300 ml) unterworfen. Proben (100 ul) aus den Fraktionen (jede 10 ml) wurden kolorimetrisch mit dem Folin-Lolly-Verfahren bei 750 nm gemessen. Die Fraktionen Nr. 33-37 wurden gesammelt und auf eine Säule (2,8 x 5,5 cm) aus CHP-20-Harz (Warenzeichen von Mitsubishi Kasei Kogyo) aufgebracht und mit einer Elution mit linearem Gradienten in 0,1 M wäßriger Essigsäure eluiert, die 25 % Acetonitril (150 ml) 0,1 M wäßrige Essigsäure enthielt, die 40 % Acetonitril (150 ml) enthielt. Die Fraktionen Nr. 10- 12 (jeweils 6,4 ml) wurden gesammelt und gefriergetrocknet, und es wurde ein weißes Pulver erhalten (30,5 mg). Das Pulver wurde mit Umkehrphasen-HPLC gereignigt, und es wurde gereignigtes Desalanyl-[Asu2,7]-c-CGRP erhalten (3,4 mg).
Säule: Nucleosil 5C&sub1;&sub8;
Puffer: 0,1 % TFA-Acetonitril (Gradientenelution mit Acetonitril-Konzentrationen von 28 bis 38 % in 25 Minuten).
Flüß: 2,5 ml/min
Fraktion: Peak, erhalten bei einer Retentionzeit von 17,8 min
Physikalische Eigenschaften: größer als 10,25 [α]D26,5: -53,3 (c=0,094, 0,1M Essigsäure) Aminosäureanalyse:
Desalanyl-[Asu2,7]-geschütztes c-CGRP-MBHA-Harz wurde mit folgendem Verfahren erhalten:
Festphasen-Peptid-Synthetisierer; 430-A Peptide Synthesizer Applied Biosystems Corp.

(1) Herstellen von PF(9-37)-MBHA-Harz,

d.h.
MBHA-Harz (Applied Biosystems Corp., Aminogruppe: 0,61 mM/g) (0,8 g), welches in das Reaktionsgefäß eines Festphasen-Peptid-Synthestisierers gesetzt war, wurde behandelt mit DCM (8 ml) (viermal jeweils 1 Min.), DCM-Lösung (8 ml) enthaltend 60 % TFA (20 Min.), DCM (4 ml) (dreimal jeweils 15 s), DMF Lösung (3 ml) enthaltend DEIA (1 ml) (zweimal jeweils 1 Min.) und DMF (8 ml) (sechsmal jeweils 40 s.), und zwar in dieser Reihenfolge und unter Rühren in einer Stickstoffatmosphäre und nach jeder Behandlung filtriert.
DCC (0,5 M-DCM-Lösung) (2 ml) wurde in einem Aminosäure-Aktivatorgefäß zu Boc-Phe (2 mM, Aminosäuresequenz Nr. 37) gegeben, welches in DCM (5 ml) gelöst war und 5 Minuten lang umgesetzt. Das filtrierte Reaktionsgemisch wurde in ein Gefäß zum Konzentrieren gegeben, und es wurde DMF (3 ml) zugesetzt. Destilliertes DCM wurde dann unter Stickstoffatmoshäre abdestilliert. Es wurde noch einmal DMF (3 ml) zugegeben, und das Gemisch wurde in das obige Reaktionsgefäß überführt und dann 25 Minuten lang der Reaktion unterworfen. Das Reaktionsgemisch wurde sechsmal jeweils 20 Sekunden lang mit DCM (8 ml) gewaschen und filtriert, und es wurde ein Boc-Phe-MBHA-Harz erhalten.
Das Boc-Phe-MBHA-Harz wurde im Reaktionsgefäß viermal mit DCM gewaschen (8 ml, jeweils 1 Min.) und filtriert. Es wurde 40-prozentige DCM-Lösung (8 ml) zugegeben, welche 60 % TFA enthielt und zum Entfernen des Boc 20 Minuten lang gerührt. Das so erhaltene Harz wurde dreimal gewaschen und zwar in dieser Reihenfolge mit DCM (4 ml, jeweils 15 s.), zweimal mit DMF-Lösung (3 ml), welche DIEA enthielt (1 ml, jeweils 1 Min.) und sechsmal mit DMF (8 ml, jeweils 40 s.) und filtriert.
DCC (0,5 M-DCM-Lösung) (2 ml) wurde in einem Aminosäure-Aktivatorgefäß zu Boc-Ala (2 mM, Aminosäuresequenz Nr. 36) gegeben, welches in DCM (5 ml) gelöst war, 5 Minuten lang umgesetzt und dann so behandelt wie vorstehend das Boc-Phe. Das Reaktionsgemisch wurde nach Zugabe von DMF in Stickstoffatmosphäre konzentriert, in ein Reaktionsgefäß überführt und 20 Minuten lang umgesetzt, sechsmal mit DCM gewaschen (8 ml, jeweils 20 s.) und filtriert, und es wurde ein Boc-Ala-Phe-MBHA-Harz erhalten.
Nachfolgend wurden die Aminosäuren (Sequenz Nr. 35 bis 9) den Kupplungsreaktionen unterworfen, und es wurde ein PF(9-37)-MBHA-Harz erhalten.
Die in dem Verfahren verwendeten geschützten Aminogruppen sind die folgenden: Aminosäure-Nr. geschützte Aminosäure eingesetzte Menge (mM)
Wenn bei der obigen Festphasen-Synthese Asn und Arg eingesetzt wurden, wurden DCC-Lösung (2 ml) und HOBt-Lösung (0,5 M-DMF-Lösung) (2 ml) zu den Aminosäuren (2 mM) in einem Gemisch von DMF-DCM (3:1) (4 ml) gegeben, 1 Minute lang umgesetzt und dann in gleicher Weise wie die anderen Aminosäuren behandelt. Das Gemisch wurde zum Durchführen der Kupplungsreaktion in ein Reaktionsgefäß überführt, mit DCM gewaschen und filtriert. Es wurden weitere DCC-Lösung (2 ml) und HOBt-Lösung (0,5 M-DMF-Lösung) (2 ml) zu den Aminosäuren (2 mM) in einem Gemisch von DMF-DCM (3:1) (4 ml) gegeben und 25 Minuten lang umgesetzt, und das Gemisch wurde zum Durchführen der Kupplungsreaktion nach dem sogenannten Zweifach-Kupplungsverfahren in ein Reaktionsgefäß überführt.

(2) Herstellen von Desalanyl-[Asu2,7]-geschützem c-CGRP (3- 37)-MBHA-Harz

4 N-Chlorwasserstoff (0,93 ml) in Dioxan wurde unter Kühlung bei -40 ºC zu zyklischem PF(3-8)[10] (220 mg), gelöst in DMF (10 ml), der folgenden Formel gegeben:
und dazu Isoamylnitrit (60 ul) bei -30ºC. Nach 30 Minuten, Bestätigung des negativen Hydrazintests, wurde Triethylamin (520 ul) unter Kühlung bei -70 ºC zum Neutralisieren des Reaktionsgemisches zugesetzt. Es wurde PF(9-37)-MBHA-Harz (1,13 g) zugegeben, weiter Triethylamin (90 ul) zugesetzt, 5 Stunden lang bei -20 ºC bis -10 ºC gerührt und dann über Nacht bei 4 ºC gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde saugfiltriert, in dieser Reihenfolge mit DMF (10 ml), 0,1 M Essigsäure (10 ml) und Ethanol (10 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet, und es wurde Desalanyl-[Asu2,7]-geschütztes c- CGRP (3-37)-MBHA-Harz erhalten (1,09 g).
Ein zyklisches PF(3-8) [10] wie oben wurde mit dem folgenden Verfahren hergestellt. (3) Herstellen von zyklisch-geschütztem PF(3-8):
p-Nitrophenyltrifluoracetat (5,7 Äquivalente) wurde in Pyridin (50 ml) gelöstem Boc-Asn-Thr(Bzl)-Ala-Thr(Bzl)-Asu- Val-OMe [7] (3,4 g) zugesetzt und 4 Stunden lang bei 45 ºC gerührt. Nach Abdestillieren von Pyridin wurde Ether zugesetzt und das ausgefällte Material gesammelt. Boc wurde durch Zusetzen von TFA (30 ml) entfernt, welches im Vakuum abdestilliert wurde. Es wurde Ether zugesetzt, und der Niederschlag wurde gesammelt. Der in DMF (82 ml) gelöste Niederschlag wurde tropfenweise Pyridin (2,3 l) bei 45 ºC zugesetzt, und es wurde 6 Stunden lang bei 50 ºC und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Pyridin wurde im Vakuum abdestilliert. Dem Rückstand wurde 0,5-prozentiges wäßriges Natriumbicarbonat (100 ml) zugesetzt, und der so erhaltene Niederschlag wurde mit Wasser vollständig gewaschen und dann in einem Exsikkator getrocknet, und es wurde zyklisches geschütztes PF(3-8) [8] erhalten (3,26 g). (4) Zyklisches PF(3-8)
Dem zyklischen geschützten PF(3-8) [8] (1,48 g) wurde Anisol (1,5 ml) zugesetzt. Es wurde wasserfreier Fluorwasserstoff (15 ml) zugesetzt und 1 Stunde lang bei 0 ºC gerührt. Nach Abdestillieren des wasserfreien Fluorwasserstoffs im Vakuum wurde der Rückstand mit Ether gewaschen, und es wurde ein weißes Pulver erhalten (1,15 g). Dem in Essigsäure (3 ml) gelösten Pulver wurde 0,1 M Essigsäure (9 ml) zugesetzt und es wurde auf eine CHP-20-Säule (3,2 x 25 cm) aufgebracht, mit 0,1 M Essigsäure gepackt, welche 33 % DMF enthielt, und mit Elution mit linearem Gradienten in 33-prozentiger Essigsäure (700 ml) 33-prozentiger Essigsäure, die 70 % DMF (700 ml) enthielt, eluiert.
Die Fraktionen Nr. 32-49 (jeweils 10 ml) wurden gesammelt, DMF wurde abdestilliert, und die Fraktionen wurden gefriergetrocknet, und es wurde ein weißes Pulver von zyklischem PF(3-8)[9] erhalten (600 mg). Aminosäureanalyse:

(5) Zyklisches PF(3-8) [10]

Zyklisches PF(3-8) [9] (600 mg) in THF (20 ml) wurde unter Rühren bei 60 ºC gelöst und bei 30 ºC gehalten. Es wurde NH&sub2;NH&sub2;xH&sub2;O (2 ml) zugesetzt und 6 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt. Es wurden THF (20 ml) und DMF (10 ml) zugesetzt und über Nacht gerührt. Nach Abdestillieren des Lösemittels im Vakuum wurde der Rückstand in Essigsäure (5 ml) gelöst, es wurde Wasser (15 ml) zugesetzt und auf eine CHP-20-Säule (2,8 x 16,0 mm) aufgebracht und mit Elution mit linearem Gradienten in 0,1 M Essigsäure (300 ml) 0,1 M Essigsäure, die 40 % Acetonitril (300 ml) enthielt, eluiert. Die Fraktionen Nr. 46-56 (jeweils 9,6 ml) wurden gesammelt und gefriergetrocknet, und es wurde ein weißes Pulver von zyklischem PF(3-8) [10] erhalten (224 mg).
Das obige Boc-Asn-Thr(Bzl)-Ala-Thr(Bzl)-Asu-Val-OMe [7] wurde mit einem Verfahren hergestellt, welches in dem Verfahrensschema zur Herstellung für ein Peptidfragment (3-8) in Fig. 5 dargestellt ist.
Die physikochemischen Eigenschaften der Zwischen-Peptidfragmente werden nachfolgend angegeben: Aminosäureanalyse: Aminosäureanalyse: Aminosäureanalyse: F.; ölig bei Zimmertemperatur F.; ölig bei Zimmertemperatur Aminosäureanalyse:

Beispiel 2

Herstellen von Desalanyl-[Asp³, Asu2,7]-c-CGRP:

Desalanyl-[Asp³, Asu2,7]-geschütztem c-CGRP-(3-37)- MBHA-Harz der folgenden Formel wurde Anisol (1 ml) zugesetzt:
-MBHA-Harz (1,09 g). Es wurde wasserfreies Fluorwasserstoff (25 ml) zugesetzt und 1 Stunde lang bei 0 ºC gerührt. Nach dem Abdestillieren des wasserfreien Fluorwasserstoffs im Vakuum wurde der Rückstand mit Ether gewaschen, und es wurde 0,1 M Essigsäure (20 ml) zum Extrahieren des Peptids zugesetzt. Der Extrakt wurde durch eine Dowex WGR-Säule (2,8 x 16 cm) (Warenzeichen) geleitet und mit 0,1 M Essigsäure (60 ml) eluiert. Das Eluat wurde gefriergetrocknet, und es wurde ein weißes Pulver erhalten (410 mg). Das Pulver wurde auf eine Carboxymethylzellulose-Säule (2,8 x 14 cm) aufgebracht und eine Elution mit linearem Gradienten mit 0,01 M wäßrigem Ammoniumacetat pH=4,5, 300 ml) 0,5 M wäßrigem Ammoniumacetat (pH=5,9, 300 ml) unterworfen. Proben (100 ul) der Fraktionen (jeweils 100 ml) wurden kolorimetrisch mit dem Folin-Lolly-Verfahren bei 750 nm gemessen. Die Fraktionen Nr. 29-31 wurden gesammelt und auf eine Säule (2,8 x 6,5 cm) aus CHP-20-Harz (Warenzeichen, Mitsubishi Kasei Kogyo) aufgebracht und mit Elution mit linearem Gradienten in 0,1 M wäßriger Essigsäure, die 25 % Acetonitril (150 ml) enthielt 0,1 M wäßrige Essigsäure, die 40 % Acteonitril (150 ml) enthielt, eluiert. Die Fraktionen (jeweils 6,4 ml) Nr. 10-12 wurden gesammelt und gefriergetrocknet, und es wurde ein weißes Pulver (18,2 mg) erhalten. Das Pulver wurde mit Umkehrphasen-HPLC gereinigt, und es wurde gereinigtes Desalanyl-[Asp³, Asu2,7]-c-CGRP erhalten (2,8 mg).
Säule: Nucleosil 5C&sub1;&sub8;
Puffer: 0,1 % TFA-Acetonitril (Gradientenelution mit einer Acetonitril-Konzentration von 28 bis 38 % in 25 Minuten).
Fluß: 2,5 ml/min
Fraktion: gesammelt wurde ein Peak bei einem Retentionsvolumen von 17,7 min
Physikalische Eigenschaften: pI: größer als 10,25 [α]D26,5. -56,8 (c = 0,091, 0,1 M Essigsäure) Aminosäureanalyse:
Desalanyl-[Asp³, Asu2,7]-geschütztes c-CGRP-MBHA-Harz wurde mit dem folgenden Verfahren erhalten.
(1) PF(9-37)-MBHA-Harz wurde mit demselben Verfahren wie in Beispiel 1 hergestellt
(2) Herstellen von Desalanyl-[Asp³, Asu2,7]-geschütztem c- CGRP (3-37)-MBHA-Harz:
4 N-Chlorwasserstoff (0,93 ml) in Dioxan wurde unter Kühlung bei -40 ºC zu zyklischem PF(3-8)[14] (250 mg), gelöst in DMF (10 ml) der folgenden Formel gegeben:
und dazu Isoamylnitrit (60 ul) bei -30ºC. Nach 30 Minuten, Bestätigung des negativen Hydrazintests, wurde Triethylamin (520 ul) unter Kühlung bei -70 ºC zum Neutralisieren des Reaktionsgemisches zugesetzt. Es wurde PF(9-37)-MBHA-Harz (1,13 g) zugegeben, weiter Triethylamin (90 ul) zugesetzt, 5 Stunden lang bei -20 ºC bis -10 ºC gerührt und dann über Nacht bei 4 ºC gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde saugfiltriert, in dieser Reihenfolge mit DMF (10 ml), 0,1 M Essigsäure (10 ml) und Ethanol (10 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet, und es wurde Desalanyl-[Asp³, Asu2,7]-geschütztes c-CGRP (3-37)-MBHA-Harz erhalten (1,09 g).
Das zyklisches PF(3-8) [14] wurde mit dem folgenden Verfahren hergestellt. (3) Herstellen von zyklisch geschütztem PF(3-8):
p-Nitrophenyltrifluoracetat (7 Äquivalente) wurde in Pyridin (40 ml) gelöstem Boc-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ala- Thr(Bzl)-Asu-Val-OMe [11] (3,2 g) zugesetzt und 3 Stunden lang bei 45 ºC gerührt. Nach Abdestillieren von Pyridin wurde Ether zugesetzt und das ausgefällte Material gesammelt. Boc wurde durch Zusetzen von TFA (30 ml) entfernt, welches im Vakuum abdestilliert wurde. Es wurde Ether zugesetzt, und der Niederschlag wurde gesammelt. Der in DMF (70 ml) gelöste Niederschlag wurde tropfenweise Pyridin (2 l) bei 45 ºC zugesetzt, und es wurde 7 Stunden lang bei 50 ºC und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt.
Pyridin wurde im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wurde mit Chloroform (400 ml) extrahiert, und es wurde zyklisches geschütztes PF(3-8) [12] erhalten (2,62 g). (4) Zyklisches PF(3-8)
Dem zyklischen geschützten PF(3-8) [12] (2,67 g) wurde Anisol (1 ml) zugesetzt. Es wurde wasserfreier Fluorwasserstoff (15 ml) unter Kühlung bei 0 ºC zugesetzt und 1 Stunde lang gerührt. Nach Abdestillieren des wasserfreien Fluorwasserstoffs im Vakuum wurde der Rückstand mit Ether gewaschen, und es wurde ein weißes Pulver erhalten (1,75 g). Dem in DMF (10 ml) gelösten Pulver wurde 0,1 M Essigsäure (10 ml) zugesetzt und auf eine CHP-20-Säule (3,2 x 32 cm) aufgebracht, gepackt mit 0,1 M Essigsäure, welche 20 % DMF enthielt, und mit Elutuion mit linearem Gradienten in 0,1 M Essigsäure (500 ml), welche 20 % DMF enthielt 0,1 M Essigsäure, welche 66 % DMF enthielt (500 ml), eluiert. Die Fraktionen Nr. 54-63 (jeweils 14,8 ml) wurden gesammelt und im Vakuum getrocknet, und es wurde ein weißes Pulver zyklisches PF(3-8)[13] erhalten (670 mg).
F.: 154 bis 160 ºC Aminosäureanalyse:
Massenspektrum: 673(M&spplus;) (theoretischer Wert 672,71)

(5) Zyklisches PF(3-8) [14]

Zyklisches PF(3-8) [13] (800 mg) in THF (25 ml) wurde unter Erwärmen gelöst und auf 30 ºC abgekühlt. NH&sub2;NH&sub2;xH&sub2;O (2 ml) wurde zugegeben, und es wurde 6 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt. Es wurde weiter DMF (10 ml) zugegeben und über Nacht gerührt. Nach Abdestillieren des Lösemittels im Vakuum wurde der Rückstand in 0,1 M Essigsäure (15 ml) gelöst und auf eine CHP-20-Säule (2,6 x 13,0 cm) aufgebracht und mit Elution mit linearem Gradienten in 0,1 M Essigsäure (300 ml 0,1 M Essigsäure, die 33 % Acetonitril enthielt (300 ml), eluiert. Die Fraktionen Nr. 26-40 (jeweils 7,9 ml) wurden gesammelt und gefriergetrocknet, und es wurde ein weißes Pulver aus zyklischem PF(3-8) [14] erhalten (502 mg).
Das obige Boc-Asp-(OBzl)-Thr(Bzl)-Ala-Thr(Bzl)-Asu-Val- OMe [11] wurde mit einem Verfahren hergestellt, welches in dem Verfahrensschema zur Herstellung für ein Peptidfragment (3-8) in Fig. 6 dargestellt ist.
Die physikochemischen Eigenschaften der Zwischen-Peptidfragmente [11] werden nachfolgend angegeben:
TLC: Rf&sub2;; 0,58

Aminosäureanalyse:

Asp 1,04(1), Thr 2,04(2), Ala 1,00(1), Val 1,06 (1), Asu 1,25(1)

Beispiel 3

Herstellen von Desalanyl-deamino-CGRP:

Anisol (4 ml), Dimethylsufid (4 ml) und Ethandithiol (0,8 ml) wurden zu geschütztem Desalanyl-deamino-c-CGRP- MBHA-Harz (2,65 g) der Formel
gegeben. Es wurde wasserfreier Fluorwasserstoff (40 ml) zugegeben und 1 Stunde lang bei 0 ºC gerührt. Nach Abdestillieren des wasserfreien Fluorwasserstoffs im Vakuum wurde der Rückstand mit Ether gewaschen, und es wurde zum Extrahieren des Peptids 20-prozentige Essigsäure (50 ml) zugegeben. Der Extrakt wurde durch eine Dowex WGR-Säule (2,5 x 15 cm) (Warenzeichen) geschickt und mit 1 M Essigsäure (160 ml) eluiert. Das Eluat wurde gefriergetrocknet, und es wurde ein weißes Pulver erhalten (780 mg). Das Pulver (150 mg) wurde in 50 mM Na&sub2;HPO&sub4;-Puffer (pH=7,5, 10 ml) gelöst, der 8 M Harnstoff und 5 mM Dithithrietol enthielt, und 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 50 mM Na&sub2;HPO&sub4;-Puffer (pH=7,5, 1125 ml) verdünnt, und es wurde eine wäßrige Lösung von 20 mM K&sub3;Fe(CN)&sub6; (8 ml) zugegeben.
Die Lösung wurde auf eine CHP-20P-Harzsäule (Warenzeichen von Mitsubishi Kasei Kogyo) (2,5 x 10 cm) aufgebracht und einer Elution mit linearem Gradienten mit 0,1 N wäßriger Ameisensäure, die 5 % Acetonitril enthielt (500 ml) 0,1 N wäßrige Ameisensäure, die 45 % Acetonitril enthielt (500 ml), unterworfen.
Proben (100 ul) der Fraktionen (jeweils 10 ml) wurden kolorimetrisch mit dem Folin-Lolly-Verfahren bei 750 nm gemessen. Fraktionen Nr. 46-53 wurden gesammelt und gefriergetrocknet, und es wurde ein weißes Pulver als Produkt erhalten (35 mg). Das in 0,1 M Essigsäure gelöste Pulver wurde auf eine Säule aus Sephadex G-25 Fine (1,6 x 45 cm) aufgebracht und mit 0,1 M wäßrige Essigsäure eluiert. Die Fraktionen (jeweils ml) Nr. 5-15 wurden gesammelt und gefriergetrocknet, und es wurde ein weißes Pulver als Produkt erhalten (31 mg). Das Pulver wurde mit Umkehrphasen-HBLC (nachfolgend) gereinigt, und es wurde gereinigtes Desalanyl-deamino-c-CGRP (10,0 mg) erhalten.
Säule: Typ YMC-GEL ODS 5-5 AM (20 mmID x 250 mm)
Puffer: 0,1 % TFA-Acetonitril (Gradientenelution mit Acetonitril-Konzentrationen von 27 bis 40 % in 30 Minuten).
Fluß: 7 ml/min
Fraktion: gesammelt wurde ein Peak mit einer Retentionszeit von 17,3 min
Physikalische Eigenschaften: pI: größer als 10,25 [α]D²&sup4;: -60,46 (c = 0,086, 0,1 M Essigsäure) Aminosäureanalyse (6N-HCl-Hydrolysat):
Das obige geschützte Desalanyl-deamino-c-CGRP-MBHA-Harz wurde mit dem folgenden Verfahren erhalten:
Es wurde ein Festphasen-Peptid-Synthetisierer, (430-A- Peptide Synthesizer der Applied Biosystems Corp.) verwendet.
MBHA-Harz (Applied Biosystems Corp., Aminogruppe: 0,48 mM/g) (1,0 g), welches in das Reaktionsgefäß eines Festphasen-Peptid-Synthestisierers gesetzt war, wurde behandelt mit DCM (8 ml) (viermal jeweils 1 Min.), DCM-Lösung (8 ml) enthaltend 60 % TFA (20 Min.), DCM (4 ml) (dreimal jeweils 15 s), DMF-Lösung (3 ml) enthaltend DIEA (1 ml) (zweimal jeweils 1 Min.) und DMF (8 ml) (sechsmal jeweils 40 s.), und zwar in dieser Reihenfolge und unter Rühren in einer Stickstoffatmosphäre und nach jeder Behandlung filtriert.
DCC (0,5 M-DCM-Lösung) (2 ml) wurde in einem Aminosäure-Aktivatorgefäß zu Boc-Phe (2 mM, Aminosäuresequenz Nr. 37) gegeben, welches in DCM (5 ml) gelöst war und 5 Minuten lang umgesetzt. Das filtrierte Reaktionsgemisch wurde in ein Gefäß zum Konzentrieren gegeben, und es wurde DMF (3 ml) zugesetzt und DCM dann unter Stickstoffatmoshäre abdestilliert. Es wurde noch einmal DMF (3 ml) zugegeben, und das Gemisch wurde in das obige Reaktionsgefäß überführt und dann 25 Minuten lang der Reaktion unterworfen. Das Reaktionsgemisch wurde sechsmal jeweils 20 Sekunden lang mit DCM (8 ml) gewaschen und filtriert, und es wurde ein Boc-Phe- MBHA-Harz erhalten.
Das Boc-Phe-MBHA-Harz wurde im Reaktionsgefäß viermal mit DCM gewaschen (8 ml, jeweils 1 Min.) und filtriert. Es wurde 40-prozentige DCM-Lösung (8 ml) zugegeben, welche 60 % TFA enthielt, und zum Entfernen des Boc 20 Minuten lang gerührt. Das so erhaltene Harz wurde dreimal gewaschen und zwar in dieser Reihenfolge mit DCM (4 ml, jeweils 15 s.), zweimal mit DMF-Lösung (3 ml), welche DIEA enthielt (1 ml, jeweils 1 Min.), und sechsmal mit DMF (8 ml, jeweils 40 s.) und filtriert.
DCC (0,5 M-DCM-Lösung) (2 ml) wurde in einem Aminosäure-Aktivatorgefäß zu Boc-Ala (2 mM, Aminosäuresequenz Nr. 36) gegeben, welches in DCM (5 ml) gelöst war, 5 Minuten lang umgesetzt und dann so behandelt wie vorstehend das Boc-Phe. Das Reaktionsgemisch wurde nach Zugabe von DMF in Stickstoffatmosphäre konzentriert, in ein Reaktionsgefäß überführt und 20 Minuten lang umgesetzt, sechsmal mit DCM gewaschen (8 ml, jeweils 20 s.) und filtriert, und es wurde ein Boc-Ala-Phe-MBHA-Harz erhalten.
Nachfolgend wurden die Aminosäuren (Sequenz von Nr. 35 bis 3) den Kupplungsreaktionen unterworfen, und das Peptid wurde mit MBzl-β-Mercaptopropionsäure bei der letzten Reaktionsstufe acyliert, und es wurde ein geschütztes Desalanyl-deamino-c-CGRP-MBHA-Harz erhalten.
Die in dem Verfahren verwendeten geschützten Aminogruppen sind: Aminosäure-Nr. geschützte Aminosäure eingesetzte Menge (mM)
Wenn bei der obigen Festphasen-Synthese Asn und Arg eingesetzt wurden, wurden DCC-Lösung (2 ml) und HOBt-Lösung (0,5 M-DMF-Lösung) (2 ml) zu den Aminosäuren (2 mM) in einem Gemisch von DMF-DCM (3:1) (4 ml) gegeben, 1 Minute lang umgesetzt und dann in gleicher Weise wie die anderen Aminosäuren behandelt. Das Gemisch wurde zum Durchführen der Kupplungsreaktion in ein Reaktionsgefäß übergeführt, mit DCM gewaschen und filtriert. Es wurden weitere DCC-Lösung (2 ml) und HOBt-Lösung (0,5 M-DMF-Lösung) (2 ml) zu den Aminosäuren (2 mM) in einem Gemisch von DMF-DCM (3:1) (4 ml) gegeben und 25 Minuten lang umgesetzt, und das Gemisch wurde zum Durchführen der Kupplungsreaktion nach dem sogenannten Zweifach-Kupplungsverfahren in ein Reaktionsgefäß überführt.

Claims

1. Verbindung der Formel (1):

wobei Y die Bedeutung Schwefel oder Methylen und A die Bedeutung Asn oder Asp hat, oder ein physiologisch verträgliches Salz davon.

2. Verbindung nach Anspruch 1 in Gestalt eines Peptids der Formel

oder eines physiologisch verträglichen Salzes davon.

3. Verbindung nach Anspruch 1 in Gestalt eines Peptids der Formel

oder eines physiologisch vertraglichen Salzes davon.

4. Verbindung nach Anspruch 1 in Gestalt eines Peptids der Formel

oder eines physiologisch verträglichen Salzes davon.

5. Verfahren zum Herstellen einer Verbindung der Formel (1) gemäß Definition in Anspruch 1, wobei Y die Bedeutung Schwefel hat oder eines physiologisch verträglichen Salzes davon, wobei man

(i) ein Peptid synthetisiert, welches eine Kettenstruktur der Formel Q&sub1;-S-(CH&sub2;)&sub2;-CO-A-Thr-Ala-Thr-Cys-Val-Thr-His-Arg- Leu-Ala-Asp-Phe-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Val-Gly- Lys-Asn-Asn-Phe-Val-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys- Ala-Phe-Q&sub2;

aufweist, wobei A die Bedeutung Asn oder Asp hat, Q&sub1; die Bedeutung Wasserstoff oder die einer mercaptoschützenden Gruppe hat und Q&sub2; wahlweise ist, jedoch - falls vorhanden - die Bedeutung -NH&sub2; hat oder zusammen mit der Carboxylgruppe von -Phe- eine geschützte Amidgruppe bedeutet, und wobei funktionelle Seitenkettengruppen wahlweise geschützt sind;

(ii) wenn Q eine mercaptoschützende Gruppe bedeutet und/oder wenn die Seitenketten-Mercaptogruppe von Cys geschützt ist, die oder jede dieser schützenden Gruppen entfernt;

(iii) die freien Mercaptogruppen zur Bildung einer Disulfidbrücke oxidiert;

(iv) alle wahlweise vorhandenen funktionellen gruppenschützenden Gruppen in Seitenketten entfernt und, wenn Q&sub2; nicht -NH&sub2; bedeutet, die terminalen Carboxygruppen von Phe in eine Amidgruppe umwandelt; und

(v) falls gewünscht, die entstehende Verbindung der Formel (1) in ein phyisologisch verträgliches Salz davon umwandelt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das in Schritt (i) eingesetzte Peptid mit Hilfe der Festphasensynthese hergestellt worden ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei man das in Schritt (i) eingesetzte Peptid mit Hilfe der Lösungsphasensynthese hergestellt worden ist.

8. Verfahren zum Herstellen einer Verbindung der Formel (1) gemäß Definition in Anspruch 1, wobei Y die Bedeutung Methylen hat, oder eines physiologisch verträglichen Salzes davon, wobei man

(i) entweder ein Peptid synthetisiert, welches eine Kettenstruktur der Formel

A-Thr-Ala-Thr-Asu-Val-Thr-His-Arg-Leu-Ala-Asp- Phe-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Val-Gly-Lys-Asn-Asn- Phe-Val-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-Q&sub2;

aufweist, wobei A und Q&sub2; die in Anspruch 5 definierte Bedeutung haben, und wabei Seitenkettengruppen wahlweise geschützt sind, oder einen Teil davon, der die Sequenz

A-Thr-Ala-Thr-Asu-

enthält;

(ii) die Sequenz A-Thr-Ala-Thr-Asu zur Bildung der Einheit

zyklisiert;

(iii) den Rest der Sequenz des Peptids der Formel (1) synthetisiert, wenn er nicht in Schritt (i) synthetisiert wurde;

9. Verfahren zum Herstellen einer Verbindung der Formel (1) gemäß Definition in Anspruch 1, wobei Y die Bedeutung Methylen hat, oder eines physiologisch verträglichen Salzes davon, wobei man

(i) einen Teil der Verbindung der Formel (1) synthetisiert, der die Struktur

aufweist, wobei A die in Anspruch 5 definierte Bedeutung hat und wobei die funktionellen Seitengruppenketten wahlweise geschützt sind;

(ii) den anderen Teil der Verbindung der Formel (1) synthetisiert und dabei wahlweise Schutzgruppen für funktionelle Seitenkettengruppen vorsieht;

(iii) die in Schritt (i) und (ii) synthetisierten Teile kondensiert;

(iv) alle wahlweise vorhandenen funktionellen gruppenschützenden Gruppen in Seitenketten entfernt und, wenn die carboxyterminale -Phe- Carboxylgruppe nicht in eine Amidgruppe umgewandelt worden ist, die Umwandlung bewirkt; und

10. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Verbindung der Formel (1) gemäß Definition in Anspruch 1 oder ein Physiologisch verträgliches Salz davon als Wirkung und ein(en) Pharmazeutisch verträglichen(es) Trägerstoff oder Verdünnungsmittel.