JPH0672157B2 - 新規ペプチド - Google Patents

新規ペプチド

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JPH0672157B2
JPH0672157B2 JP59180000A JP18000084A JPH0672157B2 JP H0672157 B2 JPH0672157 B2 JP H0672157B2 JP 59180000 A JP59180000 A JP 59180000A JP 18000084 A JP18000084 A JP 18000084A JP H0672157 B2 JPH0672157 B2 JP H0672157B2
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bzl
boc
tos
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俊平 ▲榊▼原
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Ajinomoto Co Inc
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、利尿剤、高血圧治療剤、心臓病治療剤、筋弛
緩剤等医薬として期待できる新規ペプチドに関する。
従来の技術 高血圧症の95％が本態性高血圧であり、その半分がNa感
受性高血圧である。この種の高血圧は、生体内Na容量調
節系によって制御されている可能性がある。このNa利尿
作用に関係する因子は、GFR（糸球体瀘過率）、アルデ
ストロン以外に未知の液性因子（第３因子）の存在が推
定されてきた。第３因子にはNa−KATPaseを阻害するも
のと阻害しないものがあり、これらの解明は本態性高血
圧の原因解明及び治療に画期的な新局面を開くものと期
待される。
1983年秋より第３因子の一個（Na−KATPase阻害能な
し）で、心房よりり分泌されるNa利尿ホルモンの構造決
定が次々に発表された。本物質は強力なNa利尿作用と筋
弛緩作用を有する。人心房より単離されたNa利尿ホルモ
ンの一種は、hANP（human atrial natriuretic peptide
の略称）と呼ばれ、次の構造式を有する。
発明が解決しようとする問題点 高血圧症の治療には、古くから降圧利尿剤が第一選択薬
剤として多用されてきた。しかるに近年、その心蔵疾患
に及ぼす副作用が明らかになり、見直しが求められてい
る。より安全性が高く、確実な作用を示す新しい薬剤の
開発が、臨床現場より強く求められている。
hANPは、内因性物質であり、また、ペプチドでもあり、
その安全性は極めて高いと推定される。しかるに、一方
ではペプチドであるが由に、ペプチターゼによる分解、
短い作用時間、不安定な物性等々そのまま薬剤として開
発するには多くの問題点もも考えられる。
本発明者らは新しい薬剤のリード化合物として期待され
るhANPに注目し、それらの新規関連化合物を合成し、よ
りすぐれたペプチド系循環器系薬剤の開発を試みた。
問題点を解決するための手段 本発明は、式 で表わされる新規ペプチドに関するものである。
本発明のペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ−体,D−体
のいずれであってもよい。
本発明のペプチドは、ナトリウム，カリウム，リチウ
ム，カルシウム等の金属塩，有機塩基による塩の形態で
あってもよい。有機塩基としては、アンモニア（アンモ
ニウム塩），ジシクロヘキシルアミン等のアミンや塩基
性アミノ酸、例えばリジン，アルギニンを採用すること
ができる。
また、本発明のペプチドは塩酸，硫酸，リン酸等の鉱
酸、あるいは酢酸，マレイン酸等の有機酸との塩の形態
であってもよい。
もちろん、本発明のペプチドを利尿剤等の医薬に使用す
るときは、遊離形または医薬的に許容し得る塩あるいは
保護基を有するものは無毒性が要求される。
本発明のペプチドは後述の実施例に基づき、さらにペプ
チド合成において常用されている方法や公知文献、例え
ば赤堀ら共編 タンパク質化学１アミノ酸・ペプチド，
共立出版（昭和44年）を利用して製造することができ
る。
後述の実施例からも明らかな如く、本発明のペプチドが
利尿剤，心臓病治療剤等循環器系薬剤としての使用が期
待できる。
本願明細書において使用される略称，略号の意義は次の
如くである。
1.アミノ酸残基について、 Phe:フェニルアラニン,Gly:グリシン,Arg:アルギニン,A
sp:アスパラギン酸,Ile:イソロイシン,Ala:アラニン,Gl
n:グルタミン,Ser:セリン,Leu:ロイシン,Met:メチオニ
ン,Met（Ｏ）：メチオニンオキシド,Nle:ノルロイシン,
Cys:システィン,Asu:α−アミノスベリン酸,Asn:アスパ
ラギン,Tyr:チロシン， シスチン 2.保護基について、 Boc:t−ブチルオキシカルボニル,4−CH3Bzl:p−メチル
ベンジル,Bzl:ベンジル,Tos:トシル,Cl2Bzl:2.6−ジク
ロルベンジル,ET:エチル,Me:メチル,Pac:フェナシル,S
u:スクシイミド 3.試薬について、 DMF:ジメチルホルムアミド,AcOEt:酢酸エチル,TFA:トリ
フルオロ酢酸,Et2O:エーテル,HOBt:1−ハイドロキシベ
ンゾトリアゾール,CH2Cl2:ジクロルメタン,WSCI:水溶性
カルボジイミド,Ca:カルシウム,AcOH:酢酸,HCl:塩化水
素または塩酸,TFE:トリフルオロエタノール,NaHCO3:重
曹,n−hexane:n−ヘキサン,TsOH:p−トルエンスルホン
酸,HF:フッ化水素,NaOH:水酸化ナトリウム,NEt3::トリ
エチルアミン,MgSO4:硫酸マグネシウム,MeOH:メタノー
ル,CHCl3:クロロホルム,Zn:亜鉛,NMP:N−メチル２−ピ
ロリドン,P2O5:五酸化リン,CH3CN:アセトニトリル,Na2S
O4:硫酸ナトリウム 以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
参考例１ hANP（５−27）の合成 Boc−Cys（MeBzl）AsnSer（Bzl）PheArg（Tos）−OBzl
の合成 （１） Boc−PheArg（Tos）−OBzlの合成： Boc−Phe−OH4g（15mmol）、Ｈ−Arg−OBzl・TosOH8.9g
（15mmol）、HOBt2.1g（15.75mmol）をDMF25mlに溶解冷
却下WSCI2.9ml（15.75mmol）を滴下し（pH＝４）一夜撹
拌した。反応液にAcOEt300mlを加え、1NHCl、水、５％N
aHCO3、水の順に洗い、Na2SO4で乾燥した。AcOEtを減圧
溜去後酢酸エチル、エーテル、ｎ−ヘキサンで油状物と
し、デカント後酢酸エチル、ヘキサンから粉末とし、目
的物6.89g（69％）を得た。
（２） Boc−Ser（Bzl）PheArg（Tos）−OBzlの合成： Boc−PheArg（Tos）−OBzl6.79g（10.2mmol）をTFA20ml
で冷却下10分間、室温で20分処理後TFAを減圧溜去し残
渣にエーテルを加えて析出した粉末を濾取しNaOH上２時
間減圧乾燥した。DMF25mlに溶解し冷却下NEt31mlを加
え、ついでBoc−Ser（Bzl）−OSu4.2g（0.7mmol）を加
え反応した。2.5時間後NEt30.4ml［全量1.4ml（10.2mmo
l）］を加え、更に少量のNEt3を加えつつ40時間撹拌し
た。
AcOEt250mlを加え1NHCl、水、５％NaHCO3、水で洗いMgS
O4で乾燥した。AcOEtを溜去しAcOEt/エーテル、ｎ−ヘ
キサンでのデカントを繰り返した後同様の系から粉末と
し、目的物7.7g（89.5％）を得た。
（３） Boc−AsnSer（Bzl）PheArg（Tos）−OBzlの合
成： Boc−Ser（Bzl）PheArg（Tos）−OBzl7.6g（9mmol）をT
FA25mlで冷却下10分間、室温で30分間処理し、6.9NHCl/
ジオキサン1.6ml（10.8mmol）を加えた後溶媒を減圧溜
去し残渣にエーテルを加えて粉末とし濾取後NaOH上３時
間減圧乾燥した。Boc−Asn2.3g（9.9mmol）、HOBt1.4g
（9.9mmol）と共にDMF25mlに溶解冷却下WSCI 1.8ml
（9.9mmol）を滴下し（pH＝4.5）、一夜撹拌した。酢酸
エチル200mlを加え1N HCl、水、５％NaHCO3、水で洗いM
gSO4で乾燥した。酢酸エチルを溜去後酢酸エチル、メタ
ノール／エーテルから２回粉末とし目的物7.3g（84.9
％）を得た。
（４） Boc−Cys（４−MeBzl）AsnSer（Bzl）PheArg
（Tos）−OBzlの合成 Boc−AsnSer（Bzl）PheArg（Tos）−OBzl3.8g（4mmol）
をTFA25mlで冷却下10分間室温で25分間処理し、6.9N HC
l/ジオキサン0.7ml（4.8mmol）を加えた後溶媒を溜去
し、残渣にEt2Oを加え粉末とし、濾取後、NaOH上3.5時
間乾燥した。
Boc−Cys（４−MeBzl）−OH 1.43g（4.4mmol）,HOBt59
5mg（4.4mmol）と共にDMF15mlに溶解し、冷却下WSCI
0.81ml（4.4mmol）を滴下し（pH＝4.5）一夜撹拌した。
酢酸エチル150mlを加え、1N HCl,水,5％NaHCO3,水で洗
い、トルエンフラッシュで脱水後CHCl3,メタノール／エ
ーテルから２回粉末とし目的物4.21g（90.3％）を得
た。
6N塩酸分解によるアミノ酸分析（108℃,22時間，フェノ
ール存在下） 元素分析： C57H73O12N9S2・1/2H2Oとしての 計算値 C60.39％,H6.36％ N10.74％ 分析値 C60.47％,H6.37％ N10.76％ ［Boc−AlaGlnSer（Bzl）GlyLeuGly−OH合成］ （５） Boc−Ser（Bzl）−Gly−OHの合成： Boc−Ser（Bzl）−OH 14.8g（50mmol） Ｈ−Gly−CEt・HCl8.4g（60mmol）をCH2Cl2100mlに懸濁
し、冷却下WSCI10ml（55mmol）を滴下し（pH＝７）、一
夜撹拌した。
CH2Cl2を減圧溜去し、エーテル（300ml）と水（50ml）
に溶解し、1N HCl,水,5％NaHCO3,水で洗いそのままエー
テルを溜去した。得られた油状物をMeOH50mlにとかし、
０〜１゜に冷却下1N NaOH50ml（50mmol）を滴下し、即
冷媒をはずし60分間撹拌した。
再冷却下6N HClでpH＝７としメタノールを溜去後、残渣
をNaHCO3水に溶解しエーテルで２回洗浄し、水層を6N H
ClでpH＝２とし酢酸エチル250mlで抽出後水で洗い無水
硫酸ナトリウムで乾燥した。酢酸エチルを減圧溜去し、
油状物として目的物を定量的に得た。
（６） Boc−Ser（Bzl）GlyLeuGly−OPacの合成： Boc−LeuGly−OPac 16.3g（40mmol）をTFA40mlで冷却
下10分間室温で30分間処理し、3.5N HClジオキサン13.7
ml（48mmol）を加えた後溶媒を溜去し、残渣にエーテル
−ｎ−ヘキサンを加え油状物とし、デカント後エーテル
−ｎ−ヘキサンで粉末とし、濾取後水酸化ナトリウム上
3.5時間乾燥した。Boc−Ser（Bzl）Gly−OH（上で得た
油状物全量）、HOBt5.9g（44mmol）と共にDMF60mlに溶
解冷却下WSCI8ml（44mmol）を滴下し（pH＝４）一夜撹
拌した。酢酸エチル400mlを加え1NHCl、水、５％NaHCO3
水、水で洗い無水硫酸ナトリウムで乾燥後AcOEtを溜去
し、AcOEt/Et2Oから２回ゲル状粉末とし目的物19.3g（7
5.4％）を得た。
6N塩酸分解物のアミノ酸分析 （７） Boc−GlnSer（Bzl）GlyLeuGly−OPacの合成： Boc−Ser（Bzl）GlyLeuGly−OPac19.2g（30mmol）をTFA
50mlで冷却下10分間、室温で40分間処理し、3.5N NClジ
オキサン10.3ml（36mmol）を加えた後溶媒を溜去し、残
渣にエーテル−ｎ−ヘキサンを加え粉末とし濾取後NaOH
上３時間乾燥した。Boc−Gln−OH8.1g（33mmol）、HOBt
4.7g（34.5mmol）と共にDMF50mlに溶解し、冷却下WSCI
6.3ml（34.5mmol）を滴下し（pH＝４）一夜撹拌する
と固化した。
冷却下水を加え粉末化後濾取し、水、ｎ−ヘキサン エ
ーテルで洗った。得られた粉末を加温クロロホルム−メ
タノールに溶解後トルエンフラッシュで脱水し、クロロ
ホルム−メタノール懸濁物／エーテルで２回加温し目的
物22.3g（96.5％）を得た。
（８） Boc−AlaGlnSer（Bzl）GlyLeuGly−OPacの合
成： Boc−GlnSer（Bzl）GlyLeuGly−OPac11.5g（15mmol）を
TFA30mlで冷却下10分間、室温で45分間処理し、6.9N HC
lジオキサン2.6ml（18mmol）を加えた後溶媒を溜去し、
残渣にエーテルを加えて粉末とし、濾取後水酸化ナトリ
ウム上３時間乾燥した。Boc−Ala3.1g（16.5mmol）、HO
Bt2.2g（16.5mmol）と共にDMF30mlに溶解し、冷却下WSC
I3ml（16.5mmol）を滴下し（pH＝５）反応した。約３分
後全体がゲル化し、DMF30mlを追加し一夜撹拌した。
冷却下水を加え粉末化し濾取後、水、ｎ−ヘキサン、エ
ーテルで洗い、CHCl3とメタノールに溶かし、トルエン
フラッシュで脱水後、CHCl3−メタノール／エーテルで
２回加温して精製し目的物11.65g（92.5％）を得た。
6NHCl分解物のアミノ酸分析 元素分析 C41H57O12N7・1/2H2Oとしての 計算値 C58.01％ H6.89％ N11.55％ 分析値 C58.14％ H6.92％ N11.57％ （９） Boc−AlaGlnSer（Bzl）GlyLeuGly−OHの合成： Boc−AlaGlnSer（Bzl）GlyLeuGly−OPac 10.9g（13mmo
l）を酢酸100mlに加温下溶解し、放冷後亜鉛粉末17gを
加え43℃の湯浴上50分撹拌した。亜鉛粉末を濾去後酢酸
を溜去し残渣に水を加え粉末化し濾取後水で洗った（粉
末Ａ）。母液にｎ−ヘキサンを加えると再び粉末が析出
し、濾取後エーテルで洗つた（粉末Ｂ）。粉末Ａと粉末
Ｂを合わせ加温メタノールに溶解しトルエンフラッシュ
で脱水後加温メタノール／エーテルから再沈澱し、目的
物8.93g（95％）を得た。
6NHCl分解物のアミノ酸分析 元素分析 C33H51O11N7・0.3H2Oとしての 計算値 C54.50％ H7.15％ N13.48％ 分析値 C54.45％ H7.18％ N13.36％ （10） Boc−AlaGlnSer（Bzl）GlyLeuGly Cys（4MeBz
l）AsnSer（Bzl）PheArg（Tos）−OBzlの合成： Boc−Cys（4MeBzl）AsnSer（Bzl）PheArg（Tos）−OBzl
1.63g（1.4mmol）をTFA5mlで冷却下10分、室温で50分
処理し、3.5NHCl/ジオキサン0.48ml（1.68mmol）を加え
た後溶媒を溜去し、残渣にエーテルを加え粉末として濾
取後NaOH上３時間乾燥した。
Boc−AlaGInSer（Bzl）GlyLeuGly−OH1.06g（1.47mmo
l）、HOBt208mg（1.54mmol）と共にDMF30mlに溶解し、
冷却下WSCI 0.28ml（1.54mmol）を加え（pH＝4.5）一
夜撹拌すると固化した。冷却下水を加え粉末化し濾取後
水、５％NaHCO3、水、ｎ−ヘキサン、エーテルの順に洗
いP2O5上乾燥した。加温DMF250mlに溶解しゴミ濾別後DM
Fを溜去し、加温DMF/メタノールから再沈澱し、目的物
2.33g（94％）を得た。
6NHCl分解物のアミノ酸分析 元素分析 C87H114O20N16S2としての 計算値 C59.10％ H6.50％ N12.68％ 分析値 C58.92％ H6.60％ N12.55％ （11） Boc−IleGly−OEt: Gly−OEt・HCl 9.77g（70.0mmol）、Boc−Ile・1/2H2O
17.7g（73.5mmol、予め、CHCl3、トルエンに溶解し、
濃縮し、脱水。）及びHOBt9.93g（73.5mmol）をDMF70ml
に溶解し、冷却撹拌下にWSCI 13.5ml（73.5mmol）を滴
下した。翌日、フルオロレスカミンテストで（−）を確
認した。反応液に水を注ぎ、遊離した油状物を酢酸エチ
ルで抽出した。酢酸エチル層を、５％NaHCO3水、1NHC
l、NaCl水で、順次洗浄しMgSO4で乾燥した。酢酸エチル
を溜去し、結晶性残渣を、酢酸エチル/n−ヘキサンより
再結晶し、17.5g（79％）得た。
（12） Boc−IleGly−OH: Boc−IleGly−OEt 17.4g（55.5mmol）をメタノール60m
lに溶かし、冷却撹拌下に、2N NaOH33ml（66.6mmol）を
滴下した。冷却浴をはずし、約15℃で１時間撹拌した。
6NHClで中和し、メタノールを溜去した。pH〜２に調整
し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を水洗し、Mg
SO4で乾燥した。酢酸エチル溜去し、油状残渣を酢酸エ
チル/n−ヘキサンより結晶化し、15.5g（98％）得た。
（13） Boc−IleGly−OPac Boc−IleGly−OH 15.3g（53.1mmol）、Pac−Br 10.8g
（54.2mmol）をDMF50mlに溶かし、冷却下にEt3N 7.4ml
（54.2mmol）滴下した。４時間後反応液に水を注ぎ酢酸
エチル抽出した。酢酸エチル層を1NHCl、水、５％NaHCO
3水、水で順次洗浄した。MgSO4で乾燥し、酢酸エチルを
溜去し、メタノール／エーテルより再結晶した。収量:1
6.0g。
母液を濃縮し、酢酸エチル/n−ヘキサンより再結晶し
て、5.4g得た。両者あわせて、21.4g（99％）得た。
（14） Boc−Arg（Tos）IleGly−OPac Boc−IleGly−OPac 14.3g（35.18mmol）をCF3CO2H80ml
で冷却下10分、室温で50分処理した。3.5N HCl/ジオキ
サン12.1ml（42.2mmol）を添加し、過剰の酸を溜去し
た。エーテル、ｎ−ヘキサンを加え結晶化し、NaOH上乾
燥した。この結晶および、Boc−Arg（Tos）15.9g（36.9
mmol）,HOBt5.0g（36.9mmol）をDMF50mlに溶解し、冷却
撹拌下にWSCI 6.76ml（36.9mmol）を滴下した。Et3Nを
加え、PH５に調整した。翌日、Boc−Arg（Tos）1.50
g、HOBt0.48gおよびWSCI0.66ml（各0.1eq）を追加し
た。更に翌日、フルオロレスカミンテストで（−）を確
認した。反応液を水に注ぎ、遊離した油状物を酢酸エチ
ルで抽出した。酢酸エチル層を、５％NaHCO3水、1NHC
l、水で順次洗浄した。ゲル状物が析出しはじめたの
で、酢酸エチルを溜去した。エーテル、ｎ−ヘキサンを
加え濾取、乾燥した。
メタノール／エーテルより再結晶し、22.0g（87％）得
た。
（15） Boc−Asp（OBzl）Arg（Tos）IleGly−OPac Boc−Arg（Tos）IleGly−OPac21.8g（30.4mmol）をCF3C
O2H90mlで冷却下10分、室温下で50分、処理した。6.9NH
Cl/ジオキサン5.3ml（36.48mmol）を添加し、過剰の酸
を溜去した。エーテルを加え粉末とし、NaOH上乾燥し
た。上記粉末およびBoc−Asp（OBzl）10.3g（31.9mmo
l）,HOBt4.31g（31.9mmol）をDMF60mlに溶解し、冷却撹
拌下にWSCI5.84ml（31.9mmol）滴下した。Et3Nを加え、
PH4〜５に調整した。翌日、Boc−Asp（OBzl）0.30g、HO
Bt0.15gおよびWSCI 0.28ml（0.05eq）追加した２時間
後、フルオロレスカミンテストで（−）を確認した。水
を注ぎ、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を５％Na
HCO3水、水および飽和NaCl水で順次洗浄し、MgSO4で乾
燥した。酢酸エチルを溜去し、固体残渣を、メタノール
／エーテルより再結晶して27.6g（98％）得た。
（16） Boc−MetAsp（OBzl）Arg（Tos）IleGly−OPac Boc−Asp（OBzl）Arg（Tos）IleGly−OPac 27.5g（29.
8mmol）をCF3CO2H110mlで冷却10分、室温50分、処理し
た。6.9NHCl/ジオキサン5.2ml（35.8mmol）を添加し、
過剰の酸を溜去した。エーテルを加え、粉末とし、NaOH
上乾燥した。上記のうち、25.0mmolに相当する粉末およ
び、Boc−Met6.54g（26.3mmol）,HOBt3.55g（26.3mmo
l）をDMF40mlに溶解し、冷却撹拌下に、WSCI 4.80ml
（26.3mmol）を滴下した。pH５。翌日、フルオロレス
カミンテストで（−）を確認した。反応液に水、酢酸エ
チルを注ぎ、析出したゲル状物濾取。エーテル洗浄、メ
タノール／エーテルより再沈澱し、25.0g（95％）得
た。
（17） Boc−Arg（Tos）MetAsp（OBzl）Arg（Tos）Ile
Gly−OPac Boc−MetAsp（OBzl）Arg（Tos）IleGly−OPac 24.5g
（23.3mmol）をCF3CO2H100mlで、冷却10分、室温50分、
処理した。6.9NHCl/ジオキサン4.1ml（28mmol）添加
し、過剰の酸を溜去した。エーテルを加え粉末とし、濾
取。NaOH上乾燥した。上記粉末および、Boc−Arg（To
s）11.0g（25.6mmol）、HOBt3.5g（25.6mmol）をDMF60m
lに溶解し、冷却撹拌下に、WSCI 4.69ml（25.6mmol）
を滴下した。pH５。翌日、フルオロレスカミンテスト
で（−）を確認した。水を加え、析出した固体を濾取。
水洗後、エーテル洗浄した。クロロホルム−メタノール
／エーテルより再沈澱し、29.8g（94％）得た。
（18） Boc−Arg（Tos）MetAsp（OBzl）Arg（Tos）Ile
Gly−OH Boc−Arg（Tos）MetAsp（OBzl）Arg（Tos）IleGly−OPa
c 13.6g（10.0mmol）を、酢酸50mlに溶解し、亜鉛粉末
14gを加え、47〜48℃に加温した。１時間で反応完了。
触媒を濾去し酢酸溜去した。水を加え析出した固体を濾
取し、水洗後エーテル洗浄した。クロロホルム−メタノ
ール／エーテルより再沈澱を２回繰り返して、11.9g（9
6％）得た。
（19） Boc−Arg（Tos）MetAsp（OBzl）Arg（Tos）Ile
GlyAlaGlnSer（Bzl）GlyLeuGlyCys（４−MeBzl）AsnSer
（Bzl）PheArg（Tos）−OBzl: 上記調製（10）のペプチド2.2g（1.25mmol）をTFA10ml
で冷却下10分、室温で45分処理し、3.5NHCl/ジオキサン
0.43ml（1.5mmol）を加えた後溶媒を溜去し残渣にエー
テルを加え粉末とし濾取後NaOH上一夜乾燥した。
Boc−Arg（Tos）MetAsp（Bzl）Arg（Tos）IleGly−OH
1.6g（1.29mmol）、HOBt177mg（1.31mmol）と共にDMF15
mlとNMP10mlの混合溶媒に溶かし、冷却下WSCI 0.24ml
（1.31mmol）を加え反応した。３時間後全体が寒天化
し、NMP10mlを追加し一夜撹拌するとフルオレスカミン
テストで（−）となった。冷却下水を加え粉末化し、濾
取後、水、ｎ−ヘキサンおよびエーテルで洗いP2O5上乾
燥した。加温DMF全量300mlに繰り返し溶解しゴミ濾別後
DMFを溜去し、加温DMF/メタノールから粉末とし目的物
3.3g（91.2％）を得た。
（20） Boc−GlyGly−OPac Boc−GlyGly−OH 9.28g（40mmol）とフェナシルブロミ
ド8.76g（44mmol）をDMF40mlに溶解し、冷却下Et3N6.16
ml（44mmol）を加えた。５時間後反応液に水を加え、析
出した沈澱を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチルをＮ−
HCl、５％NaHCO3、および水で順次洗浄した後MgSO4で乾
燥した。酢酸エチルを溜去し残渣を酢酸エチル−ｎ−ヘ
キサンで再結晶した。収量13.0g（92.9％）。
（21） Boc−PheGlyGly−OPac Boc−GlyGly−OPac 12.6g（36mmol）にTFA50mlを加え4
5分かきまぜた。TFAを溜去した後残渣に6.9N HCl/ジオ
キサン7.8ml（54mmol）を加えよくかきまぜた。エーテ
ルを加え析出した沈澱を濾取乾燥後、沈澱をDMF80mlに
懸濁し−15℃冷却下HOBt5.35g（39.6mmol）、Boc−Phe
−OH 10.5g（39.6mmol）、WSCI 7.25ml（39.6mmol）
を加えた。16時間かきまぜた後反応液に水を加え、析出
した沈澱を濾取後メタノールで再結晶した。収量15.3g
（85.5％）。
（22） Boc−Cys（4CH3Bzl）PheGlyGly−OPac Boc−PheGlyGly−OPac 12.4g（25mmol）にTFA50mlを加
え50分かきまぜた。TFAを溜去し残渣に3.5N HCl/ジオ
キサン10.6ml（37mmol）を加えよくかきまぜた後エーテ
ルを加えた。析出した沈澱を濾取乾燥後、沈澱をDMF40m
lに溶解し−15℃冷却下HOBt3.78g（28mmol）、Boc−Cys
（4CH3Bzl）−OH9.1g（28mmol）、WSCI 5.1ml（28mmo
l）を加えた。16時間かきまぜた後反応液に水を加え、
析出した沈澱を濾取後メタノールで２回再結晶した。収
量14.1g（80.1％）。
6NHClによる加水分解物の分析 元素分析 計算値 C56.30％ H6.45％ N13.42％ 分析値 C56.27％ H6.48％ N13.40％ （23） Boc−Ser（Bzl）Cys（４−MeBzl）PheGlyGly−
OPac Boc−Cys（４−MeBzl）PheGlyGly−OPac 12g（17mmo
l）にTFA50mlを加え50分かきまぜた。TFAを溜去し残渣
に3.5N HCl/ジオキサン7.3ml（25.5mmol）を加えよく
かきまぜたのちエーテルを加えた。析出した沈澱を濾取
し乾燥後、沈澱をDMF50mlに溶かし−15℃冷却下HOBt2.7
g（20mmol）Boc−Ser（Bzl）−OH5.9g（20mmol）、WSCI
37ml（20mmol）を加えた。16時間かきまぜたのち反応
液に水を加え析出した沈澱を濾取した。沈澱をメタノー
ルで２回再結晶した。収量12.1g（80.7％）。
（24） Boc−Ser（Bzl）Ser（Bzl）Cys（４−MeBzl）P
heGlyGly−OPac Boc−Ser（Bzl）Cys（４−MeBzl）PheGlyGly−OPac 10
g（11.3mmol）にTFA40mlを加え50分かきまぜた。TFAを
溜去し残渣に3.5NHCl/ジオキサン4.8ml（17mmol）を加
えよくかきまぜたのちエーテルを加えた。析出した沈澱
を濾取し乾燥後、沈澱をDMF30mlに溶かし−15℃冷却下H
OBt1.69g（12.5mmol）、Boc−Ser（Bzl）−OH3.7g（12.
5mmol）、WSCI 2.3ml（12.5mmol）を加えた。16時間か
きまぜたのち反応液に水を加え、析出した沈澱を濾取後
メタノールで２回再結晶した。収量11.0g（91.7％）。
（25） Boc−Ser（Bzl）Ser（Bzl）Cys（４−MeBzl）P
heGlyGly−OH Boc−Ser（Bzl）Ser（Bzl）Cys（４−MeBzl）PheGlyGly
−OPac 8.25g（7.8mmol）を酢酸200mlに溶かし亜鉛粉
末15gを加え45℃で１時間かきまぜた。亜鉛を濾去した
のち、酢酸を濃縮し残渣に水を加えた。析出した沈澱を
濾取乾燥後クロロホルム／エーテルで再沈澱した。収量
7.0g（95.5％）。
アミノ酸分析（6NHCl 加水分解） （26） Boc−Ser（Bzl）Ser（Bzl）Cys（４−MeBzl）P
heGlyGlyArg（Tos）MetAsp（OBzl）Arg（Tos）IleGlyAl
aGlnSer（Bzl）GlyLeuGlyCys（４−MeBzl）AsnSer（Bz
l）PheArg（Tos）−OBzl: Boc−Arg（Tos）MetAsp（OBzl）Arg（Tos）IleGlyAlaGl
nSer（Bzl）GlyLeuGlyCys（４−MeBzl）AsnSer（Bzl）P
heArg（Tos）−OBzl 2.17g（0.75mmol）をTFA10mlで冷
却下10分、室温で50分処理し、3.5NHCl/ジオキサン0.26
ml（0.9mmol）を加えた後溶媒を溜去し、残渣にエーテ
ルを加えて粉末とし濾取後NaOH上一夜乾燥した。Boc−S
er（Bzl）Ser（Bzl）Cys（４−MeBzl）PheGlyGly−OH
741mg（0.788mmol）、HOBt111mg（0.825mmol）と共にNM
P30mlに溶かし、冷却下WSCI 150μ（0.825mmol）を
加え（pH＝５）反応した。２時間後全体が寒天化し、NM
P10mlを加えて一夜撹拌した。冷却下水を加え粉末化
後、濾取し、順次水、ｎ−ヘキサンおよびエーテルで洗
いP2O5上乾燥した。加温NMP140ml＋DMF500mlに繰り返し
溶解し、ゴミ濾別後DMFを溜去し、NMP溶液にメタノール
を加えゲル状粉末とし、濾取後メタノールで洗い目的物
2.2g（80.5％）を得た。
6NHClによる加水分解物のアミノ酸分析 元素分析 C181H234O40N34S6・7H2Oとしての 計算値 C56.55％ H6.50％ N12.39％ 分析値 C56.30％ H6.46％ N12.69％ （27）hANP（５−27）の合成 保護ペプチド483mg（26）（0.13mmol）をTFA5mlで冷却
下10分室温で50分処理し、3.5NHCl/ジオキサン0.1mlを
加えた後溶媒を溜去し残渣にエーテルを加え粉末とし、
NaOH上一夜乾燥した。この粉末をアニソール1.25ml存在
下 HF7mlで−１〜０℃60分処理し、過剰のHFを溜去
後、約50％酢酸に溶解しエーテルで３回洗浄し、水層を
「Dow １×２」（AcO-、約50ml）のカラムに吸着し、
５％酢酸で溶出し粗粉末（還元体）を得た。このものを
13mlの1N酢酸＋尿素に溶解し、60mg（0.18mmol）のK3Fe
（CN）６を含む1MNH4OAc/8M尿素（pH7.4）117ml中に32
分で滴下した（途中10％NH4OHでpH＝7.4に保った。）滴
下終了30後酢酸でpH＝4.75とし、「IRA−45」（Cl-、10
ml）を加え、ついで「IRA−45」（Cl-、50ml）のカラム
に吸着させIN酢酸で溶出した。「HP−20」（約100ml）
のカラムにフィードし、１％酢酸で洗浄後CH3CN/H2O/酢
酸（8/1/1）で溶離後濃縮し１％酢酸から凍結乾燥して
粗粉末（酸化体）を285mg得た。このもの229mgを用い、
0.05M（pH4.7）→0.5M（pH4.8）NH4OAcで溶出する「CM
−Ｃ」により精製後、０→23％CH3CN/5％酢酸で溶出す
る「HP−20」により精製した。「HP−20」の主画分49mg
をTFA3mlに溶解し、冷却下NH4I水溶液（40mg/1ml水）20
μ（5.52μmol）を加え氷溶上10分撹拌した。ドライ
アイス／冷媒で冷やしながら水とCCl4を加え、ゆっくり
撹拌後シェーカーに移すと徐々にゲルが析出してきた。
そのままCCl4洗いを続け、ゲルが析出するまま「HP−2
0」（約20ml）に導き脱塩（５％酢酸溶出）後、CH3CN/H
2O/AcOH（8/1/1）で溶出し濃縮後、５％酢酸に溶解し
「Dow1×２」（AcO-、約25ml）素通り（５％酢酸溶出）
後凍結乾燥した。このものを2N酢酸で溶出する「セファ
デックスLH−20」で精製し目的物30mgを得た。
6NHClによる加水分解物のアミノ酸分析 元素分析 C97H154O32N34S3・3AcOH・15H2Oとしての 計算値 C43.33％ H6.92％ N16.68％ 分析値 C43.31％ H6.73％ N16.49％ 参考例２ hANP（５−28）の合成 （28） Boc−Cys（４−MeBzl）AsnSer（Bzl）PheArg
（Tos）Tyr（Cl2Bzl）−OBzlの合成 Boc−Arg（Tos）Tyr（Cl2Bzl）−OBzl: Boc−Arg（Tos）−OH 2.97g（6.93mmol）、Ｈ−Tyr（C
l2Bzl）−OBzl・HCl2.95g（6.3mmol）,HOBt936mg（6.93
mmol）をCH2Cl225ml＋DMF10mlに懸濁し、冷却下WSCI1.3
ml（6.93mmol）を滴下し（pH＝４）反応し。約40分均一
溶液となり一夜撹拌した。TLC分析によりアミノ成分が
残存していたので、Boc−Arg（Tos）−OH 270mg（0.63
mmol）とWSCI 115ml（0.63mmol）を追加し３時間撹拌
した。CH2Cl2を溜去後、酢酸エチル150mlを加え1NHCl、
水、５％NaHCO3、水で洗いNa2SO4で乾燥した。酢酸エチ
ルを溜去後、酢酸エチル／エーテル、ｎ−ヘキサンでデ
カントを２回し、同様の系から粉末として目的物5.2g
（98.1％）を得た。
（29） Boc−PheArg（Tos）Tyr（Cl2Bzl）−OBzl: Boc−Arg（Tos）Tyr（Cl2Bzl）−OBzl 5.1g（6.07mmo
l）をTFA15mlで冷却下10分、室内で35分処理し、6.9NHC
l/ジオキサン1.1ml（7.28mmol）を加えた後溶媒を溜去
し残渣にエーテルを加え粉末とし、濾取後NaOH上で３時
間減圧乾燥した。Boc−Phe−OH 1.7g（6.37mmol）、HO
Bt902mg（6.68mmol）と共にDMF20mlに溶解し、冷却下WS
CI 1.22ml（6.68mmol）を滴下し（pH＝4.5）一夜撹拌
した。酢酸エチル150mlを加え、1NHCl、水、５％NaHC
O3、水で洗い、MgSO4で乾燥後、酢酸エチルを溜去し、
酢酸エチル／エーテル、ｎ−ヘキサンから２回粉末と
し、目的物5.56g（92.7％）を得た。
（30） Boc−Ser（Bzl）PheArg（Tos）Tyr（Cl2Bzl）
−OBzl: Boc−PheArg（Tos）Tyr（Cl2Bzl）−OBzl5.46g（5.53mm
ol）をTFA15mlで冷却下10分、室温で35分処理し、6.9NH
Cl/ジオキサン0.96ml（6.64mmol）を加えた後溶媒を溜
去し残渣にエーテルを加え粉末とし、濾取後NaOH上２時
間乾燥した。Boc−Ser（Bzl）−OH1.8g（6.08mmol）、H
OBt822mg（6.08mmol）と共にDMF18mlに溶解し、冷却下W
SCI 1.1ml（6.08mmol）を滴下し（pH＝4.5）一夜撹拌
した。酢酸エチル150mlを加え、1NHCl、水、５％NaHC
O3、水で洗いNa2SO4で乾燥した。酢酸エチルを溜去後、
酢酸エチル／エーテルで油状物とし、一夜放置すると結
晶化した。同様にして再結晶し目的物5.47g（85.5％）
を得た。
（31） Boc−AsnSer（Bzl）PheArg（Tos）Tyr（Cl2Bz
l）−OBzl: Boc−Ser（Bzl）PheArg（Tos）Tyr（Cl2Bzl）−OBzl
5.4g（4.63mmol）をTFA15mlで冷却下10分、室温で40分
処理し、3.5NHCl/ジオキサン1.6ml（5.56mmol）を加え
た後溶媒を溜去し、残渣にエーテルを加え粉末とし、濾
取後NaOH上５時間乾燥した。Boc−Asn−OH1.2g（5.09mm
ol）、HOBt688mg（5.09mmol）と共にDMF20mlに溶解し、
冷却下WSCI 0.93ml（5.09mmol）を滴下し一夜撹拌し
た。酢酸エチル250mlを加え1NHCl、水、５％NaHCO3、水
で洗い、トルエンフラッシュで脱水後クロロホルム＋メ
タノール／エーテルから２回粉末とし、目的物5.38g（9
0.9％）を得た。
6NHClによる加水分解のアミノ酸分析 元素分析 C64H73O13N9SCl2としての 計算値 C60.09％ H5.75％ N9.85％ 分析値 C60.00％ H5.74％ N9.83％ （32） Boc−Cys（4MeBzl）AsnSer（Bzl）PheArg（To
s）Tyr（Cl2Bzl）−OBzl: Boc−AsnSer（Bzl）PheArg（Tos）Tyr（Cl2Bzl）−OBzl
5.3g（4.14mmol）をTFA20mlで冷却下10分、室温で40
分処理し、3.5NCl/ジオキサン1.42ml（5mmol）を加えた
後溶媒を溜去し、残渣にエーテルを加え粉末とし、濾取
後NaOH上2.5時間乾燥した。Boc−Cys（4MeBzl）−OH1.4
8g（4.55mmol）HOBt615mg（4.55mmol）と共にDMF20mlに
溶解し、冷却下WSCI 0.83ml（4.55mmol）を滴下し（pH
＝５）一夜撹拌した。酢酸エチル200mlを加え水で洗う
とゲルが、析出したが、そのまま1NHCl、水、５％NaHCO
3、水で洗い、トルエンフラッシュで脱水後クロロホル
ム＋メタノール／エーテルから２回粉末化し、目的物5.
87g（95.4％）を得た。
6NHCl加水分解物のアミノ酸分析 元素分析 C75H86O14N10S2Cl2としての 計算値 C60.60％ H5.83％ N9.42％ 分析値 C60.55％ H5.83％ N9.38％ （33）保護されたhANP（５−28）の合成 Boc−AlaGlnSer（Bzl）GlyLeuGlyCys（4MeBzl）AsnSer
（Bzl）PheArg（Tos）Tyr（Cl2Bzl）−OBzl: Boc−Cys（4MeBzl）AsnSer（Bzl）PheArg（Tos）Tyr（C
l2Bzl）−OBzl 5.87g（3.95mmol）をTFA20mlで冷却下1
0分、室温で35分処理し、3.5NHCl/ジオキサン1.35ml
（4.74mmol）を加えた後溶媒を溜去し、残渣にエーテル
を加えて粉末とし、濾取後、NaOH上4.5時間乾燥した。
カルボン酸成分3g（4.15mmol）HOBt587mg（4.35mmol）
と共にDMF70mlに溶解し冷却下WSCI 0.8ml（4.35mmol）
を滴下し（pH＝4.5）反応した。30分後寒天化し、３時
間後再び均一溶液となり、そのまま一夜撹拌するとフル
オロレスカミンテスト陰性となった（少々ゲル析出）。
稀NaHCO3水溶液中に注ぎ粉末とし、濾取後、水、ｎ−ヘ
キサン、エーテルで洗いP2O5上乾燥した。加温DMF全量4
00mlに繰り返し溶解し、ゴミ濾別後DMFを溜去し、加温D
MF/メタノールからゲル状粉末とし、目的物7.76g（93.9
％）を得た。
6NHCl加水分解物のアミノ酸分析 元素分析 C103H127O22N17S2Cl2としての 計算値 C59.18％ H6.12％ N11.39％ 分析値 C58.94％ H6.22％ N11.25％ （34） Boc−Arg（Tos）MetAsp（OBzl）Arg（Tos）Ile
GlyAlaGlnSer（Bzl）GlyLeuGlyCys（4MeBzl）AsnSer（B
zl）PheArg（Tos）Tyr（Cl2Bzl）−OBzl: 上記調製されたペプチド5.8g（2.77mmol）をTFA20mlで
冷却下10分、室温で55分処理し、3.5NHCl/ジオキサン0.
95ml（3.32mmol）を加えた後溶媒を溜去し残渣にエーテ
ルを加え粉末とし、濾取後NaOH上一夜乾燥した。カルボ
ン酸成分3.6g（2.91mmol）およびHOBt412mg（3.05mmo
l）と共にNMP40mlとDMF25ml混合溶媒に溶解し−８℃に
冷却下WSCI 0.56ml（3.05mmol）を滴下し反応した。２
時間後寒天化し、5.5時間後NMP15mlを追加し一夜撹拌す
ると均一溶液となり、又フルオロレスカミンテスト陰性
となった。氷冷水中に注ぎ粉末とし、濾取後、水、ｎ−
ヘキサン、エーテルで洗いP2O5上乾燥した。加温DMF全
量400mlに繰り返し溶解し、ゴミ濾別後DMFを溜去し、DM
F/メタノールからゲル状粉末とし目的物8.71g（97.9
％）を得た。
6NHCl加水分解物のアミノ酸分析 元素分析 C153H197O34N29S5Cl22.5H2Oとしての 計算値 C56.32％ H6.24％ N12.50％ 分析値 C56.30％ H6.36％ N12.69％ （35） Boc−Ser（Bzl）Ser（Bzl）Cys（4MeBzl）PheG
lyGlyArg（Tos）MetAsp（OBzl）Arg（Tos）IleGlyAlaGl
nSer（Bzl）GlyLeuGlyCys（4MeBzl）AsnSer（Bzl）PheA
rg（Tos）Tyr（Cl2Bzl）−OBzl: 前記調製したペプチド2.4g（0.75mmol）をTFA10mlで冷
却下10分、室温で50分処理し3.5NHCl/ジオキサン0.26ml
（0.9mmol）を加えた後、溶媒を溜去し残渣にエーテル
を加え粉末とし、濾取後NaOH上一夜乾燥した。カルボン
酸成分741mg（0.79mmol）HOBt111mg（0.83mmol）と共に
NMP35mlに溶解し、冷却下WSCI 150μ（0.83mmol）を
加え（pH＝５）反応した。２時間後に寒天化し、５時間
後NMP10mlを追加し一夜撹拌するとフルオロレスカミン
テスト陰性となった。冷却下水を加え粉末化後、濾取
後、順次、水、ｎ−ヘキサン、エーテルで洗いP2O5上乾
燥した。少加温DMF懸濁／メタノールから精製して、目
的物2.74g（91.3％）を得た。
6NHCl加水分解物のアミノ酸分析 元素分析 C197H247O42N35S6Cl2としての 計算値 C58.56％ H6.16％ N12.13％ 分析値 C58.40％ H6.24％ N12.14％ （36）hANP（５−28）の合成 保護ペプチド525mg（0.13mmol）をhANP（５−27）の場
合と同様に脱Bocして得られた粉末をアニソール1.4ml存
在下 HF7.9mlで−２〜−１℃で60分処理し過剰のHFを
溜去後約50％酢酸に溶解し、エーテルで３回洗浄した後
「Dowex １×２」（AcO-、約30ml）を素通りさせ（10
％酢酸溶出）粗粉末（還元型）を得た。このものをhANP
（５−27）の場合と同様に酸化して粗粉末（酸化型）を
得た。このものを0.05M（pH4.7）→0.5M（pH4.8）NH4OA
cで溶出するCM−Ｃカラムで精製し、さらに０→27％CH3
CN/5％酢酸で溶出する「HP−20」カラム、2N酢酸で溶出
する「セファデックスLH−20」カラムで精製して目的物
42mgを得た。
6NHCl加水分解物のアミノ酸分析 元素分析 C106H163O34N35S32AcOH13H2Oとしての 計算値 C45.21％ H6.80％ N16.78％ 分析値 C45.51％ H6.62％ N16.45％ 参考例３ （Nle12）hANP（１−28）の合成 Boc−Arg（Tos）NleAsp（OBzl）Arg（Tos）IleGly−OH
の合成 （37） Boc−NleAsp（OBzl）Arg（Tos）IleGly−OPac Asp（OBzl）Arg（Tos）IleGly−OPac・HCl 4.14g（4.8
2mmol）、Boc−Nle・ジシクロヘキシルアミン2.18g（5.
30mmol、予め脱塩）、HOBt0.69g（5.06mmol）をDMF10ml
に溶解し、冷却撹拌下に、WSCI0.93ml（5.06mmol）滴下
した。pH5〜６。翌日、フルオロレスカミンテストで
（−）を確認した。反応液に、水を注ぎ、酢酸エチルで
抽出した。酢酸エチル層を順次５％NaHCO3水、水、NHC
l、水で洗浄した。ゲル状物が析出。酢酸エチル溜去し
エーテルを加え、ゲル状物を濾取。エーテル洗浄した。
メタノール／エーテルより再沈澱し、4.12g（83％）得
た。
（38） Boc−Arg（Tos）NleAsp（OBzl）Arg（Tos）Ile
Gly−OPac Boc−NleAsp（OBzl）Arg（Tos）IleGly−OPac 4.04g
（3.9mmol）を、CF3CO2H18mlで冷却10分、室温50分処理
した。6.9NHCl/ジオキサン0.7ml（4.68mmol）添加し、
過剰の酸を溜去した。エーテルを加え、粉末とし、NaOH
上乾燥した。
上記粉末および、Boc−Arg（Tos）1.84g（4.29mmol）、
HOBt0.58g（4.29mmol）をDMF8mlに溶解し、冷却撹拌下
に、WSCI0.79ml（4.29mmol）滴下した。pH4〜５。翌
日、Boc−Arg（Tos）0.1g、HOBt40mg、WSCI 43ml追加
した。４時間後、フルオロレスカミンテストで（−）を
確認した。水を加え、析出した固体を濾取し、水洗、エ
ーテル洗浄した。CTCl3−メタノール／エーテルより再
沈澱し、4.8g（91％）得た。
（39） Boc−Arg（Tos）NleAsp（OBzl）Arg（Tos）Ile
Gly−OH Boc−Arg（Tos）NleAsp（OBzl）Arg（Tos）IleGly−OPa
c3.36g（2.5mmol）を酢酸25mlに溶解し、亜鉛粉末3.3g
を加え、45℃で50分撹拌した。亜鉛を濾去し酢酸を溜去
した。水を加え、析出した固体を濾取し、水、エーテル
で洗浄した。クロロホルム−メタノール／エーテルより
再沈澱し、目的物2.9g（94.5％）を得た。
元素分析 C56H82O15N12S2H2Oとしての 計算値 C54.00 H6.80 N13.50％ 分析値 C53.80 H6.78 N13.54％ アミノ酸分析 （6NHCl、110℃、23時間＋フェノール） （40） Boc−Arg（Tos）Ser（Bzl）Ser（Bzl）Cys（4M
eBzl）PheGlyGly−OPac Boc−Ser（Bzl）Ser（Bzl）Cys（4MeBzl）PheGlyGly−O
Pac 2.5g（2.36mmol）にTFA10mlを加え50分かきまぜ
た。TFAを溜去し残渣に3.2N−NCl/ジオキサン1ml（3.54
mmol）を加えよくかきまぜたのちエーテルを加えた。析
出した沈澱を濾取し乾燥後、沈澱をDMF10mlに溶解し、
−15℃冷却下HOBt392mg（2.9mmol）、Boc−Arg（Tos）
−OH 1.24g（2.9mmol）、WSCI 0.53ml（2.9mmol）を
加えた。16時間かきまぜた後反応液に水を加え析出した
沈澱を濾取後、沈澱をメタノールで２回再結晶した。収
量3.0g（92.9％）。
（41） Boc−Arg（Tos）Arg（Tos）Ser（Bzl）Ser（Bz
l）Cys（4MeBzl）PheGlyGly−OPac Boc−Arg（Tos）Ser（Bzl）Ser（Bzl）Cys（4MeBzl）Ph
eGlyGly−OPac 2.9g（2.1mmol）にTFA10mlを加え50分
かきまぜた。TFAを溜去し残渣に3.5N−HCl/ジオキサン
0.9ml（3.15mmol）を加えよくかきまぜた後エーテルを
加えた。析出した沈澱を濾取し乾燥後、沈澱をDMF15ml
に溶解し、−15℃冷却下HOBt338mg（2.5mmol）、Boc−A
rg（Tos）−OH 1.07g（2.5mmol）、WSCI 0.46ml（2.5
mmol）を加えた。16時間かきまぜた後反応液に水を加え
析出した沈澱を濾取後、沈澱をメタノールで２回還流し
た。収量3.1g（88.6％）。
（42） Boc−LeuArg（Tos）Arg（Tos）Ser（Bzl）Ser
（Bzl）Cys（4MeBzl）PheGlyGly−OPac Boc−Arg（Tos）Arg（Tos）Ser（Bzl）Ser（Bzl）Cys
（4MeBzl）Phe−Gly−Gly−OPac3g（1.79mmol）にTFA10
mlを加え50分かきまぜた。TFAを溜去し残渣に3.5N−HCl
/ジオキサン0.77ml（2.69mmol）を加えよくかきまぜた
後エーテルを加えた。析出した沈澱を濾取し乾燥後、沈
澱をDMF15mlに溶解し、−15℃冷却下HOBt290mg（2.15mm
ol）、Boc−Leu−OH・H2O 535mg（2.15mmol）、CHCl3
−トルエンでフラッシュして得た油状物をDMF3mlに溶か
した溶液及びWSCI 0.39ml（2.15mmol）を加えた。16時
間かきまぜた後反応液に水を加え析出した沈澱を濾取
後、沈澱をメタノールで２回再結晶した。収量2.95g（9
2.2％）。
（43） Boc−Ser（Bzl）LeuArg（Tos）Arg（Tos）Ser
（Bzl）Ser（Bzl）Cys（4MeBzl）PheGlyGly−OPac Boc−Leu−Arg（Tos）Arg（Tos）Ser（Bzl）Ser（Bzl）
Cys（4MeBzl）PheGlyGly−OPac2.9g（1.62mmol）にTFA1
0mlを加え50分かきまぜた。TFAを溜去し残渣に3.5N−HC
l/ジオキサン0.7ml（2.43mmol）を加えよくかきまぜた
のちエーテルを加えた。析出した沈澱を濾取し乾燥後、
沈澱をDMF15mlに溶解し、−15℃冷却下HOBt243mg（1.8m
mol）、Boc−Ser（Bzl）−OH 531mg（1.8mmol）、WSCI
0.33ml（1.8mmol）を加えた。16時間かきまぜた後反
応液に水を加え析出した沈澱を濾取後、沈澱をメタノー
ルで２回還流した。収量2.94g（91.8％）。
（44） Boc−Ser（Bzl）LeuArg（Tos）Arg（Tos）Ser
（Bzl）Ser（Bzl）Cys（4MeBzl）PheGlyGly−OH Boc−Ser（Bzl）LeuArg（Tos）Arg（Tos）Ser（Bzl）Se
r（Bzl）Cys（4MeBzl）PheGlyGly−OPac 2.8g（1.42mm
ol）をAcOH80mlに加熱溶解し、亜鉛末4gを加え45℃で１
時間かきまぜた。亜鉛を濾去し、酢酸を溜去後、残渣に
水を加えた。析出した沈澱を濾取後沈澱をメタノールで
洗い次いでDMF−MeOHで再沈澱した。収量2.16g（82.1
％）。
アミノ酸分析（6N−HCl加水分解後） 保護された（Nle12）hANP（１−28）の合成 （45） Boc−Arg（Tos）NleAsp（OBzl）Arg（Tos）Ile
GlyAlaGlnSer（Bzl）GlyLeuGlyCys（4MeBzl）AsnSer（B
zl）PheArg（Tos）Tyr（OBzl）−OBzl: 前記調製したペプチド（33）1.88g（0.9mmol）をTFA10m
lで冷却下10分、室温で50分処理し3.5NHCl/ジオキサン
0.34ml（1.08mmol）を加えた後、溶媒を溜去し残渣にエ
ーテルを加え粉末とし、濾取後NaOH上一夜乾燥した。カ
ルボン酸成分（39）1.16g（0.95mmol）、HOBt 134mg
（0.99mmol）と共にNMP15mlとDMF12mlの混合溶媒に溶解
し、冷却下WSCI 180μ（0.99mmol）を加え（pH＝5.
5）反応した。2.5時間後に寒天化し、一夜撹拌するとフ
ルオロレスカミンテスト（−）となった。冷却下水を加
え結晶化し、濾取後、水、ｎ−ヘキサンで洗いP2O5上乾
燥した。加温DMF全量200mlに繰り返し溶解しゴミ濾別後
DMFを溜去し、加温DMF/MeOHからゲル状粉末とし目的物
2.69（93.4％）を得た。
アミノ酸分析 元素分析 C154H199O34N29S4Cl2としての 計算値 C57.81％ H6.27％ N12.70％ 分析値 C57.53％ H6.38％ N12.58％ （46） Boc−Ser（Bzl）LeuArg（Tos）Arg（Tos）Ser
（Bzl）Ser（Bzl）Cys（4MeBzl）PheGlyGlyArg（Tos）N
leAsp（OBzl）Arg（Tos）IleGlyAlaGlnSer（Bzl）GlyLe
uGlyCys（4MeBzl）AsnSer（Bzl）PheArg（Tos）Tyr（OB
zl）−OBzl: 前記調製したペプチド（45）1.375g（0.43mmol）をTFA1
0mlで冷却下10分、室温で50分処理し3.5NHCl/ジオキサ
ン0.15ml（0.52mmol）を加えた後溶媒を溜去し残渣にエ
ーテルを加え粉末とし、濾取後NaOH上一夜乾燥した。カ
ルボン酸成分836mg（0.45mmol）、HOBt（0.47mmol）と
共にNMP25mlに溶解し、冷却下WSCI 87μ（0.47mmo
l）を加え（pH＝５）反応した。1.5時間後寒天化し、そ
のまま一夜撹拌するとフルオロレスカミンテスト（−）
となった。冷却下水を加えを粉末化し、濾取後、水、ｎ
−ヘキサン、エーテルで洗いP2O5上乾燥した。少加温DM
F懸濁物/MeOHで精製して目的物1.97（92.9％）を得た。
アミノ酸分析 （6NHCl/PhOH 108゜,25時間） 元素分析 C240H307O51N45S7Cl2・2H2Oとしての 計算値 C58.00％ H6.31％ N12.68％ 分析値 C58.00％ H6.41％ N12.42％ （47）［Nle12］ANP（１−28）の合成 保護ペプチド641mg（0.13mmol）をアニソール1.7ml存在
下HF8.5mlで−２〜−１℃60分処理し、過剰のHFを溜去
後約50％AcOHにとかし、エーテルで３回洗浄した後Dowe
x1×２（AcO-、Ca50ml）を素通りさせ（1NAcOH溶出）凍
結乾燥した。このものをANP（５−27）の場合と同様に
酸化して粗粉末を得た。このものを0.05M（pH5.0）→0.
7M（pH5.5）NH4OAcで溶出するCM−Ｃカラム、Ｏ→27％C
H3CN/5％AcOHで溶出するHP−20カラム、１％AcOHで溶出
する「セファデックスLH−２」カラムで精製して目的物
83mgを得た。
アミノ酸分析値（6N−HCl加水分解） 元素分析 C122H194O38N44S2・4AcOH・14H2Oとしての 計算値 C45.37％ H6.97％ N17.91％ 分析値 C45.51％ H6.88％ N17.67％ 参考例４ hANP（５−25）の合成 Boc−Cys（4MeBzl）AsnSer（Bzl）−OBzlの合成 （48） Ser（Bzl）−OBzl・TosOH Boc−Ser（Bzl）8.0g（27.1mmol）をDMF30mlに溶解し、
冷却撹拌下にBzl−Br3.3ml（27.6mmol）、Et3N3.84ml
（27.6mmol）を添加した。更にEt3Nを追加して、pH〜７
に調整した。翌日反応液に水を注ぎ、AcOEtで抽出し
た。酢酸エチル層を、水、５％NaHCO3水、Ｎ−HCl、水
で、順次洗浄し、MgSO4で乾燥した。AcOEtを溜去して得
た油状物をAcOH20mlに溶解し、TosOH・H2O7.8g（40.6mm
ol）添加した。室温で1.5時間、撹拌した後、AcOHを留
去し、エーテルを加え粉末化した。濾取し、エーテルで
充分洗浄した後NaOH上乾燥した。11.15g（90％）得た。
（49） Boc−AsnSer（Bzl）−OBzlSer（Bzl）−OBzl・
TosOH 11.15g（24.4mmol）、Boc−Asn6.22g（26.8mmo
l）およびHOBt3.7g（26.8mmol）をDMF30mlに溶解し、冷
却撹拌下にWSCI 490ml（26.8mmol）を滴下した。滴下
終了時のpH５。３時間後、フルオロレスカミンテスト
で（−）を確認した。反応液に水を注ぎ、遊離した油状
物をAcOEtで抽出した。酢酸エチル層を、水、５％NaHCO
3水、水、Ｎ−HCl、水で、順次洗浄し、MgSO4で乾燥し
た。AcOEtを溜去し、固定残渣をAcOEt/n−ヘキサンより
再沈澱を２回繰り返して、11.13g（91％）得た。
（50） Boc−Cys（4MeBzl）AsnSer（Bzl）−OBzl Boc−AsnSer（Bzl）−OBzl10.0g（20.0mmol）をTFA45ml
（0.60mol）で冷却10分、室温50分、処理した。3.5N−H
Cl/ジオキサン7.0ml（24.0mmol）を添加し、過剰の酸を
溜去した。エーテルを加え結晶化し、濾取してNaOH上乾
燥した。この結晶及び、Boc−Cys（4MeBzl）6.84g（21.
0mmol）、HOBt2.84g（21.0mmol）をDMF30mlに溶かし、
冷却撹拌下にWSCI 3.85ml（21.0mmol）を滴下した。Et
3Nを加え、pH４に調整した。翌日、WSCI 0.37ml（2.
0mmol）を追加した。２時間後、フルオロレスカミンテ
ストで（−）を確認した。水を注ぎ、析出した固体を濾
取。水洗、エーテル洗浄した。CHCl3−MeOH/AcOEtより
再沈澱を２回繰り返して、12.6g（89％）得た。
（51） Boc−AlaGlnSer（Bzl）GlyLeuGlyCys（4MeBz
l）AsnSer（Bzl）−OBzl（17−25） Boc−Cys（4MeBzl）AsnSer（Bzl）−OBzl 0.885gg（1.
25mmol）を、TFA4ml（50mmol）で、冷却10分、室温50
分、処理した。6.9N−HCl/ジオキサン0.22ml（1.55mmo
l）添加し、過剰の酸を溜去した。エーテルを加え粉末
とし、濾取し、NaOH上乾燥した。上記粉末および、Boc
−AlaGlnSer（Bzl）GlyLeuGly−OH 0.95g（1.31mmo
l）、HOBt0.19g（1.38mmol）をDMF30mlに溶解し、冷却
撹拌下に、WSCI 0.252ml（1.38mmol）を添加した。pH
６。２時間後、フルオロレスカミンテストで（−）を
確認した。水を加え、析出した固体を濾取し水洗後、エ
ーテル洗浄した。DMF/MeOHより再沈澱し、1.57g（96
％）得た。
アミノ酸分析（6N−HCl、110℃、22時間） （52） Boc−Arg（Tos）MetAsp（OBzl）Arg（Tos）Ile
GlyAlaGlnSer（Bzl）GlyLeuGlyCys（4MeBzl）AsnSer（B
zl）−OBzl（11−25） Boc−AlaGlnSer（Bzl）GlyLeuGlyCys（４−MeBzl）AsnS
er（Bzl）−OBzl1.47g（1.12mmol）を、TFA9ml（112mmo
l）で、冷却10分、室温50分、処理した。6.9N−HCl/ジ
オキサン0.25ml（1.68mmol）添加し、過剰の酸を溜去し
た。エーテルを加え粉末とし、NaOH上乾燥した。上記粉
末および、Boc−Arg（Tos）MetAsp（OBzl）Arg（Tos）I
leGly−OH1.47g（1.18mmol）、HOBt0.17g（1.23mmol）
をDMF15ml、NMP5mlに溶解し、冷却撹拌下に、WSCI 0.2
26ml（1.23mmol）を添加した。pH５。翌日、フルオロ
レスカミンテストで（−）を確認した。プディング状に
なっている反応物に、水を加え、濾取し、水洗、エーテ
ル洗浄した。DMF/MeOHより再沈澱し、2.57g（94％）得
た。
アミノ酸分析（6N−HCl、110℃、22時間） （53） Boc−Ser（Bzl）Ser（Bzl）Cys（4MeBzl）PheG
lyGlyArg（Tos）MetAsp（OBzl）Arg（Tos）IleGlyAlaGl
nSer（Bzl）GlyLeuGlyCys（4MeBzl）AsnSer（Bzl）−OB
zl（５−25） Boc−Arg（Tog）MetAsp（OBzl）Arg（Tos）IleGlyAlaGl
nSer（Bzl）GlyLeuGlyCys（4MeBzl）AsnSer（Bzl）−OB
zl 2.43g（1.0mmol）を、TFA12mlで、冷却10分、室温5
0分、処理した。6.9N−HCl/ジオキサン0.22ml（1.5mmo
l）添加し、過剰の酸を溜去した。エーテルを加え粉末
とし、NaOH上乾燥した。上記粉末および、Boc−Ber（Bz
l）Ser（Bzl）Cys（４−MeBzl）PheGlyGly−OH0.99g
（1.05mmol）、HOBt0.15g（1.10mmol）をDMF5ml、NMP20
mlに溶解し、冷却撹拌下に、WSCI 0.201ml（1.10mmo
l）を添加した。pH5〜６。４時間後、フルオロレスカミ
ンテストで（−）を確認した。プディング状になった反
応物に、水を加え、濾取し、順次、水、ｎ−ヘキサン、
エーテルで洗浄した。DMF/MeOHより再沈澱し、3.0g（92
％）得た。
アミノ酸分析 （6N−HCl、110℃、22時間） （54） hANP（５−25） 保護ペプチド1.0g（0.307mmol）をTFA5ml（67.5mmol）
で０℃、10分、室温50分処理した。6.9N−HCl/ジオキサ
ン0.1ml（0.76mmol）添加して、過剰の酸を溜去した。
エーテルを加え粉末とし、NaO上乾燥した。上記粉末
を、アニソール1.5ml（13.8mmol）存在下 HF約9mlで０
℃１時間処理した。HFを溜去し、油状残渣を2N−AcOHに
溶解しエーテルで洗浄した。水層を「Dowex １×２」
（AcO-型、100ml）に通液し、Ｎ−AcOHで溶出した。フ
ルオロレスカミンテスト（＋）の画分を集め、凍結乾燥
した。
上記凍結乾燥品を、30mlのＮ−AcOH/尿素に溶解し、こ
の溶液を、K3Fe（CN）６ 0.142g（0.43mmol）を含んだ
1M−AcONH4（pH7.4）/8M−尿素270mlに、10分間で滴下
した。この間、10％アンモニア水を滴下してpH7.4に保
った。
更に10分間撹拌した後、酢酸を加えpH4〜５に調整した
「IRA−45」（Cl-型、約20ml）を加え、10分間ゆっくり
撹拌した。この溶液を「IRA−45」（Cl-型、100ml）、
「HP−20」（fine、150ml）カラムに順次導き、Ｎ−AcO
H600mlで洗浄した。「HP−20」カラムを、CH3CN/AcOH/H
2O（8:1:1）500mlで溶出し、濃縮した。油状残渣をＮ−
AcOHより凍結乾燥した。
上記凍結乾燥品を、TFA30mlに溶解し、氷冷撹拌下に、N
H4I 95mg（0.61mmol）/H2O 1mlを添加した。10分後、
水400mlを注ぎ、CCl4で洗浄した。水層に、アスコルビ
ン酸55mg添加したのち、「HP−20」（fine、100ml）カ
ラムに通液した。Ｎ−AcOH500mlで洗浄したのち、CH3CN
/AcOH/H2O（8:1:1）400mlで溶出した。溶出液を濃縮
し、油状残渣をＮ−AcOHに溶解「Dowex １×２」（AcO
-型、100ml）カラムに通液した。Ｎ−AcOHで溶出し、フ
ルオロレスカミンテスト（＋）の画分を集め、凍結乾燥
した。
次にCM−セルロース（φ2.65×40cm）0.03MAcONH4（pH
4.8）、900ml→0.3MAcONH4（pH4.8）900mlへのリニヤ−
グラジエントで溶出し精製した。
さらに「HP−20」（φ1.9×50cm）カラム、０％CH3CN/1
％AcOH（600ml）→20％CH3CN/1％AcOH（600ml）のリニ
ヤ−グラジエンド溶出し、目的物を濃縮し、Ｎ−AcOHよ
り凍結乾燥した。更に、この凍結乾燥品「LH−20」（φ
2.13×46cm）カラムでＮ−AcOH溶出した。
以上のシステムで精製し75mg得た。（10.3％） 元素分析 C82H133N29O30S3・AcOH・12H2Oとしての 計算値 C42.43％ H6.83％ N17.09％ 実験値 C42.57％ H6.45％ N16.81％ アミノ酸分析（6N−HCl、110℃、22時間） 実施例１ hANP（７−28）の合成 （55） Boc−Cys（4MeBzl）PheGlyGly−OH Boc−Cys（4MeBzl）PheGlyGly−OPac 3.2g（4.5mmol）
を酢酸50mlに溶解し、亜鉛粉末8gを加え45℃で50分かき
まぜた。亜鉛を濾去した後、酢酸を溜去した。残渣に水
を加え、析出した沈澱を濾取乾燥後メタノール／エーテ
ルで再沈澱した。収量2.27g（87.3％）。
（56）保護されたhANP（７−28）の合成 Boc−Cys（4MeBzl）PheGlyGlyArg（Tos）MetAsp（OBz
l）Arg（Tos）IleGlyAlaGlnSer（Bzl）GlyLeuGlyCys（4
MeBzl）AsnSer（OBzl）PheArg（Tos）Tyr（Cl2Bzl）−O
Bzl Boc−Arg（Tos）MetAsp（OBzl）Arg（Tos）IleGlyAlaGl
nSer（Bzl）GlyLeuGlyCys（4MeBzl）AsnSer（Bzl）PheA
rg（Tos）Tyr（Cl2Bzl）−OBzl 2.09g（0.65mmol）にT
FA15mlを加え50分かきまぜた。TFAを溜去し残渣に3.5N
−HCl/ジオキサン0.28ml（0.98mmol）を加えよくかきま
ぜたのちエーテルを加えた。析出した沈澱を残渣し乾燥
後、沈澱をNMP25mlに溶解し、−15℃冷却下、HOBt97mg
（0.72mmol）、Boc−Cys（4MeBzl）PheGlyGly−OH 422
mg（0.72mmol）および、WSCI 140μ（0.72mmol）を
加えた。16時間かきまぜた後ゲル化した反応液に水を加
え、析出した沈澱を濾取した後、沈澱をMeOHで洗いつい
でMeOHで還流する。収量2.2g（91.6％）。
（57） の合成 Boc−Cys（4MeBzl）PheGlyGlyArg（Tos）MetAsp（OBz
l）Arg（Tos）IleGlyAlaGlnSer（Bzl）GlyLeuGlyCys（4
MeBzl）AsnSer（Bzl）PheArg（Tos）Tyr（Cl2Bzl）−OB
zl 1g（0.27mmol）にTFA5mlを加え50分かきまぜる。TF
Aを溜去した後残渣にエーテルを加えた。析出した沈澱
を濾取し乾燥した。沈澱をアンソール2ml、HF20mlで０
℃、60分処理した。HF溜去後、残渣にエーテルを加え
た。析出した沈澱をエーテルで洗浄した後、20％酢酸に
溶解した。「Dowex1×２」（AcO-）に通し1N−AcOHで溶
出した。溶出液を集め凍結乾燥した。得られた粉末全量
を27mlの1N−AcOHに溶解し、この溶液を1MAcONH4/尿素
溶液243mlとK3Fe（CN）6125mgの混合液に滴下する。こ
の時10％NH4OHでpH7.4に調製した。30分で滴下を終え濃
AcOHでpH4.75にした後「IRA−45」（Cl-）20mlを加えゆ
っくりかきまぜた。次いで「IRA−45」（Cl-）100mlの
カラムに通し1N−AcOHで洗った。洗液を「HP−20」で吸
着後１％AcOHで洗浄した。CH3CN/AcOH/水（8:1:1）で溶
出後凍結乾燥した。凍結乾燥して得た粉末をCM−セルロ
ースで0.05M→0.5M NH4OAcのグラジェントによる精製
を行う。主画分（fr60−67）を集め凍結乾燥する。次い
で「HP−20」のカラムによる精製を行った。（５％CH3C
N→25％CH3CN）主画分（fr70−82）を集め凍結乾燥し
た。最後に「LH−20」で精製（2MAcOH）することにより
78mgを得た。
アミノ酸分析（6N−HCl加水分解） HPLC（カラム:Nucleos:l5C18）0.1％TFA（１％→60％グ
ラジェント）26.0分に単一ピークを与えた。
参考例５（Asu7,23）hANP（７−23）の合成 （58） Boc−AlaGlnSer（Bzl）GlnLeuGlyAsu（OPac）
−OBzlの合成 Boc−AlaGlnSer（Bzl）GlyLeuGly−OH（1.23g,1.7mmo
l）、ｐ−HosOH・Asu（OPac）−OBzl（1.03g,1.8mmol）
およびTOBt（0.26g,1.9mmole）をDMF（10ml）に溶解
し、−５℃でWSCI（0.35ml,1.9mmol）を加えた。−５℃
で１時間室温で一夜かきまぜた後、反応液を冷水（100m
l）注ぎ込み析出した固体を濾取し、水、エーテルで洗
い、クロロホルム−メタノール／エーテルより再沈澱し
た。収量1.65g（88％）。
アミノ酸分析 （6N−HCl−フェノール/110゜,22時間） 生成物の高速液体クロマトグラフィー（HPLC）のリテン
ションタイム:4分30秒。用いた樹脂は「ヌクレオシル5C
18」である。以下特に記述しないかぎりはすべてこの樹
脂を用いてHPLCを行った。
溶離液:MeOH−H2O−TFA（80−20−0.1） 溶離方法：イソクラチィック （59） Boc−Arg（Tos）MetAsp（OBzl）Arg（Tos）Ile
GlyAlaGlnSer（Bzl）GlyLeuGlyAsu（OPac）−OBzlの合
成 Boc−AlaGlnSer（Bzl）GlyLeuGlyAsu（OPac）−OBzl
（1.5g,1.36mmol）にTFA（10ml）を加え、−５℃で10分
間、室温で30分間かきまぜた。過剰のTFAを減圧溜去
し、残渣に3.5N−HCl/ジオキサン（0.5ml）を加え、遊
離のアミノ基を塩酸塩に変換させた後、エーテルを加
え、析出した固体を濾取し、NaOH上５時間減圧乾燥し
た。上で得られた固体をDMF（15ml）に溶かし、それにB
oc−Arg（Tos）MetAsp（OBzl）Arg（Tos）IleGly−OH
（1.78g,1.43mmol）とHOBt（0.20g,1.5mmol）を加え更
に−５℃でWSCI（0.28ml,1.5mmol）を加えた。−５℃で
１時間、室温で一夜かきまぜた後、反応液を冷水（200m
l）に注ぎ込み析出した固体を濾取し、水、エーテルで
洗浄後、DMF/MeOHより再沈澱した。収量2.6g（86％）。
アミノ酸分析 （6N−HCl−フェノール/110℃,22時間） HPLCのリテンションタイム:12分45秒 溶離液:MeOH−H2O−TFA（80−20−0.1） 溶離方法：イソクラチィック （60） Boc−PheGlyGly−OH Boc−PheGlyGly−OPac 2.5g（5mmol）を酢酸50mlに溶
解し、亜鉛粉末4gを加えて45℃で40分かきまぜた。亜鉛
を濾去した後、酢酸を濃縮した。残渣に水を加え、析出
した油状物を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層をＮ
−HCl、水で洗浄しNa2SO4で乾燥後酢酸エチルを溜去し
た。残渣を酢酸エチル−ｎ−ヘキサンで再結晶した。収
量1.75g（92.1％）． （61） Boc−PheGlyGlyArg（Tos）MetAsp（OBzl）Arg
（Tos）IleGlyAlaGlnSer（Bzl）GlyLeuGlyAsu（OPac）
−OBzlの合成 Boc−Arg（Tos）MetAsp（OBzl）Arg（Tos）IleGlyAlaGl
nSer（Bzl）GlyLeuGlyAsu（OPac）−OBzl（2.2g,1mmo
l）にTFA（10ml）を加え、−５℃で20分、室温で30分間
かきまぜた。過剰のTFAを減圧溜去し、残渣に3.5N−HCl
/ジオキサン（0.4ml）を加え、遊離のアミノ基を塩酸塩
に変換させた後、エーテルを加え、析出した固体を濾取
し、NaOH上、５時間減圧乾燥した。上で得られた固体を
DMF（30ml）に溶解し、それにBoc−Phe−Gly−Gly−OH
（0.42g,1.1mmol）とHOBt（0.15g,1.1mmol）を加え更に
−５℃でWSCI（0.20ml,1.1mmol）を加えた。−５℃で１
時間、室温で一夜かきまぜた後、更にBoc−Phe−Gly−G
ly−OH（38mg,0.1mmol）とHOBt（14mg,0.1mmol）をDMF
（5ml）に溶解し、反応液に加え、更に−５℃で反応液
にWSCI（19μ,0.1mmol）を加えた。−５℃で１時間、
室温で３時間かきまぜた後、反応液を冷2.5％重ソウ水
（300ml）に注ぎ込み析出した固体を濾取し、水、エー
テルで洗った後、MeOH（200ml）で還流し、放冷後、濾
取した。収量2.3g（92％）。
アミノ酸分析 （6N−HCl−フェノール/110゜,22時間） HPLCのリテンションタイム:9分40秒 溶離液:MeOH−H2O−TFA（82.5−17.5−0.1） 溶離方法：イソクラチィック （62） Boc−PheGlyGlyArg（Tos）MetAsp（OBzl）Arg
（Tos）IleGlyAlaGlnSer（Bzl）GlyLeuGlyAsu（OH）−O
Bzl Boc−PheGlyGlyArg（Tos）MetAsp（OBzl）Arg（Tos）Il
eGlyAlaGlnSer（Bzl）GlyLeuGlyAsu（OPac）−OBzl（1.
7g、0.7mmol）をAcOH−TFE（80ml−20ml）に溶解し、亜
鉛粉末（2.3g、35mmol）を加え、49℃で50分かきまぜ
た。未反応物（Pac体）が検出されたので、亜鉛粉末
（2.5g、38mmol）を加え、49℃で20分間、更に亜鉛粉末
（1g、15mmol）を加え、49℃で10分間かきまぜた。過剰
の亜鉛を濾去し、濾液を減圧濃縮し、残渣に水を加え、
析出した固体を濾取し、水、エーテルで洗った後、メタ
ノール（100ml）で還流、放冷後、濾取した。
アミノ酸分析 （6N−HCl−フェノール/110゜,22時間） HPLCのリテンションタイム:5分30秒 溶離液:MeOH−H2O−TFA（82.5−17.5−0.1） 溶離方法：イソクラチィック MetがMet（Ｏ）になったものが生成物のなかにかなり
（約30％）が含まれていいた。因みに、このものの、HP
LCのリテンションタイムは上記の条件では４分である。
（63） Boc−PheGlyGlyArg（Tos）MetAsp（OBzl）Arg（Tos）Il
eGlyAlaGlnSer（Bzl）GlyLeuGlyAsu（OH）−OBzl（0.67
g、0.28mmol）にTFA（5ml）を加え、−５℃で10分間、
室温で50分間かきまぜた。過剰のTFAを減圧溜去し、残
渣に、エーテルを加え、析出した固体を濾取し、NaOH
上、２時間減圧乾燥した。上で得られた固体をDMF（10m
l）に溶解し、−５℃でEt3N（40μ、0.28mmol）を加
え、中和後、更に水を加え、析出した固体を濾取し、
水、エーテルで洗浄し、P2O5上２日間減圧乾燥した。上
で得られた脱Boc体をDMF（40ml）に溶解し、それにHOBt
（57mg、0.42mmol）を加え−５℃で更にWSCI・HCl（81m
g、0.42mmol）を加え、−５℃で１時間、室温で４時間
かきまぜた後、−５℃でHOBt（57mg、0.42mmol）とWSCI
・HCl（81mg、0.42mmol）を加え、−５℃で１時間、室
温で一夜かきまぜた。DMFを減圧溜去し、残渣に水を加
え、析出した固体を濾取し、水、エーテルで洗浄し、Me
OH/AcOEt−エーテルより再沈澱した。収量430mg（68
％）。
HPLCのリテンションタイム:19分50秒 溶離液： MeOH−H2O−TFA（70−30−0.1）（Ａと呼ぶ） MeOH−H2O−TFA（95−５−0.1）（Ｂと呼ぶ） 溶離方法： ＡとＢの直線グラジュエントで15分間溶離した後、Ｂで
15分間溶離した。
上記条件下ではMet（Ｏ）体は17分50秒脱Boc体は13分40
秒（上記条件下）であった。
（64） の合成 （338mg、0.15mmol）をアニソール（0.3ml）とメチオニ
ン（34mg）存在下HF（5ml）で氷浴上、１時間かきまぜ
た。過剰のHFを減圧溜去し、残渣を50％AcOH（5ml）に
溶解し、「Dowex1×２」（AcO-型）のカラム（50ml）を
通過させた。得られた溶出液を減圧濃縮し、残渣を2M−
AcOHに溶解し凍結乾燥をして粗生成物を得た。上で得ら
れた粗生成物をCM−Ｃカラムクロマトグラフィーにより
精製した。［カラムサイズ:1.75×29cm、溶出溶媒:0.01
M−AcONH4（pH4.8）（Ａ−bufferと呼ぶ）、0.4M−AcON
H4（pH4.8）（Ｂ−bufferと呼ぶ）、溶出方法:A−buffe
r（300ml）とＢ−buffer（300ml）の直線グラジュエン
ト］収量90mg。
上で得られた部分精製品40mgを用い以下の精製を行っ
た。まずTFA（2ml））に溶解し、氷浴上、４％NH4I水溶
液（110μ、30μmol）を加え、10分間かきまぜた。次
に、大過剰の水を反応液に加えCCl4で洗浄し、水層を
「Dia−ion HP−20」に吸着させ、水洗後、CH3CN−10％
AcOH（６−４）で脱着させた。得られた溶出液を減圧濃
縮し、残渣を2M−AcOHに溶解し、「Dowex1×２（AcO
-型）のカラムを通過させ、得られた溶出液を凍結乾燥
した。続いて上で得られたものを「Dia−ionHP−20」に
よるカラムクロマトグラフィーで精製した。［カラムサ
イズ:1.75×29cm、溶出溶媒10％AcOH（Ａ液と呼ぶ）CH3
CN−10％AcOH（25−75）（Ｂ液と呼ぶ）、溶出方法:A液
（300ml）とＢ液（300ml）の直線グラジュエント］ 目的物を含む画分を集め減圧濃縮し、残渣を2M−AcOHに
溶解し凍結乾燥した。更に得られた凍結乾燥品を「セフ
ァデックスLH−20」によるカラムクロマトグラフィーに
より精製した。［カラムサイズ:1.75×29cm、溶出溶媒:
2M−AcOH］収量:21mg比旋光度［α］30−32.0゜（C0.52
M−AcOH） アミノ酸分析（6N−HCl/110゜,22時間） HPLCのリテンションタイム:26分 溶離液： CH3CN−H2O−TFA（１−99−0.1）（Ａと呼ぶ） CH3CN−H2O−TFA（60−40−0.1）（Ｂと呼ぶ） 溶離方法： ＡとＢの直線グラジュエント25分間、続いてＢで10分間
溶離した。
（65） （Nle12）α−hANP（７−28）の合成 Protected（Nle12）α−hANP（７−28）の合成 Boc−Arg（Tos）NleAsp（OBzl）Arg（Tos）IleGlyAlaGl
nSer（Bzl）GlyLeuGlyCys（4CH3Bzl）AsnSer（Bzl）Phe
Arg（Tos）Tyr（Cl2Bzl）−OBzl 650mg（0.20mmol）に
TFA5mlを加え50分かきまぜる。TFA溜去し残渣に3.5N−H
Cl/ジオキサン100μ（0.35mmol）を加えよくかきまぜ
た後エーテルを加える。析出した沈澱を濾取し乾燥後、
沈澱をＮ−メチルピロリドン15mlに溶かし−15℃冷却下
HOBT36mg（0.26mmol）、Boc−Cys（4CH3Bzl）PheGlyGly
−OH 153mg（0.26mmol）WSCI 50μ（0.27mmol）を
加える。16時間かきまぜたのち寒点化した反応液に水を
加え析出した沈澱を濾取する。沈澱をMeOHで２回熱時洗
浄する。収量700mg。
アミノ酸分析値 （6N−HCl加水分解110℃,22時間） （66） の合成 （（Nle12）α−hANP（７−28）） Protected（Nle12）−α−hANP（７−28）500mg（0.136
mmol）をアニソール1ml存在下HF10mlで０℃60分処理す
る。HF溜去後、残渣にエーテルを加える。析出した沈澱
をエーテルで洗ったのち20％AcOHにとかす。Dowex1×２
（AcO-）に通し1N−AcOHで溶出する。溶出液を集め凍結
乾燥する。得られた粉末全量を14mlの1N−AcOHにとかし
この溶液を1MAcONH4/ureu溶液126mlとK3Fe（CN）663mg
の混合液に滴下する。この時10％NH4OHでpHを7.4に調製
する。30分で滴下を終え濃AcOHでpH4.75にしたのちIRA
−45（Cl）15mlを加えゆっくりかきまぜる。ついでIRA
−45（Cl-）70mlのカラムに通し1N−AcOHで洗う。洗液
をHP−20で吸着後１％AcOHで洗う。CH3CN/AcOH/H2O（8/
1/1）の混合溶媒で溶出し濃縮後凍結乾燥する。凍結乾
燥して得た粗粉末をCM−セルロースカラムクロマトグラ
フィーで0.05M（pH5）→0.5MNH4OAcのグラジェントによ
る精製を行う。主成分（fr50−58）を集め凍結乾燥す
る。ついでHP−20のカラムクロマトグラフィーで５％CH
3CN→25％CH3CNのグラジェントによる精製を行い主成分
（fr68−81）を集め凍結乾燥する。最後にLH−20で精製
（2M−AcOH）することにより目的物を74mg得た。
アミノ酸分析値（6N−HCl加水分解） 参考例６ Met（Ｏ）12−hANP（１−28）の合成 （67） Boc−Ser（Bzl）LeuArg（Tos）Arg（Tos）Ser
（Bzl）SerCys（4CH3Bzl）PheGlyGlyArg（Tos）MetAsp
（OBzl）Arg（Tos）IleGlyAlaGlnSer（Bzl）GlyLeuGlyG
ys（4CH3Bzl）AsnSer（Bzl）PheArg（Tos）Tyr（Cl2Bz
l）−OBzl Boc−Arg（Tos）MetAsp（OBzl）Arg（Tos）IleGlyAlaGl
nSer（Bzl）GlyLenGlyCys（4CH3Bzl）AsnSer（Bzl）Phe
Arg（Tos）Tyr（Cl2Bzl）−OBzl 2.02g（0.63mmol）に
TFA20mlを加え50分かきまぜた。TFAを溜去し残渣に3.5N
−HCl/ジオキサン0.27mlを加えよくかきまぜたのちエー
テルを加える。析出した沈澱を濾取し乾燥後、沈澱をＮ
−メチルピロリドン30mlにとかし、−15℃冷却下、HOBt
89mg（0.66mmol）、Boc−Ser（Bzl）Ler（Tos）Arg（To
s）Arg（Tos）Ser（Bzl）Ser（Bzl）Cys（4CH3Bzl）Phe
GlyGly−OH 1.22g（0.66mmol）およびWSCI 120μ
（0.66mmol）を加えた。16時間かきまぜた後ゲル化した
反応液に水を加え析出した沈澱を濾取した後、沈澱をメ
タノールで洗いついでメタノールで還流した。収量3.0g
（96.5％）。
アミノ酸分析（6N−HCl加水分解後） （68） Met（Ｏ）12−hANP（１−28） Boc−Ser（Bzl）LeuArg（Tos）Arg（Tos）Ser（Bzl）Se
r（Bzl）Cys（4CH3Bzl）PheGlyGlyArg（Tos）MetAsp（O
Bzl）Arg（Tos）IleGlyAla−GlnSer（Bzl）GlyLenGlyCy
s（4CH3Bzl）AsnSer（Bzl）PheArg（Tos）Tyr（Cl2Bz
l）−OBzl 1g（0.2mmol）にTFA5mlを加え50分かきまぜ
た。TFAを溜去し残渣にエーテルを加えた。析出した沈
澱を濾取後乾燥した。沈澱をアンソール1.5ml存在下HF3
0mlで０℃60分反応させた後、HFを溜去した。残渣にエ
ーテルを加えよく洗った後2N−AcOHに溶解した。「Dowe
x1×２」（AcO-）に通し1N−AcOHで溶出した後凍結乾燥
した。凍結乾燥して得た粉末を20ml1M酢酸に溶解しこの
溶液を1MNH4OAc−尿素溶液180mlとK3Fe（CN）693mgの混
合溶液に滴下した。その間10％NH4OHでpHを7.4に保っ
た。30分で滴下後AcOHでpHを4.75にした後「IRA−45」
（Cl）20mlを加えてゆっくりかきまぜた。「IRA−45（C
l-）」100mlのカラムにとおした後溶出液を「HP−20」
のカラムで吸着させた。１％AcOHで洗浄後CH3CN−H2O−
AcOH（8/1/1）で溶出し、濃縮後凍結乾燥した。得られ
た粉末をCM−セルロースによるカラムクロマトグラフィ
ーで0.05→0.7MNH4OAc（１→１）のグラジェンで行
い画分89→99を集め凍結乾燥した。得られた粉末を「HP
−20」により精製後最後に「LH−20」で精製した。精製
した粉末のうち10mgを1N−AcOH3mlに溶解し、H2O20.5ml
を加え20分かきまぜた後「HP−20で吸着させた。１％Ac
OHで洗浄した後CH3CN−H2O−AcOH（8/1/1）で溶出後、
凍結乾燥することにより6mgのMet（Ｏ）12−α−hANPを
得た。HPLC（カラム：ヌクレオシル5C18で（0.1％TFA
CH3CN1％→60％グラジェント）24.8分に単一ピークを与
えた。
アミノ酸分析（6N−HCl加水分解後） 前記実施例において製造されたペプチドについて利尿試
験を行った。
［試験方法］ 心房性ナトリウム利尿ペプチドの生理活性試験 1.ラット大動脈標本における弛緩作用 スプラーグードーリイ系ラット、オス、体重250−280g
を用いた。断頭後、胸部大動脈を摘出し、80゜の角度で
らせん状大動脈標本を作製した。栄養液はクレブス液を
用いた。37±0.5℃に設定した20mlのマグヌス管内に大
動脈標本に懸垂した。マグヌス管内には５％二酸化炭素
と95％酸素からなる混合ガスを通気した。大動脈の反応
は等張性に記録した。等張記録系として、トランスジュ
ーサーと増幅器（ME コマーシャル、ME4012）、記録計
（三栄8K21）を使用した。大動脈に対する負荷は0.5gと
した。上記条件下で１時間放置し、大動脈を安定させ
た。ノルエピネフリン（５×10-8M）により収縮させた
大動脈標本に、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）
を作用させ弛緩作用をみた。標本となるhANP（１−28）
とANPフラグメントの２本の用量反応曲線を１つの標本
から得た。この２つの用量反応曲線からそれぞれの50％
有効量（ED50）を求め、その比を比活性値とした。
2.ヒヨコ直腸標本における弛緩作用 ２〜３週令のオス、体重155〜175gのヒヨコを用いた。
ペントバルビタールを60mg/kg、腹腔内適用して麻酔し
た後、直腸を摘出した。栄養液はクレブス液を用いた。
37±0.5℃に設定した20mlのマグヌス管内に直腸を懸垂
した。マグヌス管内には５％の二酸化炭素と95％の酸素
からなる混合ガスを通気した。直腸の反応は等張性に記
録した。等張記録系はラット大動脈標本に用いたのと同
じものを使用した。直腸に対する負荷は0.5gとした。上
記条件下で１時間放置し、標本を安定させた。カルバコ
ール（２×10-7M）により収縮させた直腸標本にANPを作
用させ弛緩作用をみた。ラット大動脈標本と同様に、標
準となるhANP（１−28）とANPフラグメントの２つのED
50を求め、比活性値を算出した。
3.ラットにおけるナトリウム利尿作用 スプラーグードーリイ系ラット、オス、体重250−300g
を用いた。ペントバルビタールを50mg/kg、腹腔内適用
して麻酔させた後、気管にカニューレを挿入して気道を
確保した。大腿動脈に挿入したカニューレから血圧およ
び心拍数を記録した。記録系として、血圧トランスジュ
ーサー（センチュリーテクノロジー,CP−01）、圧増幅
器（スターメディカル,PA−011）、心拍数計（スターメ
ディカル,HR−001）、記録計（理科電機,R−302）を使
用した。
大腿静脈に挿入したカニューレから、リンゲル液を環流
ポンプ（医工精器、Ｍ−1V）により20μ/minの速度で
持続注入した。ANPはこの静脈カニューレより適用した
（0.5ml/kg）。
膀胱内にカニューレを挿入し、尿を2mlのサンプルチュ
ーブに10分間隔で採取した。尿量は直示天秤（メトラ、
AE160）により重量で測定した。ナトリウムおよびカリ
ウムは分散した20μの尿を用い、ガラス電極式イオン
濃度計型測定機（オリオンリサーチ,901）により測定し
た。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭60−214797（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−105697（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−192598（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−136596（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−184098（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−81790（ＪＰ，Ａ) 特表 昭61−501987（ＪＰ，Ａ) 「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．］120（２），Ｐ. 333−338（1984) 「Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）］309 （２），Ｐ．717−719（1984)

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式 で表わされる新規ペプチド。
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