JPS60184098A - 新規なペプチド及びこれを有効成分とする利尿剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の分野） この発明は、利尿作用、ナトリウム利尿作用及び血圧降
下作用を有するペプチド並びにその塩、並びにこれらを
言んで成る利尿剤に関する。

（発明の背り 種々の体液性因子、すなわち生理活性物質が、物理的因
子、例えは心拍出量、血管壁の弾性等と共に血圧を規定
する重要な因子でおることは工〈知られている。この体
液性因子が関与する系として、レニン−アンジオテンシ
ン−アルドステロン系、カテコラミン系、グロスタグラ
ンソン系、カリクレイン−キニン系と共にナトリウム利
尿ホルモン系が存在し、ウプベイン様物貝といわれるナ
トリウム利尿ホルモンが血圧の上昇に関与することもす
でに周知である。

なお、この明細書において「ナトリウム利尿」とはカリ
ウムイオンに対してナトリウムイオンを選択的に排泄す
る利尿を言う。

（従来技術） 従来から、本態性高血圧の治療にすｌラムイオンの排泄
を目的として、利尿剤、例えば７０セマイド（Ｆｒｏｍ
ａｍｌｄｅ）が用いられている。しかしながら、この物
質とこの発明の物質とは構造が全く異る。

一方、ヒトの心房中には、ペグチドホルモン産生細胞中
すこ見られる顆粒と形態的に類似する顆粒が存在するこ
とが知られている［Ｊ、Ｄ、　Ｊａｍｌｅｓｏｎ及びＧ
、Ｅ、　Ｐａ１ａｄｅ、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、
２３　、１５１（１９６４））。また、ラットの心房の
ホモジネート物及びその顆粒が、う、トに対してナトリ
ウム利尿を起すことも知られているＣ　Ａ、Ｊ、　Ｄｅ
Ｂｏｌｄ等、ＬｉｆｅＳａｉ、＝　２８．８９（１９８
１）：Ｒ，Ｋａｅｌｌｅｒ、　Ｃａｎ、Ｊ、Ｐｈｙｓｌ
ｏｌ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、ｙ　６０　ｒ１０７８（１
９８２）等〕。さらに、最近においてｓ　Ｍａｒｋ　Ｇ
、　Ｃｕｒｒｉｅ　Ｓ、等はヒト、ウサギ、ブタ及びう
、トの心房中にナトリウム利尿作用を有する分子量２万
〜３万のペプチド様物質及び分子量１万以下のペプチド
様物質が存在することを示唆した（　５ｃｉｅｎｃ＠、
２．２１　、７１〜７３　（１９８３）］。

最近になってアミノ酸敗２８個のラット由来のペプチド
が同定された［　ＢＢＲＣＶｏｌ、　１１７　、扁３゜
Ｐ８３９−〜８６５（１９８３）］。また本発明考らは
、ヒト由来のα−ｈＡＮＰを見い出し、その構造及び七
〇薬理活性をあきらかにした。〔％象自昭５８−２４３
　ｂ　７５　：　ＢＢＲＣＶｏｌ’−１１８ｔ　ｙ１６
１　。

Ｐ１３１〜１３９（１９８４）Ｊ。

本発明考等は、ナトリウム這択往が高く効果的な利尿作
用を有する物質を見出すべく鋭意研死を行った結果、ヒ
トの心房から、５６個のアミノ酸で構成され約６０００
の分子弁を７１」する全く肋しいペプチドを単離するこ
とに成功し、このペプチドの構造を決定すると共に、こ
のペプチドが顕著な利鰍作用、及びナトリウム利尿作用
を有することを見出し、このｇ６明ｔ５ｉｌＳ成した。

すなわち、この発明は、顕著な利尿作用、嘴にす）　Ｉ
Ｊウム利尿作用を有する新規なペプチド、及び該ペプチ
ドを含んで成る利尿剤を提供することを目的とする。

なお、この明細書において、仁の新規ペプチドをβ−ｈ
ＡＮｐ　（β−ｈｕｍａｎ　ａｔｒｉａｌ　ｎａｔｒｌ
ｕｒｅｔｌｃｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　）と称する。

（発明の構成） （Ａ）　β−ｈ　ＡＮＰの構造及び物理化学的注實■　
この発明のペプチドβ−ｈＡＮＰは次の構造式（１）で
表わされる。

以下余日 上記の構造式（１）において、■と■、及び■と■は直
接に結合してお夛、又このアミノ酸鎖仏）は左側にアミ
ノ末端を有し右側にカルボキシ末端を有し、アミノ酸鎖
（Ｂ）Ｈこの逆である。式中、Ａｓｐはアスノ９ラギン
酸、ＡｌＩｎはアメ／４’ラギン、Ａｌａｌｊ７ラニン
、ｋｒｇｔｒｉフルギニン、１１ｓ［インロイシン、Ｇ
１３１はグリシン、Ｑｌｕはグルタミン酸、Ｇｌｎはグ
ルタミン、ｃｙｔｓｌｔｌ’Ａシスチン、Ｓｅｒはセリ
ン、Ｔｙｒ　ｌｊ：チロシン、Ｐｈｅｉｊフェニルアラ
ニン、Ｆｉｉｓｔはメチオニン、Ｌｅｕｔｌ’ｌロイシ
ンをそれぞれ表わし、いずれもし−アミノ酸である。

■　分子量：約５０００（グルｐ過による。）■　紫外
線吸収スペクトル：　Ｍａｘ＝　２７５　ｎｍ。

■　呈色反応：エールリッヒ反応陰性、坂口反応、及び
・ぐウリ反応いずれも陽性。

■　酸８：＠中性・塩基性の別：塩基性■　溶剤に対す
る溶解性：水、メタノール及び酢酸ｆｃ溶解し、酢酸エ
チル、酢酸ブチル、エテルｘ　−テｐｖ　、ヘキサン、
石油エーテル、ベンゼン及びクロロホルムに難溶である
。

■　アミノ酸組成（アミノ酸分析によるモル比〕なお、
この化合物は前記のごとく塩基性であｐ１１量酸、例え
ば塩酸、硫酸、燐酸等、又は有磯酸、例えばＭ酸、酢酸
、グロピオン酸、コ／・り酸、クエン酸等と共に常法に
従っ′て酸付加塩に転換することができる。

■　β−ｈＡＮＰを還元して−８−Ｓ−結合全切断した
後カルボキシメチル化したものと、α−ｈ　ＡＮＰを還
元して−８−８−結合を切断した後カルボキシメチル化
したものとは、液体クロマトグラフィーにおいて単一ピ
ークの同一パターンを与える。また、これらのカルボキ
シメチル体をトリプシン処理した場合も、液体クロマト
グラフィーにおいて同一の／臂ターン（同一の分解物組
成）を与える。さらに、β−ｈＡＮＰは、α−ｈ　ＡＮ
Ｐの約２倍の分子量を有する。これらの事実から、β−
ｈ　ＡＮＰはα−ｈ　ＡＮＰの−８−８−を介する２量
体であると推定される。

さらに、β−ｈＡＮＰ及びα−ｈＡＮＰ　ｉそれぞれト
リグシン消化し、生成したペプチド組成の液体クロマト
グラフィーの結果を対比することにより、前記の２量体
は、２本のα−ｈＡＮＰが相互に逆行しこれらが−５−
８−結合を介して２ケ所で結合した構造を有することが
推定される。

（Ｂ）　β−ｈ　ＡＮＰの生物学的性質この発明のペプ
チドβ−ｈ　ＡＮＰは顕著なひな直腸標本弛緩作用、利
尿作用、及びナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を有
する。

試験方法 雄性ＳＤ系ラット（体重３００〜４００ｇ）に−ペンド
パルビタール６０　ＺｌＩ＆／ｋｌ？　腹腔内投与する
ことによって麻酔し、以下Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ
＋　Ｖｏｌ＠２８、　ｐｐ　３９〜９４に記載されてい
る方法に準じて行った。

気道６′「保のため、気前カニユーレ（Ｐ　ｇ　−２４
０Ｃ１ａｙ−Ａｄａｍｓ　）をＪμし、股動脈に血圧測
定用の動脈カニユーレ（Ｐｇ−１０にＰＥ−５０を接続
）を挿入し、股静脈にリンダル液投与用の静脈カニユー
レを挿入した。この静脈カニユーレを通して１、２　ｍ
ｅのリンケゝル液を約１０分間にわたって注入した後１
．２ゴ／時の速度で定常注入（ｃｏｎｓｔａｎｔＬｎｆ
ｕｓｌｏｎ）を行った。

シラスティック−チューブ（内径０．０２インナ、外径
０．０３フインチ、ダウコーニング社製）の膀胱カニー
−レから試験管内に採尿した。この採尿は被験物質を投
与する前３０分間と投与後５分間又はその後経時的に行
い、この尿試料の分析値を比較することにＪニジ被験物
質の作用を測定した。

被験物質β−ｈ　ＡＮＰは、その所定量を５μｓのバシ
トラシン（抗菌剤）と共に５０μｌの滅菌生理食塩水に
溶解し、頚静脈から投与した。

被験物質を投与した後経時的に採尿して経過を観、原し
た場合の結果は第１図のよりであった。この図から明ら
かなごとく、この発明のβ−ｈ　ＡＮＰのオＵ尿作用及
びナトリウム利尿作用は公知の利尿剤である７０セミド
のそれよりも急速に生じた。

またα−ｈＡＮＰと比べて同程度の活性を有するが利尿
およびナトリウム利尿の持続時間が長いという特徴を有
する。

β−ｈＡＮＰの利尿剤としての適性 前記のごとくこの発明のペプチドβ−ｈＡＮＰは顕著な
利尿作用及びナトリウム利尿作用を有する。

このペプチドは繰返し投与しても抗体産生を惹起せず、
アナフィラキシ−ショックを起こさない。

また、この発明のペプチドはＬ−アミノ酸のみからなり
、投与後、生体内の各種ｆＩ：Ｉテアーゼにより徐々に
分解されるため毒作用をほとんど有しない。

前記のごとく、β−ｈＡＮＰｔよμＭＡＩのオーダーで
効果を発揮し、毒性が非常に低いがら、１μｍ１Ａ９〜
ｌｌＩψ均の範囲で投与することができ、ｌμｇ２勺〜
ｌＯＯμｇ７勺の範囲で投与するのが好ましい。

この発明のβ−ｈＡＮＰは、ペプチド系医薬の投与に一
般に使用されている投与方法、すなわち非経口的投与方
法、例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等Ｖこよ
って投与するのが好ましい。経口投与した場合、β−ｈ
ＡＮＰは消化管内で分解を受けるためこの投与方法は一
般的には効果的でないが、ｉ１Ｍ化抽（ハ）で分ルアを
受けにくい製剤、例えば活１生成分であるβ−ｈＡＮＰ
をリボゾーム中に抱谷したマイクロカプセル剤として経
口投与することも可能であ名。又、直１腸、舌下、＃４
内など消化管以外の粘膜から吸収せしめる投与方法を採
用することも可能であり、この場合、例えば坐剤、旨下
錠、点鼻スプレー剤等の形で投与することができる。

（Ｃ）　β−ｈＡＮＰの製造方法 この発明のペプチドβ−ｈＡＮＰｆ′ｉ、ヒトの心房組
織を適当な酸性溶媒、例えは燐酸鉄゛衝液、垣酸含有酢
酸等の中でホモソネートシ、ヒナ直腸標本弛緩活性を指
標として、遠心分離、等醜沈絃、溶媒抽出、限外ｐ過、
グル濾過、吸着クロマトグラフィー等、ペプチドの精製
に常用される各種処理を適宜組合わぜて分子量約５ｏｏ
ｏ〜６０００のペプチド９を分離すること１ｃｊｆｉ得
られる。次に実施例によシ、この発明をさらに具体的に
貌明する。

秀１ｔコ　見上９山１差」４し一二すＮｐｏ分１死後１
０時間後にヒトの心房４０．９を摘出し、７倍量の、２
０饋聰酸を含有する１Ｍ酢酸中で５分間煮沸することに
より内在するグロテアーゼを失活せしめた。これを冷却
した後、４℃においてポリトロンミキサーでホモジナイ
ズすることにより抽出を行った。得られた抽出液を１２
０００ｘＧで３０分間遠心分離を行い、上清２００ｄを
得た・この上清に１２−の氷酢酸を加えてその濃度を１
規足濃反（へ））にθ署１訃した。このｈ１♂１３シ；
液に、アセトンを商加してその最終σ１度を６６係にす
ることによυアセトン沈＃を行い、次にこれを遠心分離
することにより４２４ｒｎＩ！の上清を得た。得られた
上清を減圧下で儂に＋乾固し、得られた残ａ全１００ｍ
ｅのＩＮ酢酸溶液に浴解し、そして５０　ｍｌずつのエ
ーテルで２回抽出することＶｃＪニジ脱脂した。得られ
た水ノ曽を凍結乾燥し、凍結乾燥物を再度１１００ｒ、
のＩＮ［悸醪済面に浴解し、そしてこれを限外ｐ過（ア
ミコン社製ＵＭ−２を使用）することに工り脱塩して５
０ｍ７！の濃縮液を得た。この濃縮液をＩＮ酢酸浴液で
平衡化した５Ｐ−８ｅｐｂａｄｅｘＣ−２５（ファルマ
シア製＋　８．　ＯＸ　２．２　ｃＩＩＬ）でグル濾過
した。溶離故としてＩＮ酢酸溶液、２Ｎピリジン溶液、
及び２Ｎピリジン−ＩＮ酢酸溶液（ＰＩ（５，０）を用
い、この；順序でｄ出を行い、それぞれフラクションＳ
　Ｐ　−１、Ｓ　Ｐ　−１１、及びＳＰ−［１を得た。

このフラクション５ｐ−ｉｔを凍結乾燥する仁とにより
凍結乾燥物２６６〜を得、これを１Ｎ＃、酸浴液に溶解
し、セファデックスＧ−５０によシダル濾過（カラムサ
イズ１．２Ｘ１０３ｃＴＬ；流速５．４ｍｇ／時間；ク
ラクション丈°イズ２１ｎｌ）（、た。これにより、ヒ
ナ直腸標本弛緩活性を有するβ画分（フラクション４４
２〜４５）を得た。この溶出ノ４ターンを第２図に示す
。

次に、このβ画分を一緒にし陽イオン交換高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）に付した。このクロマトグ
ラフィーにおいて１４、ＴＳＫ−ＣＩｉｌ１２ＳＷ〔東
洋普遍（掬製］カラム（７，５Ｘ３００間）を用い、溶
出溶媒としＣ（〜１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐ！４６
．６）ニアセトニトリル（９０：１０）、及び（Ｂ）　
１．０　Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ６，６）ニアセトニ
トリル（９０：１０）を用い、あらかじめ（Ａｌを１２
分間流した後、直線グラノエント法により酢酸濃度を１
０ｒｒＭから０．７５　Ｍまで変化させて１４０分間溶
出し、唯一のヒナ直腸筋標本弛緩活性両分（フラクショ
ン１６６６〜６７、保持時間１４２〜１４０分）を得た
。次に、これを逆相）ＩＰＬＣＫ付した。このクロマト
グラフィーにおいては、カラムＴＳ’Ｋ　ＬＳ−４１０
０ＤＳ−８ＩＬ　（−ｔｊイズ４．０’Ｘ２５０關）ｔ
−使用し、速度１．０＋＋１７！／分、圧力１１０〜１
３０　ｋｇＡｒＬ２とし、溶出溶媒として（４）水ニア
セトニトリル：　ｉ　ｏｓトリフルオロ酢ｃ１ｋ（９０
：１０：１）、及び（Ｂ）水ニアセトニトリル：１０％
トリフルオロ酢酸（４０：６０：１）を使用した。（Ａ
）を１５分間流した後、に）から（Ｂ）への直線グラジ
ェント法で８０分間溶出した。主要ピークを分取し、実
質的に純粋なβ−ｈＡＮＰをｆｉｎモル得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は利尿作用及びナトリウム利尿作用の経時変化を
示し、第２図は心房からβ−ｈＡＮＰを分離する場合の
α成分とβ成分の分離を示すクロマトグラムである◎ ＄１図 経過時間（時）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の構造式（１） （式中■と■、及び■と■は直接に結合している） で表わされるペプチド。 ２、次の構造式（１）、 以−１：百２臼 ａ　匈 （式中■と■、及び■と■は直接に結合している） で表わされるペプチドを廟効成分とする利尿剤。