JPS617298A - 新規なペプチド及びこれを有効成分とする医薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、ひな直賜筋標本弛緩作用、利栄作用及び血
圧降下作用を有するペプチド並びにその塩、並びにこれ
らを含んで成る医薬に関する。

（従来の技術） 種々の体液性因子、すなわち生理活性物質が、物理的因
子、例えば心拍出量、血管壁の弾性等と共に血圧を規定
する重要な因子であることはよく知られている。この体
液性因子が関与する系として、レニン−アンジオテンシ
ン−アルドステロン系、カテコラミン糸、プロスタグラ
ンジン系、カリクレイン−キニン系と共にナトリウム利
尿ホルモン系が存在し、ウアペイン様物質といわれるナ
トリウム利尿ホルモンが血圧の上昇に関与することもす
でに周知である。

なお、この明細書において「ナトリウム利尿」とはカリ
ウムイオンに対してナトリウムイオンを選択的に排泄す
る利尿を言う。

ヒトの心房中には、ペプチドホルモン産生細胞中に見ら
れる顆粒と形態的に類似する顆粒が存在することが知ら
れている（　Ｊ、Ｄ、Ｊａｍｊｅｓｏｎ及びＧ、Ｅ、Ｐ
ａ１ａｄｓ、Ｊ、Ｃｓ１ｌ　Ｂｌｏｌ　、、　２３　、
　Ｉ　５１（１９６４））。また、ラットの心房のホモ
ジネート物及びその顆粒が、ラッ）Ｋ対してナトリウム
利尿を起すことも知られているＣ　Ａ、Ｊ、　ＤｅＢｏ
ｌｄ等、ＬｌｆｅＳｃｉ　　、、　　２８　　、８９（
１９８１）　　：Ｒ，Ｋｅｅｌｌｓｒ　　１Ｃａｎ、　
Ｊ、Ｐｈｙｍｊｏｌ　、　Ｐｂａｒｍａｅｏｌ、　６０
　ｓ　　１０７８（１９８２）等〕。さらに、最近にお
いて、ＭａｒｋＧ、　Ｃｕｒｒｌｓ　Ｓ、郷はヒト、ウ
サギ、ブタ及びラットの心房中にナトリウム利尿作用を
有する分子量２万〜３万のペプチド様物質及び分子量１
万以下のペプチド様物質が存在することを示唆したＣ３
ｏＩ＠ｎａ＊、２２１．７１〜７３　（１９８３））＊
最近になって、アズノ酸数２８個のラット由来のペプチ
ドが同定された（　Ｂ、Ｂ、ＲｌＣ−Ｖｏｌ　−１１７
＠黒３．８５９〜８６５頁（１９８Ｂ）：＋、ｔた本発
明者等は、ヒト由来のα−ｈＡＮＰ〔特願昭５８−２４
３６７５　：　Ｂ−Ｂ−Ｒ＝Ｃ１Ｖｏｌ　、１１８　＊
　４１−１３１〜１３９頁（１９８４））、及びβ−ｈ
ハＰ（特願昭５９−３８８１７）、並びにラット由来の
β−ｒＡＮＰ　（特願昭５９−３８８１６）　　を見出
し、その構造及び薬理活性を明らかにした。

本発明者等は、引き続き、効果的な利尿作用を有する物
質を見出すべく鋭意研究を行った結果、ラットの心房か
ら、１２６個のアミノ酸で構成され約１３，０００の分
子量を有する全く新しいペプチドを単離することに成功
し、このペプチドの構造を決定すると共に、ξのペプチ
ドが顕著な、利尿作用、及び血圧降下作用を有すること
を見出し、この発明を完成した。

（発明が解決しようとする問題点） すなわち、この発明は、顕著な利尿作用及び血圧降下作
用を有する新規なペプチド、並びに該ペプチドを含んで
成る利尿剤、及び血圧降下剤を提供する仁とを目的とす
る。

なお、この明細書において、この新規ペプチドをｒ　−
ｒＡＮＰ　（ｒ　−ｒａｔ　ａｔｒｉａｌ　ｎａｔｒｉ
ｕｒｅｔｉ。

ｐｏｌｙｐ＠ｐｔｉｄｅ　）と称する。

（問題点を解決するための手段） 前記の目的は、次に記載するγ−ｒ　ＡＮＰを提供する
ことによシ達成される。

（４）　γ−ｒＡＮＰの構造及び物理化学的性質■　こ
の発明のペプチドγ−ｒ　ＡＮＰは次の構造式％式％ （式中、１０５位のＣｙｓと１２１位のＣｙｓはジスフ
ィト結合で結合している。） 上記の構造式において、このペプチドは左側にアミン末
端を有し右側にカルボキシ末端を有する。

式中、Ａｓｎはアス、ｆラギン、Ｐｒｏはプローリン、
Ｍｅｔはメチオニン、Ｔｙｒはチロシン、Ａｌａはアラ
ニン、■ａｌハパリン、Ｓｅｒハセリン、Ａｓｐ　Ｉｄ
、　７　スｐ４　ラｘｆンｔＬＬｅｕｉｄロイシン、Ｐ
ｈｅハフェニルアラニン、ＬｙＢはリジン、Ｈｌｓはヒ
スチジン、Ｇｌｕはグルタミン酸、Ｇｌｎはグルタミン
、ＧＩｙはグリシン、Ｔｈｒｉｊスレオニン、Ａｒｇハ
アルギニン、Ｔｒｐはトリプトファン、Ｃｙｓはシステ
ィン、そしてＩｌｅはイソロイシンをそれぞれ表わし、
いずれもＬ−アミノ酸である。

この構造はアミノ酸分析の結果、及び心房から得られた
ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの解析から得られた遺伝子の同
定結果（第５図参照）から決定されたものである（同日
出願に係る「新規ＤＮＡおよびその用途」を参照のこと
）。

■　分子量：約１３，０００（ダル沢過法による。）理
論分子ｘ　　１３６２９゜ ■　紫外線吸収スペクトル：　Ｍａｘ　＝　２７５　ｎ
ｍ０■　呈色反応：エールリッヒ反応陰性、坂口反応、
及び・９ウリ反応いずれも陽性。

■　酸性・中性・塩基性の別：塩基性 ■　溶剤に対する溶解性；水、メタノール及び酢酸に溶
解し、酢酸エチル、酢酸ブチル、エチルエーテル、ヘキ
サン、石油エーテル、ベンゼン及びクロロホルムに難溶
である。

■　アミノ酸組成（アミノ酸分析による）以下余白 アミノ酸　　　実測値（モル比）　　　理論値（モル比
）Ａｓｘ　　　　　　　　１３．０６　　　　　　　　
　　１４Ａｈａ　　　　　　　　９．６１　　　　　　
　　１１０Ａｒ　　　　　’　　　９．５８　　　　　
　　　１０１１ｅ　　　　　　　　２．１０　　　　　
　　　２Ｇｔｙ　　　　　　　１１．２２　　　　　　
　　１２Ｇｌｘ　　　　　　　１１．１８　　　　　　
　　１２（Ｃｙｓ）２　　　　０．５８　　　　　　　
　　１Ｓｅｒ　　　　　　　１２．３１　　　　　　　
　１５Ｔｙｒ　　　　　　　　１．８７　　　　　　　
　　２Ｐｈｅ　　　　　　　　３．３０　　　　　　　
　　３Ｍｅ　ｔ　　　　　　　　２．８２　　　　　　
　　　３Ｌｅｕ　　　　　　　１４．３７　　　　　　
　　１５Ｖａｌ　　　　　　　　６．００　　　　　　
　　　６Ｔｈｒ　　　　　　　　２．９８　　　　　　
　　　３Ｔｒｉ　ｓ　　　　　　　　１．２７　　　　
　　　　　１Ｌｙａ　　　　　　　　４．４３　　　　
　　　　　４なお、この化合物は前記のごとく塩基性で
あり、無機酸、例えば塩酸、硫酸、燐酸等、又は有機酸
、例えｉ、ｆ蟻酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、り
エン酸等と共に常法に従って酸付加塩に転換することが
できる。

（Ｂ）　　ｒ　−ｒＡＮＰの生物学的性質この発明のペ
プチドｒ　−ｒＡＮｐは顕著な利尿作用、及び血圧降下
作用を有する。

試験方法 雄性ＳＤ系ラット（体重３００〜４００．９　）にペン
ドパルビタール６０ｍ９７ｋｆｌを腹腔内投与すること
によって麻酔し、以下Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　＋
Ｖｏｌ・２８、ｐｐ３９〜９４に記載されている方法に
準じて行った。

気道確保のため、気管カニユーレ（Ｐ　Ｅ　−２４０Ｃ
１ａｙ−Ａｄａｍｓ　）を施し、股動脈に血圧測定用の
動脈カニユーレ（ＰＥ−１０にＰＩ−５０を接続）を挿
入し、股静脈にリンダル液投与用の静脈カニユーレを挿
入した。この静脈カニユーレを通して１．２ｍｌのリン
ダル液を約１０分間にわたって注入した後１．２ｍｌ／
ｖｊの速度で定常注入（ｃｏｎｓｔａｎｔ　Ｉｎｆｕｓ
ｌｏｎ）を行った。

シラスティック・チューブ（内径０．０２インチ、外径
０．０３フインチ、ダウコーニング社製）の膀胱カニユ
ーレから試験管内に採尿した。この採尿は被験物質を投
与する前３０分間と投与後５分間又はその後経時的に行
い、この尿試料の分析値を比較することにより被験物質
の作用を測定した。

被験物質γ−ｒＡＮＰは、その１μモル及び２μモルを
５μｇのバシトラシン（抗菌剤）と共に５０ｔｔｌｌの
滅菌生理食塩水に溶解し、頚静脈から投与した。

被験物質を投与した後経時的に採尿して経過を観察した
場合の結果は第１図のようであった。この図から明らか
なごとく、この発明のγ−ｒ　ＡＮＰの利尿作用は、微
量の投与によシ生じる。

捷た、第２図に示すごとく、この発明のｒ−ｒＡＮＰを
投与した後、血圧は緩かに約２０１！ＢＨｇ降下し、約
１時間持続した。この結果によシγ−ｒＡＮＰがα−ｈ
ＡＮｐよシ顕著に持続する血圧降下作用を有することが
明らかになった。

ｒ　−ｒＡＮＰの医薬としての適性 前記のごとくこの発明のペプチドｒ　−ｒＡＮＰは顕著
な利尿作用及び血圧降下作用を有する。

このペプチドは繰返し投与しても抗体産生を惹起せず、
アナフィラキシ−ショックを起こさない・また、この発
明のペプチドはＬ−アミノ酸のみからなり、投与後、生
体内の各種プロテアーゼによシ徐々に分解されるため毒
作用をほとんど有しない。

前記のごとく、１−　ｒＡＮＰはμ９／に９のオーダー
で効果を発揮し、毒性が非常に低いから、１μｇ／ｋｙ
〜１０〃勺の範囲で投与することができ、１０μ９／ｋ
ｇ〜１４勺の範囲で投与するのが好ましい。

この発明のγ−ｒ　ＡＮＰは、ペプチド系医薬の投与に
一般に使用されている投与方法、すなわち非経口的投与
方法、例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等によ
って投与するのが好ましい。経口投与した場合、ｒ　−
ｒＡＮＰは消化管内で分解を受けるためこの投与方法は
一般的には効果的でないが、消化管内で分解を受けにく
い製剤、例えば活性成分であるｉ　−ｒＡＮＰをリポゾ
ーム中に抱容したマイクロカプセル剤として経口投与す
ることも可能である。又、直２腸、舌下、４内など消化
管以外の粘膜から吸収せしめる投与方法を採用すること
も可能であり、この場合、例えば坐剤、舌下錠９点鼻ス
プレー剤等の形で投与することができる。

（Ｃ）　　１−　ｒＡＮＰの製造方法 この発明のペプチドγ−ｒ　ＡＮＰは、ラットの心房組
織を適当な酸性溶媒、例えば燐酸緩衝液、塩酸含有酢酸
等の中でホモジネートし、ヒナ直腸標本弛緩活性を指標
として、遠心分離１等電沈澱、溶媒抽出、限外ｆ過、ダ
ル沢過、吸着りロマトダラフイー等、ペプチドのＮ製に
常用される各種処理を適宜組合わせて分子量約１３，０
００のペプチドを分離することによシ得られる。

次に実施例によシ、この発明をさらに具体的に説明する
。

実施例１．　γ−ｒＡＮＰの製造 ラットの心房９４個を摘出しＣ総ｎ１６．９＆）、１０
倍量のＩＮ酢酸を加え、ホモジナイズし、さらに冷却ア
セトンを加えて２倍量となし、ホモジナイズすることに
よシ抽出を行った。これを１６．０００Ｘｇで３０分間
遠心分離し、その上清を減圧蒸留することによりアセト
ンを除去し、約１００ｍ７Ｉの抽出液を得た０ 得られた抽出液に、酢酸：水（１：２）を４５０４を加
え、逆層カラムＬＣ８ＯＲＢ　ＳＰ−Ｃ−ＯＤＳ（Ｃｈ
ｅｍｃ。

製）９０Ｉｎｌに附し、１：Ｎ酢酸４００ｍ１で流し、
ついで水ニア七ト二トリル＝１０チドリフルオロ酢酸（
４０：６０　：　１　）３００ｍ／で溶出させその溶出
画分を凍結乾固させ、１２０ｍ９の乾固物を得た。

得られた乾固物を、５ｍｊＯＩＮ酢酸に溶解し、ＩＮ酢
酸溶液で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−７５によ
りｙル濾過（ファルマシア製；カラムサイズ１．８　Ｘ
　１３５ｃｒｎ、流速ＩＱ、６ｍ／／時間；フラクシ冒
ンサイズ５ｔｎｌ）シた。

この結果を第３図に示す。ヒナ回腸標本弛緩作用画分（
フラクション番号４３〜４８２分子量１３０００付近）
３０ｄを得、これを１００μβずつ、試料として液体高
速クロマトグラフィーに付した。

このクロマトグラフィーにおいては、ＴＳＫＯＤＳ〔東
洋１達（株）製〕カラム（サイズ４．０Ｘ２５０■）を
使用し、流速１．　Ｑ　ｍｌ　７分、圧力１１０〜１３
０　ｋｇ／ｃｔｎ２とし溶出溶媒として（Ａ）水ニアセ
トニトリル：１０チトリプルオロ酢酸（７０：３０：１
）及び（Ｂ）水ニアセトニトリル：　１０　％　）リフ
ルオロ酢酸（４０：６０：１）を使用した。カラムを（
Ａ）で平衡化した後、試料なシ主入し、（Ａ）から（Ｂ
）への直線グラジェント法で８０分間溶出した。この結
果を第４図に示す。ヒナ回腸標本弛緩画分（保持時間２
７分）のピークを分取し、純粋なγ−ｒＡＮＰ　０．９
ｎモルを得た。この操作を反復することにより合計２６
６ｎモルのγ−ｒＡＮＰを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明のｒ−ｒＡＮＰの利尿作用を示し、第
２図は血圧降下作用を示すグラフであり、第３図は５ｅ
ｐｈａｄｅｘ　Ｇ−７５を使用するクロマトグラフィー
の溶出経過を示し、第４図は液体高速クロマトグラフィ
ーにおける溶出経過を示し、そして第５図はｒ−ｒＡＮ
Ｐをコードする部分を含むｃＤＮＡの配列を示す。 （山ｕ　０８乙）　某遁 １　　　　　　０　　　　　　　■　　　　　　　さΦ
○　　　　岬く 絵　　　　　二日　−Ｑ 山？　　　　　ｌ：＋４ ：Ｉ〇 −く Ｏ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の構造式 【遺伝子配列があります】 （式中、１０５位のＣｙｓと１２１位のＣｙｓはジフル
   フィド結合により結合している、）で表わされるペプチ
   ド及びその酸付加塩。 ２、次の構造式 【遺伝子配列があります】 （式中、１０５位のＣｙｓと１２１位のＣｙｓはジスル
   フィド結合により結合している） で表わされるペプチド又はその酸付加塩を含んで成る利
   尿剤。 ３、次の構造式 【遺伝子配列があります】 （式中、１０５位のＣｙｓと１２１位のＣｙｓはジスル
   フィド結合により結合している） で表わされるペプチド又はその酸付加塩を含んで成る血
   圧降下剤。