JPH0377899A - ナトリウム排泄亢進性ペプチド化合物 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なペプチド化合物に関し、このペプチド
化合物は下垂体プロホルモンであるブロオビオ“メラノ
コルチソ（ＰＯＭＣ）のＮ−末端部（ＮＴＦ）と同様な
配列順序を有する。同じまたに記載の１類似のペプチド
は、体液と電解質のバランスの生理学的ｍ節に関係する
ホルモンとして作用するごとができる。

本発明のベグブード化合物はすトリウム排泄亢進活性お
よび利尿活性を有するので、う、血性心不全症、高血圧
症、その抽水−電解質のバランスの障害の治原に有効Ｃ
あ、、Ｃ１本発明４ｊバ二４に記載のらの医薬組成物に
も関する。

［従来の技術および発明が解決１．ようとする課題］Ｐ
ＯＭＣは、副腎皮質における糖質コルチブイド、ムルモ
ンであるコルチゾールの生産を調節するＡ　ＣＴ　１１
およびフルチ１トロピン、ならびにβ−リボトロピン、
α〜およびβ−メラノＩ・ロビン、およびβ−エンドル
フィンなどのいくつかの生理活性なペプチド類を含めた
下垂体由来〉）（ル干ン類の前駆分子であるゆ亮濃度に
おいて、これらペプチド類の全てはに質コルヂコイドホ
ルモンであるアルドステロンの分泌を試験管内でまたは
生体内で刺激することができ、このことＧ、ｊｌ、直接
的な硲ＭＥはないけれどｔ）１．容量と血圧の動的正常
平衡を生理学的に調節するうえで上記ペプチド類が重要
な役割を演することを示唆している。これらペプチド類
の全てはＰＯ）托分子の中間部分およびＣ−末端部分に
由来するが、ＰＯＭＣは７０個より多数のアミン酸から
なる大きなＮ−末＠部分を有して４写り、その生理学的
機能は未知゛Ｃある。ライ・−デ′？゛ンら（Ｗｉｅａ
ｏａｍａｎｎ　ｅｔ、　ａｌ）（第７回内分泌学アジア
およびオセ°アニア会議１９８２年、ｐ８８）はＮ　Ｔ
　Ｆ中間領域ベブチ・ド、ずなわら、ＮＴＦ（３２−４
９）を合成し６、それに対する抗匍清を作成１２、また
、ＮＴＦ中間領域様ベグチド類を測定するのに適当な放
射線標識免疫検定法を開発したゆごの検定法を用いて、
３・ｌ・リウム尿排泄元進性動物干ヌｆル（単腎臓切除
ラット）の血碩中のＮＴＦ中間領域梯免疫反応性物質（
ＩＲ−ＮＴＦ）を測定したところ、ナトリウム排泄監と
血漿ＩＲ−ＮＴＩ？　ｍ度との間には一貫した正の相関
が認められた。すなわち、ＩＲ−ＮＴＦの上昇を阻止す
る実験処置によってすｌ・リウム尿徘泄亢進も阻止され
た。　　（Ｌｉｎ　ｅｔ　ａｉ＋　１９８５．　Ａｅｉ
、、Ｉ。Ｐｈｙｓｉｏｌ。

２４９、　Ｐ２Ｏ３：　Ｌｉｒｉ　ｓｔ　ａｌ、、　１
９８７．　Ａａ、、ｉ、Ｐｈｙｓｉｏｌ。

２５２、Ｆ２７Ｇ参照）これらの実験結％、は、ＮＴＦ
またはＮＴＦ由来ペプチドによってすトリウム尿排泄が
亢進することを、証明とは言えないまでも示唆をしてい
る。完全なＮＴＦも、また、ＮＴＦの中間部分に由来す
るペプチド類もこれまで利尿またはすｌ・リウム排泄に
間ｊ、ｌｊ−る、−と［、Ｊ、知られてなかった。

〔課題を解決する六パめの手段〕

今や、本発明仔ら（、）に記載の゛アミノ酸配列順序Ｎ
　Ｔ　Ｆ’（３７−４９）を有するペプチド類がナトリ
ウム排泄亢進性および利尿性を示ずことを見出ｊ７た。

本発明は、少くとも］−′記の基本的アミノ酸配列順序
を存することを特徴とする合成ペプチド化合物を掛供す
る。

Ｘ−Ｇｕｙ−Ａｓｎ−Ｇｕｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ
−Ｐｒｏ−Ｌｅａ−Ｔｌ＋ｒ−Ｙ式中、Ｘは水素５、単
一アミノ酸（例えば、ＰＦＯ）、２−・６個のアミノ酸
からなるペプチド（例えば、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ、　ｌ′Ｉ
ｅｅ、−Ｐｔ＋ｅ−Ｐｒｏ、　Ｖａｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ
、　ＰｒｏＪｅｔＰｈｅ−Ｐｒｏ、　Ｐｒｏ−Ｖａｌ−
Ｐｈｅ−Ｐｒｏ、　Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｍｅ叡−ＰｈｅＰ
ｒｏ＋　ＴｈｒＰｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ＋　Ｇ
ｌｕ−↑ｈｒ−Ｐｒｏ−ＮｅｔＰｈｅ−ＰｒｏまたはＧ
ｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ）、炭
水化物または糖脂質であり、ＹはＯＨ，Ｎｌ２　、単一
アミノ酸（例えば、Ｇｌｕ）もしくはそのアミド、２〜
４個のアミノ酸からなるペプチドもしくはそのアミド、
炭水化物または糖脂質であり、また、Ｃ末端は遊離酸、
塩またはアミドである。

本発明はまた、上記ペプチドを有効成分とする医薬組成
物を提供する。この医薬組成物はナトリウム排泄充進剤
、利尿剤および抗高血圧症剤として有用であって、うっ
血性心不全症その他の体積動的平衡の不全症ならびに高
血圧症の患者の治療に有効である。

日のベブチ′の　゛ 本発明のペプチドは全て、アミノ酸の配列順序がＮＴＦ
の既知配列順序３７−４５と同じである活性コアをもっ
ている。しかしながら、ＮＴＦの４５位のスレオニンに
は炭水化物側鎖が付加する一方、本発明の一部のペプチ
ドは炭水化物を含まない。

第１図にはヒトＮＴＦの基本構造が示され、配列（３７
−４５）には下線がひかれ、また、グリコジル化位置に
は＊印が付いている。

ＮＴＦ配列（３７−４５）　　（以下、ｒ　Ｇ９ＴＪと
いうことがある。）と同じアミノ酸配列をもつペプチド
の他に、本発明のペプチドには、Ｇ９Ｔをコアに有し且
つＮ−末端が１．２．３．４．５．６またはそれ以上の
アミノ酸によって伸展せる、またはＣ−末端が１，２，
３．４またはそれ以上のアミノ酸によって伸展せる、ま
たはＮ−末端とＣ−末端の両方がそのように伸展せるペ
プチドが含まれる。Ｃ−末端およびＮ−末端の伸長鎖の
いずれも、ＮＴＦの天然の配列における対応するアミノ
酸と同一であっても相違してもよい。

二１±ヱΩ金底 本発明のポリペプチドは下垂体またはその他の組織から
の抽出によって、または、組換えＤＮＡ技術によって、
固相法または液相法による化学的合成法により製造でき
る。

好ましい化学的合成法は、メリーフィールド（Ｍｅｒｒ
ｉｆｉｅｌｄ）　Ｊ、Ａｓ、Ｃｈｅｓ、Ｓｏｃ、　８５
　：　２１４８（１９６３）に記載されている固相法で
ある。この方法によれば、４−アルコキシベンジル樹脂
のような固相樹脂に結合せるアミノ酸が、ペプチドのＣ
末端となるアミノ酸の保護された誘導体に始まり、生長
しつつあるペプチド鎖に一つづつカップリングされる。

この生長過程では、それぞれのアミノ酸について保護基
脱離、中和およびカシプリングからなる完全なサイクル
が行われる。アミノ酸の保護は好ましくは次のように行
われる。すなわち、全てのアミノ酸においてそのα−ア
ミノ基をｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏａ）で保
護し、アスパラギン酸およびグルタミン酸のβ−カルボ
キシル基を０−ベンジル基（０−ａｚｊりで保護し、セ
リンおよびスレオニン中の水酸基をベンジル％　（Ｂｚ
ｊ！　）で保護し、チロシンの水酸基を２．６−ジク９
０ベンジル基（Ｃｊ２ＪｚＪ）で保護し、アルギニンの
グアニジノ基およびヒスチジンのイミダゾール基をトシ
ル基（Ｔｏｓ）で保護し、リジンのε−アミノ基をクロ
ロベンジルオキシカルボニル基（ＣＩ、−Ｚ）で保護し
、システィンのチオール基をアセトアミノメチル基（Ａ
ｃｓ＋）で保護する。合成反応完了後保護されたペプチ
ド樹脂を弗化水素で処理することによって樹脂からペプ
チドを除去するとともに保護基を除去する。酢酸水溶液
を用いて粗ペプチドをペプチド樹脂混合物から抽出し、
Ｃ−１８についてのフラッシュクロマトグラフィーおよ
び逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によっ
て精製する。

本発明の合成ペプチドは、所望ペプチドのアミノ酸配列
順序についての知識を有する当業者が適当な装置を用い
て製造することができる。

本発明のペプチドは、また、下垂体から、好ましくは、
ウシ、ブタまたはヒツジの下垂体から天然ＰＯＭＣＮ−
末端を抽出し、引続き、抽出物の酵素開裂によって所望
構造を有するペプチドとし、これを抽出し、標準的蛋白
精製法によって精製することにより得られる０本発明の
ペプチドは、また、組換えＤＮＡ技術によって製造する
ことができる０例えば、所望ペプチドのアミノ酸配列順
序を符号化するオリゴヌクレオチドを合成し、これを適
当なプラスミドに挿入し、次いでこのプラスミドをＥ、
Ｃｏ１１に導入し、次いでＢ、Ｃｏ１１中のペプチドを
確立された方法で抽出し、精製することができる。

注ｍ支定 本発明のペプチドの利尿活性およびナトリウム排泄増加
活性はＳｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙまたはＬｏｎｇ−
Ｂｖａｎａ隨ラットで検定される。ペプチドまたは賦形
剤（対照用）を実験期間において静脈内注射または一つ
の腎動脈への持続注入によって麻酔動物に注入し、また
は、エーテルで簡易に麻酔せる動物に筋肉内もしくは皮
下注射によって注入し、次いで実験期間の完了まで意識
を以って自由に運動さ（することによって検定した。所
定時間後に尿試料を集めて、その量を計るとともに、炎
光分光光度分析（フレーム光度定量）によりナトリウム
およびカリウム濃度を測定した。それぞれの方法の詳細
は後記実施例■〜■において説明する。

拍Ｊ！虞孟μ豆ｍ 本発明のペプチド化合物は、うっ血性心不全または水お
よびナトリウム貯留に伴なうその他の症状、例えば慢性
腎不全、肝硬変症の患者、または高血圧産、学者の治療
に有効である。本発明のペプチド化合物は従来の利尿薬
と比較していくつかの利点をもっているやすなわち、ペ
プチドであるが故に、容易に割裂して天然アミノ酸とな
り、生体蛋白構築用ブロックを形成する。非常に高い特
異性を示すが故に、実質的に無毒性であって服用時の副
作用が従来の医薬より低い。心房性すＩ・リウム排泄亢
進ペプチドのような他のナトリウム排泄先進性ベブチＦ
と比較して、本発明のペプチド化合物は作用の持続が長
く、従って、投与回数を低減することができる。

本発明のペプチド化合物は利尿薬組成物の活性成分とし
て存用である。この化合物はＭ酪酸の形でまたはアミド
として、または酢酸塩、クエン酸塩、塩酸塩、マレイン
酸塩、マロン酸塩、シ５、つ酸塩またはコハク酸塩のよ
うな塩として用いることができる。

静脈、筋肉内および皮下注射など非経口的投与用組成物
は、そのまま使用可能な溶液としてまたは投与に先立っ
て無菌水、食塩水もしくはその他の適当な溶削に溶解し
て用いる凍結転Ｒ粉末の形に調製することができる。こ
れらの医薬組成物は溶液ａｄ当りペプチド０゜Ｏ１〜１
００マイクログラムを含むことができ、ざらに、非活性
成分、例えば、酢酸塩、重炭酸塩または燐酸塩のような
緩衝剤、アスコルビン酸またはトコフェロールのような
抗酸化剤、ブタノールのような防ＪｌｆＪ、ガラクト・
−ス、グルコース、ラクトース、ソルビトールまたはス
クロースのような浸透圧調節削を含むことができる。

非経口的投与用、特に筋肉内もしくは皮下注射用医薬組
成物は活性が持続するよう特別に調製される。すなわち
、活性ペプチドを吸収せる固体キャリア、例えば、水酸
化亜鉛から、または活性ペプチドを溶解せる粘性液、例
えば、油もしくは部分水添ゼラチンから、または活性ペ
プチドを＠潤せるヒドロコロイド、例えば、アルギン酸
ナトリウム、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム
塩もしくはポリビニルピロリドンから、または活性ペプ
チドをマイクロカプセル化して含むリボゾームから、そ
れぞれ活性ペプチドが徐々に放出されるように構成する
。医薬組成物は、また、肛門坐剤、算用スプレー剤、舌
下用錠剤、または経皮粘剤とすることができる。本発明
のペプチドを胃および小幅の消化性酵素から保護するた
めの調剤も考えられる。

いかなる投与単位においても活性成分の絶対量は投与方
法および投与率に適当なレベルを超えてはならないが、
他方、小敵の投与回数によって所望投与率が得られるよ
うにずべきである。好ましい投与形態（それに限定され
るわけではないが）は非経口投与、すなわち、静脈、筋
肉内または皮下注射である。好ましいペプチド投与量は
体重−５り０．００２〜２０．Ｏｘ　ｉＯ−”　モア１
／、好ましくは０．０２−Ｚ　Ｏｘｉｏ−９モルである
。しかしながら、いかなる場合においても投与すべき量
は、使用するペプチドの種類、医薬の処方、投与目的お
よび年令、性別および共存する疾病の種類のような要因
に依存するであろう。

〔実施例〕

以下、実施例について本発明を具体的に説明する。

ス】ｌ九１ 前記の固相ペプチド合成方法に従って次の配列を有する
ペプチド（以下、Ｆ１５Ｒと略称する）を合成した。

Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａｓｎ−Ｇ　１　ｙ−Ａ
ｓｐ−Ｇ　１　ｕ−Ｇ　１　ｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＯＨＣ末端残基
としてのＢｏｃ−Ａｒｇ　（Ｔｏｓ）−０−樹脂（置換
度０．３８　ｓ＋ｅｑ／　ｇ　）から出発して、保護基
脱離、中和およびカップリング反応のサイクルを次の手
順に従って繰返し１４回行った。Ｂｏｃ−Ｐｒｏ、　Ｈ
ｏｅ−Ａｓｎ＋Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）＋　Ｂｏｃ
−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、　Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、　Ｂｏｃ−Ｐ
ｒｏｓＢｏｃ−Ｇｉｎ、　Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）
、　Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）、　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ＋
　Ｂｏｃ−Ａｓｎ＋　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ＋　Ｂｏｃ−Ｐｒ
ｏおよびＢｏｃ−Ｐｈｅ。

Ｂｏｃ−＾ｒｇ（Ｔｏｓ）−０−樹脂２．６ｇを塩化メ
チレン（ＭｅＣｊｌ　）で３回洗浄し、次いで、ＴＦＡ
の４０容量％（ｖ／ｖ）　　ＭｅＣ４溶液で処理するこ
とによってＢｏｃ基を除いた。その際、５分間の予備洗
浄およびそれに続いて３０分間の脱保護基反応を行った
。

アミノ酸樹脂を３回ＭｅＣ１で洗浄し、２回エタノール
（Ｅ　ｔＱＨ）で洗浄し、次いで１０％トリエチルアミ
ンＭｅＣＪ！溶液で中和した。このＷＡ５分間の予備洗
浄とそれに続き１０分間中和処理を行った。樹脂をＭｅ
Ｃｊｌで３回洗浄した後カップリング反応を行った。　
Ａｓｎ’、　Ｇｉｎ”およびＡｓｎ’コを組入れる場合
を除き、カップリングは次のように行った。適切なりｏ
ｃアミノ酸の３倍過剰量（６ミリモル）のＭｅ（４２５
Ｍ１溶解液を保護基を脱離せるペプチド樹脂に加えた。

２分間撹拌後３倍過剰量（６ミリモル）のジシクロへキ
シルカルボジイミド（ＤＣＣ）のＭｅＣｊ１５ｍ溶解液
を加え、２時間反応せしめた。　Ａｓｎ’Ｇｉｎ”およ
びＡｓｎ”は、ＤＣＣおよびヒドロキシベンゾトリアゾ
ール（ＨＯＯＴ）法、すなわち、６倍過剰量のＨＯＢＴ
および６倍過剰量のＤＣＣのジメチルホルムアミド／　
ＭｅＣＪ　　（１：　１）混合物溶解液を用いる方法に
よって組入れた。いずれの場合においても、ペプチド樹
脂はＭｅＣｊｌで３回洗浄し、ＥｔＯＨで２回洗浄し、
ＭｅＣｊ？で３回洗浄し、次いでカップリング反応を行
った。カップリング反応の終了はカイザー（Ｋａｉｓｅ
ｒ）らのニンヒドリン発色試験法によって監視した（Ａ
ｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｓ、３４　：　５９５−５９８゜
１９７０参照）。

合成が完了した後保護されたペプチド樹脂をＭｅＣｊｌ
で洗浄し、ＴＦＡの４０％ＭｅＣｊ溶解液で３０分処理
し、引続き阿ｅｃｌ　、ＥｔＯＨおよびＭｅＣｌで洗浄
し、減圧乾燥した。乾燥ペプチド樹脂を４．０ｇ秤量し
た。アニソール７．５ｄの存在下に蒸留無水フッ化水素
（ＨＦ）７０ｍを用いて一２０℃で３０分間さらに０℃
で３０分間処理することによって、ペプチドの保護基脱
離および開裂を行った。過剰のＩＦを除去した後、ペプ
チド樹脂混合物を無水エーテルで洗浄して、アニソール
およびその誘導体を除去した。　１０％酢酸水溶液にて
粗ペプチドを抽出した。

流量２．５ｍ／分にて０〜１００％のＢの直線状濃度勾
配（Ａ：０．１％ＴＦＡＩ　Ｉ！：　Ｂ　：３ｕ％アセ
トニトリル／７０％ｕｚｏｔｚ）を用いて４　Ｘ２０Ｃ
ＩＣ−１８（Ｊ、Ｔ。

Ｂａｋｅｒ、　４０　ｍ）カラム上フラッシュ・クロマ
トグラフィーにて粗ペプチドの凍結乾燥生成物１．１ｇ
を精製した。溶出液を２５４ｎｓにて監視し、分析用高
速液体クロマトグラフィーＨＰＬＣおよび薄層クロマト
グラフィー（ＴＬＣ）により分析した。この手法を２回
繰返して最終ペプチド生成物を合計４７．１■得た。こ
のペプチドをＨＰＬＣＳＴＬＣ、濾紙電気泳動、アミノ
酸分析および高性能電気泳動にて分析したところ、実質
的に不純分を含んでいなかった（表Ｉ参照）。

Ｆ１５Ｒと同一の手法によって、配列ｃｌｙ−＾５ｎ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｈｒを有するＧ９Ｔ、配列Ｇ　１　ｙ−Ａｓｎ−Ｇ１　
ｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌ　ｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈ
ｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを有するＧ１３Ｒ
，および配列Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｎｅ　ｔ−Ｐｈ
ｅ−Ｐｒｏ−Ｇ　ｌｙ−Ａｓｎ−Ｇ　ｌｙ−Ａｓｐ−Ｇ
　１ｕ−Ｇ　ｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ　−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ
−＾５ｎ−Ｐｒｏ−＾ｒｇを有するＥ１９Ｒの合成およ
び分析を行った。これらのペプチドのアミノ酸分析およ
びＴＬＣ分析の結果をそれぞれ表■および表■に示す。

表　　■ 韻ペフ′−チｌ’Ｆ月匁−ｐ−分−梶 Ａ、薄層クロマトグラフィー セルロースＦ　：　　ｎＢｕＯｌｌ　：　　Ｐｙｒ　：
　ＨＯＡｅ　：　Ｈ１＋０＝１５：１．０：　３　：ｉ
２、 ニンヒドリン 結果：主要スポット（上下両 スポットは無視し得る程度）、 Ｒ，−０，３４ セルロースＦ　ｃ：　ｎＢｕｏｌｌ　：　　Ｐｙｒ　：
　ＨＯＡｅ　：　Ｈ１＋０＝２１：１２：　２　：ｉｓ
、 ニンヒドリン 結果：主要スポット（上下両 スポットは無視し得る程度）、 Ｒ，＝０．５８ Ｂ。

Ｃ０ 濾紙電気泳動 四ｈａＬＬ１１ａｎ　３Ｍ１１．　ｐＨ１，９＜ｕｃｏ
ｏｎ　：　Ａｃｅｔ）　　：ｉ、ｏｏｏｖ、、ｉ時間、
ニンヒドリン結果：主要スポットは陰極の方向へ 移＠（下スポットは無視し得る程度） Ｒ，−０゜４２（“アルギニンを参照として） アミノ酸分析 ペプチドＮ：　８４．６％ 理論Ｆ Ａｓｐ　　　　　３ Ｔｈｒ　　　　　Ｉ Ｇｌｕ　　　　　３ Ｐｒｏ　　　　　３ Ｇｉｙ　　　　　２ Ｌｅｕ　　　　　Ｉ Ｐｈｅ　　　　　Ｉ ＮＯ３ Ａｒｇ　　　　　１ 実測量 ２゜９５ １゜０２ ３゜０７ ２．９１ ｏ１２ ０゜９９ ０．９９ ２．７１． ０．８７ Ｄ。

Ｅ。

高速液体クロマトグラフィー ＨＰＬＣモテル・パーキン・エルマー、Ｃ−１８カラム
、流量：１．０７１分、溶剤Ａ　：　０．０５ＭＮａＨ
２ＰＯ，、溶剤Ｂ：６０％ＣＩｂＣＮのＡ溶解液、濃度
勾配：ｏ−１ｏｏ％のＢの直線状（４０分間）、リコー
ダー：１．Ｏｍｍ／分、検知器：　２１０ｎｍ、試料８
０．１６■の溶剤Ａ　２００ｄ溶解液０．１５　ｔｄ。

結果：単一ピーク、保持時間１５．９９分。

高性能電気泳動 ８、０００　Ｖ　／　３０ｃｍ、１５μＡ、２５趨ＩＤ
、０．２Ｍフォスフェート緩衝液、ｐ）１２．５６、検
知器２００ｎｍ。

リコーダー：ｌスケール７分（＋から−へ）、作動時間
：４０分 結果：試料中に他の成分は検出されなかった。

ベプ シリカ　Ｆ＠ シリカ セルロースセ ルロ−ス 表　　■ ロマ （ｎＢｕＯＨ：Ｐｙｒ：ＨＯＡｃ：ＨｚＯ．　１５：１
５：３：１２）（ｎＢｕＯＨ：ＨｔＯ＾ｃ：ＨＯＡｃ：
Ｈｚｏ．１：１：１：１）Ｆ　（ｎＢｕＯＨ：Ｐｙｒ：
ＨＯＡｃ：ＨｚＯ．　１５：１０：３：１２）ＦＣ（ｎ
ＢｕＯＨ：Ｐｙｒ：ＨＯＡｃ：ＨｚＯ．２１：１２：２
：１５）ｅ Ｇ９Ｔ　　Ｇ１３Ｒ　　Ｂ１９Ｒ Ｏ．３０　　０．１７ ０、２４ ０、１４　　０．２９ ０、０６ 本発明のペプチドＦ１５Ｒ　、　Ｇ１３Ｒ　、　Ｂ１９
ＲおよびＧ９Ｔをラットに腎臓内注入してナトリウム排
泄亢進活性および利尿活性を評価した．　Ｆ１５Ｒの腎
臓内注入によるナトリウム排泄量への影響を示すデータ
の代表例を第２図に示す′。体重３５０ｇのＳｐｒａｇ
ｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに軽いエーテル麻酔を施した
うえ持続性バルビッール酸塩イナクチンＩｎａｃｔｉｎ
　＠　（Ｂｙｋ−Ｇｕｌｄｅｎ＋　Ｋｏｎｓｔａｎｚ，
　ＦＲＧ）４２■を腹腔内注射した。

気管カニユーレを取付けた後カテーテルを右大腿静脈に
取付けて５％ウシ血清アルブミン生理食塩水溶液５．２
５１１を３０分間に亘って注入し、引続き実験期間に亘
って生理食塩水を２．（ｌｄ／時の割合で注入した．腹
部中央線切開によって左腎臓を露出し、カテーテルを左
尿管に取付けて尿を採取し、また、カテーテルに取付け
た３０ゲージ針を左腎動脈に挿入して賦形剤（ウシ血清
アルブミン１％およびバシトラシン０．　１％の標準生
理食塩水溶液）を１．Ｏｄ／時の割合で注入した。４５
分以内に腹部切開部を閉じて外科手術準備を完了した．
６０分間の回復時間の後、予め秤量せるバイアルを用い
て左および右腎臓から相次いで１５分間尿を採取した。

３つの対照時間に従って、賦形剤注入に替えて同じ流量
にてＦ１５Ｒ注入（　１．　８　ｐｍｏｌ　／　ａｆｔ
　）を行い、Ｆ１５Ｒを３０ｆモル／分の割合で左腎動
脈に送り込んだ．６０分の後腎臓内注入を賦形剤注入に
変え７５分間続けた．尿容量は重量で測定し、また尿中
ナトリウムおよびカリウム濃度はフレーム光度定量によ
った。

第２図に示すように、Ｆ１５Ｒの腎臓注入によってナト
リウム排泄量は急激に増加し、１時間後にはベース量の
５倍のピークに達し、Ｆ１５Ｒの注入を中止すると急速
に低下した。未注入腎臓の場合にもＦ１５Ｒの一般循環
系への混入によって変化量は小さいが定性的に同様な挙
動が認められた。

ペプチドＧ１３Ｒ　、　ＩＩ！１９ＲおよびＧ９Ｔの腎
臓への注入によって、それぞれ第３図、第４図および第
５図に示すようにＦ１５Ｒと同様なナトリウム排泄増加
反応が認められた。

、ｉｍｉｔ 本発明のペプチドＦ１５Ｒ　、　Ｇ１３ＲおよびＢ１９
Ｒの静脈内注射によるナトリウム排泄増加および利尿効
果を体重３００〜４００ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌ
ｅｙまたはＬｏｎｇ−Ｅｖａｎｓ　ｇラットについて試
験した．試験動物に軽度のエーテル麻酔を施したうえ体
重−当り１２０■のイナクチン＠　（Ｉｎａｃｔｉｎ）
を腹腔内投与した．気管カニユーレを取付けた後カテー
テルを右大腿静脈に取付けて５％ウシ血清アルブミンを
６．０ｍ／時の割合で体重の０．　４％注入した．引続
き、標準生理食塩水を２．　０　ｍ／時の割合で実験期
間に亘って注入した．腹部切開によって膀胱を露出せし
め、カテーテルを取付けて尿を採取した．４５分の回復
時間の後予め秤量せるバイアルを用いて相次いで１５分
間尿を採取した．４つの比較対照試料を採取した後ペプ
チドの賦形剤溶解液０．　１　ｄを大腿静脈に１分間に
亘って注射し、さらに６〜１０個の尿試料を採取した．
尿容量は重量で測定し、また尿中ナトリウムおよびカリ
ウム濃度はフレーム光度定量によった。

全てのペプチドは、概して注射の後３０〜６０分の間に
ナトリウム排泄増加および利尿効果のピークを示した．
注射の目安として、ペプチド投与の３０〜６０分後およ
び３０〜θ分前における尿容量とナトリウム排泄量の差
を各ラットについて計算した。

結果を表■に示す。

表　　■ 賦形剤 ５ ９１゜４±３６゜８ ０．５９　±００９７ 数値はいずれも平均値上ＳＥＭ 叉１１１凹 Ｆ１５Ｒの皮下投与効果を知覚のある自由運動ラットに
ついて試験した。エーテルで軽度の麻酔を行ったうえ、
体重３２０〜’４００ｇの６匹の雄Ｌｏｎｇ４ｖａｎｓ
ラッＦ・に体重の２．５％に相当する無頭生理食塩水を
腹腔内に負荷し、賦形剤（ウシ血清アルブミン１％およ
びバシトラシン０．１％の生理食塩水溶液）０．１ａｉ
ｔまたばＦ１５ＲＯ，１ｍ　（体重−当り０．２５ｎモ
ル）を皮下注射した。次いで、それぞれ食物および水を
供給せずに代謝ケージに入れた。引続き６時間の間に自
然に排泄される尿を各排尿毎に別個に回収した。尿の容
量は重量によって測定し、また、尿中のナトリウムおよ
びカリウム濃度はフレー人光度定量によった、その翌日
に同様な実験を繰返した。但し、賦形剤を注入したラッ
Ｉ・にはペプチドを投与し、また、ペプチドを投与した
ラットには賦形剤を投与した。

結果を麦■に示す。表■に示すように、Ｆ１５Ｒの投与
によって排尿量、ナトリウム排泄量および尿中Ｎａ／に
比が増大する。

表　　Ｖ 排尿１（ｉｄ／６時間）　　　　８．０４±０゜７６ナ
ト’ｊ？ム排泄量（ｕｅｑ／６時間）９０６±９５数値
はいずれも平均値±ＳＥＭ １０．６９±０ｏ４７ １．３３０±１４８ 〔発明の効果〕 本発明のペプチド化合物はナトリウム徘泄九進活性およ
び利尿活性を示す、従って、高血圧症、うっ血性心不全
症、その池水・電解質バランスの失調に伴なうその他の
症状、例えば、慢性腎不全、肝硬変などの治療に有効で
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒト・プロオピオメラノコルチンＮ末端部分
のアミノ酸配列順序を表す図であり、図中＊印は炭水化
物側鎖が結合する位置を示す。また、アミノ酸３７−４
５位置に下線を施した。 第２図は、賦形剤−本発明のペプチドＦ１５Ｒ−賦形剤
をこの順序で相次いでラットの左腎動脈に注入した際の
排尿中のＮａ量と時間との関係を示すグラフである（実
施例■参照）。 第３図は、賦形剤−本発明のペプチドＧ１３Ｒ−賦形剤
をこの順序で相次いでラットの左腎動脈に注入した際の
排尿中のＮａ量と時間との関係を示すグラフである（実
施例■参照）。 第４図は、賦形剤−本発明のペプチドＥ１９Ｒ−賦形剖
一ベブチド■１９Ｒをこの順序で相次いでラットの左腎
動脈に注入した際の排尿中のＮａ量と時間との関係を示
すグラフである（実施例■参照）。 第５図は、賦形剤−本発明のペプチドＧ９Ｔ−賦形剤を
この順序で相次いでラットの左腎動脈に注入した際の排
尿中のＮａｌと時間との関係を示すグラフである（実施
例■参照）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少くとも下記のアミノ酸配列順序を有することを特
   徴とする実質的に純粋な形態のペプチド化合物。 【遺伝子配列があります】 式中、Ｘは水素、アミノ酸、２〜６個のアミノ酸からな
   るペプチド、炭水化物または糖脂質であり、ＹはＯＨ、
   ＮＨ＿２、アミノ酸もしくはそのアミド、２〜４個のア
   ミノ酸からなるペプチドもしくはそのアミド、炭水化物
   または糖脂質である。 ２、式中のＸが次の各式の中から選ばれたペプチドであ
   る請求項１記載のペプチド化合物。 【遺伝子配列があります】 ３、式中のＸが水素である請求項１記載のペプチド化合
   物。 ４、式中のＸがＰｒｏである請求項１記載のペプチド化
   合物。 ５、式中のＹが次の各式の中から選ばれたペプチドであ
   る請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド化合物。 【遺伝子配列があります】または【遺伝子配列がありま
   す】【遺伝子配列があります】または【遺伝子配列があ
   ります】【遺伝子配列があります】または【遺伝子配列
   があります】 ６、式中のＹがＧｌｕ−ＯＨまたはＧｌｕ−ＮＨ＿２で
   ある請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド化合物。 ７、式中のＹがＯＨである請求項１〜４のいずれかに記
   載のペプチド化合物。 ８、式中のＹがＮＨ＿２である請求項１〜４のいずれか
   に記載のペプチド化合物。 ９、請求項１に記載のペプチド化合物を有効成分として
   含有することを特徴とするナトリウム排泄亢進性または
   利尿性医薬組成物。 １０、請求項１に記載のペプチド化合物を有効成分とし
   て含有することを特徴とする高血圧症およびうつ血栓疾
   患治療剤組成物。 １１、ペプチド化合物の含有量が０．００００１〜０．
   １ｍｇ／ｍｌである請求項９または１０に記載の組成物
   。