JPH0674279B2 - 成長ホルモン放出性因子類似体及びその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 生長ホルモン放出性因子（releasing factor）（GRF）
は最近人間の島細胞腫（islet cell tumor）から単離さ
れ、ソーク・インステイチユート（Salk Institute）で
ドクターギレミン（Dr.Guillemin）及び共同研究者によ
つて構造的に同定された〔サイエンス（Science）218、
585−587（1982年11月５日）〕。GRFの単離及び同定
は、10年間考えられていたが、GRFの極く少量の存在の
ためにこれまで不成功であつた。人間の視床下部生長ホ
ルモン放出性因子（hGRF）は、島細胞腫から単離された
GRFと同一の構造を有することが見出された〔ベーレン
（Ｂhlen）等、バイオケミカル・アンド・バイオフイ
ジカル・リサーチ・コミユニケーシヨン（Bichem.Bic
phys.Res.Comm.114、930−936（1983）〕。

リビーア（Rivier）等によりネイチヤー（Nature）30
0、276−278（1982）及びギレミン（Guillemin）等によ
りサイエンス（Science）218、585−587（1982）にそれ
ぞれGRF（１−40）及びGRF（１−44）の構造が記載され
ており、GRFが生長ホルモノンの放出に対して特異的で
あることを示している。GRFのこれらの２つの型はアミ
ノ（NH₂−）末端で同一であるが、しかしカルボキシ（C
OOH）末端の終点において異なる。更にGRF（１−44）は
カルボキシ末端にアミノ基を有することに特色がある。
リビーア等は、GRFの生物活性は分子のNH₂−末端部分に
あり、全ての本質的な活性及び能力が試験管内において
GRF（１−29）−NH₂によつて立証されることを示してい
る。

ランス（Lance）等はバイオケミカル・アンド・バイオ
フイジカル・リサーチ・コミユニケーシヨンズ（Bioche
m.Biophys.Res.Comm.）119、265−272（1984）におい
て、位置１、２及び３で選ばれたアミノ酸の置換による
GRF（１−29）−NH₂は生体内でブタ及びラツトの双方に
おいて生長ホルモン（GH）の放出増加をもたらすことを
示している。リビーア等は米国特許第4,518,586号にお
いて、位置15でＤ−Alaの置換を含めて、種々なGRF合成
ペプチドを開示している。同様に、1985年７月９日発行
の米国特許第4,528,190号は位置15でＤ−Ala−の置換を
含めて種々なGRF同族体を開示している。

動物の生長は生体−調節分子（bio-requlatory molecul
es）のカスケード（cascade）によつて多分調節され
る。視床下部は生長ホルモンの下垂体放出を誘発するGR
Fを生産する。少量のGRFは血液中に生長ホルモンの実質
的な下垂体放出をもたらすことが見出された。例えばGR
Fは下垂体不全矮小発育症（hypopituitary dwarfis
m）、生長ホルモン生産異常による糖尿病の処置、けが
治癒の促進、やけどの処置及び老化過程の遅延において
用いることができる。同様に、GRFは農業の分野におい
て効用を有する。農業用途の例には、同一飼料供給期間
でより早く市場に出し得るか、より大きな動物を生産す
るか、または肉対脂肪の比を改善するために鶏またはブ
タ、ウシ等の如き食用飼育動物の肉の生産増加が含まれ
る。またGRFは搾乳牛のミルク生産及び鶏の卵生産を刺
激する。

本発明は式 式中、R¹はTyr、Ｄ−Tyr、desNH₂−Tyr、 Ac−TyrまたはHisを表わし;R²はAla、 Ｄ−AlaまたはＮ−メチル−Ｄ−Alaを表わし;R³はLysま
たはAlaを表わし； R⁴はAla、Leu、Val、Ile、Nle、Nval、 β−Alaまたはα−Aibを表わし;R⁵はMet、Leu、Nleまた
はIleを表わし;R⁶はArg−Gln−Gln−Gly−Glu−Ser−As
n−Gln−Glu−Arg−Gly−Ala−Arg−Ala−Arg−Leu及び
そのフラグメントから選ばれるアミノ酸配列を表わし、
該フラグメントの配列はカルボキシル末端から１〜15個
のアミノ酸残基け数が減ぜられており；そしてＸはOHま
たはNH₂である、 の新規なペプチド、その製薬学的に許容し得る酸または
塩基付加塩及び該化合物を含有する薬剤組成物に関す
る。

本発明における薬剤組成物は29個から44個までのアミノ
酸残基を有するGRF−同族体及び無毒性の不活性な製薬
学的または獣医学的に許容し得る液体または固体の担体
を含有する。かかる薬剤組成物は治療及び／または診断
目的に投与するために医薬及び獣医薬の双方に臨床医薬
として用いることができる。更に該化合物は定温及び変
温動物の生長を促進させるために用いることができる。

本発明のペプチドは上記の処置に用いる際に、下垂体腺
から生長ホルモンの放出を刺激するための方法に有用で
ある。

本明細書において用いる「GRF」なる用語はヒト生長ホ
ルモン放出因子、アミノ酸配列を有するポリペプチド
〔サイエンス（Science）218、585、1982年11月５日〕 または全ポリペプチドの少なくとも最初の29個のアミノ
酸を有し且つ生長ホルモン放出活性を示すその生物学的
に活性なフラグメントを意味する。普通の表示に従え
ば、Ｎ−末端でのアミノ基は左そしてＣ−末端でのカル
ボキシル基は右に現れる。アミノ酸はGly、Ala、Val、L
eu、Ile、Ser、Thr、Lys、Arg、Asp、Asn、Glu、Gln、C
ys、Met、Phe、Tyr、Pro、Trp及びHisからなる蛋白質に
曲型的に見出される天然に存在するアミノ酸の１つの意
味を有する。Nleはノルロイシンを意味し、そしてNval
はノルバリンを意味する。アミノ酸残基が異性体型を有
する場合、これは特記せぬ限り、アミノ酸のＬ−型を表
わす。「GRF」の後の添え字「−OH」及び「−NH₂」はそ
れぞれポリペプチドの遊離酸及びアミド型を示す。添え
字を用いなくても、この表示には双方の型が含まれるも
のとする。GRFの同族体は「GRF」の前のかつこの内の置
換されたアミノ酸を説明することによつて示される；即
ち、例えば「（Ala¹⁵）GRF」はGRFに相当するアミノ酸
残基を有するポリペプチドを示し、この場合、アラニン
残基は位置15でグリシンと置換されている。「GRF」に
続くかつこの内の数字はアミノ酸残基の位置数を与える
ことによつて全ポリペプチドのフラグメントを示す、例
えばGRF（１−29）は全配列の最初の29個のアミノ酸を
有するフラグメントを示す。

本発明はGRF分子の位置15でのグリシン残基が、下垂体
から生長ホルモンの放出を刺激することによつて高めら
れた生物学的能力を有するGRF同族体を生成する異なる
適当に選ばれるアミノ酸によつて置換され得ると云う発
見に基ずくものである。位置15で置換されるアミノ酸は
疎水性アミノ酸、例えばAla、Leu、Val、Ile、Nle及びN
valの群から選ぶことができる。またα−アミノイソ酪
酸（α−Aib）及びびβ−アラニン（β−Ala）を位置15
で置換することができる。更に詳細には、疎水性アミノ
酸、例えば位置15に置換されたアラニン、バリンまたは
ロイシンを有するGRF同族体は、下垂体腺から生長ホル
モンの放出をもたらす際に強められた生物活性を有する
ことが示された。

当該分野においてよく知られた種々な方法を、特定の位
置でGRFにおける置換に際し、特定のアミノ酸を選択す
るために用いることができる。かかる方法の１つは、ヘ
リシテイー（helicty）及びヒドロパスイシテイ−（hyd
ropathicity）分析によつて、そして更に、生ずるポリ
ペプチドの蛋白質分解（proteolytic breakdown）の容
易さを減じることによつて立証される如く、生ずるポリ
ペプチドの第二構造を変更またはアムフイフイリツク特
性（amphiphilic character）を変えるように置換アミ
ノ酸を選ぶことである。ヘリシテイー及びヒドロパスイ
シテイー分析は当該分野において公知の普通の方法によ
つて行われる。

更にまた、約29個のアミノ酸から44個以下までのアミノ
酸の鎖長に変わるGRFフラグメントにおける位置15の適
当に選ばれるアミノ酸の置換は、下垂体GH放出性を増加
させることによつて、強められた生物活性を有すること
が示された。更な詳細には、GRF（１−29）の位置15で
適当に選ばれるアミノ酸の置換は強められた生物活性を
有することが示された。

GRF分子の他の選ばれた位置で適当に選ばれるアミノ酸
の追加の置換は、下垂体腺によつてGHの放出をもたらす
際に生物学的効力を有するペプチドを与えた多置換され
たGRF同族体を生ずる15位置での置換を相伴う。第二の
位置に対するGRFペプチドの選ばれる位置は１、２、12
または27位置が含まれるが、しかしこれに限定されな
い。適当に選ばれた位置での置換に対して選ばれるアミ
ノ酸にはチロシン、desNH₂−チロシン、Ac−チロシン、
ヒスチジン、リジン、アラニン、β−アラニン及び上記
アミノ酸のＤ−アミノ酸が含まれる。位置15での置換に
加えて、各々選ばれた位置での置換により、二置換、三
置換または四置換されたポリペプチドを生成させること
ができる。

更に、15位置での置換に加えて、全鎖長GRF（１−44）
のまたはアミド、29個のアミノ酸GRF（１−29）または
鎖長において約29個より大及び44個より小のアミノ酸GR
Fは強められた生物活性を有することがわかつた。殊
に、15位置で置換された適当に選ばれたアミノ酸を有す
るGRF（１−44）及びGRF（１−29）は強められた生物活
性を有することが示された。

本発明の代表的な化合物には次のものが含まれる： 〔Ala¹⁵〕GRF（１−29）−NH₂ 〔Ala¹²、Ala¹⁵〕GRF（１−29）−NH₂ 〔Leu¹⁵〕GRF（１−29）−NH₂ 〔Val¹⁵〕GRF（１−29）−NH₂ 〔Ｄ−Ala²、Ala¹⁵〕GRF（１−29）−NH₂ 〔β−Ala¹⁵〕GRF（１−29）−NH₂ 〔α−Aib¹⁵〕GRF（１−29）−NH₂ 〔Ala¹⁵〕GRF（１−29）−OH 〔Leu¹⁵〕GRF（１−29）−OH 〔Val¹⁵〕GRF（１−29）−OH 〔Ala¹⁵〕GRF（１−44）−NH₂ 〔Leu¹⁵〕GRF（１−44）−NH₂ 〔Val¹⁵〕GRF（１−44）−NH₂ 〔desNH₂−Tyr¹,Ala¹⁵〕GRF（１−29）−NH₂ 〔Ｄ−Tyr¹,Ala¹⁵〕GRF（１−29）−NH₂ 〔Ac−Tyr¹,Ala¹⁵〕GRF（１−29）−NH₂ ヒト生長ホルモン放出性因子（hGRF）からなる配列に対
する変更を述べたが、同様な変更をブタ生長ホルモン放
出性因子（pGRF）、ウシ生長ホルモン放出性因子（bGR
F）、ヒツジ生長ホルモン放出性因子（oGRF）及びヤギ
生長ホルモン放出性因子（cGRF）に対して行うことがで
きる。

本発明のポリペプチドは当該分野においてよく知られた
方法に従つて、即ち、固相ペプチド合成法、液相ペプチ
ド合成法または組換えDNA法によつて製造することがで
きる。最近発展した組換DNA法を「普通」のアミノ酸残
基のみを含む同族体を製造するため、或いは「普通」の
アミノ酸残基のみを含む同族体の部分を製造するために
用いることができ、次に後者を短いＮ−末端ペプチドに
カツプリングさせることができる。

ペプチド類を、メリフイールド（Merrifield）によりジ
ヤーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテイ
（J.Am.Chem.Soc.）、85、2149（1963）に記載された如
き固相合成法を用いて製造することができるが、当該分
野に精通せる者にとつては公知の他の同等の化学的合成
法を用いることができる。固相合成は保護されたアミノ
酸を適当な樹脂にカツプリングさせることにより、ペプ
チドのＣ−末端から開始される。出発物質はアミノ−保
護されたアミノ酸をベンジルエステル結合を介してクロ
ロメチル化された樹脂またはヒドロキシメチル樹脂に、
或いはアミド結合を介してベンズヒドリルアミン（BH
A）樹脂またはメチルベンズヒドリルアミン（MBHA）樹
脂に結合させることによつて製造することができる。こ
の樹脂は市販品であり、その製造は当該分野に精通せる
者にとつては公知である。

新規な同族体の酸型は、固体担体としてベンジルエステ
ル樹脂を用いて、固相ペプチド合成法によつて製造する
ことができる。ポリペプチドを分取型高速液体クロマト
グラフイー（HPLC）によつて均質性に精製することがで
き、次に２つの分析用HPLC系、等電点及び高電圧薄層電
気泳動によつて均質性を示すことができる。アミノ酸分
析は予想したアミノ酸組成を確かめるために行うことが
できる。対応するアミド、固相ペプチド合成に対する固
体担体としてベンズヒドリルアミンまたはメチルベンズ
ヒドリルアミン樹脂を用いて製造することができる。当
該分野に精通せる者には、BHAまたはMBHAを用いる場
合、固体担体からポリペプチドを除去するために無水HF
で処理することにより、末端アミノ基を有するポリペプ
チドを生ずることが認められよう。

Ｃ−末端アミノ酸、例えばArgは適当に選ばれる保護
基、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（Boc）及びｐ
−トルエンスルホニル（Tos）によつてそれぞれＮ^α−
アミノ及び側鎖グアニジノ位置で保護される。次にBoc
−Arg（Tos）−OHをジシクロヘキシルカルボジイミド
（DCC）を用いて、約25℃で２時間撹拌しながら、ベン
ズヒドリルアミン樹脂にカツプリングさせることができ
る。Boc保護されたアミノ酸の樹脂担体へのカツプリン
グに続いて、α−アミノ保護基を塩化メチレン中のトリ
フルオロ酢酸（TFA）またはTFAのみを用いて除去する。
この脱保護は約０℃乃至室温間の温度で行われる。

アミノ酸を結合した樹脂担体からα−アミノ保護基を除
去した後、他のBoc−保護されたアミノ酸を所望の順序
で段階的にカツプリングさせる。各アミノ酸を別個に加
える代りに、固相合成装置に加える前に適当な方法で２
種またはそれ以上のアミノ酸を一緒にカツプリングさせ
ることができる。適当なカツプリング試薬は当該分野に
精通せる者にとつて公知のものである；殊にDCCが適当
である。

各保護されたアミノ酸またはアミノ酸配列を過剰量にお
いて固相合成装置に導入し、カツプリングをジメチルホ
ルムアミド（DMF）または塩化メチレン（CH₂Cl₂）或い
はその混合物の媒質中で行うことができる。不完全なカ
ツプリングを生ずる場合、次のアミノ酸のカツプリング
前に、Ｎ^α−アミノ保護基の除去以前にカツプリング工
程をくり返し行う。合成の各段階でカツプリング反応の
成果を監視することができる。合成を監視する好ましい
方法はニンヒドリン反応である。カツプリング反応を自
動的に、例えばベガ250ペプチド合成装置（Vega 250 Pe
ptide Synthesizer）によつて行うことができる。

樹脂から完了したペプチドの開裂をペプチド化学におい
てよく知られた方法を用いて、好ましくは無水液体フツ
化水素（HF）を用いて行うことができる。ｐ−クレゾー
ル及びジメチルスルフアイドの存在下において０℃で１
時間フツ化水素との反に続いて、ｐ−クレゾールの存在
下において０℃で２時間フツ化水素との第二の反応を行
わせることができる。

従つて、また本発明は上に定義した如き式Ｉの生長ホル
モン放出性因子（GRF）化合物及びその製剤上許容し得
るまたは塩基付加塩の製造方法からなる。該方法は、 （ａ）液相ペプチド合成によつて合成された対応するア
ミノ酸配列の正当に保護されたポリペプチドの保護基を
普通の方法を用いて開裂させるか、或いは （ｂ）固相ペプチド合成によつて合成された対応するア
ミノ酸配列のポリペプチドに結合した正当に側鎖の保護
された樹脂を無水液体HFと反応させ、 そして必要に応じて、得られた式Ｉの化合物を製剤上許
容し得る酸または塩基付加塩に転化することを特徴とす
る。

本発明のポリペプチド類の精製はペプチド化学において
よく知られた方法を用いて行うことができる。すでに示
した如く、本ポリペプチド類は分取型HPLCを用いて精製
することができる；しかしながら、また他の公知のクロ
マトグラフ法、例えばゲル浸透、イオン交換及び分配ク
ロマトグラフイーまたは向流分配を用いることもでき
る。

本発明のポリペプチド類は生長ホルモン放出性活性を有
する。本発明による薬剤組成物は、製薬学的または獣医
学的に許容し得る液体または固体の担体に分散させた式
ＩのGRF同族体またはかかる化合物の無毒性塩を含有す
る。かかる薬剤組成物は人間及び獣医薬の双方の臨床医
薬として治療または診断目的に用いることができる。例
えば本化合物は生長に関連した障害、例えば下垂体不全
矮小発育症及び生長ホルモン生産異常による糖尿病の処
置において有用である。更に、また本化合物は肉を生産
するために飼育する動物の生長を刺激または飼料効率を
高めるため、ミルク生産を高めそして卵生を刺激するた
めに用いることができる。

投与する本発明のポリペプチド類の適当な投薬量は個々
の患者及び処置する症状に応じて多少変えられよう。当
該分野に精通せる者には、正常の生長に伴う生長ホルモ
ンの既知の循環レベル及びポリペプチドの生長ホルモン
放出性活性に基ずく適当な投薬量を決定することができ
よう。

本発明の化合物は試験管内においてGRF（１−44）より
も５倍の生長ホルモン放出を誘発する。また、本発明の
化合物は毒性が少なく、例えば、後記実施例22において
製造される［desNH₂−Tyr¹,D−Ala²,Ala¹⁵］GRF（１−2
9）−NH₂は、ラツトにおける２週間の経口毒性（挿管
法）調査において、5,50または500μg/kg/日の経口投与
レベルで、何らの悪影響も観察されなかつた。かくし
て、これらの同族体を、生長ホルモン放出性因子を同一
目的のために投与する場合よりも、顕著に少ない投薬量
で投与することができる。当該分野においてはよく知ら
れているように、生長に関連した障害の処置は、生長ホ
ルモン生産の不全症の程度に応じて、個人個人の投薬量
を変える必要がある。一般に、生長ホルモンの放出を刺
激するために、患者の体重に基ずき0.04μg/kg/日〜約
1.0μg/kg/日の範囲の投薬量を用いることができる。家
畜において生長活性を刺激するために用いる投薬量は、
人間における下垂体矮小発育症の如き生長ホルモン不全
症の場合に正常な生長を復活するために用いる投薬量よ
りも、顕著に多い（疾患動物のkg体重当り）。家畜にお
いては、一般に下垂体生長ホルモンの放出を刺激するた
めに、0.4μg/kg/日〜約10μg/kg/日の範囲の投薬量を
皮下的に用いることができる。

かくして、本発明に従い、正常な生長に伴うレベルに生
長ホルモンの生産を刺激するために十分な量の本発明に
よる同族体を投与することからなる生長ホルモンの不完
全生産に特徴ずけられる生長関連障害を処置する方法が
提供される。

生長ホルモンの正常レベルは個体間でかなり変化し、そ
して１個体でも、循環する生長ホルモンのレベルは１日
中でかなり変化する。成人においては、生長ホルモンの
正常血清レベルは約０〜10ng/mlに変化することが報告
されている。小供においては、生長ホルモンの正常血清
レベルは約０〜20ng/mlに変化することが報告されてい
る。

下垂体不全矮小発育症を上記の同族体で効果的に処置す
るために、正常な生長の期間中処置が行われる。女性に
おいては、この期間は一般に月経の開始時程度迄であ
る。かくして、女性の処置は個体に応じて、ほぼ12〜16
才まで行うべきである。男性においては、生長の刺激は
青春期を越えてかなり長期間可能である。従って、男性
の有効な処置は通常約18〜19才まで、そして或る個体の
場合には約25才まで可能である。

また、正常な生長に伴うよりも大きいレベルで生長ホル
モンの生産を刺激するために十分な量の同族体を投与す
ることにより、動物の生長速度を増加させる方法を提供
する。

本発明のポリペプチドは人間または動物用の薬剤組成物
の形態で投与することができ、該組成物は普通の薬剤調
製物製法によつて製造することができる。経口、静脈、
皮下、筋肉内、腹腔内または鼻内投与に適する組成物を
用いることができる。薬剤としての用途に適する投与形
態は本発明の化合物約0.01〜0.5mgを含み、これを無菌
の水またたは塩水で再構成するために凍結乾燥すること
ができる。同族体の安定性を保持するために、組成物を
約8.0以下のpH値に保持すべきである。また処置する種
族からの血清アルブミン（例えば人間の場合にはヒト血
清アルブミン、牛の場合にはウシ血清アルブミン等）が
他の公知の製薬学的補助剤と共に存在することができ
る。

以下の実施例は本発明を説明するものであり、決して本
発明の範囲を限定するものとして解釈すべきでない。特
記せぬ限り、全ての部及び％は重量によるものであり、
全ての温度はセツ氏度である。

実施例中、特記せぬ限り、Ｌ−立体配置における光学的
活性な保護されたアミノ酸を用いた。保護されたアミノ
酸をシリカゲルＧプレート上で薄層クロマトグラフイー
により試験し、塩素/N,N,N′−テトラメチル−4,4′−
ジアミノジフエニル−メタン（TDM）で展開させた。融
点をトーマス−フーバー（Thomas−Hoover）装置で測定
し（未補正）、光学的回転をパーキン−エルマー・モデ
ル141偏光計（Perkin-Elmer Model 141 Polarimeter）
によつてジヤケツト付１−dmセル中で測定し、一般に認
められた値に一致させた。アミノ酸分析はウオーターズ
・アミノ酸分析装置（Waters Amino Acid Analyzer）で
行つた。

実施例中、種々な保護基及び試薬を指示するために、次
の略号を用いた： BOC＝ｔ−ブチルオキシカルボニル Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル 2ClZ＝２−クロロベンジルオキシカルボニル Bzl＝ベンジル 2,6−Cl₂−Bzl＝2,6−ジクロロベンジル Tos＝ｐ−トルエンスルホニル DCC＝ジシクロヘキシルカルボジイミド BHA＝ベンズヒドリルアミン DMF＝ジメチルホルムアミド TFA＝トリフルオロ酢酸 TGA＝チオグリコール酸 本発明の同族体を、市販の自動化された固相ペプチド合
成装置（Vega 250 Peptide Synthesizer）を用いて、ア
ミノ酸の逐次カツプリングによつて製造した。合成に際
してＮ^α−Boc−アミノ酸を用いた。

３官能性アミノ酸はＮ^α−Boc−Lys（2ClZ）、 Ｎ^α−Boc−Asp（OBzl）、Ｎ^α−Boc−Glu（OBzl）、 Ｎ^α−Boc−Ser（Bzl）、Ｎ^α−Boc−Thr（Bzl）、 Ｎ^α−Boc−Tyr（2,6−Cl₂−Bzl）及びＮ^α−Boc−−Ar
g（Tos）として保護した。

実施例１ Boc−Arg（Tos）−ベンズヒドリルアミノ−樹脂の製造 BHA−樹脂（40.44g、0.5ミリモル/g、20.22ミリモル）
を、DCC（16.78g、81.4ミリモル）を用いて、２時間25
％DMF−CH₂Cl₂（250ml）中のBoc−Arg（Tos）−OH（34.
6g、80.7ミリモル）とカツプリングさせ、次いで１％ジ
イソプロピルエチルアミンを添加し、0.5時間反応させ
た。生じたBoc−Arg（Tos）−BHA−樹脂をCH₂Cl₂（３×
50ml）、MeOH（３×250ml）、CH₂Cl₂（３×250ml）で洗
浄し、そして乾燥した。カツプリング及び洗浄操作をく
り返し行い、部分標本を加水分解した（130℃で２時
間、6Mプロピオン酸/HCl1ml）。アミノ酸分析は樹脂1g
当りArg0.35mmolの置換を示した。残りのアミノ基をAc₂
O−ピリジンでアセチル化した。収量:48.88g。

実施例２ 〔Ala¹⁵〕−hGRF（１−29）−BHA−樹脂の製造 実施例１における如くして製造したBoc−Arg（Tos）−B
HA−樹脂（15.0g、5.25ミリモル）をベガ250ペプチド合
成装置の反応容器中に入れ、固相合成を対称性無水物法
（symmetric anhydride procedure）によつて合成６循
環行い、hGRF（23−29）−BHA−樹脂（21.74g）を得
た。2.5g（0.60ミリモル）部分を取り出し、更に10回の
循環固相合成に付し、hGRF（13−29）−BHA−樹脂（2.6
1g）を得た。1.3g（0.30ミリモル）部分を残りの12回の
循環固相合成に付した。合成終了時に、Ｎ−末端アミノ
酸残基のBoc−基を除去し（TFA）、ペプチド−樹脂、
〔Ala¹⁵〕hGRF（１−29）−BHA−樹脂を乾燥し、1.66g
を得た。

実施例３ 〔Ala¹⁵〕hGRF（１−29）−NH₂の製造、精製及特徴化 実施例２において製造した如き〔Ala¹⁵〕hGRF（１−2
9）−樹脂（1.66g）を０℃にて１時間、タム（Tam）等
〔テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）2
3、2939〜2942（1982）〕の変更条件を用いて、無水液
体HF、ｐ−クレゾール（10％）、ジメチルスルフアイド
（65％）、HF（25％）〔合計容量20ml〕で処理し、そし
て蒸発させた。このものを続いて０℃で22時間、ｐ−ク
レゾール（10％）、HF（90％）〔合計容量20ml〕と反応
させた。HFを０℃で蒸発させ、粗製のペプチド及び樹脂
混合物をEtOAcと共に砕解し、TFAで抽出し、蒸発させ、
残渣をエーテルと共に砕解し、そして乾燥した。粗製の
物質（1.01g）をH₂O（TFA0.5％含有）10mlに溶解し、
過し〔0.45NタイプHAミリポア（Millipore）フイルタ
ー〕、ホワツトマン・パーテイジル（Whatman Partisi
l）Ｍ−20 ODS−３カラム（２×50cm）に詰めた。この
カラムを、120分内に10〜32％CH₃CNの直線グレデイエン
ト法において、CH₃CN（TFA0.25％含有）及びH₂O（TFA0.
50％含有）からなる溶媒系で溶離し（6ml/分）、32％で
更に60分間保持した。次にカラムを90分内に32％CH₃CN
（0.25％TFA）−H₂O（0.5％TFA）〜38％CH₃CN（0.25％T
FA）−H₂O（0.5％TFA）に移行する直線グレデイエント
で溶離した。流速を6ml/分で続け、フラクシヨンを捕集
し（２分／フラクシヨン）、部分標本を分析用HPLCで分
析した。生成物がフラクシヨン136〜140（252〜270分）
に現れ、このものを合液し、蒸発させ、凍結乾燥し、純
粋な〔Ala¹⁵〕GRF（１−29）−NH₂を得た；収量:71.3mg
（7.05％）。中心流出前後のフラクシヨンを合液し、蒸
発させ、そして凍結乾燥し、半純粋な生成物53mgが得ら
れ、このものは更に処理しなかつた。

この生成物は分析用HPLC及び高電圧薄層電気泳動（Ｒ
_Arg＝0.33）により均質性であることがわかつた。分析
用HPLCにより、トリプシンの作用を有するペプチド地図
は、予想した残基12−20及び13−20を包含して、トリプ
シンの作用を有するフラグメントに対してわずかに異な
る保持時間を有して、GRF（１−29）−NH₂と同様であつ
た。アミノ酸分析（チオグリコール酸１％を含む6N HC
l、110℃、24時間）:Asp,3.30;Thr,1.07;Ser,2.85;Glu,
2.10;Ala,3.82;Val,0.90;Met,0.98;Ile,1.87;Leu,4.11;
Tyr,1.97;Phe,0.90;Lys,2.02;Arg,3.12。

実施例４ 〔Ala¹²,¹⁵〕hGRF（１−29）−BHA−樹脂の製造 実施例１のBoc−Arg（Tos）−BHA−樹脂（5g、1.75ミリ
モル）を固相ペプトド合成の４回の循環に付し（実施例
２における如く）、保護されたhGRF（25−29）−BHA−
樹脂6.1gを得た。2g部分を取り出し、固相合成の更に24
回の循環に付した。末端アミノ酸残基のBoc基を除去し
（TFA）、側鎖を保護したペプチド樹脂、〔Ala^12,15〕h
GRF（１−29）−BHA−樹脂を乾燥し、2.34gを得た。

実施例５ 〔Ala^12,15〕hGRF（１−29）−NH₂の製造、精製及び特
徴化 実施例４の〔Ala^12,15〕hGRF（１−29）−BHA−樹脂
（2.34g）を無水液体HFで処理し（実施例３における如
く）、粗製の〔Ala^12,15〕hGRF（１−29）−NH₂1.15gが
得られた。粗製の生成物をHPLC精製に付し（実施例３に
おける如くして）、所望の生成物がフラクシヨン138〜1
41に現れ、このものを合液し、蒸発させ、そして凍結乾
燥したた；収量〔Ala^12,15〕−hGRF（１−29）−NH₂56m
g、このものは分析用HPLCにより均質性であることがわ
かつた。アミノ組成（6N−チオグリコール酸中で加水分
解、110℃、24時間）:Asp,3,18;Thr,0.99;Ser,2.81;Glu
2.17;Ala,5.18;Val,0.92;Met,1.05;Ile,1.92;Leu,4.27;
Tyr,2.07;Phe,0.92;Lys,1.04;Arg,3.20。

実施例６ 〔Leu¹⁵〕hGRF（１−29）−NH₂の製造 実施例４によるhGRF（25−29）−BHA−樹脂の残り4.1g
を固相ペプチド合成の９回の循環に付し、保護されたhG
RF（16−29）−BHA−樹脂6.0g（1.14ミリモル）を得
た。一部（1.5g、0.28ミリモル）を固相合成の15回の循
環に付し、TFAで処理し、乾燥し、粗製の側鎖の保護さ
れた〔Leu¹⁵〕hGRF（１−29）−BHA−樹脂0.98gを得
た。HF開裂（実施例３における如くして）、そして処理
した後、粗製の〔Leu¹⁵〕hGRF（１−29）−NH₂536mgが
得られた。この物質の200mgを0.025％TFA（H₂O）に溶解
し、過し、二連の（直列）シンクロパツク・カラム
（Synchropak columns）（RP−P,1×25cm）に詰め、カ
ラムを、120分内に25〜40％のCH₃CNの直線グレデイエン
ト法において、CH₃CN（TFA0.025％含有）及びH₂O（TFA
0.025％含有）からなる溶媒系で溶離した（2ml/分）。
フラクシヨン（2ml/フラクシヨン）を捕集し、部分標本
をHPLCによつて分析した。所望の生成物がフラクシヨン
24〜26に現、これを合液し、蒸発させ、そして凍結乾燥
した、収量:9.9mg。生成物〔Leu¹⁵〕hGRF（１−29）−N
H₂は分析用HPLCにより均質性であることが示された。ア
ミノ酸組成（6N HCl−TGA中で加水分解、110℃、24時
間）:Asp,3.01;Thr,0.96;Ser,2.82;Glu,2.09;Ala,3.10;
Val,0.99;Met,1.02;Ile,1.91;Leu,5.19;Tyr,1.93;Phe,
0.92;Lys,1.98;Arg,3.07。

実施例７ 〔Val¹⁵〕hGRF（１−29）−NH₂の製造 実施例６による保護されたhGRF（16−29）−BHA−樹脂
（1.5g、0.28ミリモル）を固相ペプチド合成の15回の循
環に付し、TFAで処理し、乾燥し、側鎖の保護された〔V
al¹⁵〕hGRF（１−29）−BHA−樹脂1.3gを得た。無水HF
開裂（実施例３における如くして）、次いで処理して、
粗製の〔Val¹⁵〕hGRF（１−29）−NH₂625mgを得た。200
mg部分をHPLC精製に付し（実施例６における如くし
て）、精製された〔Val¹⁵〕hGRF（１−29）−NH₂7.0mg
が得られた。この生成物は分析用HPLCにより均質である
ことが示された。アミノ酸組成（6N HCl−TGA中で加水
分解、110℃、24時間）:Asp,2.99;Thr,0.97;Ser,2.78;G
lu,2.09;Ala,3.07;Val,1.98;Met,0.97;Ile,1.93;Leu,4.
16;Tyr,2.02;Phe,0.96;Lys,1.99;Arg,3.08。

実施例８ 〔Ｄ−Ala²,Ala¹⁵〕hGRF（１−29）−NH₂の製造 実施例６による保護されたhGRF（16−29）−BHA−樹脂
（3g、0.57ミリモル）を固相ペプチド合成の13回の循環
に付し、保護された〔Ala¹⁵〕−hGRF（３−29）−BHA−
樹脂3.6gを得た。一部（1g、0.16ミリモル）を固相合成
の２回の循環に付し、TFAで処理し、〔Ｄ−Ala²、Al
a¹⁵〕hGRF（１−29）−BHA−樹脂1.02gを得た。実施例
３における如くして、この樹脂を無水HFで開裂させ、次
いで処理し、粗製の〔Ｄ−Ala²,Ala¹⁵〕hGRF（１−29）
−NH₂575mgを得た。

200mg部分をHPLC精製に付し（実施例６における如くし
て）、精製された〔Ｄ−Ala²,Ala¹⁵〕hGRF（１−29）−
NH₂8.1mgが得られた。この生成物は分析用HPLCにより均
質であることが示された。アミノ酸組成（6N HCl−TGA
中で加水分解、110℃、24時間）:Asp,3.05;Thr,0.93;Se
r,2.57;Glu,2.04;Ala,4.27;Val,0.99;Met,0.98;Ile,1.9
3;Leu,4.16;Tyr,1.98;Phe,0.97;Lys,2.00;Arg,3.08。

実施例９ 〔Ala¹⁵〕hGRF（１−29）−樹脂の製造 Boc−Arg（Tos）−樹脂〔バツケム（Bachem）;3.0g;0.6
15ミリモル）をベガ1000ペプチド合成装置の反応容器に
入れ、固相ペプチド合成を合計13回の循環に対して対称
性無水物法によつて行い、hGRF（16−29）−樹脂（4.4
g）を得た。1g部分（0.13ミリモル）を固相合成の更に1
5回の循環に付した。合成終了時に、Ｎ−末端アミノ酸
残基のBoc−基を除去し（TFA）、ペプチド樹脂、〔Ala
¹⁵〕hGRF（１−29）−樹脂を乾燥し、1.66gを得た。

実施例10 〔Ala¹⁵〕hGRF（１−29）−OHの製造、精製及び特徴化 実施例９による〔Ala¹⁵〕hGRF（１−29）−樹脂（1.66
g）を実施例３における如くして無水HFで処理し、粗製
の〔Ala¹⁵〕hGRF（１−29）−OH262mgが得られた。粗製
の物質を0.1％TFA（H₂O）4mlに溶解し、過し、ヌクレ
オシルC18カラム（１×50cm）に詰めた。このカラム
を、180分内に20〜40％CH₃CNの直線グレイデイエント法
において、CH₃CN（TFA0.1％含有）及びH₂O（TFA0.1％含
有）からなる溶媒系によつて溶離した（3ml/分）。フラ
クシヨン（２分）を捕集し、HPLCによつて分析した。フ
ラクシヨン76中に現れた所望の生成物を蒸発ささせ、凍
結乾燥した；収量〔Ala¹⁵〕hGRF（１−29）−OH2.4mg、
このものは分析用HPLCにより均質であることが示され
た。アミノ酸分析（6N HCl−チオグリコール酸中で加水
分解、110℃、24時間及び72時間）:Asp,2.98;Thr,0.97;
Ser,2.88;Glu,2.15;Leu,3.85;Tyr,193;Arg,2.95;Ala,4.
17;Val,0.99;Met,1.04;Ile,1.91;Phe,0.86;Lys,2.02。

実施例11 〔Leu¹⁵〕hGRF（１−29）−OHの製造 hGRF（16−29）−樹脂（実施例９による）1g部分を実施
例９における如くして固相合成の更に15回の循環に付し
た。収量：側鎖の保護された〔Leu¹⁵〕hGRF（１−29）
−樹脂1.16g。無水HF開裂（実施例における如くし
て）、次に処理した後、粗製の〔Leu¹⁵〕hGRF（１−2
9）−OH388mgが得られた。実施例10における如くして精
製し（HPLC）、半純粋な〔Leu¹⁵〕−hGRF（１−29）−O
H4.4mgが得られ、このものを実施例６における如くして
更に精製した。所望の生成物はフラクシヨン40〜42に現
れた。収量：〔Leu¹⁵〕hGRF（１−29）−OH0.9mg。この
生成物は分析用HPLCによつて均質であることが示され
た。アミノ酸分析（6N HCl−TGA中で加水分解、110℃、
24時間及ひ72時間）:Asp,3.06:Thr,0.94;Ser,2.95;Glu,
2.11;Ala,3.05;Val,0.99;Met,0.94;Leu,1.15;Tyr,1.81;
Arg,3.02;Ile,2.06;Phe,0.85;Lys,2.02。

実施例12 〔Val¹⁵〕hGRF（１−29）−OHの製造 hGRF（16−29）−樹脂（実施例９による）1gを、実施例
９における如くして、固相ペプチド合成の更に15回の循
環に付した。収量：側鎖の保護された〔Val¹⁵〕hGRF
（１−29）−樹脂1.30g。無水液体HFによつて樹脂から
開裂させ（実施例３における如くして）、そして処理し
た後、粗製の〔Val¹⁵〕hGRF（１−29）−OH158mgが得ら
れた。精製により（実施例６における如くして）、半純
粋な生成物4.6mgを得た。この物質を実施例10における
如くして、更に精製した。フラクシヨン78に現れる生成
物を蒸発させ、そして凍結乾燥した。収量％〔Val¹⁵〕h
GRF（１−29）−OH1.8mg。この生成物は分析用HPLCによ
つて均質であることが示された。アミノ酸分析（6N HCl
−TGA中で加水分解、110℃、72時間）:Asp,2.92;Glu,2.
00;Ala,2.91;Val,2.03;Met,0.98;Phe,0.87;Lys,213;Le
u,4.14;Arg,3.08（6N HCl−TGA中で加水分解、150℃、
１時間）:Ile,1.93;Tyr,1.91。

実施例13 Boc−Leu−MBHA−樹脂の製造 実施例１における如くして、Boc−Leu−OH（17.68g、83
ミリモル）をメチルベンズヒドリルアミン樹脂（70g、
0.28meq/g）にカツプリングさせ、Boc−Leu−MBHA−樹
脂を製造した。収量:72.87g。アミノ酸は0.23ミリモル/
g樹脂の置換を示した。

実施例14 〔Ala¹⁵〕hGRF（１−44）−MBHA−樹脂の製造 実施例13によるBoc−Leu−BHA−樹脂（78.87g、18.1ミ
リモル）をベガ296ペプチド合成装置の反応容器に入
れ、固相合成を合計16回の循環に付し、hGRF（28−44）
−MBHA−樹脂（37.65g）を得た。この5g（0.75ミリモ
ル）部分を取り出し、固相合成の更に12回の循環に付
し、hGRF（16−44）−MBHA−樹脂（5.15g）を得た。合
成の終了時に、Ｎ−末端アミノ酸残基のBoc−基を除去
し（TFA）、ペプチド−樹脂、〔Ala¹⁵〕hGRF（１−44）
−MBHA−樹脂を乾燥し、1.73gが得られた。

実施例15 〔Ala¹⁵〕hGRF（１−44）−NH₂の製造 実施例14の〔Ala¹⁵〕hGRF（１−44）−MBHM−樹脂（0.8
5g）を実施例３における如くして無水液体HFで処理し
た；収量：粗製の〔Ala¹⁵〕hGRF（１−44）−NH₂380m
g。この190mg部を実施例６における如くして（直線クレ
デイエント15〜35％）精製した。所望の生成物がフラク
シヨン42〜43に現れ、このものを合液し、蒸発させ、そ
して凍結乾燥した；収量：〔Ala¹⁵〕−hGRF（１−44）
−NH₂10.5mg。この生成物は分析用HPLCによつて均質で
あることが示された。アミノ酸組成（6N HCl−TGA中で
加水分解、110℃、24時間及び72時間）:Asp,4.00;Thr,
0.91;Ser,3.69;Glu,7.40;Gly,2.16;Ala.6.00;Val,0.97;
Met,0.93;Ile,1.85;Leu,5.25;Tyr,1.83;Phe,0.85;Lys,
1.97;Arg,6.16;Phe,0.91。

実施例16 〔Leu¹⁵〕hGRF（１−44）−NH₂の合成 実施例14によるhGRF（16−44）MBHA−樹脂1.79gを実施
例14における如くして固相合成の更に15回の循環に付し
た；収量：側鎖の保護された〔Leu¹⁵〕hGRF（１−44）
−MBHA−樹脂1.67g。この物質の半分を実施例３におけ
る如くして、無水液体HFで処理した；収量：粗製の〔Le
u¹⁵〕GRF（１−44）−NH₂400mg。この200mgを実施例６
及び15における如くしてHPLC精製に付した。所望の生成
物がフラクシヨン43及び44に現れ、これを合液し蒸発
せ、そして凍結乾燥した；収量〔Leu¹⁵〕hGRF（１−4
4）−NH₂11.0mg。この生成物は分析用HPLCによつて均質
であることが示された。アミノ酸組成（6N HCl−TGA中
で加水分解;110℃;24時間及び72時間）:Asp,3.89;Thr,
0.93;Ser,3.67;Glu,7.40;Gly,2.15;Ala,5.00;Val,0.95;
Met,0.98;Phe,1.02。

実施例17 〔Ala¹⁵〕GRF（１−38）−BHA−樹脂の製造 実施例１において製造した如きBoc−Arg（Tos）−BHA−
樹脂をベガ250ペプチド合成装置の反応容器中に入れ、
固相合成を対称性無水物法によつて合計16回の循環によ
つて行い、GRF（22−38）−BHA−樹脂を得ることができ
た。この一部を取り出し、固相合成の６回の循環に付
し、GRF（16−38）−BHA−樹脂を得た。次にこの一部を
残りの15回の循環の固相合成によつて転化した。合成の
終了時に、Ｎ−末端アミノ酸残基のBoc−基をTFAを用い
て除去し、得られた〔Ala¹⁵〕GRF（１−38）−BHA−樹
脂を乾燥することができた。

実施例18 〔Ala¹⁵〕GRF（１−38）−NH₂の製造、精製及び特徴化 実施例７による〔Ala¹⁵〕GRF（１−38）−BHA−樹脂を
実施例３における如くして無水液体HFで処理することが
できた。次のこの一部を実施例６における如くして（直
線グレデイエント15〜35％）精製に付した。所望の生成
物を含むフラクシヨンを合液し、蒸発させ、そして凍結
乾燥した。次に生成物を分析用HPLCによつて均質性につ
いて評価し、アミノ酸分析によて確証することができ
た。

実施例19 〔Leu¹⁵〕GRF（１−38）−NH₂の合成 実施例17によるGRF（16−38）−BHA−樹脂の一部を実施
例17における如くして固相合成の更に15回の循環に付
し、保護された〔Leu¹⁵〕GRF（１−38）BHA−樹脂を得
ることができた。この物質の一部を実施例３における如
くして無水液体HFで処処理し、粗製の〔Leu¹⁵〕GRF（１
−38）−NH₂を得ることができた。次にこの粗製の生成
物の一部を実施例６及び15における如くしてHPLC精製に
付すことができた。所望の生成物を含むフラクシヨンを
合流し、蒸発させ、そして凍結乾燥した。この生成物は
分析用HPLCによつて均質であることが示され、そしてア
ミノ酸分析によつて確証することができた。

実施例20 〔Ala¹⁵、Leu²⁷〕GRF（１−29）−NH₂の合成 実施例１において製造した如きBoc−Arg（Tos）−BHA−
樹脂をベガ250ペプチド合成装置の反応容器に入れ、固
相合成を対称無水法によつて合計２回の循環によつて行
い、GRF（28−29）−BHA−樹脂を得ることができた。こ
の一部を取り出し、Boc−Leuとカツプリングさせ、次に
固相合成の更に10回の循環に付し、〔Leu²⁷〕−GRF（16
−29）−BHA−を得ることができた。次にこの一部を取
り出し、Boc−Alaとカツプリングさせ、実施例３に述べ
た如くして、固相合成の残りの14回の循環に付すことが
できた。

実施例21 〔β−Ala¹⁵〕hGRF（１−29）−NH₂の製造 実施例６によるhGRF（16−29）BHA−樹脂1.68g（1.68
g、0.30ミリモル）を固相ペプチド合成の15回の循環に
付し、TFAで処理し、そして乾燥し、側鎖の保護された
〔β−Ala¹⁵〕hGRF（１−29）BHA−樹脂1.93gを得た。
この保護されたペプチド樹脂を無水HF開裂に付し（実施
例３における如くして）、そして処理した後、粗製の
〔β−Ala¹⁵〕hGRF（１−29）−NH₂1.2gを得た。この20
0mg（0.05ミリモル）部分をHPLC精製に付し、（実施例
６における如くして）、〔β−Ala¹⁵〕−GRF（１−29）
−NH₂35.5mgを得た。この生成物は分析用HPLCによつて
均質であることが示された。アミノ酸組成（6N HCl−TG
A中で加水分解、150℃、１時間）:Asp,3.13;Thr,0.98;S
er,2.95;Glu,2.14;Ala,3.13;Met,1.01;Tyr,2.03;Lys,1.
99（6N HCl−TGA中で加水分解、110℃、24時間）:Vol,
1.09;Phe,1.10;β−Ala,0.87;Arg,2.94。

参考例１ 〔desNH₂−Tyr¹〕hGRF（１−29）−NH₂の製造 実施例８において製造した如き保護されたhGRF（３−2
9）−BHA−樹脂（1.0g、0.13ミリモル）を固相ペプチド
合成の２回の循環に付し、〔desNH₂−Tyr¹〕hGRF（１−
29）−BHA−樹脂1.26gを得た。実施例３における如くし
て、HFによつて樹脂から開裂させ、粗製の〔desNH₂−Ty
r¹〕hGRF（１−29）−NH₂0.79gを得た。この120mg部分
を実施例６における如くしてHPLC精製に付し、〔desNH₂
−Tyr¹〕hGRF（１−29）−NH₂19.5mgを得た。この生成
物は分析用HPLCによつて均質であることが示され。アミ
ノ酸分析（6N HCl−TGA中で加水分解、110℃、24時
間）:Asp,3.08;Thr,0.98;Ser,2.94;Glu,2.13;Gly,1.10;
Ala,3.31;Val,1.01;Met,1.01;Ile,1.97;Leu,4.29;Tyr,
1.04;Phe,0.98;Lys,1.99;Arg,3.15。

実施例22 〔desNH₂−Tyr¹,D−Ala²,Ala¹⁵〕hGRF（１−29）−NH₂
の製造 実施例６によるhGRF（16−29）−BHA−樹脂の一部（3.2
3g、0.58ミリモル）を固相ペプチド合成の13回の循環に
付し、TFAで処理し、そして乾燥し、〔Ala¹⁵〕hGRF（３
−29）−BHA−樹脂を得た。この保護されたペプチド樹
脂1.798gを固相ペプチド合成の２回の循環に付し、その
際に順次Ｄ−Ala及び３−（４−ヒドロキシフエニル）
−プロピオネートを加えた。保護されたペプチド樹脂
（1.85g）を実施例３における如くしてHFで処理し、粗
製の生成物を乾燥し、0.827gが得られた。この一部（20
0mg）を実施例６における如くして、HPLC精製に付し、
〔desNH₂−Tyr¹,D−Ala²,Ala¹⁵〕hGRF（１−29）−NH₂
（22.2mg、収率:9％）を得た。この生成物は分析用HPLC
によれば均質であつた。アミノ酸組成（6N HCl−TGA中
で加水分解、110℃、24時間及び72時間）:Thr,1.02;Se
r,2.798;Tyr,1.00;Lys,2.04;Arg,3.13;Asp,2.80;Glu,2.
10;Als,3.98;Val,1.04;Met,1.03;Ile,1.85;Phe,0.92。

実施例23 〔desNH₂−Tyr¹,Ala¹⁵〕hGRF（１−29）−NH₂の製造 実施例25からの〔Ala¹⁵〕hGRF（３−29）−BHA−樹脂1.
8g部分を実施例４における如くして、Ala及び３−（４
−ヒドロキシフエニル）−プロピオネートを順次加え
て、ペプチド合成の２回の循環に付した。この保護され
たペプチド樹脂を実施例３における如くしてHFで開裂さ
せ、粗製のペプチド0.79gを得た。この一部（200mg）を
実施例６における如くしてHPLC精製に付し、〔desNH₂−
Tyr¹,Ala¹⁵〕hGRF（１−29）−NH₂13mg（収率５％）を
得た。この生成物は分析用HPLCにより均質であることが
示された。アミノ酸組成（6N HCl−TGA中で加水分解、1
50℃、１時間及び72時間）:Asp,3.00;Thr.1.00;Ser,3.0
0;Tyr,0.99;Lys,1.99;Arg,3.04;Glu,2.05;Ala,4.25;Va
l,0.99;Met,0.92;Ile,1.85;Leu,3.97;Phe,0.94。

実施例24 〔α−Aib¹⁵〕hGRF（１−29）−NH₂の製造 実施例６によるhGRF（16−29）BHA−樹脂の一部（1.68
g、0.30ミリモル）を固相ペプチド合成の15回の循環に
付、TFAで処理し、乾燥し、側鎖の保護された〔α−Aib
¹⁵〕hGRF（１−29）BHA−樹脂1.93gを得た。この保護さ
れたペプチド樹脂を実施例３における如くして無水HF開
裂に付し、そして常法で処理した後、粗製の〔α−Aib
¹⁵〕hGRF（１−29）−NH₂を得た。この200mg部分を実施
例６における如くしてHPLC精製に付し、〔α−Aib〕hGR
F（１−29）−NH₂が得られた。この生成物は分析用HPLC
によつて均質であることが示された。

実施例25 本化合物の生物活性を合成GRF（１−44）−NH₂の活性と
比較した。合成GRF（１−44）−NH₂の生物活性は、先端
巨大症にかかつた患者の膵臓腫から単離した天然GRF
（１−44）−NH₂〔Salk Institute標準hGRF−NH₂（NL−
Ａ−10）〕と同一であつた。組織培養においてラツトの
下垂体細胞の生長ホルモンの生産を刺激する能力に基ず
く生物活性に対する効力検定を次の方法で行つた： 30〜40匹の雄スプラーグードーレイ（Sprague−Dawle
y）ラツト（体重175g）から下垂体を首切り後、無菌状
態で除去した。下垂体前葉を補集し、無菌のへペス（He
pes）緩衝剤（0.025M、pH値7.35）で３回洗浄し、膠原
酵素（4mg/ml）及びデイスパーゼ（Dispase）（蛋白酵
素級II、2mg/ml）を含有するヘペス緩衝剤（pH値7.35）
20〜30mlに分散させた。パスツール（Pasteur）ピペツ
トによつて静かに100〜110分間、渦巻きそして砕解した
後、分散した細胞を遠心分離によつて分離し（150×
ｇ、４分間）、ノイラミニダーゼ（neuraminidase）（8
g/ml）及びエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）二ナト
リウム塩200g/mlを含むへペス緩衝剤、pH値7.35、に10
分間再懸濁させた。平板培養媒質（plating medium）で
２回洗浄し、次の限定された媒質を用いて、マルチウエ
ル−プレート（multiwell−plates（1.5×10⁵細胞/ml）
上にプレイテイングした:2g BSA/1、2.38gヘペス/1.50m
g PSN抗生物質混合物によるＦ−12/DMEM/BGJ（6:3:1、
ギブコ（Gibco）:430−1700/430−1600/320−2591）
〔ギブコ・ラボラトリーズ（Gibco Laboratories）〕、
1.83gm NazHCO₃/1〔ベイカー（Baker）による10mg/ト
ランスフエリン〔シグマ（Sigma）T2252〕。各ウエル中
の媒質を媒質1ml当り0.8〜200ミリモルの濃度範囲で、
新規なGRF同族体または天然GRF（１−44）−NH₂で補足
した。対照ウエルは補足物を含まなかつた。セルの速い
固定を確実にするために、２％牛胎児血清を加えたこの
媒質でプレーテイングを行つた。第４日目に、牛胎児血
清を含まぬ上記の限定した媒質で細胞を２回洗浄した。
最後に、限定された媒質900μを各ウエルに加え、加
えて各個々の処理物を含む同一媒質100μを三重に加
えた。４時間培養した後、媒質を捕集し、ラツト生長ホ
ルモンに対してラジオイムノアツセイ（radioimmunoass
ay）（RIA）を行うために必要な濃度に希釈した。ラツ
ド生長ホルモンに対するRIAを、スイナ（Sinha′ｓ）抗
ネヅミGH免疫血清を用いて、そして抗体抗原結合体を沈
殿させるために蛋白質Ａを用いて、ナシヨナル・ピチユ
ーイタリ・エージエンスイ（National Pituitary Agenc
y）による方法に従つて行つた。

効力検定の結果は、（Ala¹⁵）GRF（１−29）NH₂がGRF
（１−29）NH₂に匹敵し、5.1倍の効力を有することがわ
かつた。GRF（１−44）NH₂と比較した場合、（Ala¹⁵）G
RF（１−29）NH₂は重量／重量に基ずき4.1倍の効力を有
することがわかつた。

実施例26 ［Ala¹⁵］GRF（１−32）OHの製造 Boc−Gly−PAM−樹脂（8g、0.41mM/g）をベガ296ペプチ
ド合成装置の反応容器中に入れ、固相ペプチド合成を合
計で５サイクル行い、BMS（Bzl）−Arg（Tos）−Gln−G
ln−Gly−PAM−樹脂を得た。保護されたペプチド樹脂の
2.0g部分をベガ1000ペプチド合成装置の反応容器中に入
れ、固相ペプチド合成を26サイクル続け［３位及び25位
のアスパラギン酸をBoc−Asp（OFm）として導入し
た］、保護されたペプチド−樹脂4.1gが生成した。その
−OFm保護基を20％ピペリジン/DMF（85ml、１分）で除
去し、樹脂を濾過し、DMF、MeOH及CH₂Cl₂で洗浄した。
部分的に保護されたペプチド−樹脂を50％TFA/CH₂Cl₂で
脱保護し、乾燥した（収量:4.02g）。その1g部分を（実
施例１におけると同様にして）無水HFで開裂させ、乾燥
した（収量:492.5mg）。

生成物を実施例１におけると同様にして精製し（22段
階）、フラクシヨン117−118に現れた生成物を一緒に
し、蒸発させ凍結乾燥した。収量:0.6mg。この生成物、
［Ala¹⁵］SRF（１−32）OHは、分析的hplcにより本質的
に均質であることを示し、酸加水分解（6N HCl;110℃;2
4時間）後に所期のアミノ酸組成を与えた:Asp,3.2;Thr,
1.0;Ser,2.9;Glu,4.0;Gly^＊,1.5;Ala,4.4;Val,0.9;Met,
0.8;Ile,1.8;Leu,.8;Tyr,1.8;Phe,0.9;Lys,2.0;Arg,3.0
（^＊高いグリシンバツクグラウンド）。

実施例27 部分的に脱保護したペプチド−樹脂（実施例７からTFA
で脱保護した後のもの）の分離した0.5g部分を、25℃に
おいて21時間メタノール中でNH₃により開裂させた。樹
脂を濾過し50％TFA−CH₂Cl₂で洗浄後、濾液を蒸発乾固
し、エーテルで沈殿させ、減圧乾燥して、部分的に保護
されたペプチド186.5mgを得た。トリフルオロエタノー
ル中のNH₃または液体NH₃で開裂させると同様の粗製中間
体が得られた。合計で655gの粗製の部分的に保護された
ペプチド（合計で2.0gのペプチド−樹脂から）を０℃に
おいて２時間無水HF（約10ml、10％DTEを含む）で処理
して充分に脱保護し、実施例１に記載したと同様に処理
して粗生成物218.3mgを得た。

この生成物を実施例１におけると同様に精製し（２段
階）、フラクシヨン1122に現れる生成物を蒸発させ凍結
乾燥した。収量:3.4mg。この生成物、［Ala¹⁵］GRF（１
−32）NH₂は分析的hplcにより本質的に均質であること
を示し、酸加水分解（6N HCl;110℃;24時間）後に所期
のアミノ酸組成を与えた:Asp,3.00;Thr,0.97;Ser,2.90;
Glu,4.30;Gly,1.20;Iie,1.83;Ala,4.00;Val,1.01;Met,
0.91;Leu,3.88;Tyr,1.79;Phe,0.99;Lys,1.80;Arg,2.8
4。構造の確認はフアスト・アトム・ボンバードメント
（Fast Atom Bombardment）質量分析法により行なっ
た。計算値:3685.2;実測値:3686.3。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−139347（ＪＰ，Ａ)

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式 式中、 R¹はTyrまたはdesNH₂−Tyrを表わし； R²はAla、Ｄ−AlaまたはＮ−メチル−Ｄ−Alaを表わ
   し； R³はLysまたはAlaを表わし； R⁴はAla、Leu、Val、β−Alaまたはα−Aibを表わし； R⁵はMet、LeuまたはNleを表わし； R⁶はArg−Gln−Gln−Gly−Glu−Ser−Asn−Gln−Glu−A
   rg−Gly−Ala−Arg−Ala−Arg−Leu及びそのフラグメン
   トから選ばれる酸配列を表わし、該フラグメントの配列
   はカルボキシル末端から１〜15個のアミノ酸残基だけ数
   が減ぜられており；そして ＸはOHまたはNH₂である、 の生長ホルモン放出性因子（GRF）化合物及びその製薬
   学的に許容し得る酸または塩基付加塩。
2. 【請求項２】式 式中、R¹、R²、R³、R⁴、R⁵及びＸは特許請求の範囲第１
   項記載の通りである、 で示される特許請求の範囲第１項記載の化合物。
3. 【請求項３】［Ala¹⁵］GRF（１−44）−NH₂である特許
   請求の範囲第２項記載の化合物。
4. 【請求項４】［Val¹⁵］GRF（１−44）−NH₂である特許
   請求の範囲第２項記載の化合物。
5. 【請求項５】［Leu¹⁵］GRF（１−44）−NH₂である特許
   請求の範囲第２項記載の化合物。
6. 【請求項６】R⁶がArgであり、そしてR¹、R²、R³、R⁴、R
   ⁵及びＸが特許請求の範囲第１項記載の通りである特許
   請求の範囲第１項記載の化合物。
7. 【請求項７】［Leu¹⁵］GRF（１−29）−NH₂である特許
   請求の範囲第６項記載の化合物。
8. 【請求項８】［Val¹⁵］GRF（１−29）−NH₂である特許
   請求の範囲第６項記載の化合物。
9. 【請求項９】［Leu¹⁵］GRF（１−29）−OHである特許請
   求の範囲第６項記載の化合物。
10. 【請求項１０】［Val¹⁵］GRF（１−29）−OHである特許
    請求の範囲第６項記載の化合物。
11. 【請求項１１】［β−Ala¹⁵］GRF（１−29）−NH₂であ
    る特許請求の範囲第６項記載の化合物。
12. 【請求項１２】［α−Aib¹⁵］GRF（１−29）−NH₂であ
    る特許請求の範囲第６項記載の化合物。
13. 【請求項１３】R⁴がAlaであり、そしてR¹、R²、R³、
    R⁴、R⁵、R⁶及びＸが特許請求の範囲第１項記載の通りで
    ある特許請求の範囲第１項記載の化合物。
14. 【請求項１４】［Ala¹⁵］GRF（１−29）−NH₂である特
    許請求の範囲第13項記載の化合物。
15. 【請求項１５】［Ala¹²,Ala¹⁵］GRF（１−29）−NH₂で
    ある特許請求の範囲第13項記載の化合物。
16. 【請求項１６】［Ｄ−Ala²,Ala¹⁵］GRF（１−29）−NH₂
    である特許請求の範囲第13項記載の化合物。
17. 【請求項１７】［Ala¹⁵］GRF（１−29）−OHである特許
    請求の範囲第13項記載の化合物。
18. 【請求項１８】［desNH₂−Tyr¹,Ala¹⁵］GRF（１−29）
    −NH₂である特許請求の範囲第13項記載の化合物。
19. 【請求項１９】［desNH₂−Tyr¹,D−Ala²,Ala¹⁵］GRF
    （１−29）−NH₂である特許請求の範囲第13項記載の化
    合物。
20. 【請求項２０】［desNH₂−Tyr¹,D−Ala²,Ala¹²,Ala¹⁵］
    GRF（１−29）−NH₂である特許請求の範囲第13項記載の
    化合物。
21. 【請求項２１】R⁴がAlaであり、R⁵がLeuであり、R⁶がAr
    gであり、そしてR¹、R²、R³及びＸが特許請求の範囲第
    １項記載の通りである特許請求の範囲第１項記載の化合
    物。
22. 【請求項２２】［Ala¹⁵,Leu²⁷］GRF（１−29）−NH₂で
    ある特許請求の範囲第21項記載の化合物。
23. 【請求項２３】［Ala¹⁵,Leu²⁷］GRF（１−29）−OHであ
    る特許請求の範囲第21項記載の化合物。
24. 【請求項２４】液相ペプチド合成によって合成された対
    応するアミノ酸配列の正当に保護されたポリペプチドの
    保護基を通常の方法を用いて開裂させ、そして必要に応
    じて、得られる下記式Ｉの化合物を製薬学的に許容し得
    る酸または塩基付加塩に転化することを特徴とする式 式中、 R¹はTyrまたはdesNH₂−Tyrを表わし； R²はAla、Ｄ−AlaまたはＮ−メチル−Ｄ−Alaを表わ
    し； R³はLysまたはAlaを表わし； R⁴はAla、Leu、Val、β−Alaまたはα−Aibを表わし； R⁵はMet、LeuまたはNleを表わし； R⁶はArg−Gln−Gln−Gly−Glu−Ser−Asn−Gln−Glu−A
    ug−Gly−Ala−Arg−Ala−Arg−Leu及びそのフラグメン
    トから選ばれるアミノ酸配列を表わし、該フラグメント
    の配列はカルボキシル末端から１〜15個のアミノ酸残基
    だけ数が減ぜられており；そして ＸはOHまたはNH₂である、 の生長ホルモン放出性因子（GRF）化合物及びその製薬
    学的に許容し得る酸または塩基付加塩の製造方法。
25. 【請求項２５】固相ペプチド合成によって合成された対
    応するアミノ酸配列のポリペプチドに結合した正当に側
    鎖に保護された樹脂を無水液体HFと反応させ、そして必
    要に応じて、得られる下記式Ｉの化合物を製薬学的に許
    容し得る酸または塩基付加塩に転化することを特徴とす
    る式 式中、 R¹はTyrまたはdesNH₂−Tyrを表わし； R²はAla、Ｄ−AlaまたはＮ−メチル−Ｄ−Alaを表わ
    し； R₃はLysまたはAlaを表わし； R⁴はAla、Leu、Val、β−Alaまたはα−Aibを表わし； R⁵はMet、LeuまたはNleを表わし； R⁶はArg−Gln−Gln−Gly−Glu−Ser−Asn−Gln−Glu−A
    rg−Gly−Ala−Arg−Ala−Arg−Leu及びそのフラグメン
    トから選ばれるアミノ酸配列を表わし、該フラグメント
    の配列はカルボキシル末端から１〜15個のアミノ酸残基
    だけ数が減ぜられており；そして ＸはOHまたはNH₂である、 の生長ホルモン放出性因子（GRF）化合物及びその製薬
    学的に許容し得る酸または塩基付加塩の製造方法。
26. 【請求項２６】式 式中、 R¹はTyrまたはdesNH₂−Tyrを表わし； R²はAla、Ｄ−AlaまたはＮ−メチル−Ｄ−Alaを表わ
    し； R³はLysまたはAlaを表わし； R⁴はAla、Leu、Val、β−Alaまたはα−Aibを表わし； R⁵はMet、LeuまたはNleを表わし； R⁶はArg−Gln−Gln−Gly−Glu−Ser−Asn−Gln−Glu−A
    rg−Gly−Ala−Arg−Ala−Arg−Leu及びそのフラグメン
    トから選ばれるアミノ酸配列を表わし、該フラグメント
    の配列はカルボキシル末端から１〜15個のアミノ酸残基
    だけ数が減ぜられており；そして ＸはOHまたはNH₂である、 の生長ホルモン放出性因子（GRF）化合物またはその製
    薬学的に許容し得る酸または塩基付加塩を有効成分とし
    て含有することを特徴とする生長ホルモン放出剤。