JPS63243096A

JPS63243096A - ポリペプチドの製造法

Info

Publication number: JPS63243096A
Application number: JP62075561A
Authority: JP
Inventors: Tetsutaro Sajiki; 桟敷　徹太郎; Mitsuo Nakashita; 中下　光夫; Akiko Watanabe; 晶子渡辺
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 1987-03-27
Filing date: 1987-03-27
Publication date: 1988-10-07

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｉ
）〔以下、単にポリペプチド（１）という〕の固相法に
よる製造法に関する。

１ｌ−Ｔｙｒ−Ａ　Ｉａ−Ａｓｐ−Ａ　Ｉａ−１１ｅ−
Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ　−５ｅｒ−Ｔｙｒ　−Ａｒｇ
−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−
５ｅｒ−＾１ａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｎ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｍｅｔ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌ
ｎ−ＧＩｒｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−八ｓｎ−Ｇｌ
ｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−八Ｉａ
−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−ＮＨｚ　　　　　　　　　　　　　
（１）〔従来の技術〕ポリペプチド（Ｉ）はサイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　
＋拡５８５〜５８７　（１９Ｂ２）において公知の如く
ヒトの膵臓腫瘍から分離・抽出された物質であり、ｈｕ
ｍａｎｐａｎｃｒｅａｓ　ｇｒｏｗｔｈ　ｈｏｒｍｏｎ
ｅ　ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　（ｈｐＧＲＦ
）と命名されている。この物質は強い成長ホルモン分泌
促進作用を有することから小人症等種々の成長ホルモン
欠乏症にを効であるばかりでなく、抗潰瘍剤、創傷の治
療剤等としての利用も考えられ、医薬品として極めて有
用である。

ポリペプチドＨ）の製造法としては、上記の文献および
特開昭５９−１６８６３号明細書に記載されている固相
法を用いる方法ならびに特開昭５９−１６１３４４号明
細書および特開昭５９−２１６８５９号明細書に記載さ
れている液相法を用いる方法等が既に知られている。

高速液体クロマトグラフィーによる分取精製等の高度な
精製技術が発達した現在、短時間に効率よく合成できる
固相法はペプチドの製造方法として有用な手段となって
きている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者らは、上記固相法文献（特開昭５９−１６８６
３号明細書）に記載の方法について検討を重ねてきたと
ころ、当該方法によればポリペプチド（１）以外に副生
成物としてイミド体がポリペプチド（１）の約１．５倍
程度も生成し、ポリペプチド（１）の収量を減少させて
いることがわかった。また、室温の上昇と共に（特に２
５“Ｃ以上では大量に）副生成物の生成が増加し、ポリ
ペプチド（１）の約２．５倍程度にもなることもわかっ
た。即ち、上記同相法に従ってポリペプチド（１）を公
知製造法によって製造すれば、予想以上に大量の副生成
物が生し、ポリペプチド（１）の収量が大幅に減少する
こと、特に反応温度が若干上昇すると、大幅にポリペプ
チド（１）の収量が減少することを知見した。

従って、本発明の目的は、副生成物の生成を抑えること
により、ポリペプチド（Ｉ）の収量を大幅に増加させた
ポリペプチド（１）の製造方法を提供することである。

本発明の他の目的は、温度の影響によるポリペプチド（
１）の収量に変動の少ないポリペプチド（１）の製造方
法を提供することである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは上記の目的を達成するために種々研究を重
ねて来たところ、副生成物の生成には、３位と２５位の
アスパラギン酸が関与していること、特に３位のアスパ
ラギン酸が関与していることを見出した。また、当該３
位のアスパラギン酸の側鎖の保護基としてシクロアルキ
ル基を用いることにより、好ましくは３位のアスパラギ
ン酸の側鎖に加えて、さらに２５位のアスパラギン酸の
側鎖の保護基としても上記の保護基を使用することによ
り、温度の高低にかかわらず、副生成物の生成が抑えら
れ、ポリペプチド（１）の収量が増加されることを見出
し、さらに研究を重ねて本発明を完成した。

即ち、本発明はポリペプチド（１）の固相法による製造
において、少なくとも３位のアスパラギン酸の側鎖の保
護基としてシクロアルキル基を用いることを特徴とする
ポリペプチド（１）の製造法に関する。また、本発明の
好ましい態様は、さらに２５位のアスパラギン酸の側鎖
の保護基としても、シクロアルキル基を用いることに関
するものである。

本明細書において、固相法によるペプチド合成とは、た
とえば〔榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化
学■、第４０１頁（東京化学同人）〕に記載されている
如く、不溶性担体に製造を意図するポリペプチドのＣ，
！端から保護されたα−アミノ酸を１個ずつＮ末端まで
順次結合させることによるポリペプチドの製造方法であ
る。各アミノ酸を結合させた後、不溶性担体からの切り
離し、脱保護基、精製を行って目的のポリペプチドが得
られる。

本発明において、３位のアスパラギン酸の側鎖カルボキ
シル基の保護基としては、シクロアルキル基が用いられ
る。

また、３位のアスパラギン酸の側鎖カルボキシル基に加
えて、２５位のアスパラギン酸の側鎖カルボキシル基と
しても、シクロアルキル基を用いることが好ましい。

当該シクロアルキル基としては、好ましくは炭素数５〜
７のもの、即ちシクロペンチル基、シクロヘキシル基お
よびシクロヘプチル基が例示される。また、３位のアス
パラギン酸の側鎖カルボキシル基の保護基と、２５位の
アスパラギン酸の側鎖カルボキシル基の保護基とは同一
であっても異なるものであってもよい。

次にアスパラギン酸の側鎖カルボキシル基の保護基以外
の保護基について説明する。

α−アミン基の保護基としては、たとえば下記のものが
例示される。

＋１＋　　脂肪族ウレタン保３１，１、たとえばｔ−ブ
チルオキシカルボニルａ　（Ｂ　ｏ　ｃ基）、ジイソプ
ロピルメチルオキンカルボニル基、（２）芳香族ウレタン型保護基、たとえばヘンシルオキ
シカルボニル基、ｐ−ニトロヘンシルオキシカルボニル
基、ｐ−ブロムヘンシルオキシカルボニル基、ｐ−メト
キシヘンシルオキシカルボニル基、（３）　　その他と
してたとえばホルミル基、トリチル基、特に好ましいα−アミノ基の保護基としては、１３ｏｃ
基が挙げられる、チロシンのフェノール性水酸基のための保護基は、好適
にはテトラヒドロピラニル基、む−ブチル基、Ｉ・リチ
ル基、ヘンシル基、２，６−ジクロルベンジル基、ヘン
シルオキシカルボニル基等の保護基から選ばれる。特に
好ましい保護基は２，６−ジクロルベンジル基である。

セリン、スレオニンの水酸基のための保護基は、好適に
はアセチル基、ｔ−ブチル基、テトラヒドロピラニル基
、ヘンジイル基、ヘンシル基、ヘンシルオキシカルボニ
ル基等の保護基から選ばれる。

特に好ましい保護基はヘンシル基である。

アルギニンのグアニジノ基の保護基は、好適にはニトロ
基、トシル基、ヘンシルオキシカルボニル基、アダマン
チルオキシカルボニル基等の保護基から選ばれる。特に
好ましい保護基はトシル基である。

リジンの側鎖アミノ基の保護基は、好適には２−クロル
ベンジルオキシカルボニル基、トシル基、ベンジルオキ
シカルボニル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基等の保
護基から選ばれる。特に好ましい保護基は２−クロルヘ
ンシルオキシカルボニル基である。

グルタミン酸の側鎖カルボキシル基の保護基は、好適に
はベンジル基、２，６−ジクロルベンジル基、シクロペ
ンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等の保
護基から選ばれる。特に好ましい保護基はシクロペンチ
ル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、ベンジル
基である。

固相合成に用いられる不溶性担体としてはポリスチレン
樹脂、ポリアクリルアミド樹脂等が挙げられ、目的のペ
プチド（１）のＣ末端がアミド体であるためＣ末端をア
ミド体として合成できる担体であるものならば特に制限
はない。具体的には、たとえばベンズヒドリルアミン樹
脂（ＢＨＡ）、ｐ−メチルヘンズヒドリルアミン樹脂（
ＭＢＨＡ）等が用いられる。好ましくはＭＢＨＡ樹脂が
用いられる。

ポリペプチド（１）の製造に際しては、ポリペプチド（
Ｉ）に対応するＣ末端から保護アミノ酸を順次１個ずつ
、たとえば同相反応器に導入して縮合反応させていく。

本発明における縮合反応に際してはカルボキシル基自体
として反応に供する場合は、通常縮合剤の存在下に行わ
れる。縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミ
ドヒドロキシヘンシトリアゾール、１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣＤ
）等が例示される。また、カルボキシル基を反応性誘導
体に変換したものを反応に供してもよく、かかる反応性
誘導体としては、たとえば混合酸無水物（たとえば、ア
ミノ酸のカルボキシル部分とクロル蟻酸エチル、クロル
蟻酸イソブチル等との混合酸無水物）、対称酸無水物、
酸ハライド（たとえば、酸クロライド）、活性エステル
等が例示される。

当該縮合反応に際しては、反応に不活性な溶媒を使用す
ることが好ましく、溶媒としては好ましくは塩化メチレ
ン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、これらの混合溶
媒が使用される。なお、不完全なカンプリング反応がお
こった場合、同しアミノ酸によるカップリング反応を繰
り返すことができる。

当該縮合反応においては、アミノ基の保護されたアミノ
酸を縮合させた後、当該アミノ基の保護基を脱保護し、
次のアミノ基の保護されたアミノ゛　酸を反応させる。

その際、たとえばα−アミノ基の脱保護はたとえば塩化
メチレン中のトリフルオロ酢酸もしくはトリフルオロ酢
酸単独、またはジオキサン中の塩酸を用いることにより
実施される。

各アミノ酸を縮合後、ポリペプチド（１）の不溶性担体
からの切り離しおよび脱保護を行うことが好ましい、そ
の手段としては、たとえばフ・７化水素を用いる方法等
の常套手段が用いられる。

上記で得られた粗ペプチドは自体既知の手段にて任意の
純度のものとして単離精製することができる。その具体
的手段としては、たとえばイオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲルクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフ
ィー等の単独または組合わせが例示される。

本明細書においては、アミノ酸について以下の略号を使
用した。

Ａｓｐ：アスパラギン酸　Ａｓｎ：アスパラギンＴｈｒ
：スレオニン　　　Ｓｅｒ：セリンＧｌｎ：グルタミン
　　　Ｇｌｕ：グルタミン酸Ｇａｙニゲリシン　　　　
Δ１ａ：アラニンＶａｌ：バリン　　　　　門ｅｔ：メ
チオニンＩｃｅ：イソロイシン　　Ｌｅｕ　：ロイシン
Ｔｙｒ：チロシン　　　　Ｐｈｅ：フェニルアラニン１
、ｙｓ：リジン　　　　　八ｒｇ：アルギニン〔発明の
作用・効果〕ポリペプチド（１）を製造するにあたり、３位アスパラ
ギン酸の側鎖の保護基として、または３位および２５位
のアスパラギン酸の側鎖の保護基としてシクロアルキル
基を用いることにより副生成物の生成が極度に抑えられ
、ポリペプチド（１）の収量を大幅に増大させることが
できる。さらにに驚くべきことに、本発明法により、ポ
リペプチド（１）を製造する際には温度が上昇（２５℃
以上）しても上記副生成物が増加しない。

ところで、日本のように寒暖差の大きいところでは一定
の温度を維持する温度調整設備には真人な費用を必要と
するが、本発明法によれば温度調整を厳密に行わすとも
ポリペプチド（１）を好収量で製造することができ、本
発明は工業的に極めて有用なものである。

〔実施例〕

以下に実施例を掲げて本発明をより具体的に説明するが
、これら実施例は本発明の説明を目的とするものであっ
て、本発明の限定を意図するものではない。

なお、下記実施例は特に特記しない限り次の要領で行っ
た。

■温度は七ノ氏度で表示した。

■グリシンを除き、他のアミノ酸はＬ体のものを使用し
た。

■アミノ酸の保護基としては、α−アミノ基にはＢｏｃ
基を使用した。ＳｅｒおよびＴｈｒの側鎖水酸基の保護
基としてはベンジル基を使用した。Ｌｙｓ側鎖の保護基
としては２−クロルベンジルオキシカルボニル基を使用
した。Δｒｇの側鎖グアニジノ基の保護基としてはｐ−
）ルエンスルホニル基を使用した。Ｔｙｒのフェノール
性水酸基の保護基としては２．６−シクロアルキル基を
使用した。

実施例１ポリペプチド（Ｉ）の合成をヘソクマン９９０型ペプチ
ド合成装置を用いてＭＢＨＡ樹脂（約６ｇの樹脂を用い
た。樹脂１ｇ当たり０．６２ミリ当景のアミノ基置換を
含有するもの）上にて段階的に行った。Ｇｌｕおよび＾
ｓｐの側鎖カルボキシル基はシクロヘキシル基により保
護した。

縮合手段およびフン化水素による脱保護基は特開昭５９
−１６８６３号明細書に記載の方法に準じて行った。合
成反応器の温度は２０〜２４℃であった０得られた粗ペプチドをＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＡＭ−３０３
（山村化学社製）オクタデシルシリカゲルカラム（０，
４６×２５国、５Ｐｍ）を用い０．１％トリフルオロ酢
酸中２７〜４０％アセトニトリルの直線的グラジェント
により分析した（２２０ｎｍの波長で検出）。ＨＰＬＣ
（高速液体クロマトグラフィー）の面積百分率の値から
算出するとイミド体と推定される副生成物はポリペプチ
ド（１）の約１９％生成していた。

このポリペプチド（１）の精製は、まずセファデックス
Ｇ−５０フアインを充填したカラム（５，ＯＸｌｏｏｃ
ｍ）で溶出液として３０％酢酸水溶液を用いて、ゲル濾
過クロマトグラフィーにより行った。続いて開始バッフ
ァー０．０１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ４，５）
　８００　ｍｌから最終バソファ−０，４Ｍ酢酸アンモ
ニうム水溶液（ｐｌ＋　６．５　）への指数関数的な凸
型勾配を用いてＣＭ−５２カルボキシメチルセルロース
（ワットマン社製）陽イオン交換クロマトグラフィー（
２，ＯＸ４５ｃｍ）によってペプチドを精製した。

次にこれをさらにＹＭＣ−Ｉ’ａｃｋ　Ａ−３６３（山
村化学社製）逆相オクタデシルシリカゲルカラム（３，
ＯＸ２５ｃｍ）上で均一溶離液として２８％アセトニト
リル−０，１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（ｐ＋＋　４．
５　）を用いて精製した。最終精製は上記ＹＭＣ−Ｐａ
ｃｋ　Ａ−３６３カラム上で均一溶離液として２０％ア
セトニトリル−０，２Ｎ−酢酸水溶液を用いる逆相クロ
マトグラフィーにより行われた。精製画分を集めこれら
を凍結乾燥してポリペプチド（１）を白色粉末として得
た。この物質はＹＭＣ−Ｉ”ａｃｋ　ＡＭ−３０３（山
村化学社製）オクタデシルシリカゲルカラム（０，４６
ｘ　２５　ｃ＋ｎ、　５　ｐｍ）を用い０．１％トリフ
ルオロ酢酸中２７〜４０％アセトニトリルの直線的グラ
ジエン１−により１ｍ１１分で用いる分析用ＨＰＬＣに
おいて２０分で現れる１つのピークを示し、実質的に純
粋であると判定された。

６Ｎの塩酸加水分解物のアミノ酸分析は次のアミノ酸比
を示した。

八Ｓｐ　（４，２）、　　Ｔｈｒ　　（１，０）、　　
Ｓｅｒ　　（３，６）、　　Ｇｌｕ　　（７，２）。

Ｇｌｙ　（３，１）、　Ａｌａ　（５，１）、　Ｖａｌ
　（１，０）、　Ｍｅｔ　（１，１）。

１１ｅ　（２，０）、　Ｌｅｕ　（５，０）、　Ｔｙｒ
　（２，０）、　Ｐｈｅ　（１，０）。

Ｌｙｓ　（２，０）、　Ａｒｇ　（５，９）分析によっ
て配列の正しいことが確認された。

実施例２ポリペプチド（１）の合成をヘソクマン９９０型ペプチ
ド合成装置を用いて、実施例１に記載した方法により、
ＭＢＨＡ樹脂上で段階的に行った。

反応器の温度は２５〜２８℃であった。実施例１に記載
の方法に４８して処理して樹脂より分離され、保護基を
除去された粗ペプチドをＨＰＬＣにより分析したところ
イミド体と推定される副生成物はポリペプチド（Ｉ）の
約１３％であった。実施例１に記載した方法に準じて精
製を行いポリペプチドＮ）を得た。ＨＰＬＣを用いてこ
のペプチドは実質的に純粋であると判定された。

実施例３ポリペプチド（１）の合成を実施例１に記載した方法に
よりＭＢＨＡ樹脂上で段階的に行った。

但し３３位と３７位のＧｌｕ側鎖の保護基としてシクロ
ヘキシル基ではなく、ヘンシル基を使用した。

反応器の温度は２０〜２２℃であった。

実施例１と同様に処理して樹脂より分離され、保護基を
除去された粗ペプチドをＨＰＬＣにより分析した。イミ
ド体と推定される副生成物はポリペプチド（１）の約２
８％生成していた。実施例１に記載した方法に準じて精
製を行いポリペプチド（１）を得た。ＨＰ　Ｌ　Ｃを用
いてこのペプチドは実質的に純粋であると判定された。

八ｓｐ　　（４，２）、　　Ｔｈｒ　　（１，０）、　
　Ｓｅｔ　　（３，６）、　　Ｇｌｕ　　（７，２）。

Ｇｌｙ　　（３，２）、　　八Ｉａ　　（５，２）、　
　Ｖａｌ　　（１，０）、　　Ｍｅｔ　　（１，０）。

Ｉ］ｅ　（２、Ｏ）、　Ｌｅｕ　（５，０）、　Ｔｙｒ
　（１，９Ｌ　Ｐｈｅ　（１，０）。

Ｉ−ｙｓ　　（１，９）ｌ　Ａｒｇ　　（５，８）分析
によって配列の正しいことが確認された。

実施例４ポリペプチド（Ｉ）の合成をヘソクマン９９０型ペプチ
ド合成装置を用いて、実施例１に記載した方法によりＭ
ＢＨＡ樹脂上で段階的に行った。

但し３３位と３７位のＧｌｕおよび２５位のＡｓｐ側鎖
の保護基としてシクロヘキシル基ではなく、ヘンシル基
を使用した。反応器の温度は１９〜２２℃であった。

実施例１と同様に処理して樹脂より分離され、保護基を
除去された粗ペプチドをＨＰＬＣにより分析した。イミ
ド体と推定される副生成物はポリペプチド（１）の約３
０％生成していた。実施例１に記載した方法に準じて精
製を行いポリペプチド（１）を得た。ＨＰＬＣを用いて
このペプチドは実質的に純粋であると判定された。

比較例１ポリペプチド（１）の合成をヘノラマン９９０型ペプチ
ド合成装置を用いて、実施例１に記載した方法に準じて
ＭＢＨＡ樹脂上で段階的に行った。

但しＧｌｕおよびＡｓｐ側鎖の保護基としてヘンジル基
（即ち従来法）を使用した。反応器の温度は１８〜２０
“Ｃであった。

実施例１と同様に処理して樹脂より分離され、保護基を
除去された粗ペプチドをＨＰ　Ｌ　Ｃにより分析した。

イミド体と推定される副生成物はポリペプチド（１）の
１７０％生成していた。

比較例２ポリペプチド（１）の合成をヘソクマン９９０型ペプチ
ド合成装置を用いて、実施例１に記載した方法型してＭ
　Ｂ　ＨＡ樹脂上で段階的に行った。

ただしＧｌｕおよびＡｓｐ側鎖の保護基としてヘンシル
基（即ち従来法）を使用した。反応器の温度は２２〜２
４°Ｃ（一時最高温度２７℃）であった。

イミド体と推定される副生成物はポリペプチドＮ）の２
６０％生成していた。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ I
）の固相法による製造において、少なくとも３位のアス
パラギン酸の側鎖の保護基としてシクロアルキル基を用
いることを特徴とするポリペプチド（ I ）の製造法。【アミノ酸配列があります】（ I ）
（２）２５位のアスパラギン酸の側鎖の保護基としても
シクロアルキル基を用いることを特徴とするポリペプチ
ド（ I ）の製造法。