JP2559767B2 - 新規カルシトニン誘導体及びその塩 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は、血清Ca²⁺濃度を低下させる作用を有し、骨
粗鬆症、骨ページェット病、高カルシウム血症等の治療
薬として有用な新規カルシトニン誘導体及びその塩に関
するものである。

（従来の技術及びその問題点） カルシトニン（以下「CT」と称する）は、ヒトなどの
各種哺乳動物の甲状腺、あるいは、魚類、円口類、鳥類
の鰓後体に存在するペプチドホルモンである。このホル
モンは、副甲状腺ホルモンと拮抗する作用を示し、骨な
どに作用して血液中のCa²⁺濃度を低下させることが知ら
れている。現在までのところ、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツ
ジ、ラット、ニワトリ、サケ、ウナギからCTが抽出精製
され、そのアミノ酸一次配列が明らかにされている。こ
れら動物由来CTは、いずれも32個のアミノ酸からなるポ
リペプチドで、１位と７位のシステイン残基が、ジスル
フィド結合を形成し、カルボキシル基末端（以下「Ｃ末
端」と称する）がプロリンアミドである点で共通してい
る。

これらCTは、骨粗鬆症、骨ページェット病あるいは高
カルシウム血症などの治療薬として期待される。しかし
ながら、CTの有するジスルフィド結合が溶液中で極めて
不安定であると推定され、生理活性の低下をまねく可能
性があるため、医薬品としての利用が極めて限定されて
きた。この問題を解決する手段として、CTのシスチン残
基 を、α−アミノスベリン酸残基 で置換した誘導体（以下 と称する）が合成された。この誘導体は高いCT活性を有
し、しかも溶液中で高い安定性を示すため、医薬品とし
て有用であった。

しかし、 はAsuを含むため、合成が複雑で、即ち、ペプチド化学
における液相法によってのみ合成が可能で、簡便かつ迅
速な合成法である固相法が適用できない、という問題点
がある。そこで、本発明者らは、高活性、高安定性を有
し、かつ固相法による合成が可能な誘導体を得ることを
目的として鋭意研究を重ねた結果、カルシトニンの１位
のアミノ酸残基を特定の環状アミノ酸残基とすることに
より前記目的が達成されることを見出し、本発明を完成
するに至った。

本願明細書において使用される略称、略号の意味、意
義は次の如くである。

1.アミノ酸について Ala:アラニン、Arg:アルギニン、Asn:アスパラギン、
Asp:アスパラギン酸、Cys:システイン、Gln:グルタミ
ン、Glu:グルタミン酸、Gly:グリシン、His:ヒスチジ
ン、Ile:イソロイシン、Leu:ロイシン、Lys:リジン、Me
t:メチオニン、Phe:ファニルアラニン、Pro:プロリン、
Ser:セリン、Thr:スレオニン、Trp:トリプトファン、Ty
r:チロシン、Val:バリン、 Oct:3−オキソ−５−カルボキシペルヒドロ−1,4−チア
ジン、Kpc:2−ケト−ピペリジン−６−カルボン酸、pGl
u:ピログルタミン酸 各々、対応するアミノ酸残基を示す場合もある。

2.保護基について Boc:t−ブチルオキシカルボニル、Fmoc:9−フルオレ
ニルメチルオキシカルボニル、Bu^t:t−ブチル、Bzl:ベ
ンジル、Cl₂・Bzl:2,6−ジクロロベンジル、Z:ベンジル
オキシカルボニル、Cl・Z:2−クロロベンジルオキシカ
ルボニル、Npys:3−ニトロピリジンスルフェニル、OBz
l:ベンジルエステル、OBu^t:t−ブチルエステル、OcHex:
シクロヘキシルエステル、Tos:トシル、Br・Z:2−ブロ
モベンジルオキシカルボニル、NO₂：ニトロ基、Mtr:4−
メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼンスルホニル、Fo
r:ホルミル、Acm:アセトアミドメチル、Ｍ・Bzl:4−メ
トキシベンジル、4CH₃・Bzl:4−メチルベンジル、Trt:
トリチル、SBu^t:t−ブチルメルカプト、CA:カルバモイ
ルメチル、CM:カルボキシメチル、AE:アミノエチル 3.試薬について DCC:ジシクロヘキシルカルボジイミド、HOBt:1−ヒド
ロキシベンゾトリアゾール、DTT:ジチオスレイトール、
DCM:ジクロロメタン、DMF:ジメチルホルムアミド、DMS
O:ジメチルスルホキシド、MeOH:メタノール、TEA:トリ
エチルアミン、TFA:トリフルオロ酢酸、HF:フッ化水
素、HCl:塩化水素又は塩酸、CH₃CN：アセトニトリル、T
ris:HCl:トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸
塩 ［発明の構成］ （問題点を解決するための手段） 本発明は、カルシトニンの１位のアミノ酸残基が 次式（Ｉ）： （式中、Ｘはイオウ原子又はメチレン基を表し;nは０又
は１を表す。） で示される環状アミノ酸残基であり、７位のアミノ酸残
基が適当な保護基で置換されていてもよいシステイン残
基であることを特徴とするカルシトニン誘導体及びその
塩に関するものである。

カルシトニンとは、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ラッ
ト、ニワトリ、サケ、ウナギ等の臓器から抽出精製され
る32個のアミノ酸残基からなる天然型カルシトニン、合
成カルシトニン（例えば、特開昭61-47498号公報、特開
昭61-233699号、米国特許第4,622,387号、同第4,497,73
2号、同第4,604,238号、同第4,605,515号、同第4,605,5
14号、同第4,604,237号、同第4,604,236号公報記載のカ
ルシトニン）及びカルシトニン誘導体をいう。

１位の環状アミノ酸残基としては、特にOct、Kpc、pG
luが好ましい。

７位のアミノ酸残基であるシステイン残基は、適当な
保護基で置換されていてもよい。

かかるシステイン残基の保護基は、ペプチド化学上慣
用されるメルカプト基の保護基であればよく、例えば、
ペプチドの合成時の保護基として用いられる4CH₃・Bzl
基、Acm基、Trt基、あるいは、メルカプト基と修飾剤の
反応によって導入されるCA基、CM基、AE基等が挙げられ
る。特に、Acm基、CA基が好ましい。

１位及び７位以外のアミノ酸残基は、カルシトニンを
構成しうるものであれば制限はなく、例えば、以下のよ
うなものが挙げられる。

２位:Ala、Ser又はGly ３位:Ser又はAsn ４位:Leu ５位:Ser ６位:Thr ８位:Val又はMet ９位:Leu 10位:Gly又はSer 11位:Lys、Thr又はAla 12位:Leu又はTyr 13位:Ser、Thr又はTrp 14位:Gln、Lys又はArg 15位:Glu、Asp又はAsn 16位:Leu又はPhe 17位:His又はAsn 18位:Lys又はAsn 19位:Leu、Phe又はTyr 20位:Gln又はHis 21位:Thr又はArg 22位:Tyr又はPhe 23位:Pro又はSer 24位:Arg、Gln又はGly 25位:Thr又はMet 26位:Asp、Asn、Ser、Gly又はAla 27位:Val、Thr、Ile又はPhe 28位:Gly 29位:Ala、Ser、Val又はPro 30位:Gly又はGlu 31位:Thr、Val又はAla これらのアミノ酸残基のうち、特に、ニワトリカルシ
トニン、ウナギカルシトニン、サケカルシトニンを構成
するアミノ酸残基の組合せが好ましい。

本発明のカルシトニン誘導体の具体例は次の如くであ
る。

［（Oct¹,Cys（CA）^７）−CCT］ ［（Oct¹,Cys（Acm）^７）−CCT］ ［（Oct¹,Cys（Acm）^７）−ECT］ （式中、CCTはニワトリカルシトニンを表し、ECTはウナ
ギカルシトニンを表す。以下同様） 本発明のカルシトニン誘導体は、塩酸、硫酸、リン酸
等の鉱酸、あるいは酢酸、クエン酸等の有機酸との塩の
形態であってもよく、また、ナトリウム、カリウム、カ
ルシウム等の金属塩、あるいは、アンモニア、ジシクロ
ヘキシルアミン、ピリジン等の有機塩基との塩の形態で
あってもよい。

本発明のカルシトニン誘導体は、ペプチドの合成に常
用される固相法又は液相法によって合成することができ
る。この合成は、例えば、矢島治明、榊原俊平著、日本
生化学会編、生化学実験講座（Ｉ）；“蛋白質の化学"4
巻、東京化学同人発行（1977）；及び、泉屋信夫ほか著
“ペプチド合成の基礎と実験”丸善（株）発行（1985）
に記載されている方法に準じて行うことができる。本発
明のカルシトニン誘導体の合成法としては、固相法が好
ましい。

以下、固相法により本発明のカルシトニン誘導体を合
成する場合について説明する。

１）まず、目的とするカルシトニン誘導体のＣ末端アミ
ノ酸、即ちProを不溶性樹脂に結合させる。次いで、該
誘導体のアミノ酸配列に従ってＣ末端側から保護アミノ
酸を順次結合させ、保護ペプチド樹脂を得る。不溶性樹
脂としては、当該技術分野で知られたもののいずれであ
ってもよく、例えば、HFで脱離可能なクロロメチル樹
脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂
（BHA樹脂）、TFAで脱離可能な４−（オキシメチル）フ
ェノキシメチル樹脂、４−（アミノメチル）フェノキシ
メチル樹脂等が挙げられるが、BHA樹脂あるいは４−
（アミノメチル）フェノキシメチル樹脂は該樹脂とペプ
チド鎖間の開裂によって直接アミドを与えるので、特に
好ましい。

「保護アミノ酸」とは、官能基を公知の方法により保
護基で保護したアミノ酸であり、各種の保護アミノ酸が
市販されている。本発明のカルシトニン誘導体を合成す
る場合には、以下に示す保護基のいずれかを選択するの
が好ましい。まず、アミノ酸のα−アミノ基の保護基は
Boc又はFmocである。Ser、Thrの水酸基の保護基は、B
u^t、Bzlである。Tyrの水酸基の保護基は、Cl₂・Bzl、Bu
^tであるか、あるいは保護しなくてもよい。Lysのε−ア
ミノ基の保護基は、Ｚ、Cl・Ｚ、Boc、Npysである。Gl
u、Aspのカルボキシル基の保護基は、OBzl、OBu^t、OcHe
xである。Argのグアニジノ基の保護基は、Tos、NO₂、Mt
rである。Hisのイミダゾリル基の保護基は、Tos、Fmoc
である。Metの保護基は酸素でもよいが、保護しない方
が好ましい。Trpのインドリル基の保護基は、Forである
か、あるいは保護しなくてもよい。Cysのメルカプト基
の保護基は、Bzl、Ｍ・Bzl、4CH₃・Bzl、Acm、Trt、Npy
s、Bu^t、SBu^tである。メルカプト基の保護基には、後述
のようなメルカプト基と修飾剤の反応によって導入され
るCM、CA、AE等の保護基もあるが固相法における使用は
好ましくない。各保護基は、ペプチドの合成条件に応じ
適切なものを選択する必要がある。

前記式（Ｉ）で示される環状アミノ酸残基に対応する
環状アミノ酸であるOct、Kpc等は公知の方法に従って合
成することができる。この合成は、例えば、特公昭41-2
0827号公報;J.Chromatogr.,294（1984）,413;Bull.Che
m.Soc.Japan,36（1963）,920;特開昭52-116465号公報等
に記載されている方法に準じて行なうことができる。Oc
tの場合、例えば、以下に示す方法に従って合成する。

システイン又はその塩を水に懸濁し、モノヨードアセ
トアミド、モノブロモアセトアミド等のカルバモイルメ
チル化剤を加える。適切な塩基、例えば、水酸化ナトリ
ウム、リン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウ
ム、水酸化アンモニウム等の無機塩基、あるいは、TE
A、ジシクロヘキシルアミン等の有機塩基を添加し、混
合溶液をpH6〜10、好ましくはpH7〜９に調整する。反応
温度20〜60℃、好ましくは室温〜50℃で、反応時間0.1
〜10時間、好ましくは0.5〜５時間で反応させ、システ
インのメルカプト基をカルバモイルメチル化する。続い
て、反応溶液を封管中で、反応温度60〜150℃、好まし
くは80〜120℃で、反応時間0.5〜50時間、好ましくは１
〜10時間で反応させ、Octを得る。得られたOctは再結
晶、各種クロマトグラフィー等の方法を用いて精製す
る。

保護アミノ酸の結合は、通常の縮合法、例えば、DCC
法、活性エステル法、混合あるいは対称酸無水物法、カ
ルボニルジイミダゾール法、DCC-HOBt法、ジフェニルホ
スホリルアジド法等に従って行なうことができるが、DC
C法、DCC-HOBt法、対称酸無水物法が好ましい。これら
の縮合反応は、通常、DCM、DMF、クロロホルム、DMSO、
ベンゼン等の有機溶媒又はそれらの混合溶媒中で行なわ
れる。DCM、DMF又はこれらの混合溶媒中で行なうのが好
ましい。α−アミノ基の保護基の脱離試薬としては、TF
A/DCM、HCl/ジオキサン、ピペリジン/DMF等が用いら
れ、該保護基の種類により適宜選択する。また、合成の
各段階における縮合反応の進行の程度はE.カイザーらの
方法［Anal.Biochem.,34,595（1970）］（ニンヒドリン
反応法）によって検査される。

以上のようにして、所望のアミノ酸配列を有する保護
ペプチド樹脂を得るがその具体的な例を以下に示す。

この保護ペプチド樹脂のペプチドを樹脂から脱離さ
せ、更に、メルカプト保護基以外の保護基を脱離させる
試薬、例えば、HF、TFA等で処理すること（最終脱保護
反応）により、目的とするカルシトニン誘導体を得る。

２）また、７位のCysのメルカプト基の保護基に前述の
最終脱保護条件下で脱離可能な保護基を用いた場合に
は、保護ペプチド樹脂の最終脱保護反応により、Cysの
メルカプト基が遊離のペプチドを得る。このペプチド自
身も、本発明のカルシトニン誘導体に含まれるが、この
ペプチドを緩衝液中で、修飾剤と反応させ、メルカプト
基を保護することにより、７位のCysが保護された本発
明のカルシトニン誘導体を得ることができる。修飾剤と
しては、メルカプト基と反応して、保護基を導入しうる
ものであれば、どのようなものでもよい。例えば、モノ
ヨード酢酸、モノブロモ酢酸、モノヨードアセトアミ
ド、エチレンイミン、アクリロニトリル、ビニルピリジ
ン等のアルキル化又はアリール化剤、5,5′−ジチオビ
ス−（２−ニトロ）安息香酸又は2,2′−ジピリジルジ
スルフィドのような非対称ジスルフィド形成剤、Ｎ−エ
チルマレイミド、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸
等が挙げられる。修飾反応は、通常pH2〜11の、好まし
くはpH6〜９の緩衝液中で行なわれる。かかる反応に用
いられる緩衝液は公知のもので、例えば、クエン酸−ク
エン酸ナトリウム、酢酸−酢酸ナトリウム、リン酸、キ
ミダゾール−塩酸、Tris・HCl、ホウ酸、ジエタノール
アミン−塩酸、グリシン−水酸化ナトリウム等が挙げら
れる。修飾反応の条件は、修飾剤の種類によって異なる
が、例えば、モノヨードアセトアミドを用いる場合に
は、通常pH6〜10の各種の緩衝液を用いる。この場合、
モノヨードアセトアミドは、メルカプト基の通常0.1〜1
0倍当量、好ましくは１〜２倍当量であり、反応温度
は、通常０〜60℃、好ましくは20〜40℃であり、反応時
間は、通常0.1〜10時間、好ましくは0.5〜２時間であ
る。

３）また、本発明のカルシトニン誘導体のうち、１位の
アミノ酸残基がOctであるペプチドは、以下に示す方法
により合成してもよい。即ち、前述の最終脱保護条件下
で脱離可能な保護基、例えば、Ｍ・Bzl、4CH₃・Bzlで保
護したCysをOctの代わりに用いて保護ペプチド樹脂を合
成する。この保護ペプチド樹脂の具体的な例を以下に示
す。

この保護ペプチド樹脂は、前述の方法に従って、最終
脱保護を行ない、遊離のメルカプト基をもつペプチドを
得る。このペプチドのメルカプト基は、例えば、モノヨ
ードアセトアミド、モノブロモアセトアミド等の修飾剤
を用いてカルバモイルメチル化して保護する。得られた
CA化ペプチドを緩衝液中で加熱することにより、目的と
するペプチドを得る。かかる反応に用いられる緩衝液は
前述のごとく公知のものであり、そのpHは、通常２〜1
0、好ましくは３〜７である。また、ペプチドの濃度
は、通常0.1〜100μＭ、好ましくは0.5〜10μＭであ
り、反応温度は、通常30〜150℃、好ましくは60〜100℃
であり、反応時間は、通常0.1〜100時間、好ましくは0.
5〜50時間である。

４）更に、３）で述べたカルシトニン誘導体のうち、７
位のアミノ酸残基がカルバモイルメチルで保護されたCy
sであるペプチドは、以下に示す方法により合成しても
よい。

天然型カルシトニンを塩基性水溶液中で適切な還元剤
を作用させ、分子内ジスルフィド結合を還元し、メルカ
プト基を遊離させる。次いで、前述３）の方法と同様の
方法で、目的とするペプチドを得る。かかる還元反応に
用いる塩基性水溶液は、pH7〜13の各種緩衝液を用い
る。かかる緩衝液としては、前述と同様のものを用い
る。還元剤としては、有機合成で一般に用いられる還元
剤をすべて用いることができる。例えば、DTT、チオグ
リコール酸、２−メルカプトエタノール等のチオール
類、水素化ホウ素ナトリウム、水素化アルミニウムリチ
ウム、亜鉛等が挙げられる。例えば、DTTを使用する場
合、その使用量は、ペプチドの通常0.1〜100倍当量、好
ましくは１〜10倍当量であり、反応温度は、通常１〜60
℃、好ましくは20〜40℃であり、反応時間は、通常１〜
24時間、好ましくは３〜５時間である。修飾反応におい
て、モノヨードアセトアミドやモノブロモアセトアミド
等の修飾剤は、還元剤に対し、通常0.1〜100倍当量、好
ましくは１〜２倍当量加える。

かくして得られたペプチドは、ペプチドの常套的手
段、例えば、抽出、再結晶、各種クロマトグラフィー
（ゲル過、イオン交換、分配、吸着、逆相）、電気泳
動、向流分配等により単離精製することができるが、逆
相高速液体クロマトグラフィー（逆相HPLC）による方法
が最も効果的である。

（発明の実施例） 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、
これらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。

実施例１ （II,（Oct¹,Csy（CA）^７）−CCT）の合成（１） （１）３−オキソ−５−カルボキシペルヒドロ−1,4−
チアジンの合成 Ｌ−システイン塩酸塩一水和物1.75g（10mmol）を水5
0mlに溶解し、1M炭酸ナトリウムでpH8.0に調整した。窒
素気流下、モノヨードアセトアミド1.85g（10mmol）と1
M炭酸ナトリウム交互に、pH8.0に保ちながら加えた。室
温で１時間反応させた後、更に100℃で２時間封管中で
反応させた。反応液に4N HClを加え、pHを3.25に調整し
た後、濃縮乾固した。残渣を熱エタノールで抽出し、冷
却後、結晶を取し、熱エタノールより再結晶した。収
量560mg（34.8％）、融点182〜184℃、Fab質量分析［Ｍ
＋Ｈ］^＋＝162 （２）BHA樹脂へのプロリンの導入 BHA樹脂（ペプチド研究所製、ジビニルベンゼン２
％、100〜200メッシュ、アミノ基当量0.61meq/g）2gを
ペプチド固相合成用反応容器（ベガ社製）に入れ、下記
の溶媒各30mlで順次処理し、各々の処理後に過した。

DCM（３回、各２分） MeOH（３回、各１分） DCM（３回、各２分） 10％TEA/DCM溶液（５分、10分、各１回） 次いで、BHA樹脂をDCM15mlに溶解したBoc-Pro0.32g
（1.5mmol）とともに２分攪拌した。DCC0.31g（1.5mmo
l）のDCM15ml溶液を加え、120分攪拌した。反応混合物
を過して、Boc-Pro−樹脂を次の溶媒各30mlで洗浄・
過した。

DCM（３回、各２分） MeOH（３回、各２分） DCM（３回、各２分） 更に、Boc-Pro−樹脂に１−アセチルイミダゾール1.3
4g（12.2mmol）のDCM30ml溶液を加え、12時間かけてア
セチル化を行なった。これにより、BHA樹脂中の未反応
のアミノ基が修飾され、以下、保護アミノ酸の付加延長
はプロリンのＮ末端が反応開始点となる。

（３）31位スレオニンの導入 （２）で得られたBoc-Pro−樹脂全量をDCMで３回、Me
OHで３回、DCMで３回、各２分洗浄し、過した。この
樹脂に50％TFA溶液（溶媒;DCM）30mlを加え、５分攪拌
後、過した。更に、同様のTFA溶液下で30分攪拌し、B
oc基を脱離させた。得られた樹脂を（２）と同様にして
下記の溶媒各30mlで順次処理し、各々の処理後に過し
た。

DCM（３回、各２分） MeOH（３回、各２分） DCM（３回、各２分） 10％TEA/DCM溶液（５分、10分、各１回） DCM（３回、各２分） 次いで、Pro−樹脂にBoc-Thr（Bzl）0.46g（1.5mmo
l）のDCM15ml溶液を加え、２分攪拌した。次に、DCC0.3
1gのDCM15ml溶液を加え、240分攪拌した。反応後、DCM
で３回、MeOHで３回、DCMで３回、各２分洗浄し、過
した。この樹脂の極微量を採取し、ニンヒドリン試験が
陰性であることを確認した。次いで、樹脂の一部を採取
し、そのＣ末端アミノ酸結合量を測定したところ、0.15
mmol/gであった。

（４）30〜１位の各アミノ酸の導入 （３）と同様にして、Boc-Thr（Bzl）−Pro−樹脂
に、前記式（II）で示されるCTの30位から１位までの各
構成アミノ酸に対応する保護アミノ酸を順次カップリン
グした。表１に各反応段階で用いた保護アミノ酸とその
使用量を示す。

カップリング反応は、同一の保護アミノ酸量で２回行
ない、第１回目は120分、第２回目は300分のカップリン
グ反応時間とした。ここで、LysはBoc-Lys（Cl・Ｚ）TB
A（ペプチド研究所製）のTBAを脱離してBoc-Lys（Cl・
Ｚ）として用いた。Boc-Leu・H₂O及びOctはDCM単一溶媒
には難溶のため、Boc-Leu・H₂OはDMFとDCMの混合溶媒
（1:4）の混合溶媒に、OctはDMFに溶解して用いた。更
にOctのカップリング時の洗浄溶媒はDCMに代えてDMFを
用いた。14位及び20位のGluの導入においては、HOBt0.2
3gとBoc-Gln0.37gとを同時に反応容器へ添加した。

樹脂ペプチドを一昼夜減圧乾燥して乾燥樹脂ペプチド
を得た。

（５）HFによる分解 乾燥した樹脂ペプチドの一部（200mg）を秤量し、HF
分解用反応容器（テフロン製）に入れ、アニソール1.0m
lを加え、一夜放置し、樹脂を膨潤させた。攪拌子を入
れた前記反応容器をHF分解装置（ペプチド研究所製）に
取り付けドライアイス−エタノール浴中に置き、HF10ml
を反応容器中に導入した。この混合物を氷浴中において
１時間、０℃で攪拌した。減圧下にHFを徐々に留去し
た。３時間後、反応容器を取りはずし、ジエチルエーテ
ルを用いて反応容器から樹脂ペプチド分解物を取出し、
ジエチルエーテルで洗浄した。2M酢酸20ml中に樹脂ペプ
チド分解物を加え、脱保護されたペプチドを溶解した。

（６）メルカプト基のカルバモイルメチル化 この溶液を過し、アンモニア水でpH8.0に調整した
（40ml）。DTT30.8mgを加え、37℃で４時間攪拌した。
この還元操作で、メルカプト基の酸化によって生成する
可能性がある二量体が単量体にもどる。次に、モノヨー
ド酢酸37.0mgを加え、37℃で30分間暗所で反応させた。

この反応液をオクタデシルシリルシリカを充填したカ
ラム（ODSカラム，φ２×30cm）に吸着させ、水で洗浄
後、60％アセトニトリル溶液でペプチドを溶出した。溶
出液を凍結乾燥し、粗（Oct¹,Cys（CA）^７）−CCT26.8m
gを得た。

（７）粗（Oct¹,Cys（CA）^７）−CCTの精製 得られた粗（Oct¹,Cys（CA）^７）−CCTを1M酢酸に溶
解（5mg/ml）し、濃度勾配型高速液体クロマトグラフィ
ーにて精製した。カラムはケムコ社製ケムコパックODS-
H（φ10mm×250mm）を用い、溶離液はＡ液として水（10
0）−10％TFA（１）、Ｂ液として水（40）−アセトニト
リル（60）−10％TFA（１）を用い、Ａ液からＢ液への
直線型濃度勾配条件下で溶出した。ここで、（ ）内は
溶媒の体積比である。（Oct¹,Cys（CA）^７）−CCTに相
当する画分を分取し、凍結乾燥して白色粉末2.8mgを得
た。得られた白色粉末の生物活性を特開昭60-123500号
公報記載の方法に従い測定したところ、天然型CCTの生
物活性が4500MRC U/mgであったのに対し5400MRC U/mgで
あった。そのアミノ酸分析値を表２に示す。

得られた白色粉末を高速液体クロマトグラフィーで検
定した。

測定条件： カラム；ケムコ社製ケムコパックODS-H （φ4.6mm×150mm） 流 速;1.0ml/分 溶離液;A液（水：アセトニトリル:10％TFA＝100:0:1） Ｂ液（水：アセトニトリル:10％TFA＝40:60:
1） を用い、Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出
（30分） 測定波長;210nm その結果、保持時間24.7分にペプチドに基づく単一の
強い吸収を認め、これが本発明の（Oct¹,Cys（CA）^７）
−CCTであった。

次に本品15μｇをトリプシン５μｇ含有の１％炭酸水
素アンモニウム水溶液（pH8.0）50μｌに溶解し、37℃
で２時間トリプシン消化を行なった。本消化物を前述の
測定条件と同一条件で分析したところ、保持時間11.2
分、11.9分、13.0分、18.9分にペプチドに基づくピーク
を検出した。これらのペプチドのFab質量分析の結果を
表３に示す。その結果、（Oct¹,Cys（CA）^７）−CCTは
予想通り、Lys、ArgのＣ末端側で切断されて４つのペプ
チドフラグメントを与え、それぞれが理論値に一致する
質量数（［Ｍ＋Ｈ］^＋）を示した。

（表中、T₁、T₂、T₃、T₄はそれぞれ（Oct¹,Cys（C
A）^７）−CCTのトリプシン消化物をの条件で逆相HPLC
に供した時、保持時間11.2分、12.9分、13.0分、18.9分
にピークを示すペプチドを表わす。） また、本品の溶液中での安定性試験を以下のようにし
て行った。

0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に（Oct¹,Cy
s（CA）^７）−CCTを溶解し、10μg/ml濃度とした。この
溶液1mlを80℃、24時間封管中で放置した。測定条件
を用いた逆相HPLCで分析し、残存する（Oct¹,Cys（CA）
^７）−CCTの溶出ピーク面積Ａを求めた。同様にして、
加熱処理していない試料溶液中の（Oct¹,Cys（CA）^７）
−CCTの溶出ピーク面積Ｂを求め、ＡのＢに対する割合
（％）を安定性の指標とした。同様にして、CCT及び の安定性試験を行なった結果を表４にまとめる。

実施例２ （II）の合成（２） 次式で示される天然型ニワトリCT: を200μｇ秤量し、0.2M Tris・HCl緩衝液（pH8.2,0.2％
EDTA含有）150μｌに溶解した。この溶液に、DTT 185μ
ｇを溶解した同一緩衝液100μｌを窒素気流下添加し、3
7℃で５時間反応させた。次いで、モノヨードアセトア
ミド444μｇを溶解した0.1M NaOH 25μｌを添加し、37
℃暗所で30分間反応させた。1N AcOHを添加し、pHを２
〜３に調整した。

この混合液を逆相HPLCを用いて精製し、主ピークを分
画して凍結乾燥し、下記構造を有するペプチドを得た。

逆相HPLCの条件は下記のとおりである。

カラム；ケムコ社製ケムコパック ODS-H （φ4.6mm×150mm） 流 速;1.0ml/分 溶離液;A液（水：アセトニトリル＝100:0） Ｂ液（水：アセトニトリル＝40:60）を用い、
Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（30分） 測定波長;210nm このペプチドを0.2Mクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.
0）に溶解し（10μg/ml濃度）、80℃、24時間封管中で
放置した。反応液を逆相HPLC（条件は測定条件と同
一）を用いて精製し、主ピークを分画し、凍結乾燥して
白色粉末78.8μｇを得た。この白色粉末の逆相HPLCによ
る検定、アミノ酸分析及びトリプシン分解物のFab質量
分析の結果は、実施例１に示す（Oct¹,Cys（CA）^７）−
CCTと一致した。また、本ペプチドのトリプシン分解に
よって得られるＮ末端側フラグメントペプチドのカルボ
キシペプチダーゼＹ分解物のアミノ酸分析及びFab質量
分析の結果も、実施例１に示す（Oct¹,Cys（CA）^７）−
CCTと一致し、本ペプチドは、（Oct¹,Cys（CA）^７）−C
CTであることが判明した。本ペプチドの生物活性を実施
例１に示す方法に従って測定したところ、実施例１で得
られたものと同等であった。

実施例３ ［（Oct¹,Cys（Acm）^７）−CCT］の合成 ７位のアミノ酸の導入において、Boc-Cys（4CH₃・Bz
l）の代わりにBoc-Cys（Acm）0.44g（1.5mmol）を用い
る以外は、実施例１と同様の条件にて固相合成を行な
い、保護ペプチド樹脂を得た。保護ペプチド樹脂の一部
（200mg）を実施例１と同様にしてHF分解した。得られ
たペプチドの酢酸溶液をそのまま凍結乾燥し、粗（Oc
t¹,Cys（Acm）^７）−CCT 31.0mgを得た。このペプチド
を実施例１−（７）と同様の方法で精製し、（Oct¹,Cys
（Acm）^７）−CCT 3.7mgを得た。本ペプチドの生物活性
を実施例１と同様にして測定したところ、天然型CTTの
生物活性が4500 MRC U/mgであったのに対し5500 MRC U/
mgであった。

実施例４ ［（Oct¹,Cys（Acm）^７）−ECT］の合成 ２位、３位、７位のアミノ酸の導入において、Boc-Al
aの代わりにBoc-Ser（Bzl）0.44gを、Boc-Ser（Bzl）の
代わりにBon-Asn0.35gとHOBt0.23gを、Boc-Cys（4CH₃・
Bzl）の代わりにBoc-Cys（Acm）0.44gをそれぞれ用いる
以外は、実施例１と同様の条件で固相合成を行ない、保
護ペプチド樹脂を得た。保護ペプチド樹脂の一部を実施
例１と同様にしてHF分解し、得られた粗ペプチドを実施
例１−（７）と同様の方法で精製し、（Oct¹,Cys（Ac
m）^７）−ECTを得た。本ペプチドの生物活性を実施例１
と同様にして測定したところ、天然型ECTの生物活性が4
500MRC U/mgであったのに対し5400MRC U/mgであった。

実施例５ HF分解処理後において、メルカプト基を保護する操
作、即ちモノヨードアセトアミド処理を実施しないこと
以外は、実施例１と同様の方法で合成を行ない、（Oc
t¹,Cys⁷）−CCTを得た。本ペプチドの安定性、生物活性
を実施例１と同様にして測定したところ、実施例１の
（Oct¹,Cys（CA）^７）−CCTとほぼ同等であった。

実施例６ １位のアミノ酸の導入において、Octの代わりにKpc0.
21g（1.5mmol）を用いる以外は、実施例１と同様の方法
で合成を行ない、（Kpc¹,Cys（CA）^７）−CCTを得た。
本ペプチドの安定性、生物活性を測定したところ、いず
れも実施例１の（Oct¹,Cys（CA）^７）−CCTとほぼ同等
であった。

実施例７ １位のアミノ酸の導入において、Octの代わりにpGlu
0.19g（1.5mmol）を用いる以外は、実施例１と同様の方
法で合成を行ない、（pGlu¹,Cys（CA）^７）−CCTを得
た。本ペプチドの安定性、生物活性を測定したところ、
いずれも実施例１の（Oct¹,Cys（CA）^７）−CCTとほぼ
同等であった。

これまでに記載し、又は各実施例に述べた化合物の製
法は多くの点で変更可能である。例えば、用いる保護ア
ミノ酸は保護基の異なるアミノ酸が数多く市販されてい
る。これら市販の保護アミノ酸を適宜変更して用いるこ
とができ、得られるペプチドはすべて本発明のカルシト
ニン誘導体と同等である。

比較例 本発明のカルシトニン誘導体と 及びCCTとの活性の比較を下の表に示す。

［発明の効果］ 本発明によれば、高活性、高安定性を有するカルシト
ニン誘導体を安定にかつ安価に供給することができる。
また、本発明のカルシトニン誘導体は、実験用試薬とし
て、更にこれを用いてアッセイ系を確立し診断薬として
用いうるし、生物活性に基づいて医薬又は動物薬として
利用することも可能である。

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】カルシトニンの１位のアミノ酸残基が 次式： （式中、Ｘはイオウ原子又はメチレン基を表し;nは０又
   は１を表す。） で示される環状アミノ酸残基であり、７位のアミノ酸残
   基が適当な保護基で置換されていてもよいシステイン残
   基であることを特徴とするカルシトニン誘導体及びその
   塩。