JP2680080B2 - 新規カルシトニン誘導体 - Google Patents
新規カルシトニン誘導体Info
- Publication number
- JP2680080B2 JP2680080B2 JP63294761A JP29476188A JP2680080B2 JP 2680080 B2 JP2680080 B2 JP 2680080B2 JP 63294761 A JP63294761 A JP 63294761A JP 29476188 A JP29476188 A JP 29476188A JP 2680080 B2 JP2680080 B2 JP 2680080B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- resin
- group
- solution
- minutes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は、血清Ca2+濃度を低下させる作用を有し、骨
粗鬆症、骨ページェット病、高カルシウム血症等の治療
薬として有用な新規カルシトニン誘導体及びその塩に関
するものである。
粗鬆症、骨ページェット病、高カルシウム血症等の治療
薬として有用な新規カルシトニン誘導体及びその塩に関
するものである。
（従来の技術及び発明が解決しようとする課題） カルシトニンは、血清カルシウム低下作用を有する、
アミノ酸32個よりなるペプチドホルモンであり、サケ、
ウナギ、ニワトリ、ヒト、ブタ、ウシ、ヒツジ、ラット
由来のものが知られている。これら天然型カルシトニン
は、分子内にジスルフィド結合を有するため、溶液中で
の安定性が低く、高Ca血症、骨粗鬆症、骨ページェット
病などの治療薬としては、主にジスルフィド結合をエチ
レン結合に置換した合成カルシトニン誘導体が用いられ
てきた（特公昭53−41677号公報）。
アミノ酸32個よりなるペプチドホルモンであり、サケ、
ウナギ、ニワトリ、ヒト、ブタ、ウシ、ヒツジ、ラット
由来のものが知られている。これら天然型カルシトニン
は、分子内にジスルフィド結合を有するため、溶液中で
の安定性が低く、高Ca血症、骨粗鬆症、骨ページェット
病などの治療薬としては、主にジスルフィド結合をエチ
レン結合に置換した合成カルシトニン誘導体が用いられ
てきた（特公昭53−41677号公報）。
しかしながら、この方法はアミノスベリン酸をペプチ
ド鎖に導入しなければならないため、操作が煩雑であ
り、容易な手段により得られ、その生物活性が保持され
ている誘導体の出現が望まれている。
ド鎖に導入しなければならないため、操作が煩雑であ
り、容易な手段により得られ、その生物活性が保持され
ている誘導体の出現が望まれている。
最近、本発明者らはカルシトニンの１位のアミノ酸残
基を特定の環状アミノ酸とすることにより、カルシトニ
ンの生物活性、安定性が向上し、かつペプチド化学にお
ける固相法による合成が可能となることを見出し、特願
昭62−252592号として既に出願している。
基を特定の環状アミノ酸とすることにより、カルシトニ
ンの生物活性、安定性が向上し、かつペプチド化学にお
ける固相法による合成が可能となることを見出し、特願
昭62−252592号として既に出願している。
本発明者らは、更に鋭意研究を重ねた結果、上記環状
アミノ酸を有するニワトリカルシトニン誘導体の３位の
セリンをスレオニン又はアラニンで置換した誘導体に高
い生物活性と安定性を認め、本発明を完成するに至っ
た。
アミノ酸を有するニワトリカルシトニン誘導体の３位の
セリンをスレオニン又はアラニンで置換した誘導体に高
い生物活性と安定性を認め、本発明を完成するに至っ
た。
なお、本願明細書において使用される略称、略号の意
味、意義は次の如くである。
味、意義は次の如くである。
1.アミノ酸について Ala:アラニン、Arg:アルギニン、Asn:アスパラギン、As
p:アスパラギン酸、Cys:システイン、Gln:グルタミン、
Glu:グルタミン酸、Gly:グリシン、His:ヒスチジン、Le
u:ロイシン、Lys:リジン、Pro:プロリン、Ser:セリン、
Thr:スレオニン、Tyr:チロシン、Val:バリン、Oct:3−
オキソ−５−カルボキシペルヒドロ−1,4−チアジン、p
Glu:ピログルタミン酸 各々、対応するアミノ酸残基を示す場合もある。
p:アスパラギン酸、Cys:システイン、Gln:グルタミン、
Glu:グルタミン酸、Gly:グリシン、His:ヒスチジン、Le
u:ロイシン、Lys:リジン、Pro:プロリン、Ser:セリン、
Thr:スレオニン、Tyr:チロシン、Val:バリン、Oct:3−
オキソ−５−カルボキシペルヒドロ−1,4−チアジン、p
Glu:ピログルタミン酸 各々、対応するアミノ酸残基を示す場合もある。
2.保護基について Boc:t−ブチルオキシカルボニル、Fmoc:9−フルオレニ
ルメチルオキシカルボニル、But:t−ブチル、Bzl:ベン
ジル、Cl2・Bzl:2,6−ジクロロベンジル、Z:ベンジルオ
キシカルボニル、Cl・Z:2−クロロベンジルオキシカル
ボニル、Npys:3−ニトロピリジンスルフェニル、OBzl:
ベンジルエステル、OBut:t−ブチルエステル、OcHex:シ
クロヘキシルエステル、Tos:トシル、Br・Z:2−ブロモ
ベンジルオキシカルボニル、NO2:ニトロ基、Mtr:4−メ
トキシ−2,3,6−トリメチルベンゼンスルホニル、Ｍ・B
zl:4−メトキシベンジル、4CH3・Bzl:4−メチルベンジ
ル、Trt:トリチル、SBut:t−ブチルメルカプト、CA:カ
ルバモイルメチル、Acm:アセトアミドメチル、CM:カル
ボキシメチル、AE:アミノエチル 3.試薬について DCC:ジシクロヘキシルカルボジイミド、HOBt:1−ヒドロ
キシベンゾトリアゾール、DTT:ジチオスレイトール、DC
M:ジクロロメタン、DMF:ジメチルホルムアミド、DMSO:
ジメチルスルホキシド、MeOH:メタノール、TEA:トリエ
チルアミン、TFA:トリフルオロ酢酸、HF:フッ化水素、H
Cl:塩化水素又は塩酸、CH3CN:アセトニトリル、Tris・H
Cl:トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩 4.その他 CCT:ニワトリカルシトニン、 CCTのシスチン残基 α−アミノスベリン酸残基 で置換した誘導体 ［発明の構成］ （課題を解決するための手段及び作用） 本発明は、 次式： ［式中、Ｘはアラニン又はスレオニンを、Ｙは次式： （式中、Ａはイオウ原子又はメチレン基を表し、ｎは０
又は１を表す。） で示される環状アミノ酸残基を、Ｚはペプチド化学上慣
用されるメルカプト基の保護基を、Alaはアラニンを、L
euはロイシンを、Serはセリンを、Thrはスレオニンを、
Cysはシステインを、Valはバリンを、Glyはグリシン
を、Lysはリジンを、Glnはグルタミンを、Gluはグルタ
ミン酸を、Hisはヒスチジンを、Tyrはチロシンを、Pro
はプロリンを、Argはアルギニンを、Aspはアスパラギン
酸を表す。］ で示される新規カルシトニン誘導体及びその塩に関する
ものである。
ルメチルオキシカルボニル、But:t−ブチル、Bzl:ベン
ジル、Cl2・Bzl:2,6−ジクロロベンジル、Z:ベンジルオ
キシカルボニル、Cl・Z:2−クロロベンジルオキシカル
ボニル、Npys:3−ニトロピリジンスルフェニル、OBzl:
ベンジルエステル、OBut:t−ブチルエステル、OcHex:シ
クロヘキシルエステル、Tos:トシル、Br・Z:2−ブロモ
ベンジルオキシカルボニル、NO2:ニトロ基、Mtr:4−メ
トキシ−2,3,6−トリメチルベンゼンスルホニル、Ｍ・B
zl:4−メトキシベンジル、4CH3・Bzl:4−メチルベンジ
ル、Trt:トリチル、SBut:t−ブチルメルカプト、CA:カ
ルバモイルメチル、Acm:アセトアミドメチル、CM:カル
ボキシメチル、AE:アミノエチル 3.試薬について DCC:ジシクロヘキシルカルボジイミド、HOBt:1−ヒドロ
キシベンゾトリアゾール、DTT:ジチオスレイトール、DC
M:ジクロロメタン、DMF:ジメチルホルムアミド、DMSO:
ジメチルスルホキシド、MeOH:メタノール、TEA:トリエ
チルアミン、TFA:トリフルオロ酢酸、HF:フッ化水素、H
Cl:塩化水素又は塩酸、CH3CN:アセトニトリル、Tris・H
Cl:トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩 4.その他 CCT:ニワトリカルシトニン、 CCTのシスチン残基 α−アミノスベリン酸残基 で置換した誘導体 ［発明の構成］ （課題を解決するための手段及び作用） 本発明は、 次式： ［式中、Ｘはアラニン又はスレオニンを、Ｙは次式： （式中、Ａはイオウ原子又はメチレン基を表し、ｎは０
又は１を表す。） で示される環状アミノ酸残基を、Ｚはペプチド化学上慣
用されるメルカプト基の保護基を、Alaはアラニンを、L
euはロイシンを、Serはセリンを、Thrはスレオニンを、
Cysはシステインを、Valはバリンを、Glyはグリシン
を、Lysはリジンを、Glnはグルタミンを、Gluはグルタ
ミン酸を、Hisはヒスチジンを、Tyrはチロシンを、Pro
はプロリンを、Argはアルギニンを、Aspはアスパラギン
酸を表す。］ で示される新規カルシトニン誘導体及びその塩に関する
ものである。
１位の環状アミノ酸残基としては、特にOct、pGluが
好ましい。
好ましい。
前記式において、Ｚで表されるシステイン残基の保護
基は、ペプチド化学上慣用されるメルカプト基の保護基
であれば、特に制限はなく、例えば、ペプチドの合成時
の保護基として用いられるBzl基、Ｍ・Bzl基、Npys基、
But基、SBut基、4CH3・Bzl基、Acm基、Trt基、あるい
は、メルカプト基と修飾剤の反応によって導入されるCA
基、CM基、AE基等が挙げられ、特に、Acm基、CA基が好
ましい。
基は、ペプチド化学上慣用されるメルカプト基の保護基
であれば、特に制限はなく、例えば、ペプチドの合成時
の保護基として用いられるBzl基、Ｍ・Bzl基、Npys基、
But基、SBut基、4CH3・Bzl基、Acm基、Trt基、あるい
は、メルカプト基と修飾剤の反応によって導入されるCA
基、CM基、AE基等が挙げられ、特に、Acm基、CA基が好
ましい。
本発明のカルシトニン誘導体は、塩酸、硫酸、リン酸
等の鉱酸、あるいは酢酸、クエン酸等の有機酸との塩の
形態であってもよく、また、ナトリウム、カリウム、カ
ルシウム等の金属塩、あるいは、アンモニア、ジシクロ
ヘキシルアミン、ピリジン等の有機塩基との塩の形態で
あってもよい。
等の鉱酸、あるいは酢酸、クエン酸等の有機酸との塩の
形態であってもよく、また、ナトリウム、カリウム、カ
ルシウム等の金属塩、あるいは、アンモニア、ジシクロ
ヘキシルアミン、ピリジン等の有機塩基との塩の形態で
あってもよい。
本発明のカルシトニン誘導体は、ペプチドの合成に常
用される固相法又は液相法によって合成することができ
る。この合成は、例えば、矢島治明、榊原俊平著、日本
生化学会編、生化学実験講座（Ｉ）；“蛋白質の化学"4
巻、東京化学同人発行（1977）；及び、泉屋伸夫ほか著
“ペプチド合成の基礎と実験”丸善（株）発行（1985）
に記載されている方法に準じて行うことができる。本発
明のカルシトニン誘導体の合成法としては、固相法が好
ましい。
用される固相法又は液相法によって合成することができ
る。この合成は、例えば、矢島治明、榊原俊平著、日本
生化学会編、生化学実験講座（Ｉ）；“蛋白質の化学"4
巻、東京化学同人発行（1977）；及び、泉屋伸夫ほか著
“ペプチド合成の基礎と実験”丸善（株）発行（1985）
に記載されている方法に準じて行うことができる。本発
明のカルシトニン誘導体の合成法としては、固相法が好
ましい。
以下、固相法により本発明のカルシトニン誘導体を合
成する場合について説明する。
成する場合について説明する。
まず、目的とするカルシトニン誘導体のＣ端アミノ
酸、即ちProを不溶性樹脂に結合させる。次いで、該誘
導体のアミノ酸配列に従ってＣ端側から保護アミノ酸を
順次結合させ、保護ペプチド樹脂を得る。不溶性樹脂と
しては、当該技術分野で知られたもののいずれであって
もよく、例えば、HFで脱離可能なクロロメチル樹脂、ヒ
ドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂（BHA
樹脂）、TFAで脱離可能な４−（オキシメチル）フェノ
キシメチル樹脂、４−（アミノメチル）フェノキシメチ
ル樹脂等が挙げられるが、BHA樹脂あるいは４−（アミ
ノメチル）フェノキシメチル樹脂は該樹脂とペプチド鎖
間の開裂によって直接アミドを与えるので、特に好まし
い。
酸、即ちProを不溶性樹脂に結合させる。次いで、該誘
導体のアミノ酸配列に従ってＣ端側から保護アミノ酸を
順次結合させ、保護ペプチド樹脂を得る。不溶性樹脂と
しては、当該技術分野で知られたもののいずれであって
もよく、例えば、HFで脱離可能なクロロメチル樹脂、ヒ
ドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂（BHA
樹脂）、TFAで脱離可能な４−（オキシメチル）フェノ
キシメチル樹脂、４−（アミノメチル）フェノキシメチ
ル樹脂等が挙げられるが、BHA樹脂あるいは４−（アミ
ノメチル）フェノキシメチル樹脂は該樹脂とペプチド鎖
間の開裂によって直接アミドを与えるので、特に好まし
い。
「保護アミノ酸」とは、官能基を公知の方法により保
護基で保護したアミノ酸であり、各種の保護アミノ酸が
市販されている。本発明のカルシトニン誘導体を合成す
る場合には、以下に示す保護基のいずれかを選択するの
が好ましい。まず、アミノ酸のα−アミノ基の保護基は
Boc又はFmocである。Ser、Thrの水酸基の保護基は、B
ut、Bzlである。Tyrの水酸基の保護基は、Br・Ｚ、Cl2
・Bzl、Butであるか、あるいは保護しなくてもよい。Ly
sのε−アミノ基の保護基は、Ｚ、Cl・Ｚ、Boc、Npysで
ある。Glu、Aspのカルボキシル基の保護基は、OBzl、OB
ut、OcHexである。Argのグアニジノ基の保護基は、To
s、NO2、Mtrである。Hisのイミダゾリル基の保護基は、
Tos、Fmocである。
護基で保護したアミノ酸であり、各種の保護アミノ酸が
市販されている。本発明のカルシトニン誘導体を合成す
る場合には、以下に示す保護基のいずれかを選択するの
が好ましい。まず、アミノ酸のα−アミノ基の保護基は
Boc又はFmocである。Ser、Thrの水酸基の保護基は、B
ut、Bzlである。Tyrの水酸基の保護基は、Br・Ｚ、Cl2
・Bzl、Butであるか、あるいは保護しなくてもよい。Ly
sのε−アミノ基の保護基は、Ｚ、Cl・Ｚ、Boc、Npysで
ある。Glu、Aspのカルボキシル基の保護基は、OBzl、OB
ut、OcHexである。Argのグアニジノ基の保護基は、To
s、NO2、Mtrである。Hisのイミダゾリル基の保護基は、
Tos、Fmocである。
各保護基は、ペプチドの合成条件に応じ適切なものを
選択する必要がある。
選択する必要がある。
環状アミノ酸であるOctは公知の方法に従って合成す
ることができる。この合成は、例えば、特公昭41−2082
7号公報;J.Chromatogr.,294（1984）,413;Bull.Chem.So
c.Japan,36（1963）,920;特開昭52−116465号公報等に
記載されている方法に準じて行うことができる。例え
ば、以下に示す方法に従って合成する。
ることができる。この合成は、例えば、特公昭41−2082
7号公報;J.Chromatogr.,294（1984）,413;Bull.Chem.So
c.Japan,36（1963）,920;特開昭52−116465号公報等に
記載されている方法に準じて行うことができる。例え
ば、以下に示す方法に従って合成する。
システイン又はその塩を水に懸濁し、モノヨードアセ
トアミド、モノブロモアセトアミド等のカルバモイルメ
チル化剤を加える。適切な塩基、例えば、水酸化ナトリ
ウム、リン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウ
ム、水酸化アンモニウム等の無機塩基、あるいは、TE
A、ジシクロヘキシルアミン等の有機塩基を添加し、混
合溶液をpH6〜10、好ましくはpH7〜９に調整する。反応
温度20〜60℃、好ましくは室温〜50℃で、反応時間0.1
〜10時間、好ましくは0.5〜５時間で反応させ、システ
インのメルカプト基をカルバモイルメチル化する。続い
て、反応溶液を封管中で、反応温度60〜150℃、好まし
くは80〜120℃で、反応時間0.5〜50時間、好ましくは１
〜10時間で反応させ、Octを得る。得られたOctは再結
晶、各種クロマトグラフィー等の方法を用いて精製す
る。
トアミド、モノブロモアセトアミド等のカルバモイルメ
チル化剤を加える。適切な塩基、例えば、水酸化ナトリ
ウム、リン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウ
ム、水酸化アンモニウム等の無機塩基、あるいは、TE
A、ジシクロヘキシルアミン等の有機塩基を添加し、混
合溶液をpH6〜10、好ましくはpH7〜９に調整する。反応
温度20〜60℃、好ましくは室温〜50℃で、反応時間0.1
〜10時間、好ましくは0.5〜５時間で反応させ、システ
インのメルカプト基をカルバモイルメチル化する。続い
て、反応溶液を封管中で、反応温度60〜150℃、好まし
くは80〜120℃で、反応時間0.5〜50時間、好ましくは１
〜10時間で反応させ、Octを得る。得られたOctは再結
晶、各種クロマトグラフィー等の方法を用いて精製す
る。
保護アミノ酸の結合は、通常の縮合法、例えば、DCC
法、活性エステル法、混合あるいは対称酸無水物法、カ
ルボニルジイミダゾール法、DCC−HOBt法、ジフェニル
ホスホリルアジド法等に従って行うことができるが、DC
C法、DCC−HOBt法、対称酸無水物法が好ましい。これら
の縮合反応は、通常、DCM、DMF、クロロホルム、DMSO、
ベンゼン等の有機溶媒又はそれらの混合溶媒中で行う。
DCM、DMF又はこれらの混合溶媒中で行うのが好ましい。
α−アミノ基の保護基の脱離試薬としては、TFA/DCM、H
C1/ジオキサン、ピペリジン/DMF等が用いられ、該保護
基の種類により適宜選択する。また、合成の各段階にお
ける縮合反応の進行の程度はE.カイザーらの方法［Ana
l.Biochem.,34,595（1970）］（ニンヒドリン反応法）
によって検査される。
法、活性エステル法、混合あるいは対称酸無水物法、カ
ルボニルジイミダゾール法、DCC−HOBt法、ジフェニル
ホスホリルアジド法等に従って行うことができるが、DC
C法、DCC−HOBt法、対称酸無水物法が好ましい。これら
の縮合反応は、通常、DCM、DMF、クロロホルム、DMSO、
ベンゼン等の有機溶媒又はそれらの混合溶媒中で行う。
DCM、DMF又はこれらの混合溶媒中で行うのが好ましい。
α−アミノ基の保護基の脱離試薬としては、TFA/DCM、H
C1/ジオキサン、ピペリジン/DMF等が用いられ、該保護
基の種類により適宜選択する。また、合成の各段階にお
ける縮合反応の進行の程度はE.カイザーらの方法［Ana
l.Biochem.,34,595（1970）］（ニンヒドリン反応法）
によって検査される。
以上のようにして、所望のアミノ酸配列を有する保護
ペプチド樹脂を得るがその具体的な例を以下に示す。
ペプチド樹脂を得るがその具体的な例を以下に示す。
保護ペプチド樹脂は、ペプチドを樹脂から脱離させ、
更に、メルカプト保護基以外の保護基を脱離させる試
薬、例えば、HF、TFA等で処理すること（最終脱保護反
応）により、目的とするカルシトニン誘導体を得る。
更に、メルカプト保護基以外の保護基を脱離させる試
薬、例えば、HF、TFA等で処理すること（最終脱保護反
応）により、目的とするカルシトニン誘導体を得る。
また、７位のCysのメルカプト基の保護基に前述の最
終脱保護条件下で脱離可能な保護基を用いた場合には、
保護ペプチド樹脂の最終脱保護反応により、Cysのメル
カプト基が遊離のペプチドを得る。このペプチドを緩衝
液中で、修飾剤と反応させ、メルカプト基を保護するこ
とにより、７位のCysが保護された本発明のカルシトニ
ン誘導体を得ることができる。修飾剤としては、メルカ
プト基と反応して、保護基を導入しうるものであれば、
どのようなものでもよい。例えば、モノヨード酢酸、モ
ノブロモ酢酸、モノヨードアセトアミド、モノブロモア
セトアミド、エチレンイミン、アクリロニトリル、ビニ
ルピリジン等のアルキル化又はアリール化剤、5,5′−
ジチオビス−（２−ニトロ）安息香酸又は2,2′−ジピ
リジルジスルフィドのような非対称ジスルフィド形成
剤、Ｎ−エチルマレイミド、２−ニトロ−５−チオシア
ノ安息香酸等が挙げられる。
終脱保護条件下で脱離可能な保護基を用いた場合には、
保護ペプチド樹脂の最終脱保護反応により、Cysのメル
カプト基が遊離のペプチドを得る。このペプチドを緩衝
液中で、修飾剤と反応させ、メルカプト基を保護するこ
とにより、７位のCysが保護された本発明のカルシトニ
ン誘導体を得ることができる。修飾剤としては、メルカ
プト基と反応して、保護基を導入しうるものであれば、
どのようなものでもよい。例えば、モノヨード酢酸、モ
ノブロモ酢酸、モノヨードアセトアミド、モノブロモア
セトアミド、エチレンイミン、アクリロニトリル、ビニ
ルピリジン等のアルキル化又はアリール化剤、5,5′−
ジチオビス−（２−ニトロ）安息香酸又は2,2′−ジピ
リジルジスルフィドのような非対称ジスルフィド形成
剤、Ｎ−エチルマレイミド、２−ニトロ−５−チオシア
ノ安息香酸等が挙げられる。
修飾反応は、通常pH2〜11の、好ましくはpH6〜９の緩
衝液中で行なわれる。かかる反応に用いられる緩衝液は
公知のもので、例えば、クエン酸−クエン酸ナトリウ
ム、酢酸−酢酸ナトリウム、リン酸、イミダゾール−塩
酸、Tris・HCl、ホウ酸、ジエタノールアミン−塩酸、
グリシン−水酸化ナトリウム等が挙げられる。修飾反応
の条件は、修飾剤の種類によって異なるが、例えば、修
飾剤としてモノヨードアセトアミドを用いる場合には、
通常pH6〜10の各種の緩衝液を用い、メルカプト基の通
常0.1〜10倍当量、好ましくは１〜２倍当量を加え、反
応温度は、通常０〜60℃、好ましくは20〜40℃であり、
反応時間は、通常0.1〜10時間、好ましくは0.5〜２時間
である。
衝液中で行なわれる。かかる反応に用いられる緩衝液は
公知のもので、例えば、クエン酸−クエン酸ナトリウ
ム、酢酸−酢酸ナトリウム、リン酸、イミダゾール−塩
酸、Tris・HCl、ホウ酸、ジエタノールアミン−塩酸、
グリシン−水酸化ナトリウム等が挙げられる。修飾反応
の条件は、修飾剤の種類によって異なるが、例えば、修
飾剤としてモノヨードアセトアミドを用いる場合には、
通常pH6〜10の各種の緩衝液を用い、メルカプト基の通
常0.1〜10倍当量、好ましくは１〜２倍当量を加え、反
応温度は、通常０〜60℃、好ましくは20〜40℃であり、
反応時間は、通常0.1〜10時間、好ましくは0.5〜２時間
である。
また、本発明のカルシトニン誘導体のうち、１位のア
ミノ酸残基がOctであるペプチドは、以下に示す方法に
より合成してもよい。即ち、前述の最終脱保護条件下で
脱離可能な保護基、例えば、Ｍ・Bzl、4CH3・Bzlで保護
したCysをOctの代わりに用いて保護ペプチド樹脂を合成
する。この保護ペプチド樹脂の具体的な例を以下に示
す。
ミノ酸残基がOctであるペプチドは、以下に示す方法に
より合成してもよい。即ち、前述の最終脱保護条件下で
脱離可能な保護基、例えば、Ｍ・Bzl、4CH3・Bzlで保護
したCysをOctの代わりに用いて保護ペプチド樹脂を合成
する。この保護ペプチド樹脂の具体的な例を以下に示
す。
この保護ペプチド樹脂は、前述の方法に従って、最終
脱保護を行い、遊離のメルカプト基をもつぺプチドを得
る。このペプチドのメルカプト基は、例えば、モノヨー
ドアセトアミド、モノブロモアセトアミド等の修飾剤を
用いてカルバモイルメチル化して保護する。
脱保護を行い、遊離のメルカプト基をもつぺプチドを得
る。このペプチドのメルカプト基は、例えば、モノヨー
ドアセトアミド、モノブロモアセトアミド等の修飾剤を
用いてカルバモイルメチル化して保護する。
得られたカルバモイルメチル化ペプチドを緩衝液中で
加熱することにより、目的とするペプチドを得る。かか
る反応に用いられる緩衝液は前述のごとく公知のもので
あり、そのpHは、通常２〜10、好ましくは３〜７であ
る。また、ペプチドの濃度は、通常0.1〜100μＭ、好ま
しくは0.5〜10μＭであり、反応温度は、通常30〜150
℃、好ましくは60〜100℃であり、反応時間は、通常0.1
〜100時間、好ましくは0.5〜50時間である。
加熱することにより、目的とするペプチドを得る。かか
る反応に用いられる緩衝液は前述のごとく公知のもので
あり、そのpHは、通常２〜10、好ましくは３〜７であ
る。また、ペプチドの濃度は、通常0.1〜100μＭ、好ま
しくは0.5〜10μＭであり、反応温度は、通常30〜150
℃、好ましくは60〜100℃であり、反応時間は、通常0.1
〜100時間、好ましくは0.5〜50時間である。
かくして得られたペプチドは、ペプチドの精製の常套
的手段、例えば、抽出、再結晶、各種クロマトグラフィ
ー（ゲルろ過、イオン交換、分配、吸着、逆相）、電気
泳動、向流分配等により単離精製することができるが、
逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相HPLC）による方
法が最も効果的である。
的手段、例えば、抽出、再結晶、各種クロマトグラフィ
ー（ゲルろ過、イオン交換、分配、吸着、逆相）、電気
泳動、向流分配等により単離精製することができるが、
逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相HPLC）による方
法が最も効果的である。
（発明の実施例） 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、
これらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。
これらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。
実施例１ 次式I: で示されるペプチド［（Oct1,Thr3,Cys（CA）７）−CC
T］の合成 （１） ３−オキソ−５−カルボキシペルヒドロ−1,4
−チアジンの合成 Ｌ−システイン塩酸塩一水和物1.75g（10mmol）を水5
0mlに溶解し、1M炭酸ナトリウムでpH8.0に調整した。窒
素気流下、モノヨードアセトアミド1.85g（10mmol）と1
M炭酸ナトリウム交互に、pH8.0に保ちながら加えた。室
温で１時間反応させた後、更に100℃で２時間封管中で
反応させた。反応液に4N HC1を加え、pHを3.25に調整し
た後、濃縮乾固した。残渣を熱エタノールで抽出し、冷
却後、結晶をろ取し、熱エタノールより再結晶した。収
量560mg（34.8％）、融点182〜184℃、Fab質量分析［Ｍ
＋Ｈ］＋＝162 （２） BHA樹脂へのプロリンの導入 BHA樹脂（ペプチド研究所製、ジビニルベンゼン２
％、100〜200メッシュ、アミノ基当量0.61meq/g）2gを
ペプチド固相合成用反応容器（デュポン社製）に入れ、
下記の溶媒各30mlで順次処理し、各々の処理後にろ過し
た。
T］の合成 （１） ３−オキソ−５−カルボキシペルヒドロ−1,4
−チアジンの合成 Ｌ−システイン塩酸塩一水和物1.75g（10mmol）を水5
0mlに溶解し、1M炭酸ナトリウムでpH8.0に調整した。窒
素気流下、モノヨードアセトアミド1.85g（10mmol）と1
M炭酸ナトリウム交互に、pH8.0に保ちながら加えた。室
温で１時間反応させた後、更に100℃で２時間封管中で
反応させた。反応液に4N HC1を加え、pHを3.25に調整し
た後、濃縮乾固した。残渣を熱エタノールで抽出し、冷
却後、結晶をろ取し、熱エタノールより再結晶した。収
量560mg（34.8％）、融点182〜184℃、Fab質量分析［Ｍ
＋Ｈ］＋＝162 （２） BHA樹脂へのプロリンの導入 BHA樹脂（ペプチド研究所製、ジビニルベンゼン２
％、100〜200メッシュ、アミノ基当量0.61meq/g）2gを
ペプチド固相合成用反応容器（デュポン社製）に入れ、
下記の溶媒各30mlで順次処理し、各々の処理後にろ過し
た。
DCM（３回、各２分） MeOH（３回、各１分） DCM（３回、各２分） 10％TEA/DCM溶液（５回、10分、各１回） 次いで、BHA樹脂をDCM15mlに溶解したBoc−Pro0.32g
（1.5mmol）とともに２分撹拌した。DCC0.31g（1.5mmo
l）のDCM15ml溶液を加え、120分撹拌した。反応混合物
をろ過して、Boc−Pro一樹脂を次の溶媒各30mlで洗浄・
ろ過した。
（1.5mmol）とともに２分撹拌した。DCC0.31g（1.5mmo
l）のDCM15ml溶液を加え、120分撹拌した。反応混合物
をろ過して、Boc−Pro一樹脂を次の溶媒各30mlで洗浄・
ろ過した。
DCM（３回、各２分） MeOH（３回、各２分） DCM（３回、各２分） 更に、Boc−Pro−樹脂に１−アセチルイミダゾール1.
34g（12.2mmol）のDCM30ml溶液を加え、12時間かけてア
セチル化を行った。これにより、BHA樹脂中の未反応の
アミノ基が修飾され、以下、保護アミノ酸の付加延長は
プロリンのＮ末端が反応開始点となる。
34g（12.2mmol）のDCM30ml溶液を加え、12時間かけてア
セチル化を行った。これにより、BHA樹脂中の未反応の
アミノ基が修飾され、以下、保護アミノ酸の付加延長は
プロリンのＮ末端が反応開始点となる。
（３） 31位スレオニンの導入 （２）で得られたBoc−Pro−樹脂全量をDCMで３回、M
eOHで３回、DCMで３回、各２分洗浄し、ろ過した。この
樹脂に50％TFA溶液（溶媒;DCM）30mlを加え、５分撹拌
後、ろ過した。更に、同様のTFA溶液下で30分撹拌し、B
oc基を脱離させた。得られた樹脂を（２）と同様にして
下記の溶媒各30mlで順次処理し、各々の処理後にろ過し
た。
eOHで３回、DCMで３回、各２分洗浄し、ろ過した。この
樹脂に50％TFA溶液（溶媒;DCM）30mlを加え、５分撹拌
後、ろ過した。更に、同様のTFA溶液下で30分撹拌し、B
oc基を脱離させた。得られた樹脂を（２）と同様にして
下記の溶媒各30mlで順次処理し、各々の処理後にろ過し
た。
DCM（３回、各２分） MeOH（３回、各２分） DCM（３回、各２分） 10％TEA/DCM溶液（５分、10分、各１回） DCM（３回、各２分） 次いで、Pro−樹脂にBoc−Thr（Bzl）0.46g（1.5mmo
l）のDCM15ml溶液を加え、２分撹拌した。次に、DCC0.3
1gのDCM15ml溶液を加え、240分撹拌した。反応後、DCM
で３回、MeOHで３回、DCMで３回、各２分洗浄し、ろ過
した。この樹脂の極微量を採取し、ニンヒドリン試験が
陰性であることを確認した。次いで、樹脂の一部を採取
し、そのＣ末端アミノ酸結合量を測定したところ、0.15
mmol/gであった。
l）のDCM15ml溶液を加え、２分撹拌した。次に、DCC0.3
1gのDCM15ml溶液を加え、240分撹拌した。反応後、DCM
で３回、MeOHで３回、DCMで３回、各２分洗浄し、ろ過
した。この樹脂の極微量を採取し、ニンヒドリン試験が
陰性であることを確認した。次いで、樹脂の一部を採取
し、そのＣ末端アミノ酸結合量を測定したところ、0.15
mmol/gであった。
（４） 30〜１位の各アミノ酸の導入 （３）と同様にして、Boc−Thr（Bzl）−Pro−樹脂
に、前記式（Ｉ）で示されるカルシトニンの030位から
１位までの各構成アミノ酸に対応する保護アミノ酸を順
次カップリングした。表１に各反応段階で用いた保護ア
ミノ酸とその使用量を示す。
に、前記式（Ｉ）で示されるカルシトニンの030位から
１位までの各構成アミノ酸に対応する保護アミノ酸を順
次カップリングした。表１に各反応段階で用いた保護ア
ミノ酸とその使用量を示す。
カップリング反応は同一の保護アミノ酸量で２回行
い、第１回目は120分、第２回目は300分のカップリング
反応時間とした。
い、第１回目は120分、第２回目は300分のカップリング
反応時間とした。
ここで、LysはBoc−Lys（Cl・Ｚ）TBA（ペプチド研究
所製）のTBAを脱離してBoc−Lys（Cl・Ｚ）として用い
た。Boc−Leu・H2O及びOctはDCM単一溶媒には難溶のた
め、Boc−Leu・H2OはDMFとDCMの混合溶媒（1:4）に、Oc
tはDMFに溶解して用いた。更に、Octのカップリング時
の洗浄溶媒はDCMに代えてDMFを用いた。14位及び20位の
Glnの導入においては、HOBt0.23gとBoc−Gln0.37gとを
同時に反応容器へ添加した。
所製）のTBAを脱離してBoc−Lys（Cl・Ｚ）として用い
た。Boc−Leu・H2O及びOctはDCM単一溶媒には難溶のた
め、Boc−Leu・H2OはDMFとDCMの混合溶媒（1:4）に、Oc
tはDMFに溶解して用いた。更に、Octのカップリング時
の洗浄溶媒はDCMに代えてDMFを用いた。14位及び20位の
Glnの導入においては、HOBt0.23gとBoc−Gln0.37gとを
同時に反応容器へ添加した。
１位のアミノ酸の導入後、樹脂ペプチドを一昼夜圧乾
燥して乾燥樹脂ペプチドを得た。
燥して乾燥樹脂ペプチドを得た。
（５） HFによる分解 乾燥した樹脂ペプチドの一部（200mg）を秤量し、HF
分解用反応容器（テフロン製）に入れ、アニソール1.0m
lを加え、一夜放置し、樹脂を膨潤させた。撹拌子を入
れた前記反応容器をHF分解装置（ペプチド研究所製）に
取り付けドライアイス−エタノール浴中に起き、HF10ml
を反応容器中に導入した。この混合物を氷浴中において
１時間、０℃で撹拌した。減圧下にHFを徐々に留去し
た。３時間後、反応容器を取りはずし、ジエチルエーテ
ルを用いて反応容器から樹脂ペプチド分解物を取出し、
ジエチルエーテルで洗浄した。2M酢酸20ml中に樹脂ペプ
チド分解物を加え、脱保護されたペプチドを溶解した。
分解用反応容器（テフロン製）に入れ、アニソール1.0m
lを加え、一夜放置し、樹脂を膨潤させた。撹拌子を入
れた前記反応容器をHF分解装置（ペプチド研究所製）に
取り付けドライアイス−エタノール浴中に起き、HF10ml
を反応容器中に導入した。この混合物を氷浴中において
１時間、０℃で撹拌した。減圧下にHFを徐々に留去し
た。３時間後、反応容器を取りはずし、ジエチルエーテ
ルを用いて反応容器から樹脂ペプチド分解物を取出し、
ジエチルエーテルで洗浄した。2M酢酸20ml中に樹脂ペプ
チド分解物を加え、脱保護されたペプチドを溶解した。
（６） メルカプト基のカルバモイルメチル化 この溶液をろ過し、アンモニア水でpH8.0に調整した
（40ml）。DTT30.8mgを加え、37℃で４時間撹拌した。
この還元操作で、メルカプト基の酸化によって生成する
可能性がある二量体が単量体にもどる。次に、モノヨー
ドアセトアミド37.0mgを加え、37℃で30分間暗所で反応
させた。
（40ml）。DTT30.8mgを加え、37℃で４時間撹拌した。
この還元操作で、メルカプト基の酸化によって生成する
可能性がある二量体が単量体にもどる。次に、モノヨー
ドアセトアミド37.0mgを加え、37℃で30分間暗所で反応
させた。
この反応液をオクタデシルシリルシリカを充填したカ
ラム（ODSカラム，φ２×30cm）に吸着させ、水で洗浄
後、60％アセトニトリル溶液でペプチドを溶出した。溶
出液を凍結乾燥し、粗（Oct1,Thr3,Cys（CA）７）−CCT
27.2mgを得た。
ラム（ODSカラム，φ２×30cm）に吸着させ、水で洗浄
後、60％アセトニトリル溶液でペプチドを溶出した。溶
出液を凍結乾燥し、粗（Oct1,Thr3,Cys（CA）７）−CCT
27.2mgを得た。
（７） 粗（Oct1,Thr3,Cys（CA）７）−CCTの精製 得られた粗（Oct1,Thr3,Cys（CA）７）−CCTを1M酢酸
に溶解（5mg/ml）し、濃度勾配型高速液体クロマトグラ
フィーにて精製した。カラムはケムコ社製ケムコパック
ODS−Ｈ（φ10mm×250mm）を用い、溶離液はＡ液として
水（100）−10％TFA（１）、Ｂ液として水（40）−アセ
トニトリル（60）−10％TFA（１）を用い、Ａ液からＢ
液への直線型濃度勾配条件下で溶出した。ここで、
（ ）内は溶媒の体積比である。（Oct1,Thr3,Cys（C
A）７）−CCTに相当する画分を分取し、凍結乾燥して白
色粉末3.3mgを得た。
に溶解（5mg/ml）し、濃度勾配型高速液体クロマトグラ
フィーにて精製した。カラムはケムコ社製ケムコパック
ODS−Ｈ（φ10mm×250mm）を用い、溶離液はＡ液として
水（100）−10％TFA（１）、Ｂ液として水（40）−アセ
トニトリル（60）−10％TFA（１）を用い、Ａ液からＢ
液への直線型濃度勾配条件下で溶出した。ここで、
（ ）内は溶媒の体積比である。（Oct1,Thr3,Cys（C
A）７）−CCTに相当する画分を分取し、凍結乾燥して白
色粉末3.3mgを得た。
そのアミノ酸分析値を表２に示す。
得られた白色粉末を高速液体クロマトグラフィーで検
定した。
定した。
測定条件： カラム；ケムコ社製カムコパックODS−Ｈ（φ4.6mm×15
0mm） 流速;1.0ml/分 溶離液;A液（水：アセトニトリル:10％TFA＝100:0:1） Ｂ液（水：アセトニトリル:10％TFA＝40:60:1） を用い、Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（30分） 測定波長;210nm その結果、保持時間23.6分にペプチドに基づく単一の
強い吸収を認め、これが本発明の（Oct1,Thr3,Cys（C
A）７）−CCTであった。
0mm） 流速;1.0ml/分 溶離液;A液（水：アセトニトリル:10％TFA＝100:0:1） Ｂ液（水：アセトニトリル:10％TFA＝40:60:1） を用い、Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（30分） 測定波長;210nm その結果、保持時間23.6分にペプチドに基づく単一の
強い吸収を認め、これが本発明の（Oct1,Thr3,Cys（C
A）７）−CCTであった。
本ペプチドのFab質量分析の結果を次に示す。
測定値（［Ｍ＋Ｈ］＋） 3484.4 理論値（［Ｍ＋Ｈ］＋） 3483.8 実施例２ ［（Oct1,Ala3,Cys（CA）７）−CCT］の合成 ３位のアミノ酸の導入において、Boc−Thr（Bzl）の
代わりにBoc−Ala0.28gを用いる以外は、実施例１と同
様の条件にて固相合成を行い、保護ペプチド樹脂を得
た。保護ペプチド樹脂の一部（50mg）を実施例１と同様
にしてHF分解した。得られた粗ペプチドを実施例１
（７）と同様の方法で精製し、（Oct1,Ala3,Cys（CA）
７）−CCT0.9mgを得た。
代わりにBoc−Ala0.28gを用いる以外は、実施例１と同
様の条件にて固相合成を行い、保護ペプチド樹脂を得
た。保護ペプチド樹脂の一部（50mg）を実施例１と同様
にしてHF分解した。得られた粗ペプチドを実施例１
（７）と同様の方法で精製し、（Oct1,Ala3,Cys（CA）
７）−CCT0.9mgを得た。
実施例３ 次式II: で示されるペプチド［（Oct1,Thr3,Cys（Acm）７）−CC
T］の合成 （１） 30〜１位の各アミノ酸の導入 実施例１（３）と同様にして、Boc−Thr（Bzl）−Pro
−樹脂に、前記式（II）で示されるCTの30位から１位ま
での各構成アミノ酸に対応する保護アミノ酸を順次カッ
プリングした。表３に各反応段階で用いた保護アミノ酸
とその使用量を示す。
T］の合成 （１） 30〜１位の各アミノ酸の導入 実施例１（３）と同様にして、Boc−Thr（Bzl）−Pro
−樹脂に、前記式（II）で示されるCTの30位から１位ま
での各構成アミノ酸に対応する保護アミノ酸を順次カッ
プリングした。表３に各反応段階で用いた保護アミノ酸
とその使用量を示す。
カップリング反応は同一の保護アミノ酸量で２回行
い、第１回目は120分、第２回目は300分のカップリング
反応時間とした。ここで、LysはBoc−Lys（C1・Ｚ）TBA
（ペプチド研究所製）のTBAを脱離してBoc−Lys（C1・
Ｚ）として用いた。Boc−Leu・H2O及びOctはDCM単一溶
媒には難溶のため、Boc−Leu・H2OはDMFとDCMの混合溶
媒（1:4）に、OctはDMFに溶解して用いた。更に、Octの
カップリング時の洗浄溶媒はDCMに代えてDMFを用いた。
14位及び20位のGlnの導入においては、HOBt0.23gとBoc
−Gln0.37gとを同時に反応容器へ添加した。
い、第１回目は120分、第２回目は300分のカップリング
反応時間とした。ここで、LysはBoc−Lys（C1・Ｚ）TBA
（ペプチド研究所製）のTBAを脱離してBoc−Lys（C1・
Ｚ）として用いた。Boc−Leu・H2O及びOctはDCM単一溶
媒には難溶のため、Boc−Leu・H2OはDMFとDCMの混合溶
媒（1:4）に、OctはDMFに溶解して用いた。更に、Octの
カップリング時の洗浄溶媒はDCMに代えてDMFを用いた。
14位及び20位のGlnの導入においては、HOBt0.23gとBoc
−Gln0.37gとを同時に反応容器へ添加した。
１位のアミノ酸の導入後、樹脂ペプチドを一昼夜減圧
乾燥して乾燥樹脂ペプチドを得た。
乾燥して乾燥樹脂ペプチドを得た。
（２） HFによる分解 乾燥した樹脂ペプチドの一部（50.7mg）を秤量し、HF
分解用反応容器（テフロン製）に入れ、アニソール0.5m
lを加え、一夜放置し、樹脂を膨潤させた。撹拌子を入
れた前記反応容器をHF分解装置（ペプチド研修所製）に
取り付けドライアイス−エタノール浴中に置き、HF5ml
を反応容器中に導入した。この混合物を氷浴中において
１時間、０℃で撹拌した。減圧下にHFを徐々に留去し
た。３時間後、反応容器を取りはずし、ジエチルエーテ
ルを用いて反応容器から樹脂ペプチド分解物を取出し、
ジエチルエーテルで洗浄した。2M酢酸20ml中に樹脂ペプ
チド分解物を加え、脱保護されたペプチドを溶解した。
分解用反応容器（テフロン製）に入れ、アニソール0.5m
lを加え、一夜放置し、樹脂を膨潤させた。撹拌子を入
れた前記反応容器をHF分解装置（ペプチド研修所製）に
取り付けドライアイス−エタノール浴中に置き、HF5ml
を反応容器中に導入した。この混合物を氷浴中において
１時間、０℃で撹拌した。減圧下にHFを徐々に留去し
た。３時間後、反応容器を取りはずし、ジエチルエーテ
ルを用いて反応容器から樹脂ペプチド分解物を取出し、
ジエチルエーテルで洗浄した。2M酢酸20ml中に樹脂ペプ
チド分解物を加え、脱保護されたペプチドを溶解した。
この溶液をダウエックス（Dowex）１×2cm（AcO-）に
通し、凍結乾燥して、粗（Oct1,Thr3,Cys（Acm）７）−
CCT19.2mgを得た。
通し、凍結乾燥して、粗（Oct1,Thr3,Cys（Acm）７）−
CCT19.2mgを得た。
（３） 粗（Oct1,Thr3,Cys（Acm）７）−CCTの精製 得られた粗（Oct1,Thr3,Cys（Acm）７）−CCTを1M酢
酸に溶解し、濃度勾配型高速液体クロマトグラフィーに
て精製した。カラムはケムコ社製ケムコパックODS−Ｈ
（φ10mm×250mm）を用い、溶離液はＡ液として水（10
0）−10％TFA（１）、Ｂ液として水（40）−アセトニト
リル（60）−10％TFA（１）を用い、Ａ液からＢ液への
直線型濃度勾配条件下で溶出した。ここで、（ ）内は
溶媒の体積比である。（Oct1,Thr3,Cys（Acm）７）−CC
Tに相当する画分を分取し、凍結乾燥して白色粉末1.75m
gを得た。
酸に溶解し、濃度勾配型高速液体クロマトグラフィーに
て精製した。カラムはケムコ社製ケムコパックODS−Ｈ
（φ10mm×250mm）を用い、溶離液はＡ液として水（10
0）−10％TFA（１）、Ｂ液として水（40）−アセトニト
リル（60）−10％TFA（１）を用い、Ａ液からＢ液への
直線型濃度勾配条件下で溶出した。ここで、（ ）内は
溶媒の体積比である。（Oct1,Thr3,Cys（Acm）７）−CC
Tに相当する画分を分取し、凍結乾燥して白色粉末1.75m
gを得た。
そのアミノ酸分析値を表４に示す。
得られた白色粉末を高速液体クロマトグラフィーで検
定した。
定した。
測定条件： カラム；ケムコ社製ケムコパックODS−Ｈ（φ4.6mm×15
0mm） 流速;1.0ml/分 溶離液;A液（水：アセトニトリル:10％TFA＝100:0:1） Ｂ液（水：アセトニトリル:10％TFA＝40:60:1） を用い、Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（30分） 測定波長;210nm その結果、保持時間30.0分にペプチドに基づく単一の
強い吸収を認め、これが本発明の（Oct1,Thr3,Cys（Ac
m）７）−CCTであった。
0mm） 流速;1.0ml/分 溶離液;A液（水：アセトニトリル:10％TFA＝100:0:1） Ｂ液（水：アセトニトリル:10％TFA＝40:60:1） を用い、Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（30分） 測定波長;210nm その結果、保持時間30.0分にペプチドに基づく単一の
強い吸収を認め、これが本発明の（Oct1,Thr3,Cys（Ac
m）７）−CCTであった。
本ペプチドのFab質量分析の結果を次に示す。
測定値（［Ｍ＋Ｈ］＋） 3497.2 理論値（［Ｍ＋Ｈ］＋） 3497.8 実施例４ ［（pGlu1,Thr3,Cys（Acm）７）−CCT］の合成 １位のアミノ酸の導入において、Octの代わりにpGlu
0.19gを用いる以外は、実施例３と同様の条件にて固相
合成を行い、保護ペプチド樹脂を得た。保護ペプチド樹
脂の一部を実施例３と同様にしてHF分解した。得れらた
粗ペプチドを実施例３（３）と同様の方法で精製し、
（pGlu1,Thr3,Cys（Acm）７）−CCT1.79mgを得た。
0.19gを用いる以外は、実施例３と同様の条件にて固相
合成を行い、保護ペプチド樹脂を得た。保護ペプチド樹
脂の一部を実施例３と同様にしてHF分解した。得れらた
粗ペプチドを実施例３（３）と同様の方法で精製し、
（pGlu1,Thr3,Cys（Acm）７）−CCT1.79mgを得た。
試験例１ 生物活性試験 本発明のカルシトニン誘導体の生物活性を特開昭60−
123500号公報記載の方法に従い測定し、 の活性と比較した。結果を表５に示す。
123500号公報記載の方法に従い測定し、 の活性と比較した。結果を表５に示す。
試験例２ 安定性試験 本発明のカルシトニン誘導体の安定性試験を以下のよ
うにして行った。
うにして行った。
0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）にカルシト
ニン誘導体を溶解し、10μg/ml濃度とした。この溶液1m
lを80℃、24時間封管中で放置した。測定条件を用い
た逆相HPLCで分析し、残存するカルシトニン誘導体の溶
出ピーク面積Ａを求めた。同様にして、加熱処理してい
ない試料溶液中のカルシトニン誘導体の溶出ピーク面積
Ｂを求め、ＡのＢに対する割合（％）を安定性の指標と
した。同様にして、CCT及び の安定性試験を行った結果を表６にまとめる。
ニン誘導体を溶解し、10μg/ml濃度とした。この溶液1m
lを80℃、24時間封管中で放置した。測定条件を用い
た逆相HPLCで分析し、残存するカルシトニン誘導体の溶
出ピーク面積Ａを求めた。同様にして、加熱処理してい
ない試料溶液中のカルシトニン誘導体の溶出ピーク面積
Ｂを求め、ＡのＢに対する割合（％）を安定性の指標と
した。同様にして、CCT及び の安定性試験を行った結果を表６にまとめる。
［発明の効果］ 本発明によれば、高活性、高安定性を有するカルシト
ニン誘導体を安定にかつ安価に供給することができる。
また、本発明のカルシトニン誘導体は、実験用試薬とし
て、更にこれを用いてアッセイ系を確立し診断薬として
用いうるし、生物活性に基づいて医薬又は動物薬として
利用することも可能である。
ニン誘導体を安定にかつ安価に供給することができる。
また、本発明のカルシトニン誘導体は、実験用試薬とし
て、更にこれを用いてアッセイ系を確立し診断薬として
用いうるし、生物活性に基づいて医薬又は動物薬として
利用することも可能である。
Claims (1)
- 【請求項１】次式： ［式中、Ｘはアラニン又はスレオニンを、Ｙは次式： （式中、Ａはイオウ原子又はメチレン基を表し、ｎは０
又は１を表す。） で示される環状アミノ酸残基を、Ｚはペプチド化学上慣
用されるメルカプト基の保護基を、Alaはアラニンを、L
euはロイシンを、Serはセリンを、Thrはスレオニンを、
Cysはシステインを、Valはバリンを、Glyはグリシン
を、Lysはリジンを、Glnはグルタミンを、Gluはグルタ
ミン酸を、Hisはヒスチジンを、Tyrはチロシンを、Pro
はプロリンを、Argはアルギニンを、Aspはアスパラギン
酸を表す。］ で示される新規カルシトニン誘導体及びその塩。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63294761A JP2680080B2 (ja) | 1988-02-17 | 1988-11-24 | 新規カルシトニン誘導体 |
| US07/353,336 US5010174A (en) | 1987-07-08 | 1989-05-17 | Novel calcitonin derivative and salt thereof |
| EP19890112271 EP0370165B1 (en) | 1988-11-24 | 1989-07-05 | Novel calcitonin derivative and salt thereof |
| ES89112271T ES2061809T3 (es) | 1988-11-24 | 1989-07-05 | Un metodo para preparar un derivado de calcitonina. |
| DE1989612090 DE68912090T2 (de) | 1988-11-24 | 1989-07-05 | Calcitonin-Derivate und deren Salze. |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63-32888 | 1988-02-17 | ||
| JP3288888 | 1988-02-17 | ||
| JP63294761A JP2680080B2 (ja) | 1988-02-17 | 1988-11-24 | 新規カルシトニン誘導体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01294695A JPH01294695A (ja) | 1989-11-28 |
| JP2680080B2 true JP2680080B2 (ja) | 1997-11-19 |
Family
ID=12371422
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63294761A Expired - Lifetime JP2680080B2 (ja) | 1987-07-08 | 1988-11-24 | 新規カルシトニン誘導体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2680080B2 (ja) |
-
1988
- 1988-11-24 JP JP63294761A patent/JP2680080B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01294695A (ja) | 1989-11-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0561412B1 (en) | Parathyroid hormone derivatives | |
| US4786684A (en) | Benzylthioether-linked solid support-bound thiol compounds and method for peptide synthesis | |
| FI83660B (fi) | Foerfarande foer framstaellning bukspottskoertelns grf hos maenniskan. | |
| Hojo et al. | Development of a Linker with an Enhanced Stability for the Preparation of Peptide Thioesters and Its Application to the Synthesis of a Stable-Isotope-Labelled HU-Type DNA-Binding Protein. | |
| EP0270376B1 (en) | Calcitonin gene-related peptide derivatives | |
| JPH0684400B2 (ja) | 新規な生長ホルモン遊離ペプチド | |
| JP2960257B2 (ja) | ビオチン導入試薬およびそれを用いる合成ペプチド精製法 | |
| JP2680080B2 (ja) | 新規カルシトニン誘導体 | |
| EP0298474B1 (en) | Novel calcitonin derivative and salt thereof | |
| US4327075A (en) | Synthetic antigenically-active polypeptide and a process for its preparation | |
| JP4339797B2 (ja) | 非標的部位のアミンが保護されたペプチド、その製造方法、及びこれを利用したｐｅｇが特異的に接合されたペプチドの製造方法 | |
| JPH051798B2 (ja) | ||
| Glass et al. | Bidirectional solid-phase peptide synthesis. Extension of the dinitrophenylene-bridging method to cysteine-containing peptides | |
| EP0300737B1 (en) | Calcitonin gene related peptide derivatives | |
| EP0370165B1 (en) | Novel calcitonin derivative and salt thereof | |
| JP2559767B2 (ja) | 新規カルシトニン誘導体及びその塩 | |
| JPH0768271B2 (ja) | ヒトオステオカルシンの製造法 | |
| JPH01129000A (ja) | 環式ペプチド | |
| PHILOSOF‐OPPENHEIMER et al. | The 2, 4‐dinitrophenyl group for protection of hydroxyl function of tyrosine during solid‐phase peptide synthesis | |
| US5010174A (en) | Novel calcitonin derivative and salt thereof | |
| US4820804A (en) | Analogs of [1,7-di-alanine, des-19-leucine]calcitonin | |
| JP2777193B2 (ja) | ペプチドの製造方法 | |
| EP0495013B1 (en) | Hexapeptides with sulphate ester groups | |
| JP3587390B2 (ja) | リン酸化アミノ酸誘導体及びリン酸化ペプチド合成方法 | |
| Buku et al. | Photoaffinity, biotinyl, and iodo analogs as probes for vasotocin receptors |