JPH05320193A - 副甲状腺ホルモン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】ヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）（１−３４）
の特性を改良したＰＴＨ誘導体を提供する。 【構成】ＰＴＨ（１−３４）の３位、１４位、１５位、
１６位、１７位、２５位、２６位、２７位または３４位
の１ないしそれ以上を他のアミノ酸残基で置換したＰＴ
Ｈ誘導体。 【効果】上記の置換により、酵素分解に対する安定性が
増し、また活性が上昇するなど、優れたＰＴＨ誘導体を
得ることができた。このものは骨疾患等に対して有用な
医薬となり得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【従来の技術】副甲状腺ホルモン（PTH）は副甲状腺で
合成された後、その標的器官である骨、腎臓、腸に作用
して、主に血中カルシウムやリン酸イオンの濃度を調節
する重要な働きをしている。ＰＴＨは84個のアミノ酸か
らなるペプチドホルモンであるがその生物学的作用はＮ
末端(1-34位)のペプチドフラグメントで再現できる事が
知られている〔G.W.Tregearら、エンドクリノロジー(En
docrinology)，93 1349-1353（1973)〕。このヒト型Ｐ
ＴＨのＮ末端(1-34位)のペプチドフラグメント（ヒトＰ
ＴＨ(1-34)と略す）のアミノ酸配列は以下の通りであ
る。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser- 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH （配列番号：１） 当該ホルモンの構造活性相関を理解すべくＰＴＨ(1-34)
フラグメントについて種々の誘導体の合成がなされてき
たが、それらは主にウシＰＴＨ(1-34）に関するもので
あり、ヒトＰＴＨ(1-34)に関してはその例は少ない。例
えばヒトＰＴＨ(1-34)のＣ末端ＰｈｅをPhe-NH₂に変換
すると活性の上昇が見られる（特開昭58-96052）事が知
られている。しかし、これはカルボキシルペプチダーゼ
による分解が抑えられ、その結果見かけの活性上昇が観
察されたものと思われる。また、ヒトＰＴＨ(1-34)には
Ｍｅｔが２残基含まれるが、これらをＮｌｅに置換した
分子では酸化によるホルモン活性消失が防止されること
が知られている（特開昭61-24598)。また、F.E.Cohenら
〔ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（The Journal of Biolological Chemistry，226，19
97-2004（1991）〕は、ウシＰＴＨ（１−３４）におい
て３位Ｓｅｒを種々のＬ−アミノ酸残基に置換したが、
Ａｌａ置換体ではほぼ天然型と同程度の活性を示したほ
かは他のアミノ酸残基置換では活性が著しく低下した。
S.Reppeら〔The Journal of Biological Chemistry，22
6，14198-14201（1991）〕はヒトＰＴＨ（１−８４）に
おいて、２６位ＬｙｓをＧｌｎに置換した蛋白質では天
然型と同等の活性を有することを示したがヒトＰＴＨ
（１−３４）活性フラグメントについては、同様の置換
をほどこした誘導体は知られていない。

【０００２】

【発明が解決しようとする課題】ＰＴＨの生物学的作用
からして、これを医薬として用いれば種々の骨疾患等に
対する有用な医薬品になりうる事が期待されるが、ペプ
チドが有する次のような性質がそれを困難にしている。
１．体内で種々の酵素により分解を受けやすい。２．種
々の経路における体内への吸収効率が非常に低い。３．
例えば酸化等、種々の物理化学的条件にたいし、不安定
である。このような問題点を解決すべく、又当該ホルモ
ンの構造活性相関を解明すべく、ＰＴＨ（１−３４）活
性フラグメントについて種々の誘導体の合成がなされて
きた。これらの化合物の生物活性の測定においては、上
記１〜３の問題点のどれかが回避された化合物では、前
項で、３４位Ｐｈｅ−ＮＨ₂誘導体について述べたのと
同様、活性の上昇した誘導体がみられることが多い。
又、例えばレセプターとの調和性の増大などによって本
来の活性の上昇した誘導体は、その高活性によって上記
１〜３の問題点を補うことができる。

【０００３】

【課題を解決するための手段】先に本発明者等は、ヒト
ＰＴＨ（1−34）におけるアミノ酸残基の置換を化学合
成的に実施し、ヒトＰＴＨ（1−34）に、（１）種々の
蛋白質分解酵素に対する抵抗性を考慮したアミノ酸残基
置換をほどこす事により、（２）また予想される２次元
構造や、親水・疎水性もしくはイオン的環境を考慮した
アミノ酸残基置換によって、当該ホルモンの活性を高め
ることにより、（３）さらには酸、アルカリ性条件、酸
化条件等に対して不安定なアミノ酸残基を、活性を低下
させる事なく、これらの条件に対して安定なアミノ酸残
基に置換することによって、この目的が達成されること
を見出し、優れたヒトＰＴＨ（１−３４）誘導体を提供
した（ヨーロッパ特許出願公開第４７７８８５号公
報）。今般、さらに研究を重ねた結果、ヒトＰＴＨ（１
−３４）配列における第３位、１４位、１５位、１６
位、１７位、２５位、２６位、２７位及び３４位のアミ
ノ酸残基のいずれか、あるいはこれらの置換の組合せよ
りなる該ペプチド誘導体が活性の上昇や安定性等に優れ
ていることが期待され、本発明を完成したものである。
すなわち本発明は、 Ser-Val-R₁-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys
-R₂-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-R₃-Leu-Gln-Asp-Val
-His-Asn-R₄ 〔式中R₁はSerまたは炭素数４以下のＤ−α−アミノ酸
残基を、R₂は少なくとも１個の水溶性α−アミノ酸残基
を有するテトラペプチド鎖を、R₃は少なくとも１個の水
溶性α−アミノ酸残基を有するトリペプチド鎖を、R₄は
芳香族アミノ酸残基またはそのアミドを示す(ただし同
時にR₁がSer，R₂がHis-Leu-Asn-Ser，およびR₃がE-F-G
（式中、AはArgまたはHis，BはLysまたはHis，およびC
はLys，LeuまたはGlnを示す）である場合を除く)〕で表
されるペプチドまたはその塩に関するものである。

【０００４】上記定義中、水溶性α−アミノ酸とは側鎖
に極性基を有するα型の天然あるいは非天然の親水性ア
ミノ酸を表す。特に天然の水溶性α−アミノ酸が好まし
い。これらのうち天然アミノ酸は天然(動物、植物また
は微生物)のタンパク質を構成するアミノ酸もしくはそ
の代謝産物であるアミノ酸のうち水溶性のものをいい、
また、その側鎖に有する極性基（カルボキシル基、アミ
ノ基、グアニジノ基、ヒドロキシル基等）により酸性ア
ミノ酸、中性アミノ酸あるいは塩基性アミノ酸のいずれ
であってもよい。さらにこれらのうち塩基性アミノ酸残
基としては式：

【０００５】

【化２】

【０００６】〔式中、ＺはＮＨ₂，ＮＨＣ(ＮＨ)ＮＨ₂ま
たはイミダゾール環を、ｎは１〜５の整数を示す〕で表
されるＬもしくはＤ−αアミノ酸残基であるものが好ま
しい。R₁における炭素数４以下のＤ-α-アミノ酸残基と
してはD-Ala，D-Asn，D-Cys，D-Ser，D-Thr等の中性ア
ミノ酸残基が例示され、好ましくは、炭素数３以下のＤ
-α-アミノ酸残基、たとえばD-Ser，D-Ala等が挙げられ
る。R₂の少なくとも１個の水溶性α−アミノ酸残基を有
するテトラペプチド鎖をA-B-C-Dで表わすと、AはHis又
はそれ以外の水溶性アミノ酸残基を、BはLeu又は水溶性
アミノ酸残基を、CはAsn又はそれ以外の水溶性α−アミ
ノ酸残基を、DはSer又はそれ以外の水溶性アミノ酸残基
を表わす。R₂のA，B，C，Dにおける水溶性アミノ酸とし
てはＤもしくはＬ体のLys，Gln，Asp，Glu，Thr，Asn，
Arg，Ser，His，オルニチン，ホモアルギニン，2,3-ジ
アミノプロピオン酸，2,4-ジアミノ-酪酸，2-アミノ-4
グアニジノ酪酸，2-アミノ-3-グアニジノプロピオン酸
もしくはGlyが挙げられ、中でもLys，Argが好ましい。R
₂のA，B，C，Dは上記のものを適当に組合せることがで
きるが、中でもHis-Lys-Lys-Lys，His-Leu-Lys-Lys，Ly
s-Lys-Lys-LysもしくはHis-Leu-Lys-Serの組合せが好ま
しい。R₃の少なくとも１個の水溶性α−アミノ酸残基を
有するトリペプチド鎖E-F-Gは、中性ないし塩基性のア
ミノ酸残基が好ましく、具体的な中性アミノ酸残基とし
ては、Ser，Asn，Gln，Thr，Gly，Cit，Hci等が挙げら
れる。塩基性アミノ酸残基としてはArg，Lys，His，オ
ルニチン，ホモアルギニン，2-3ジアミノプロピオン
酸，2-4-ジアミノ酪酸，2-アミノ-4-グアニジノ-酪酸，
2-アミノ-3-グアニジノ-プロピオン酸等が挙げられる。
R₃のE-F-Gは上記のものを適当に組合せることができる
が、中でもArg-Gln-GlnもしくはArg-Lys-Hisの組合せが
特に好ましい。R₄の芳香族アミノ酸残基またはそのアミ
ドとしては、Phe，Phe-NH₂，Tyr，Tyr-NH₂等が挙げられ
る。本発明のペプチドは上記R₁，R₂，R₃およびR₄の組み
合せにより、ＰＴＨ(1-34)フラグメントに対する置換は
一ケ所だけでなく、何ケ所かの置換の組合せも可能であ
り、後述の実施例にあるように特に４ケ所までの置換の
組合せは実用的である。特に３位および３４位について
は単独よりも、他の位置での置換との組合せが、活性を
上げるうえで好ましい。

【０００７】本発明におけるペプチド合成はペプチド自
動合成装置を用いて行うことができる。基本的な合成過
程等はR.B.Merrifield〔アドバンシズ・イン・エンザイモ
ロジー（Advances in Enzymology）32，221-296（196
9）〕の方法に準じている。この方法は、カルボキシル
末端のアミノ酸を樹脂担体に共有結合させておき、α−
アミノ基の保護基の除去、保護アミノ酸の縮合を順次繰
り返して、アミノ末端に向けてペプチド鎖を延長させ目
的のアミノ酸配列を有する保護ペプチド樹脂を得る事を
その原理としている。各アミノ酸の縮合やα−アミノ基
の保護基の除去などは、ほぼ同一の条件でなされ、中間
体の精製も行なわない為、合成に際しては一般に高度な
熟練は要求されない。しかもこの方法は迅速であり、種
々のペプチドを合成するに際し、非常に便利な方法であ
る。こうして得られた保護ペプチド樹脂を、例えば無水
フッ化水素、トリフルオロメタンスルホン酸もしくはト
リフルオロ酢酸と種々の添加物の共存下に反応させる事
により、ペプチドの樹脂からの脱離と全保護基の除去を
一段階で行うことができる。得られたペプチド粗精製物
は、ペプチドまたは蛋白質を精製する公知の手段で精製
することができる。例えばゲル濾過、陽イオン交換、も
しくは陰イオン交換樹脂を用いるイオン交換クロマトグ
ラフィー、さらには疎水クロマトグラフィー、分配吸着
クロマトグラフィー等、種々の原理によるカラムクロマ
トグラフィーや高速液体クロマトグラフィーが挙げられ
る。本発明のペプチドは種々の塩の形で得られる。塩と
しては、例えば無機酸や、ギ酸、酢酸、酒石酸、クエン
酸などの有機酸との塩、もしくはナトリウムやアンモニ
アなどの無機塩基や、トリエチルアミン、エチルアミ
ン、メチルアミン等の有機塩基との塩が挙げられる。

【０００８】本発明の一般式で表わされるヒトＰＴＨ
（１−34）誘導体ペプチドは、低毒性であることが知ら
れている天然型ヒトＰＴＨ（１−34）の低毒性を変化さ
せないので、骨粗鬆症治療剤、副甲状腺機能低下症の治
療剤、高血圧治療剤として安全に用いることができる。
そしてその剤型としては、注射剤、経鼻吸収剤、直腸吸
収剤、膣吸収剤、経皮吸収剤もしくは点眼剤のようなも
のが挙げられるが、場合により経口投与されることもあ
る。該ペプチドをこのような治療剤として用いる場合、
哺乳動物に対してその有効量が用いられる。一般的には
１ｎｇ〜100μｇ／体重ｋｇの範囲で用いられるが、こ
の厳密な量については当業者によって適宜決められるも
のである。このペプチドを治療剤として用いる場合に
は、細菌や発熱物質が存在しないように十分に精製され
るが、その方法自体は公知手段に従えばよい。このペプ
チドを骨粗鬆症などの治療薬として用いる場合、そのま
まあるいは薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤
と混合したのち、上記注射剤、経鼻吸収剤、直腸吸収
剤、膣吸収剤、経皮吸収剤もしくは点眼剤などの剤型で
非経口的に投与することができる。投与量は成人の場
合、注射剤の場合、１回あたり50ｎｇ〜５ｍｇ、好まし
くは１〜500μｇで１〜３日に１回の投与が適当であ
る。治療剤の濃度は注射剤では10〜100μｇ／ｍｌが適
当である。

【０００９】本発明明細書において、アミノ酸などを略
号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commision on
Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分
野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記
する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合
は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。 Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニールアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン Ｎｌｅ ：ノルロイシン Ｃｉｔ ：シトルリン Ｈｃｉ ：ホモシトルリン Ｏｒｎ ：オルニチン ｈＰＴＨ ：ヒトＰＴＨ

【００１０】

【作用】ＰＴＨ(1-34)に本発明のような置換を行なうこ
とによって、種々の蛋白質分解酵素に対する抵抗性が増
す。また血中での活性の持続性が得られる。これは例え
ば第３位のＤ-α-アミノ酸残基への置換で達成された。
さらに１４〜１７位の少なくとも１個を他の水溶性α-
アミノ酸残基に、特に塩基性アミノ酸残基に置換するこ
とにより高いＰＴＨ活性が発現された。また、２５位か
ら２７位に存在する塩基性アミノ酸残基の少なくとも１
個を中性ないし塩基性の他の水溶性アミノ酸残基に置換
しても酵素に対する抵抗性の上昇や活性の維持、上昇が
見られた。

【００１１】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明するが、ここに挙げた代表的なアミノ酸置換の例は本
発明を制限するものと解釈されるべきではない。 〔実施例１〕ＰＴＨ部分ペプチド(1-34位)誘導体の合成
と精製 本ペプチドの合成はメリフィールドらにより開発された
ペプチドの固相合成法(R.B.Merrifield.アドバンシズ
イン エンザイモロジー(Adv.Enzymol)32巻、221-296頁
1969年)の変法に順じて行われ、自動ペプチド合成機430
Ａ(アプライドバイオシステムズ社）を用いた。保護ペ
プチド−樹脂の合成はアプライドバイオシステムズ社指
定のプロトコールを用いた。カルボキシル末端が遊離カ
ルボン酸の誘導体を得る場合には保護アミノ酸−ｐオキ
シメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂（ポリスチレ
ンー１％ジビニルベンゼン）を、またカルボキシルアミ
ドの誘導体を得る場合には４−メチルベンズヒドリル樹
脂を出発原料とし、これに遂次保護アミノ酸を縮合させ
た、縮合時に各アミノ酸のα−アミノ基を保護するた
め、三級ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）基を用い
た。側官能基保護は次のように行なった。セリンとスレ
オニンのヒドロキシル基は０−ベンジルエーテルとし
て、チロシンのヒドロキシル基又はｐ−ブロモベンジル
オキシカルボニルエスチルとして、グルタミン酸及びア
スパラギン酸のカルボキシル基はベンジルエステルとし
て、ヒスチジンのイミダゾール窒素はベンジルオキシメ
チルによって、リジンの側鎖アミノ基は２−クロルベン
ジルオキシカルボニルで、オルニチンの側鎖アミノ基は
ベンジルオキシカルボニルで、アルギニンのグアニジン
官能基はｐ−トルエンスルホニル基で、トリプトファン
のインドールイミンはホルミル基で保護した。すべての
アミノ酸は、アプライド・バイオシステムズジャパン
社、ノバ・バイオケム社又はバチェム・ケミカルズから
入手した。

【００１２】樹脂上に全てのアミノ酸を縮合した後、保
護ペプチド樹脂を合成機から取り出し、乾燥した。ペプ
チド樹脂（１ｇ）を、ｐ−クレゾール（１ml)、1,2−エ
タンジチオール（１ml)、２−メルカプトピリジン（100
mg）を含んだ、無水フッ化水素(８ml）と、０℃で２時
間反応させた。反応終了後、フッ化水素を留去し、残留
物をジエチルエーテルで洗浄し、大部分の混合試薬を除
去した。ペプチドを３％酢酸（10ml）で抽出し、濾過に
より樹脂を除いた。濾液をセファデックスＧ−25を用い
るゲル濾過により精製した。ゲル濾過の条件は、カラム
サイズ2.8×60cm、検出波長230もしくは280nm；溶媒、3
％酢酸；流速40ml／時間であった。ペプチドを含むフラ
クションを集めて凍結乾燥し、得られた粉末標品をさら
に逆相高速液体クロマトグラフィーで精製した。カラム
ＹＭＣ−パック、Ａ−324 ODS（10×250mm）溶出溶媒
Ａ，0.1％トリフルオロ酢酸−99.9％水；溶出溶媒Ｂ，
0.1％トリフルオロ酢酸−99.9％アセトニトリル；溶出
濃度勾配プログラム、０分(90％A＋10％B)、30分(60％
Ａ＋40％Ｂ）(但し必要ならば他の溶出プログラムを用
いる事もある。）溶出速度1.6ml／分、検出波長230また
は280nm。純粋な目的物を含むピーク画分を集めてバイ
オラッドＡＧＩ×８（酢酸型、1.8×5cm）のカラムに通
し、洗液も集めアセトニトリルを留去した後、凍結乾燥
した。

【００１３】このようにして得たペプチドと、そのアミ
ノ酸分析結果ならびに逆相高速液体クロマトグラフィー
における保持時間を表１に示す。なお、表１中のａ，
ｂ，ｃは以下の通りである。 ａ：４％チオグリコール酸存在下、６規定塩酸で減圧封
管中、110℃、24時間加水分解後アミノ酸分析に付し
た。カッコ内は理論値。 ｂ：被験化合物（末尾に何も付いていないのはカルボン
酸タイプである）： （１）〔Ｄ−Ｓｅｒ³〕ｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨ₂ （２）〔Ｄ−Ａｌａ³〕ｈＰＴＨ(１−３４) （３）〔Ｔｈｒ¹⁶〕ｈＰＴＨ(１−３４) （４）〔Ｇｌｕ¹⁶〕ｈＰＴＨ(１−３４) （５）〔Ｌｙｓ¹⁶〕ｈＰＴＨ（１−３４） （６）〔Ｔｈｒ²⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) （７）〔Ａｓｎ²⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４） （８）〔Ｇｌｎ^２６’^２７〕ｈＰＴＨ(１−３４) （９）〔Ｇｌｎ²⁵'²⁶'²⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) （10）〔Ｓｅｒ²⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) （11）〔Ｇｌｙ²⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) （12）〔Ｈｉｓ²⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) （13）〔Ｌｙｓ¹⁶，Ｇｌｎ²⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) （14）〔Ｏｒｎ¹⁶，Ｇｌｎ²⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) （15）〔Ｈｃｉ¹⁶，Ｇｌｎ²⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) （16）〔Ａｓｐ¹⁶，Ｇｌｎ²⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) （17）〔Ａｒｇ¹⁶，Ｇｌｎ²⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) （18）〔Ａｒｇ²⁶'²⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) （19）〔Ｇｌｎ²⁶〕ｈＰＴＨ(１−３４) （20）〔Ｌｙｓ¹⁵'¹⁶，Ｈｉｓ²⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) （21）〔Ｌｙｓ¹⁵，Ｈｉｓ²⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) （22）〔Ｇｌｎ²⁵〕ｈＰＴＨ(１−３４) （23）〔D-Ｌｙｓ¹⁶〕ｈＰＴＨ(１−３４) （24）〔Ｌｙｓ¹⁵'¹⁶'¹⁷，Ｈｉｓ²⁷〕ｈＰＴＨ(１−３
４) （25）〔Ｇｌｎ¹⁶〕ｈＰＴＨ(１−３４) （26）〔Ｓｅｒ¹⁶〕ｈＰＴＨ(１−３４) （27）〔Ｇｌｙ¹⁶〕ｈＰＴＨ(１−３４) （28）〔Ｌｙｓ¹⁶〕ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂ （29）〔Ｌｙｓ¹⁶，Ａｓｐ¹⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) （30）〔Ｌｙｓ¹⁴'¹⁵'¹⁶'¹⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) （31）〔Ｌｙｓ¹⁵'¹⁶'¹⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) （32）〔Ｌｙｓ¹⁶'¹⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) （33）〔Ａｒｇ¹⁶'¹⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) （34）〔Ａｒｇ¹⁵'¹⁶'¹⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) ｃ：誘導体の高速液体クロマトグラフィーによる保持時
間。分析条件：バりアン社製VISTA5000高速液体クロマ
トグラムとウォーターズ社712Ｗオートサンプラーを連
結して用いた。カラム，ＹＭＣ Ａ−３０３ ＯＤＳ（4.
6×250mm)；溶出液Ａ，0.１％トリフルオロ酢酸−99.9
％水；溶出溶媒Ｂ，0.１％トリフルオロ酢酸−99.9％ア
セトニトリル；溶出濃度勾配プログラム，０分（80％Ａ
＋20％Ｂ），30分（50％Ａ＋50％Ｂ）；流速0.7ml／
分；検出波長280nm。

【００１４】

【表１−１】

【００１５】

【表１−２】

【００１６】

【表１−３】

【００１７】

【表１−４】

【００１８】

【表１−５】

【００１９】

【表１−６】

【００２０】

【表１−７】

【００２１】

【実施例２】 ＰＴＨ部分ペプチド(1-34位)誘導体の生
物活性の測定 ＰＴＨ部分ペプチド（1-34位）誘導体の生物活性をシゲ
ノら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー、第263巻、第18369〜18377頁、1980年Shigenoら
〔The Journal of Biological Chemistry，263:18369-1
8377(1988)〕により報告された方法を修正して評価し
た。96穴マルチ・プレート〔ヌンクロン（Nunclon）、ヌ
ンク〕上で培養したマウス頭蓋骨由来骨芽細胞様細胞
株、MC3T3-EI細胞に、0.01，0.1，1，10あるいは100nM
の誘導体を含む、100μlの培養液〔20mMのN-2-ヒドロキ
シエチルピペラジン-Ｎ'-２-エタンスルホン酸（HEPE
S)、0.1％牛血清アルブミン（BSA）および0.5mMのイソ
ブチルメチルキサンチンを含む。Hank's液〕を加え、30
分間室温で反応させた。0.2規定度の塩酸100μｌを加え
た後、沸騰水中に２分半浸し、ＰＴＨ受容体によって産
生されたサイクリック・アデノシン・１リン酸（cAMP）
を細胞から抽出した。培養液中および細胞内の総ｃＡＭ
Ｐ測定は、市販のラジオイムノアッセイキット〔サイク
リックＡＭＰ[¹²⁵I]キット「デュポン−第一」、第一化学
薬品〕を用いて行った。標準として添加したヒトＰＴＨ
部分ペプチド（1-34位）の濃度に依存したｃＡＭＰの産
生量の増加が常に認められた。ＰＴＨ部分ペプチド（1-
34位）誘導体の生物活性については表２に示した。

【００２２】 表２ ＰＴＨ（1-34）部分ペプチドの生物活性〔hPTH(1-34)との相対活性で表わした もの〕 ｈＰＴＨ（１−３４） １．００ 〔Ｄ−Ａｌａ³〕ｈＰＴＨ（１−３４） ２．１７ 〔Ｔｈｒ¹⁶〕ｈＰＴＨ（１−３４） １．７４ 〔Ｇｌｕ¹⁶〕ｈＰＴＨ（１−３４） １．５５ 〔Ｌｙｓ¹⁶〕ｈＰＴＨ（１−３４） ３．３７ 〔Ｔｈｒ²⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) ０．９６ 〔Ｇｌｎ²⁶’²⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) １．１９ 〔Ｇｌｎ²⁵’²⁶’²⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) ０．４１ 〔Ｏｒｎ¹⁶，Ｇｌｎ²⁷〕ｈＰＴＨ（１−３４） １．８２ 〔Ｈｃｉ¹⁶，Ｇｌｎ²⁷〕ｈＰＴＨ（１−３４） １．５４ 〔Ａｒｇ¹⁶，Ｇｌｎ²⁷〕ｈＰＴＨ（１−３４） ２．１６ 〔Ａｒｇ²⁶’²⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) ０．９８ 〔Ｇｌｎ²⁶〕ｈＰＴＨ（１−３４） 〔Ｌｙｓ¹⁵’¹⁶，Ｈｉｓ²⁷〕ｈＰＴＨ（１−３４） １．４９ 〔Ｇｌｎ²⁵〕ｈＰＴＨ（１−３４） 〔Ｄ−Ｌｙｓ¹⁶〕ｈＰＴＨ（１−３４） ０．８６ 〔Ｌｙｓ¹⁵’¹⁶’¹⁷，Ｈｉｓ²⁷〕ｈＰＴＨ（１−３４） ７．４７ 〔Ｇｌｎ¹⁶〕ｈＰＴＨ（１−３４） １．７３ 〔Ｌｙｓ¹⁶，Ａｓｐ¹⁷〕ｈＰＴＨ（１−３４） １．２４ 〔Ｌｙｓ¹⁵’¹⁶’¹⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) ７．６２ 〔Ｌｙｓ¹⁶’¹⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) ８．８５ 〔Ｌｙｓ¹⁴’¹⁵’¹⁶’¹⁷〕ｈＰＴＨ(１−３４) ６．３９ 〔Ｌｙｓ¹⁶〕ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂ ５．４８

【００２３】

【配列表】配列番号：1 配列の長さ: 34 配列の種類: ペプチド トポロジー: 直鎖状 配列の型: アミノ酸 配列の特徴: 部分ペプチド 配列: Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe。

【００２４】配列番号：2 配列の長さ: 34 配列の型: アミノ酸 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: ペプチド 配列の特徴： 存在位置:3 他の情報:Xaa= Ser，炭素数4以下のD-α-アミノ酸 存在位置:14 他の情報:Xaa=His，水溶性α−アミノ酸 存在位置:15 他の情報:Xaa=Leu，水溶性α−アミノ酸 存在位置:16 他の情報:Xaa=水溶性α−アミノ酸 存在位置:17 他の情報:Xaa=Ser，水溶性α−アミノ酸 存在位置:25 他の情報:Xaa=水溶性α−アミノ酸 存在位置:26 他の情報:Xaa=水溶性α−アミノ酸 存在位置:27 他の情報:Xaa=水溶性α−アミノ酸 存在位置:34 他の情報:Xaa=芳香族アミノ酸またはそのアミド体 配列: Ser Val Xaa Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Xaa Xaa Xaa Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Xaa 34。

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アミノ酸配列： Ser-Val-R₁-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-R₂-Met-Glu-Arg-Val- Glu-Trp-Leu-R₃-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-R₄ 〔式中R₁はSerまたは炭素数４以下のＤ−α−アミノ酸
   残基を、 R₂は少なくとも１個の水溶性α−アミノ酸残基を有する
   テトラペプチド鎖を、 R₃は少なくとも１個の水溶性α−アミノ酸残基を有する
   トリペプチド鎖を、 R₄は芳香族アミノ酸残基またはそのアミドを示す(ただ
   し同時にR₁がSer，R₂がHis-Leu-Asn-Ser，およびR₃がE-
   F-G（式中、EはArgまたはHis，FはLysまたはHis，およ
   びGはLys，LeuまたはGlnを示す）である場合を除く)〕
   で表されるペプチドまたはその塩。
2. 【請求項２】R₁が中性アミノ酸残基、 R₂がA-B-C-D（AはHis又はそれ以外の水溶性アミノ酸残
   基を、BはLeu又は水溶性アミノ酸残基を、Cは水溶性α
   −アミノ酸残基を、DはSer又はそれ以外の水溶性アミノ
   酸残基を表わす）、 R₃が塩基性又は中性の水溶性α−アミノ酸残基であるト
   リペプチド鎖、である、請求項１記載のペプチドまたは
   その塩。
3. 【請求項３】塩基性アミノ酸残基が式： 【化１】 〔式中、ＺはＮＨ₂，ＮＨＣ(ＮＨ)ＮＨ₂またはイミダゾ
   ール環を、ｎは１〜５の整数を示す〕で表されるＬもし
   くはＤ−αアミノ酸残基である請求項２記載のペプチド
   またはその塩。
4. 【請求項４】塩基性アミノ酸残基がＬｙｓ，Ａｒｇもし
   くはＯｒｎである請求項３記載のペプチドまたはその
   塩。
5. 【請求項５】R₁がSer，D-SerもしくはD-Alaである請求
   項１記載のペプチドまたはその塩。
6. 【請求項６】ＡがHisもしくはLysである請求項２記載の
   ペプチドまたはその塩。
7. 【請求項７】ＢがLeu，LysもしくはArgである請求項２
   記載のペプチドまたはその塩。
8. 【請求項８】ＣがAsn，Orn，Hci，Asp，Arg，Lys，D-Ly
   s，SerもしくはGlyである請求項２記載のペプチドまた
   はその塩。
9. 【請求項９】ＤがSer，Lys，AspもしくはArgである請求
   項２記載のペプチドまたはその塩。
10. 【請求項１０】R₂がHis-Lys-Lys-Lys，His-Leu-Lys-Ly
    s，Lys-Lys-Lys-LysもしくはHis-Leu-Lys-Serである請
    求項１記載のペプチドまたはその塩。
11. 【請求項１１】ＥがArgもしくはGlnである請求項１記載
    のペプチドまたはその塩。
12. 【請求項１２】ＦがLys,GlnもしくはArgである請求項１
    記載のペプチドまたはその塩。
13. 【請求項１３】ＧがLys，Gln，Arg，His，Asn，Thrもし
    くはSerである請求項１記載のペプチドまたはその塩。
14. 【請求項１４】R₃がArg-Gln-GlnもしくはArg-Lys-Hisで
    ある請求項１記載のペプチドまたはその塩。
15. 【請求項１５】R₄がPhe，Phe-NH₂，TyrもしくはTyr-NH₂
    である請求項１記載のペプチドまたはその塩。
16. 【請求項１６】（１）R₁がSer，R₂がHis-Lys-Lys-Lys，
    R₃がArg-Lys-His，R₄がPhe （２）R₁がSer，R₂がHis-Lys-Lys-Lys，R₃がArg-Lys-Ly
    s，R₄がPhe （３）R₁がSer，R₂がHis-Leu-Lys-Lys，R₃がArg-Lys-Ly
    s，R₄がPhe （４）R₁がSer，R₂がLys-Lys-Lys-Lys，R₃がArg-Lys-Ly
    s，R₄がPhe もしくは （５）R₁がSer，R₂がHis-Leu-Lys-Ser，R₃がArg-Lys-Ly
    s，R₄がPhe-NH₂ である請求項１記載のペプチドまたはその塩。