JPH06510281A - ペプチドアミドの製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチドアミドの製造 関連出願 本願は、１９９１年８月８日に出願した米国特許出願第０７／７４２．７６８号 および１９９１年８月８日に出願した米国特許出願第０７／７４２．７６９号の 一部継続出願である。

発明の背景 非常に少量の、ヒト・アミリンを含むある種のペプチドは、自然単離を含む手順 により入手可能である。アミリンは、最近、クーパー（Ｃｏｏｐｅｒ）およびラ イリス（Ｗｉ１１４ｓ）によって発見され、単離され、精製された３７アミノ酸 ペプチドホルモンである。欧州特許出願ｊｌ！８８３０３８０３．６号（「アミ ロイドペプチド」じＡ■ｙｌｏｉｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”））。クーパーは、ア ミリンが炭水化物代謝に対する効果を示したことも決定した。例えば、クーパー （Ｃｏｏｐｅｒ）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ ブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ）　８４　：　８６２８−８６３２　（１９８７）を参照。糖尿病などの ある種の障害の治療のためのアミリン、アミリン作動薬、およびアミリン拮抗薬 の使用に関する様々な特許出願が行われた。欧州特許出願第８８３０７９２７． ９号（「真性糖尿病の治療のためのアミリンまたはＣ０ＲＰの使用」（ｖｓｅ　 ｏｆ　Ａ＋ｙｌｉｎ　ｏｒ　ＣＧＲＰ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　 ｏｆ　ＤｉａｂｅｔｅｓＭｅｌｌｉｔｕｓ”）　）　：国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８ ９１０００４９　（ｆ２型真性糖尿病の治療Ｊ　（”Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ 　Ｔｙｐｅ　２　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｍｅｌｌｉｔｕｓ−）　）。一般に譲渡さ れ、継続中の特許出願Ｕ、　Ｓ、　Ｓ、Ｎ、６６７．０４０は、固相樹脂合成法 を使用するアミリンの合成法に関する。該出願は、予想される臨床試験を含む広 範な研究のために、より多量のホルモンが入手可能となる固相法を使用する該ホ ルモンの合成を開示している。

しかしながら、アミリンの商業的需要に関する控えめな見積もりでさえ、毎年的 ５０〜５００ｋｑが必要であるという結論を導き出している。固相樹脂合成法に よって商業的に製造された今日までの最大のタンパクは、３２アミノ酸を有し、 かつ、約１０ｂ／年の規模で合成されるサケ・カルシトニンである。アミノ酸長 さが増加するにしたがって、合成の作業は、幾何学的に増加する。か（して、３ ７アミノ酸ペプチドの合成は、３２アミノ酸ペプチドよりも手に負えないもので ある。アミリンの特定のアミノ酸残基含量もまた、固相法を使用する合成の負担 を増大させる。前記の理由のために、樹脂合成法以外の選択は、アミリンのよう なより複雑なタンパクのより大規模な合成のために価値がある。ますます多量の 最終生成物の需要が伸びるので、廃棄物処理と共に、装置限界ならびにアミノ酸 および他の試薬の質層は、かかる合成法を技術的に困難に、かつ非常に高価にし 得る。

組換えＤＮＡ技術は、商業的量のアミリンの合成に対して魅力のあるアプローチ を提供する。現在、いくつかの大きいタンパクは、この方法によって商業的に製 造されている（例えば、α−インターフェロン、インターロイキン−２、組織プ ラスミノーゲン活性化因子、第■因子　Ｃ，エリトロポイエチン）。しかしなが ら、かかる生物系によるこれらのタンパクの高レベルの発現は、それらの製造、 単離および精製を商業的に可能にすることが必要とされる。イー・コリ（Ｅ、ｃ ｏｌｉ）および酵母発現系は、組換え技術によってタンパクを高収率で提供する ことができる：しかしながら、これらの系は、ある種の翻訳後修飾を行うことが できない。

例えば、それらは、ペプチドアミドを構築または発現せず、ペプチド酸だけを構 築または発現する。アミリンは、そのペプチド酸形態ではあまり生物学的に活性 ではないペプチドアミドである。いくつかの組換え発現系は、前駆体ペプチド酸 のアミド形態を提供することが報告された：しかしながら、哺乳動物の細胞など のタンパクのアミド形態を提供する組換え発現系およびバキュロウィルス発現ベ クター系は、低い収率で提供する。これらの収率は非常に低いので、必要とされ る商業的な量のアミリンを効率的かつ経済的に提供することはできない。

ペプチドアミドを得るための「タンパク前駆体酸」の、いくつかの酵素的転換方 法が開示されている。Ｃ−末端グリシン残基を冑するポリペプチド基質からα− アミド化ポリペプチドを製造するためのラットの髄様甲状腺癌（ｍｅｄｕｌｌａ ｒｙｔｈｙｒｏｉｄ　ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）から単離したα−アミド化性酵素 系の使用は、１つのグループによって報告された。ボードリイ、シー・エイ（Ｂ ｅａｕｄｒｙ、Ｇ、Ａ、）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ ー（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂ　ｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）２ ６５　：（２９）＋　１７６９４−１７６９９　（１９９０）；およびＵ。

Ｓ、Ｐ　４．７０８．９３４を参照。開示によると、アミド官能基は、前駆体ポ リペプチド酸の末端グリシン残基のα−アミノ基から切断することによって、ポ リペプチドに与えられる。得られたα−アミド化ペプチドは、１つの小さなアミ ノ酸残基ををし、グｌノンン残基は、削除された。

この酵素的アミド化は、再現するのが困難であることが証明されており、アミド 化されるべきタンパクの大きさが増大するにしたがうて、生成物の収率が指数的 に減少する。このプロセスは、自然抽出による酵素の費用のために、商業的規模 において経済的に許容されず、α−アミド化性酵素は、組換え技術によって、ク ローン化され、発現され、合成され、単離された。しかしながら、組換え技術に よって製造された配列に付加したＣ末端グリシン酸を有する前駆体ポリペプチド に対する組換えによって合成された酵素の使用によってもなお、得られたプロセ スは、非常に大規模なアミリンの製造（すなわち、５００ｍｇ／年の合成規模） について許容されないほど高価である。

タンパクアミドが得られることが報告されている他の酵素的転換は、プロテアー ゼを含む。１つのかかる方法は、カルボキンペプチダーゼ■を使用して小さなペ プチドをペプチドアミドに転換すると報告された。クラウス・ブレラダム（Ｋｌ ａｕｓ　Ｂｒｅｄｄａｗ）、カールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、Ｒｅｓ、 　Ｃｏａｔ、第５０巻、箪２０９頁（１９８５）。別の方法は、カルボキンペプ チダーゼＹおよび小さなペプチドを使用して、あるケースでは、ヒト・カルシト ニン−Ｌｅｕを使用して、Ｃ−末端アミドを有するペプチドを生じさせることが 報告された。この方法による最大収率は、２５％未満であると報告されとおりロ サンキョ・カンパニー・リミテッド（Ｓａｎｋｙｏ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｌｉｍ１ ｔｅｄ）に譲渡されたＵ、Ｓ、Ｐ、４，７０９．０１４を参照コ、かかる酵素系 を使用するペプチドアミドの収率は、ペプチド鏑の複雑さまたは長さが増大する にしたがって、減少することが報告された。

アミリンのほかに、生物学的活性を有する他のペプチドアミドとしては、チロト ロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）、オキシトシン、バソプレッシン、黄体化ホルモ ン放出ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、ガストリン、ＣＧＲＰ −１、ＣにＲＰ−２，サブスタンスＰ１セクレチン、カルシトニン、成長ホルモ ン放出ホルモン、および血管作用性腸ペプチド（Ｖ　Ｉ　Ｐ）が挙げられる。

かくして、タンパク酸をアミドに転換するための経済的に魅力的かつ技術的に簡 単な方法を提供するのは、重要である。残念なことに、カルボン酸からカルボキ シアミドへの簡単な化学的転換は知られているが、かかる反応に通常音まれる試 薬は、敏感なタンパク骨格を破壊する。さらに、ペプチド配列および構造の複雑 さが増大するにしたがって、アミノ酸側鎖における他の反応性基との競合反応が 増大し、かかる副反応は、所望のペプチドアミドの収率を徹底的に減少させる。

発明の概要 本発明は、Ｃ−末端アミド基を宵するペプチド（「ペプチドアミド」）の、Ｃ〜 末端カルボキシル基を有する対応するペプチド（「ペプチド酸」）からの製造方 法を提供するものである。かくして、本発明の１つの態様では、カルボキシル活 性化剤でペプチド酸の溶液を処理して、反応性中間体を得る。好適なカルボキシ ル活性化剤としては、カルボジイミド化合物が挙げられる。次いで、該反応性中 間体をトラッピング剤およびアミン供給源（供与体−ＮＨ，である）で処理して 、ペプチドアミドを得る。本発明の第２の好ましい態様では、酸の存在下、アル コールでペプチド酸を処理して、前記のものとは異なる反応性中間体を得る。次 いで、この中間体をアミン供給源で処理して、ペプチドアミドを得る。

本発明の方法は、ペプチドアミドを、それらの対応するペプチド酸から製造する ために使用される。かかるペプチドアミドとしては、ヒト・アミリンなどのアミ リン、それらのカルボキシ末端でアミド化されるアミリン誘導体および類似体（ 完全な長さまたは３７アミノ酸未満の長さ）が挙げられる。それらとしては、ま た、チロトロピン放出ホルモン、オキシトシン、バソブレッンン、黄体化ホルモ ン放出ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、ガストリン、Ｃ０ＲＰ−１、ＣＧ ＲＰ−２、セクレチン、カルシトニン（特に、サケ、ニワトリ、ウナギおよびヒ ト・カルシトニン）、成長ホルモン放出ホルモン、血管作用性腸ペプチド、およ び一般に３アミノ酸以上のＣ−末端断片を含有するこれらのペプチドアミドの類 似体（活性類似体を含む）が挙げられる。

前記本発明の第１の態様では、カルボキシル活性化剤による処理の前にアミンブ ａツキング剤を使用して、ペプチド酸のｉ離アミソ基を可逆的にブロックする。

１つの好ましい態様では、ブロッキング基によって、リン２などのアミノ酸の側 鎖上の遊離アミンをこのように保護し、所望により、Ｎ−末端α−アミノ基も保 護する。

本発明の別の態様では、ペプチド酸断片（ｎ−ｍアミノ酸残基を有する（ここで 、完全なペプチドアミドは、ｎアミノ酸を有する））をペプチドアミド断片（ｍ アミノ酸残基およびＣ−末端アミド基を有する）と結合させる。この方法は、（ １）カルボキシル活性化剤およびトラッピング剤または（２）酸性アルコールの 存在下、結合条件下で反応が行われ、その結果、ペプチド酸断片およびペプチド アミド断片が結合してペプチドアミドが得られる点で前記方法と同様である。

本発明の別の態様では、ペプチドアミドは、全ての遊離酸基（すなわち、カルボ キシル基）をエステル化し、次いで、Ｃ−末端カルボキシルをアミドに特異的に 転換し、次いで、側鎖エステルを酸に加水分解または脱エステル化（脱係ＩＩ） することによって、ペプチドアミドを、対応するペプチド酸から製造する。１つ の好ましい態様では、出発ペプチド酸が側鎖カルボキシル基を含有する場合、Ｃ −末端エステルからアミドへの転換は、Ｃ−末端エステルに対して選択的な酵素 およびアミンまたはアミノ酸−アミドなとのＮＨ，供給源を使用して行われる。

この方法によるアミリンの製造に有用な酵素としては、キモトリプシン、サーモ リソン、パパイン、ペプシン、プロメラインおよび芳香族アミノ酸に対して特異 的な他の酵素が挙げられる。

本発明の好ましい態様では、アミリン、Ｃ−末端アミドを含有するタンパクホル モン（アミリンアミドとしても文献中に引用されている）を、対応するアミリン 酸前駆体から製造する。本発明は、アミリンの経済的合成を生じさせる方法を提 供する。かくして、高生産性の酵母またはイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）組換え発 現系によってアミリン前駆体酸を製造する。次いで、本発明の方法に従って、該 アミリン酸を使用して、所望のアミリンを得る。かくして、本発明の方法の使用 によって、かかる組換え技術発現系の優れた経済性を利用し、次いで、それによ って生産されたペプチド酸を、対応するアミドに転換することができる。

！轡 本明細書で使用する場合、以下の語句は、別に特記しない限り、以下の意味を有 する。

「ペプチド酸」なる語は、Ｃ−末端カルボキシル基を有するオリゴペプチド、ポ リペプチドまたはタンパクを表す。

「ペプチドアミド」なる語は、Ｃ−末端アミド基を有するオリゴペプチド、ポリ ペプチドまたはタンパクを表す。

「アミリン酸」なる語は、Ｃ−末端カルボキシル基を有するアミリンポリペプチ ドを表す（例えば、ＸがＣ−末端カルボキシル基であるヒト・アミリンについて の第１図に示されるアミノ酸配列）。

「アミリン」なる語は、ある種のアミリン酸のアミド化された形態を表す、例え ば、ＸがＣ−末端アミド基である第１図に示されるヒト・アミリンのアミノ酸配 列を有するポリペプチド。

図面の簡単な説明 第１図は、ヒト・アミリンのアミノ酸配列を示す。

ｊｌ！２図は、数種の哺乳動物から単離したアミリンのアミノ酸配列の比較を示 す。

発明の詳細な説明 本発明は、アミリン酸などのペプチド酸をその対応するアミド形態、すなわち、 アミリンに転換することができる方法を提供するものである。かくして、好まし い態様では、本発明は、アミリン酸からアミリンを化学的に製造するための方法 を提供するものである。一般に、本発明の１つの態様は、実際の結合／アミド化 反応が生じる前に、これらの遊離アミン基を可逆的にブロックすることによる遊 離アミン基アミリン酸の保護を提供するものである。別の！！！様は、アミリン 酸を保護せずに結合／アミド化反応を行うことを含む。別の態様では、本発明は 、アミド化が生じる前のＣ−末端カルボキシレートの活性化について提供する。

別の態様は、活性化せずにアミド化を行うことを含む。別の態様は、ペプチド酸 断片およびアミド化アミノ酸などのアミド化ペプチド断片を結合して、ペプチド アミドを得る。

Ａ　ペプチドアミドのペプチド酸からの直接的製造１つの態様では、本発明は、 ペプチド酸から直接ペプチドアミドを製造する方法を提供するものである。本発 明のこの態様では、ペプチド酸の溶液をセリンヒドロラーゼ酵素およびアミン供 給源で処理する。好適な酵素としては、カルボキシペプチダーゼＹまたはカルボ キシペプチダーゼＰが挙げられる。好適な溶媒としては、明白なｐＨ１：調節し た水性有機混合物などの酵素補助反応と一緒に慣用的に使用されるこれらの溶媒 が挙げられる。好適なアミン供給源としては、予めアミド化されたアミノ酸が挙 げられる。

別の態様では、本発明は、ペプチドが酸性アミノ酸残基を全く含有しない場合に 、遊離アミン保護を必要とせずに、ペプチド酸から直接ペプチドアミドを製造す る方法を提供するものである。ペプチド酸が酸性アミノ酸残基を含有する場合は 、これらの残基が保護されるのが好ましい。本発明のこの態様では、ペプチド酸 の溶媒中溶液をカルボキシル活性化剤で処理して、反応性中間体を得る。好適な カルボキシル活性化剤としては、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エ チルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミドおよびカルボニルジイミダ ゾールならびにシンクロヘキシルカルボジイミドなどのカルボジイミドが挙げら れる。好適な溶媒としては、ペプチド合成で慣用的に使用される溶媒および二次 元構造的素子を分裂させ、分子内および分子間水素結合の形成を最小限にする溶 媒が挙げられる。好適な溶媒としては、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメ チルスルホキシド、テトラヒドロフラン、Ｎ−メチルピロリドンなどが挙げられ る。カルボジイミドによる処理後のイミドである反応性中間体をトラッピング剤 およびアミン供給源で処理する。好適なトラッピング剤としては、Ｎ−ヒドロキ シベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイ ミド、Ｎ−ヒドロキシグルタルイミド、ベンズヒドロキサム酸およびヒドロキシ ピペリジンが挙げられる。好適なアミン供給源としては、アンモニアおよびアン モニアの水和物形態が挙げられる。本発明の好ましい態様では、トラッピング剤 およびアミン供給源の両方として作用する試薬を提供する。

Ｂ、保護ペプチド酸を使用するペプチドアミドの製造１つの具体例では、本発明 の方法は、遊離アミン基を可逆的にブロックするアミノ−ブロッキング剤でペプ チド酸の溶液を処理して、保護ペプチド酸を得る第１の工程を含む。１つの好ま しい態様では、リシンなどのアミノ酸の側鎖上の遊離アミン基をブロックする。

所望により、Ｎ−末端α−アミノ基をブロックしてもよい。好適なブロッキング 基としては、ｔ−ブトキン−カルボニルｆｆｔ−ＢｏｃＪまたはｒＢｏｃＪ）、 Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｓｏｃ）、アセチル、ピバロイル、ブ チル、ベンゾイルおよびベンジルが挙げられる。使用されるブロッキング基がＢ ｏａである場合、保護ペプチド酸は、炭酸ジーｔｅｒｔ−ブチルを使用して製造 されるのが好ましい。所望により、保護ペプチド酸を非保護ペプチド酸から分離 し、および／または側鎖保護ペプチド酸を完全に保護されたペプチド酸から分離 する工程を含んでもよい。

遊離アミンの保護後、保護ペプチド酸を、カルボキシル活性化剤、次いで、前記 セクションＡに記載したアミン供給源を含むトラッピング剤で処理して、保護ペ プチドアミドを得る。慣用の脱ブロッキング剤およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ ）による処理などの方法によって、ブロッキング基を除去して、ペプチドアミド を得る。所望により、脱保護前に、アミド化されていない保護ペプチド酸から保 護ペプチドアミドを分離してもよい。

Ｃエステル中間体を介するペプチドアミドの製造本発明の別の態様は、エステル 中間体を使用するペプチドアミドの製造に関する。

無水または水性酸およびアルコールでペプチド酸を処理して、全てのカルボン酸 基をエステル化する。好適なアルコールとしては、メタノール、エタノール、イ ソブタノール、プロパツール、イソプロパツール、ｎ−ブタノールまたは１−ブ タノールなどの短鎖脂肪族アルコールが挙げられ、対応するメチル、エチル、イ ソブチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルまたはｔ−ブチルエステルが得 られる。次いで、該エステル中間体を、アンモニアなどのアミンおよび好ましく はキモトリプシンなどの酵素としての選択的アミド化剤で処理して、特異的に（ および選択的に）Ｃ−末端エステル基をアミドに転換する。別法としては、エス テル中間体をアミノ酸アミド（−ＮＨ，）およびカルボキシペプチダーゼＹで処 理する。

側鎖エステル基を加水分解または脱保護によって（ｔ−ブチルエステルに対して はＴＦＡなどの試薬によって）除去して、Ｃ−末端アミド化タンパクを得る。

別法としては、ペプチド酸がカルボン酸側鎖を全く有しない場合、すなわち、ペ プチド酸の唯一のカルボキシル基がＣ−末端カルボキシルである場合、エステル 中間体は、水酸化アンモニウム、メタノール中アンモニアまたはアンモニア水溶 液での処理によって対応するペプチドアミドに転換されてもよい（実施例９を参 照）。

Ｄ、ペプチドエステル中間体とペプチドアミド断片との結合によるペプチドアミ ドの製造 本発明のこの態様では、ペプチドエステル断片（ｎ−ｍアミノ酸残基を有する） とペプチドアミド断片（ｍアミノ酸残基を有する）を結合させることによって、 ペプチドアミド（ｎアミノ酸残基を有する）を製造する。この方法は、前記方法 と同様であるが、ペプチドエステル断片は、得られるペプチドアミドよりも少な いアミノ酸残基を有しており、ペプチドアミド断片は、アミン供給源として供さ れる。好ましいペプチドアミド断片は、アミド化されたアミノ酸であるか、また は約１５〜約２０までのアミノ酸残基、より好ましくは、約１〜約５アミノ酸残 基を有するアミド化されたオリゴペプチドである。

Ｅ　アミリンアミドの製造 本発明の第１の方法では、いずれのタイプの保護基をも含まない一段階反応によ って、アミリン酸をアミリンに転換する。すなわち、アミリン酸の遊離アミンは 、露出したままである。この反応は、ＤＭＦ中でカルボキシル活性化剤とじて１ −（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドおよびトラッピ ング剤／アミン供給剤を使用するアミリン酸からアミリンへの化学的転換からな る。この反応によって、収率的１６％で非保護アミリン酸を得た（実施例７を参 照）。

本発明の第２の態様では、二次酸ジーｔｅｒｔ−ブチルなどのブロッキング剤を 使用して、入手可能なアミリン酸の遊離アミンをブロックする第１段階を提供す る。

この反応は、全収率〉９０％で生じる。第２段階は、得られた保護アミリン酸の Ｃ−末端カルボニルの、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカル ボジイミドなどのカルボキシル活性化剤による活性化、次いで、アンモニアなど のアミン供給源と一緒にＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）などの トラッピング剤からなるアミド化剤を使用するアミド化段階からなる；別法とし ては、トラッピング剤およびアミン供給源は、アンモニウム＝Ｎ−ヒドロキシス クシンイミド、アンモニウム＝Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、アンモニウム＝Ｎ −ヒドロキシグルタルイミド、アンモニウム＝ベンズヒドロキサム酸、またはア ンモニウム＝Ｎ−ヒドロキシピペリジンなどの１つのアミド化剤として配合され る。

活性化およびアミド化剤は、同時に反応混合物に添加されるのが好都合である。

この反応は、出発ペプチドとしてＢｏｃ−アミリン酸を使用して収率的８６％で 、Ｂｏｃ、−アミリン酸を用いて収率２０％で生じる。第３段階は、ＴＦＡによ るＢｏｃ−アミリンの脱ブロッキングからなる。この脱ブロッキング反応は、単 離したＢｏｃ−アミリンまたは精製されていない粗製Ｂｏｃ−アミリン（Ｂｏｃ −アミリンおよびＢｏｃ、アミリン）を用いて行われ得る。粗製Ｂｏｃ−アミリ ンのＴＦＡ処理は、アミリンを完全に脱ブロックした。これは、アミリン標準同 時導入を使用して逆相ＨＰＬＣによって確認された。

前記方法は、２つのＢｏｃ−アミリン酸（すなわち、Ｂｏｃ−アミリン酸および ＢＯＣ！−アミリン酸）を分離する段階を含むが、この分離段階は、必要ではな い。

両方の保護ペプチド酸は、結合および脱保護のために同一の試薬に暴露され、個 々の保護ペプチド酸を単離する必要はない。中間生成物のいくつかは異なるが、 両方の経路からの最後の段階（ｔ−Ｂｏｃ＆保護）は、同一のアミリンペプチド を生成し、かくして、個々のペプチドの単離を除外する。したがって、Ｂｏｃ− ペプチド酸を合わせることができ、反応を一緒に行うことができ、時間および化 学物質を節約することができる。

本発明の第３の方法は請求核試薬（またはアミン供給源）がわずかに大きく（例 えば、ＮＨ，と対比してＴｙｒ−ＮＨ２−）、対応する出発ペプチド酸がより少 ないアミノ酸残基を有する（例えば、アミリント３７と対比してアミリン１づ− ）こと以外は、前記方法と同様である。この例示では、まず、前記アミリン酸の 保護のために使用したような方法を使用して、アミリント３６酸をＢｏｃ−保護 する。次いで、ＤＭＦ中で１−（３−ツメチル−アミノプロピル）−３−エチル カルボジイミドおよびＨＯＢｔを使用して、Ｂｏｃ−アミリンｌ−１１１をＴｙ ｒ−ＮＨ２に結合させる。

最後に、ＴＦＡ処理でＢｏｃ−アミリンを脱保護する（実施例８を参照）。本発 明のこの態様では、多（の種々のペプチド酸断片のうちの１つを適当なペプチド アミド断片と結合させるだけで、多（の方法で、アミリンを合成することができ る。

前記方法のいくつかは、合成ペプチド化学に含まれるプロトコールを利用する。

例えば、ボダンスキー（Ｂ　ｏｄａｎｓｚｋｙンおよびポダンスキ−（Ｂ　ｏｄ ａｎｓｚｋｙ）、ザ・プラクティス・オブ・ベブタイド・シンセシス（Ｔｈｅ　 Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　ＰｅｐｔｉｄｅＳ　ｙｎｔｈｅｓｉｓ）、（スブリン ガーーヴアーラグ（Ｓ　ｐｒｉｎｇｅｒ　−Ｖｅｒｌａｇ）、１９８４）；ザ・ ベブタイディズ・アナリシス・シンセシス・バイオロジー（Ｔｈｅ　Ｐｅｔｆｄ ｅｓＡｎａｌｙｓｉｓ、５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第１巻、（ グロス（Ｇｒｏｓｓ）およびメイエンホファ−（Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ）編、ア カデミツク・プレス・インコーホレイテッド（Ａｃａｄｅｑａｉｃ　Ｐｒｅｓｓ 、　１　ｎｃ、　）、１９７９）を参照。活性化およびトラッピング剤は、液相 および固相ペプチド化学で使用される。好適なカルボキシル活性化剤としては、 １．３−ジシクロへキンル力ルポジイミド（ＤＣＣ）、１．３−ジイソプロピル カルボジイミド、およびカルボニルジイミダゾールが挙げられる。好適なトラッ ピング剤としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミ ド、Ｎ−ヒドロキシグルタルイミドが挙げられる。他の一般的なカルボキシル活 性化剤およびトラッピング剤は、前記文献に記載されており、その内容は、本明 細書に引用記載される。Ｆ■■保護基のような化学的に不安定な部分を含む他の 好適なアミン保護基は、適当な脱保護プロトコールおよびこれらの保護基と一緒 に好都合に使用される試薬と一緒に使用される。

本発明の理解を助けるために、一連の実験結果を記載する以下の実施例を記載す る。本発明に関する以下の実施例は、もちろん、本発明を特に限定するものでは なく、当業者の範囲内である、かかる本発明の、現在知られているか、または後 に開発される変形例は、本明細書および以下の請求の範囲に記載されているとお り、本発明の範囲内であると思われる。

寒裏燃 これらの調製に使用した全ての物質は、入手したままで使用し、さらなる精製は 行わなかった。これらの実験のために使用した全ての水は、ミリポア（Ｍｆｌｌ ｉｐｏｒｅ）　ｒＭｉｌｌｉ−Ｑ　Ｗａｔｅｒ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓ ｙｓｔｅｍＪ　（５カートリツジモデル）に通して精製した。高速原子衝撃分析 は、エム−スキャン、インコーホレイテッド（Ｍ　−５ｃａｎ、Ｉ　ｎｃｏｒｐ ｏｒａｔｅｄ）　（ペンシルベニア州ウェスト・チェスター）によって行った。

質量検量線の作成は、ヨウ化セシウムまたはヨウ化セシウム／グリセロールを使 用して行った。

実施例１ アミリン酸からアミリンの製造 まず、ｐＨ５，５の５＠Ｍ　ＥＤＴＡを有する０、４Ｍチｏシン７　ミＦ６０ａ ｉにヒト・アミリン酸２５０μ９を溶解した。次いで、カルボキシペプチダーゼ Ｙ１２μ９を添加し、室温で該反応を進行させた。該反応をアミリンの収率１５ ％までＨＰＬＣによってモニターした。

実施例２ ペプチド酸からアミリンの製造 まず、既にｐＨ６，５に調節した５ｍＭ　ＥＤＴＡを有する０、４Ｍチロシンア ミド６０μｌにアミリン’−”Ａｌａ−ＯＨ２５０μ９を溶解した。次いで、カ ルボキンペプチダーゼＹ１２μ９を導入し、室温でトランスアミド化を進行させ た。アミリン形成を１５％を超過してＨＰＬＣによってモニターした。

Ｂｏａ−アミリン酸の製造 水（ガラスは避けるべきであるので、１５冨ｌのエツベンドルフ管中）０．５Ｍ ｌにアミリン酸（バチエム・バイオサイエンス（Ｂ　ａｃｈｅｓ　Ｂ　１ｏａｃ ｔｅｎｃｅ）、Ｌｏｔ　＃ＺＨ７１４）ｌｕを溶解した。この溶液にジメチルホ ルムアミド０．５ｍｌ　（ｒＤＭＦ」、アメリカン・バーディツク・アンド・ジ ャクソン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｕｒｄｉｃｋ　＆Ｊ　ａｃｋｓｏｎ）、高純度 溶媒縁）０．５ｍｊ！を導入した。次いで、この混合物に二次酸ジーｔｅｒｔ− ブチル（アルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅ鵡１ｃ ａｌＣＯ３）約２００−９を添加し、得られた混合物を室温で撹拌した。４８６ 　Ｗａｔｅｒｓｄｅｔｅｃｔｏｒおよび７１２　Ｗａｔｅｒｓ　Ｉ　ｎｔｅｌｌ ｉｇｅｎｔ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ　（Ｗ　Ｉ　Ｓ　Ｐ）を有する Ｗａｔｅｒｓ　６２５　Ｌ　Ｃを使用して逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｈ ＰＬＣ）によって反応の進行をモニターした。移動相は、水中０．１％トリフル オロ酢１！ｔ（ＴＦＡ）（溶媒Ａ）およびアセトニトリル中０．１％ＴＦＡ　（ 溶媒Ｄ）であった。逆相カラムは、Ｐｏｒｏｓ　Ｒ／Ｈカラム（４，６ｍｍｘｌ ＯＯｍｇ）であった。使用した勾配液は、流速３．０ｇ７／分で１５分のうちに ２０〜４０％溶媒Ｂであった。酸出発物質は、７３４分で溶出し、Ｂｏｃ−アミ リン酸は、８．５２分で溶出し、Ｂｏａ２−アミリン酸は、１１．３分で溶出し た。生成物を収集し、５ａｖａｎｔ　５ｐｅｅｄｖａｃ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔ ｏｒを使用して乾燥した。マススペクトル分析は、形成された２つの生成物がＢ ｏａ−アミリン酸およびＢＯＣ！−アミリン酸である二Ｂｏｃ−アミリン酸を使 用する。

まず、ＢＯＣ−アミリン酸（約５０μｇ）をＤＭＦ　２００μｊｌ＝溶解し、次 いで、１−（３−ジメチルアミノブロビル）−３−エチルカルボジイミドケミカ ル・カンパニー　（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．）、９８％）２ ００１１９およびトラッピング剤／アンモニウム供給源２００ｕを添加する。３ つの成分全てを混合した後、該混合物を室温で撹拌する。該反応は、１．５ｍｌ のエッペンドルフ背中で行う。この反応は、異なるカラムおよび溶媒系を使用す る以外は、実施例３に記載のＷａｔｅｒｇ系を使用して、逆相ＨＰＬＣによつて モニターする。Ｖｙｄａｃ　Ｃ　４−タンパク・カラム（０．　４　６冨露×２ ５寓諺）を使用する。移動相は、水中２％酢酸／３．３％トリエチルアミン（Ｔ ＥＡ）（ｐＨ５．０）（溶媒Ｃ）およびアセトニトリル中２％酢酸７３．３％Ｔ ＥＡ　（溶媒Ｄ）である。これらの分析に使用される勾配液は、１．０１１１分 で３０分のうちに２８〜３８％溶媒りである。出発物質は、２０．５分で溶出し 、生成物Ｂｏｃーアミリンは、２２．３分で溶出する。

（ＨＰＬＣ収集による）単離および（Ｓｐｅｅｄｖａｃ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔ ｏｒを使用する）乾燥の後、マススペクトル分析を行い、生成物がＢｏｃ−アミ リンについて予想されるＭ＋イオンを有することを確認する。

実施例５ Ｂｏｃ．−アミリンの製造 Ｂｏｃｚ−アミリンの製造のための出発物室として、実施例３に従って製造した Ｂｏｃ−アミリン酸を使用する。

１　、　５　ｄノ工，ベンドルフ管中、ＤＭＦ　２　０　０　μｊｌ：ｌ：Ｂｏ ｃｌーアミリン酸５０μりを溶解する。次いで、１−（３−ツメチルアミノプロ ピル）−３−エチルカルボジイミドおよびトラッピング剤／アミン供給源を共に ２　０　０　ｗｅ添加する。得られた混合物を室温で撹拌する。勾配液が４５分 のうちに２８〜４３％溶媒りである以外は、実施例４の記載に従って、該反応を ＨＰＬＣによってモニターする。

Ｂｏａ２−アミリン酸出発物質は、３４、５分で溶出し、生成物Ｂｏａ．ーアミ リンは、３７、０分で溶出する。

実施例６ Ｂｏｃ−アミリンおよびＢｏｃ２〜アミリンからアミリンの製造実施例４および ５に記載の反応を停止し、次いで、高真空下で溶媒を除去した。

次いで、小さなガラスフラスコ中、１００％ＴＦＡ　Ｏ．５■ｌを添加し、該溶 液を５分間撹拌した。その後、ＴＦＡを吸引し、脱保護について、該反応を調べ た。

固体を６Ｍグアニジン・塩酸塩中で再構成し、次いで、逆相ＨＰＬＣを使用して 、進行をモニタした。この分析に使用した移動相は、同一の勾配液およびカラム と−緒に、（Ｂｏｃ−アミリン形成の分析に使用した）実施例４に記載のものと 同一であった。Ｂｏａ−アミリンは、２２．５分の溶出時間を有したが、アミリ ン生成物は、１９．８分の溶出時間を有した。生成物の証明は、アミリン標準を 有する試料をスパイクし、１９．８分で同時溶出を観察することによって行った 。アミリン酸溶出時間は、１６．６分であり、Ｂｏｃ−アミリン中に存在する未 反応Ｂｏａ−アミリン酸のために、あるアミリン酸が観察された。Ｂｏｃｔ−ア ミリンの脱保護のために同様な条件を使用した。

酸からアミドへの転換は、遊離アミン基の保護を用いずに１つの段階で行われる 。この反応は、以下の方法に従って、保護されていないアミリン酸を使用して行 った： まず、ＤＭＦ　１．０ｇｊにアミリン酸０．８１９を溶解した。次いで、１−（ ３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドおよびトラッピング 剤／アミン供給源を各々２００＋ｖ導入した。得られた混合物を室温で撹拌した 。逆相ＨＰＬＣを使用して反応の進行をモニターした。移動相は、前記実施例４ に記載の溶媒ＣおよびＤであった。勾配液は、１　ｍｌ１分で３０分のうちに２ ８〜３８％溶媒りであった。アミリン保持時間は、１９．８分であり、アミリン 酸溶出時間は、１６．６分であった。マススペクトル分析を使用して、アミリン 形成を確認した。

実施例８ ペプチド結合を介するアミリンの製造 まず、例えば、水：ＤＭＦの１：１混合物ｌｌｌ１にアミリン１−ｓ６酸１畔を 溶解することによって、Ｎ−末端ペプチドを保護する。この混合物に、二次酸ジ ーｔｅｒｔ−ブチル２００吋を添加し、反応を室温で撹拌した。前記のｔＢｏｃ −保護ペプチドについて用いた方法（実施例２および３）と同様の逆相ＨＰＬＣ 法によってモノ−およびジー保護ペプチドを分離する。次いで、Ｔｙｒ−ＮＨｔ 　０．５９と一緒に１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジ イミドおよびＨＯＢｔ２００ｍｐを添加し、反応混合物を室温で撹拌する。前記 結合についての記載に従うてＨＰＬＣを使用して（実施例４および５を参照）、 該反応をモニターする。次いで、実施例６の記載に従って、Ｂｏｃ−アミリンを 脱保護する。

メタノール（９９，９％−アルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Ａｌｄｒｉｃ ｈＣｈｅ■１ｃａｌ　Ｃｏ、））　１．　Ｏ■ｌに塩化アセチル（アルドリッチ ・ケミカル・カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、））　１ ０．５ｄを添加することによって、ＨＣＩのメタノール中０．１５Ｎ溶液を調製 した。該溶液は、エステル化反応のほんの少し前に調製する。

前記０．１５ＮＨＣ導液３５鳳ｌでアミリン酸のアリコツト１９岬を処理した。

混合物を室温で６時間撹拌した。５．７５時間後、逆相ＨＰＬＣによって測定す ると、アミリン酸の５９％が対応するメチルエステルに転換していた。さらに１ ４時間撹拌した後、反応は、６６％メチルエステルまで進行した。さらに２時間 後、反応は、６８％メチルエステルまで進行し、混合物を処理した。該混合物を 氷で冷却し、Ｎ−メチルモルホリンを使用して中和した。高真空を使用してメタ ノールを除去した。逆相ＨＰＬＣを使用して、得られた固体を精製して、マスス ペクトル分析で確認すると純度９９％のアミリンメチルエステル６〜７ｍ＋９を 得た。

２、メタノール中塩酸およびグアニジン・塩酸塩処理まず、メタノール中０．１ ３ＮＨＣＡｌおよび４Ｍグアニジン・塩酸塩２５０μｌにアミリン酸２５０μ９ を溶解した。ＨＰＬＣによって示されるように、この反応によって、１６０分の うちに収率９０％のアミリン酸を得た。この反応は、室温で進行させた。

いずれの場合も、反応によって生じた水またはＨＣＩの除去を助けるために、該 反応混合物にモレキニラーシーブを添加した。これは、形成されたエステルのパ ーセントを改良する。

１、水酸化アンモニウム処理 工程Ａからエステル化反応混合物のアリコツトＬｏｏｍｌを取り出した。ＵＨＰ アルゴンガスを使用して、ＨＣＩおよびメタノールを排出した。水１００ｍｊに 得られたエステル／酸固体混合物を溶解し−次いで、２８〜３０％水酸化アンモ ニウム（アルドリッチ・ケミカル・カンパニー　（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ　Ｃｏ、））　５００μｌを添加し、混合物を室温で放置した。３時間後 、ＨＰＬＣは、アミリン形成を示し、これをマススペクトル分析によって確認し た。

冷たい２８〜３０％水酸化アンモニウム５００μｌで処理した精製アミリンメチ ルエステル２４０μ９を使用して、別の反応を行った。室温で３０分後、該混合 物のＨＰＬＣ分析は、アミリン形成を示した。３００分後、逆相ＨＰＬＣによっ て測定すると、アミリンメチルエステルのほとんど全てが消失していた。

２、メタノール中アンモニア処理 精製アミリンメチルエステル２４０μすをメタノール中２Ｎアンモニア（アルド リッチ・ケミカル・カンパニー　（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、 　））　５００　μｍと混合した。２０時間後、逆相ＨＰＬＣによって示される とおり、非常に少量のペプチド分解と共に、アミリン形成が見られた。

３、アンモニア水溶液処理 前記エステル化からの粗製アミリンメチルエステル（実施例５）２５０μりを一 ２００℃でアンモニア水溶液約１＠ｌと混合した。次いで、２０分間で該ペプチ ド溶液を室温に到達させた。次いで、該溶液を一２００℃に再冷却し、次いで、 アンモニアを蒸発させつつ、再度室温に到達させた。ＨＰＬＣによると、該エス テルは、９５％を超える収率でアミリンアミドに転換した。

実施例１０ キモトリプシンを使用するアミリンメチルエステルからアミリンへの転換前記実 施例９の工程Ａの記載に従って精製アミリンメチルエステルを製造した。

キモトリプシンの存在下、ｐＨ４，８〜６で、０．５７Ｍ酢酸アンモニウムなど の核試薬溶液でアミリンメチルエステルを処理する。アミリンの発生は、逆相Ｈ ＰＬＣを使用してモニターする。

１−１−１　■　１　■　１１１ Ｚ　Ｚ：　Ｊ　Ｏ■　１１−　Ｉ の　の　１１１１１１１１１ ０　Ｑ　■　１１１１１１１ 〉　〉　■　１１１１１１＋ ｚＺｌ　ｌ　ｌ　Ｉ　ｌ　ｌ　１Ｏｘ １−　１−　１　１　１　■　１１− の　の　■　乙こ乙工乙乙乙 Ｃ／）　（１）　ｌ　ｌ　ｌ　ｌ　ＣＬＣＬ　Ｉ−ＣＬ−ｕ　ｌ　ｌ　ｌ　Ｉ　 Ｉ　ｌ　ｌ　ｌ　１１１１１　＞＞＞＜＜ ＜　＜１１−１　１ｃＬｃＬＱ−１１ ０１ｊ　ｌ　ｌ　ｌ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　ｌ　ｌ　Ｉ＝　＝　Ｉ　ごｃｔααヱ　１　 αα Ｃｒ：（Ｘ　ｌ　ｌ　■　■　１１．１０　０１　■　■　１１１１ ＜　＜　ｌ　ｌ　Ｉ　ｌ　ｌ　ｌ　ｌ　ｌ　ｌフロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ　６１　Ｋ　３７／４ ３　８３１４−４ＣＣＯ７Ｃ１１０８９２８０−４Ｈ （３１）優先権主張番号 （３２）優先臼　１９９２年８月８日 （３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＣＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＣＡ 、ＤＫ、ＪＰ （７２）発明者　ジョーンズ、バーワードアメリカ合衆国カリフォルニア用９２ ０６４、ポーウェイ、セント・ジエームズ・ドライブ１６８７０番

Claims (51)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）エステル化剤でペプチドのペプチド酸形態を処理して、ペプチド酸の 遊離カルボキシル基をエステル化して、ペプチドエステルを得、（ｂ）ＮＨ２供 給源およびペプチドエステルのＣ−末端エステル基をアミド基に選択的に転換す るアミド化剤で工程（ａ）のペプチドエステルを処理して、Ｃ−末端アミド基を 有するペプチドを得ることを特徴とする、Ｃ−末端アミドを有するペプチドの製 造方法。
2. ２．さらに、 （ｃ）側鎖カルボキシル基からエステル基を除去してＣ−末端アミドを有するペ プチドを得ること からなる請求項１記載の方法。
3. ３．アミド化剤がペプチドエステルのＣ−末端エステル基をＣ−末端アミド基に 選択的に転換する酵素からなる請求項２記載の方法。
4. ４．ＮＨ２供給源がアミンであり、酵素がキモトリプシンである請求項３記載の 方法。
5. ５．ＮＨ２供給源がアミンであり、酵素がサーモリシン、パパイン、ペプシンお よびブロメラインからなる群から選択される請求項３記載の方法。
6. ６．ＮＨ２供給源がアミノ酸−アミドであり、酵素がカルボキシペプチダーゼＹ である請求項３記載の方法。
7. ７．エステル化剤がアルコールおよび酸からなる請求項１、３、４または５記載 の方法。
8. ８．Ｃ−末端アミドを有するペプチドがチロトロピン放出ホルモン、オキシトシ ン、バソプレツシン、黄体化ホルモン放出ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン 、ガストリン、ＣＧＲＰ−１、ＣＧＲＰ−２、サブスタンスＰ、セクレチン、サ ケ・カルシトニン、ウナギ・カルシトニン、ニワトリ・カルシトニン、ヒト・カ ルシトニン、成長ホルモン放出ホルモン、血管作用性腸ペプチド、および３アミ ノ酸以上のＣ−末端断片を有する前記ペプチドのいずれかの類似体から選択され る請求項１、３、４または５記載の方法。
9. ９．Ｃ−末端アミドを有するペプチドがアミリンペプチドである請求項１、３、 ４または５記載の方法。
10. １０．アミリンペプチドがヒト・アミリンである請求項９記載の方法。
11. １１．アミリンペプチドがヒト・アミリンの誘導体または類似体であり、Ｃ−末 端アミド基を含有する請求項９記載の方法。
12. １２．（ａ）エステル化剤でペプチドのペプチド酸形態を処理して、Ｃ−末端カ ルボキシル基をエステル化してペプチドエステルを得、（ｂ）アミンおよびアミ ド化剤で工程（ａ）のペプチドエステルを処理し、これによって、Ｃ−末端エス テル基がＣ−末端アミド基に転換されて、Ｃ−末端アミド基を有するペプチドを 得ること を特徴とする、側鎖カルボキシル基を全く有しない、Ｃ−末端アミドを有するペ プチドの製造方法。
13. １３．エステル化剤がアルコールおよび酸からなる請求項１２記載の方法。
14. １４．アミンおよびアミド化剤がメタノール中アンモニアからなる請求項１２ま たは１３記載の方法。
15. １５．アミンおよびアミド化剤が水酸化アンモニウムからなる請求項１２または １３記載の方法。
16. １６．アミンおよびアミド化剤がアンモニア水溶液からなる請求項１２または１ ３記載の方法。
17. １７．Ｃ−末端アミド基を有するペプチドがアミリンペプチドである請求項１２ 〜１６のいずれか１項記載の方法。
18. １８．アミリンペプチドがヒト・アミリンである請求項１７記載の方法。
19. １９．アミリンペプチドがヒト・アミリンの誘導体または類似体であり、Ｃ−末 端アミド基を含有する請求項１７記載の方法。
20. ２０．誘導体または類似体がヒト・アミリンの誘導体または類似体であり、３７ アミノ酸未満の長さである請求項１９記載の方法。
21. ２１．誘導体または類似体がヒト・アミリンの誘導体または類似体であり、３７ アミノ酸の長さである請求項１９記載の方法。
22. ２２．ペプチド酸がアミリン１−３６ｇｌｙ−ＣＯＯＨである請求項６記載の方 法。
23. ２３．ペプチド酸がアミリン１−３６ａｌａ−ＣＯＯＨである請求項６記載の方 法。
24. ２４．（ａ）カルボキシル活性化剤でＣ−末端カルボキシル基を有するペプチド の溶液を処理して、反応中間体を得、 （ｂ）結合条件下、トラッピング剤およびアミン供給源からなるアミド化剤と工 程（ａ）の反応中間体を接触させることを特徴とする、Ｃ−末端アミドを有する ペプチドの製造方法。
25. ２５．活性化剤がカルボジイミドからなる請求項２４記載の方法。
26. ２６．活性化剤が１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイ ミド、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１，３−ジイソプロピルカル ボジイミドおよびカルボニルジイミダゾールから選択される請求項２４記載の方 法。
27. ２７．アミド化剤がアンモニウム＝Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド、アンモニ ウム＝Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、アンモニウム＝Ｎ−ヒドロキシグルタルイ ミド、アンモニウム＝ベンズヒドロキサム酸、およびアンモニウム＝Ｎ−ヒドロ キシピペリジンから選択されるアンモニウム塩からなる請求項２４記載の方法。
28. ２８．カルボキシル活性化剤が１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチ ルカルボジイミドである請求項２７記載の方法。
29. ２９．Ｃ−末端アミドを有するペプチドがアミリンペプチドである請求項２８記 載の方法。
30. ３０．アミリンペプチドがヒト・アミリンである請求項２９記載の方法。
31. ３１．アミリンペプチドがアミリンの誘導体または類似体であり、Ｃ−末端アミ ドを含有する請求項２９記載の方法。
32. ３２．アミリンの誘導体または類似体が３７アミノ酸以下の長さである請求項３ １記載の方法。
33. ３３．アミリンがヒト・アミリンである請求項３１または３２記載の方法。
34. ３４．（ａ）遊離アミン基を可逆的にブロックするアミン−ブロッキング剤でＣ −末端カルボキシル基を有するペプチドの溶液を処理して、アミン−ブロックペ プチドを得、 （ｂ）カルボキシル活性化剤と工程（ａ）のアミン−ブロックペプチドを接触さ せて、反応中間体を得、 （ｃ）結合条件下、トラッピング剤およびアミン供給源からなるアミド化剤と工 程（ａ）の反応中間体を接触させることを特徴とする、Ｃ−末端アミドを有する ペプチドの製造方法。
35. ３５．アミド化剤がアンモニウム＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、アンモニウ ム＝Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、アンモニウム＝Ｎ−ヒドロキシグルタルイミ ド、アンモニウム＝ベンズヒドロキサム酸およびアンモニウム＝Ｎ−ヒドロキシ ピペリジンから選択されるアンモニウム塩からなる請求項３４記載の方法。
36. ３６．ブロッキング基がｔ−ブトキシカルボニル、Ｆｍｏｃ、ベンゾイルおよび アセチルから選択される請求項３４または３５記載の方法。
37. ３７．カルボキシル活性化基が１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチ ルカルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１，３−ジイソプロピル カルボジイミドおよびカルボニルジイミダゾールから選択される請求項３６記載 の方法。
38. ３８．Ｃ−末端アミドを有するペプチドがアミリンである請求項３４または３５ 記載の方法。
39. ３９．カルボキシル活性化基が１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチ ルカルボジイミドである請求項３６記載の方法。
40. ４０．Ｃ−末端アミドを有するペプチドがアミリンペプチドである請求項３４記 載の方法。
41. ４１．（ａ）カルボキシル活性化剤およびトラッピング剤で、ｎ−ｍアミノ酸を 有し、かつ、ブロックされたＮ−末端アミノ基を有するペプチド断片の溶液を処 理し、 （ｂ）結合条件下、ｍアミノ酸を有するペプチドアミド断片と工程（ａ）の溶液 を接触させて、ｎアミノ酸を有するペプチドアミドを得ることを特徴とする、ｎ アミノ酸を有し、かつ、Ｃ−末端アミドを有するペプチドの製造方法。
42. ４２．ペプチドアミド断片が約２０アミノ酸までを有する請求項４１記載の方法 。
43. ４３．ペプチドアミド断片が１〜約５アミノ酸を有する請求項４１記載の方法。
44. ４４．Ｃ−末端アミドを有するペプチドがチロトロピン放出ホルモン、オキシト シン、バソプレツシン、黄体化ホルモン放出ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモ ン、ガストリン、ＣＧＲＰ−１、ＣＧＲＰ−２、サブスタンスＰ、セクレチン、 サケ・カルシトニン、ウナギ・カルシトニン、ニワトリ・カルシトニン、ヒト・ カルシトニン、成長ホルモン放出ホルモン、血管作用性腸ペプチド、および３ア ミノ酸以上のＣ−末端断片を存する前記ペプチドのいずれかの類似体から選択さ れる請求項２９、３７、３９または４３のいずれか１項記載の方法。
45. ４５．Ｃ−末端アミドを有するペプチドがアミリンペプチドである請求項４３記 載の方法。
46. ４６．アミリンペプチドがヒト・アミリンである請求項４１記載の方法。
47. ４７．アミリンペプチドがアミリンの誘導体または類似体であり、Ｃ−末端アミ ドを含有する請求項４５記載の方法。
48. ４８．（ａ）カルボキシル活性化剤でアミリン酸の溶液を処理して、反応中間体 を得、 （ｂ）結合条件下、トラッピング剤およびアミン供給源からなるアミド化剤と工 程（ａ）の反応中間体を接触させることを特徴とするアミリンペプチドの製造方 法。
49. ４９．（ａ）遊離アミン基を可逆的にブロックするアミソ−ブロッキング剤でア ミリン酸の溶液を処理して、アミン−ブロックペプチドを得、（ｂ）カルボキシ ル活性化剤と工程（ａ）のアミン−ブロックペプチドを接触させて、反応中間体 を得、 （ｃ）結合条件下、トラッピング剤およびアミン供給源からなるアミド化剤と工 程（ｂ）の反応中間体を接触させることを特徴とするアミリンペプチドの製造方 法。
50. ５０．アミリンペプチドがヒト・アミリンである請求項４８または４９記載の方 法。
51. ５１．アミリンペプチドがアミリンの誘導体または類似体であり、Ｃ−末端アミ ドを含有する請求項４８または４９記載の方法。