JP2001527507A

JP2001527507A - 改良された環状ｃｒｆ拮抗剤

Info

Publication number: JP2001527507A
Application number: JP51988896A
Authority: JP
Inventors: ジーンイーエフリヴィア
Original assignee: ザソルクインスティテュートフォアバイオロジカルスタディース
Priority date: 1994-12-12
Filing date: 1995-12-08
Publication date: 2001-12-25
Also published as: EP0797593A2; DE69534852D1; ATE319742T1; DE69534852T2; US5663292A; US5844074A; WO1996019499A2; AU4514596A; JP3765831B2; US5874227A; AU4598996A; EP0800532B1; CA2207576A1; CA2206059A1; EP0800532A1; WO1996019499A3; WO1996018649A1; JPH10511086A; AU701699B2

Abstract

(57)【要約】下記のアミノ酸配列を有する新規なCRF拮抗剤環状ペプチド。(シクロ30-33)Y-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Nle-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-R₃₀-Ala-R₃₂-R₃₃-Asn-Arg-Lys-Leu-Nle-Glu-Ile-Ile-NH₂、式中、YはAc、H、Ac-Thr又はH-Thrであり;R₃₀はGlu又はCysであり;R₃₂はHis又は好ましくはD-His又はD-Argのような塩基性及び／又は芳香族D-アミノ酸であり;R₃₃はLys、Orn又はCysである。Ｎ末端はLeu又はAsp-Leuで伸長することができる。標識を容易にするために、Leu²⁷をCMLに置換することができ、D-PherをD-Tyrに置換することができる。二環式ペプチドをつくるために、Arg²³をLysに置換し、その側鎖をGlu²⁰にラクタム架橋で結合することができる。開示されたCRF拮抗剤としては下記のペプチドを挙げられる。(シクロ30-33)[D-Phe¹²，Nle^21,38，Glu³⁰，Lys³³]r/hCRF(12-41);(シクロ30-33)[Ac-Thr¹¹，D-Phe¹²，Nle^21,38，Glu³⁰，Lys³³]r/hCRF(11-41);(シクロ30-33)[D-Phe¹²，Nle^21,38，Cys^30,33]r/hCRF(12-41);(ビシクロ20-23,30-33)[D-Phe¹²，Nle^21,38，Lys^23,33，Glu³⁰]r/hCRF(12-41);(シクロ30-33)[D-Phe¹²，Nle^21,38，Glu³⁰，D-His³²，Lys³³]r/hCRF(12-41);(シクロ30-33)[D-Phe¹²，Nle^21,38，CML²⁷，Glu³⁰，D-His³²，Lys³³]r/hCRF(12-41);及び(シクロ30-33)[D-Phe¹²，Nle^21,38，Glu³⁰，D-Arg³²，Lys³³]r/hCRF(12-41)。(シクロ30-33)[I¹²⁵D-Tyr¹²，Nle^21,38，Glu³⁰，D-His³²，Lys³³]r/hCRF(12-41)のような標識拮抗剤は、薬剤スクリーニング分析に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】改良された環状ＣＲＦ拮抗剤本発明は、一般的には、ペプチド及びそのペプチドを用いて哺乳動物を薬剤治療する方法に関する。更に詳細には、本発明は、CRFヘンテトラコンタペプチドの環状拮抗剤及びCRF様ペプチドの大ファミリーの一員、その環状CRF拮抗剤を含む医薬組成物、その環状CRF拮抗剤を用いて哺乳動物を治療する方法並びにそのペプチドを用いて新規な薬剤をスクリーニングする方法に関する。発明の背景視床下部が腺下垂体の副腎皮質細胞の分泌機能の調節に重要な役割を果たすという概念は、実験及び臨床所見から支持されてきた。４０年以上前に、視床下部に存在する因子が、試験管内でインキュベートされたか又は有機培養内で維持された場合の下垂体によりACTHの分泌速度を高めることが証明された。しかしながら、1981年にヒツジCRF(oCRF)が確認されるまで生理的コルチコトロピン放出因子(CRF)は確認されなかった。米国特許第4,415,558号に開示されるように、oCRF は41残基アミド化ペプチドであることがわかった。oCRFは、哺乳動物において末梢に注入された場合に血圧を低下させ、ACTH及びβ−エンドルフィンの分泌を促進させる。後に、ラットCRF(rCRF)が単離、精製及び確認され、米国特許第4,489,163号に記載された相同アミド化ヘンテトラコンタペプチドであることがわかった。そこで、ヒトCRFのアミノ酸配列がrCRFと同じであることが決定された。rCRFとhCRF は、同じ意味に用いられ、呼称r/hCRFはそのペプチドホルモンに関してよく用いられている。それらのペプチドホルモンは、哺乳動物と魚類のCRF、ウロテンシン及びソーバジンを含む未変性CRF様ペプチドの大ファミリーの一部及び類縁体をなすと考えられ、Valeら，“Characterization of the Hypothalamic Peptide :Corticotropin Releasing Factor”，自然活性及び生物活性に関する内藤国際シンポジウムの議事録，日本，東京，1985年11月5-7日及びLederisら，“Neuroh ormones from Fish Tails，II:Actions of Urotensin I in Mammals and Fishes”，Recent Progress in Hormone Research，Vol．41，Academic Pre ss，Inc．(1985)に論じられている。はじめはその視床下部下垂体−副腎(HPA)軸における役割に基づいて単離及び確認されたが、CRFはパラ分泌調節物質又は神経伝達物質として作用することができる、中枢神経系及び副腎、胎盤及び睾丸のような神経外組織全体に広く分布されていることがわかった。更に、不安、うつ病、アルコール依存症及び神経性食欲不振症のような情動障害並びに生殖及び免疫応答をモジュレートすることと CRFとの関係は、CRF発現の変化が重要な生理学的及び病理生理学的結果になることを示している。例えば、HPA軸を含む調節ループにおける摂動は永続的に高レベルの循環グルココルチコイドをしばしば生じ、そのような患者は中心性肥満、筋力低下及び生殖能力低下を含むクッシング症候群の肉体的性質を呈する。視床下部−下垂体−副腎の活性化を仲介することでの役割のほかに、CRFはストレス応答中に生じるものがある自律神経と行動の変化をモジュレートすることがわかった。それらの行動の変化の多くは、デキサメタゾン治療によって再現されずかつ下垂体切除に感受性がないという点でHPA活性化から独立して起こることがわかった。更に、CRFをCNSへ直接注入すると種々のストレス要因に対する自律神経と行動の応答がよく似ている。CRF又はCRF拮抗剤の末梢投与がそれらの変化に影響しないものがあることから、CRFは食欲減退、覚醒及び学習能力の亢進を含む機能に対して直接脳に作用すると考えられる。しかしながら、末梢に投与されたCRF拮抗剤は、ACTH分泌のストレス仲介亢進を減じ、脳室に送達された場合には自律神経活性及び行動のストレス誘発変化を軽減する。 CRFの広範囲の解剖学的分布及び多数の生物学的作用の結果として、その調節ペプチドは多数の生物学的過程の調節に関係があると思われる。CRFは、また、炎症応答の調節にも関係があった。ある動物モデルにおいてCRFは前炎症の役割を果たすことが認められたが、ほかのものでは血管透過性の損傷誘導亢進を低下させることにより炎症を抑えることがわかる。 αヘリックス形成ポテンシャルの高いCRF類縁体は、1984年のはじめごろに開発された。それは、一般的にはAHC(αヘリックスCRF)と呼ばれる41残基アミド化ペプチドであり、米国特許第4,594,329号に記載されており、いまではCRF様ペプチドの全ファミリーの一員であると考えられている。米国特許第5,278,146 号に示されるようなα−アミノ酸のD-異性体を含む他のCRF類縁体も開発された。合成r/hCRF及びAHCは、全てACTH及びβ−エンドルフィン様活性（β−END-Li ）を試験管内及び生体内で促進し、末梢に注入された場合に血圧をかなり低下させる。それらの３種類のペプチド並びにソーバジン及びウロテンシンの拮抗剤は、1986年８月12日に発行された米国第4,605,642号に開示されている。生物作用能を示す環状CRF拮抗剤も以前に開発され、米国特許第5,245,009号（1993年９月 14日）に開示されている。上記の発見以来、CRF拮抗剤改良のための探索が続けられている。発明の要約そこで、既知のCRF拮抗剤に比べて生物活性が長時間持続しかつ増大したCRF拮抗剤ペプチドが発見され、その多くは実質的にCRFアゴニスト活性が残らない。更に、中性水溶液、例えば、生理的ｐＨにおける溶解度が高く、レセプター親和性が高い。 CRF様ペプチドのファミリーの一員のいずれもが既知のCRFレセプターを著しく活性化させずにそれに強く結合してレセプターでのCRFの作用を遮断する極めて生物作用能のあるCRF拮抗剤をつくるために修飾されることが示される。その修飾としては、未変性及び他の分子をＮ末端で短くして長さが30〜33残基にすること、例えば、r/hCRF(12-41)及び環化結合、好ましくはラクタムを組込みＣ末端残基から８番目と11番目の残基の位置にある残基の側鎖を結合すること、例えば、(シクロ30-33)[Glu³⁰，Lys³³]r/hCRF(12-41)が含まれる。後者の環化修飾は、匹敵する線状ペプチドの生物作用能を予想外にかなり大幅に向上させ、これは一般的にＣ末端残基から９番目の残基として、即ち、CRFの32位に存在するものに無関係に言えることであるのでかかる残基については幅がある。しかしながら、 D-異性体α−アミノ酸がその位置によく許容されることがわかり、その残基としてD-異性体、好ましくは塩基性及び／又は芳香族アミノ酸のD-異性体の任意の組込み、例えば、(シクロ30-33)[Glu³⁰，D-His³²，Lys³³]-r/hCRF(12-41)がその類縁体の生物作用能を更に改善させることがよくある。CRF様ペプチドのファミリーは、CRFレセプターに結合しかつヒツジCRF、単離及び確認された最初の哺乳動物CRFと少なくとも約45％アミノ酸構造相同であるペプチドを包含すると考えられる。CRF様ファミリーとしては、次の既知のペプチド:ヒツジCRF、ラット／ヒトCRF、ブタCRF、ウシCRF、魚類CRF、αヘリックスCRF(AHC)、コイウロテンシン、サッカーウロテンシン、シタビラメウロテンシン、カレイウロテンシン及びソーバジンが挙げられるがこれらに限定されない。かかるCRF拮抗剤ペプチドは、次の一般式：（AはCRF様ファミリーの使用ペプチドの対応する部分の18〜21アミノ酸残基の配列であり、Xaa_cは環化結合で結合される側鎖を有するアミノ酸残基である）で同定される。Xaaは、α−アミノ酸、好ましくはCys以外の天然α−アミノ酸残基とすることができ、更に好ましくは、CRF様ファミリーのその使用ペプチドの配列のその位置を通常占めるAlaのようなものであるがD-異性体、例えば、D-Alaとすることもできる。D-XaaはD-異性体α−アミノ酸が好ましく、芳香族及び／又は塩基性であるがCys以外のα−アミノ酸のD-異性体、又はL-異性体であってもよい、例えば、Asn又はD-Asn。Bは、CRF様ファミリーのその使用ペプチドのＣ末端部分の最後の８アミノ酸残基の配列である。従って、かかるペプチドは、CRF様ファミリーペプチドのＣ末端30残基配列の修飾転換物であり、Ｎ末端で１、２又は３残基だけ伸長されることがわかる。この10年間にわたって開発されたことの結果としてCRF拮抗剤の分野で現在周知であるような置換もその修飾環状ペプチドにおいて行われ、例えば、Met又はLeuのNleによる置換が好ましく行われるが、それらの残基は相互に等価物であると考えられる。好ましくは、D-Phe或いはD -Leuは、Phe或いはLeuが天然ペプチドに存在する拮抗剤ペプチドのＮ末端に又はその近傍に存在しなければならない。上に示されたように、それらのペプチドは、哺乳動物CRFの30〜33位である残基間に環化結合を有し、20〜23位の残基間に第２のそのような結合があってもよい。それらの結合のいずれか一方又は双方は２つのCys残基間のジスルフィド結合とすることができるが、各々が側鎖のカルボキシル基とアミノ基間のアミド結合（又はラクタム架橋）であることが好ましい。最も好ましくは、30位の残基の側鎖カルボキシル基、好ましくはGluと33位の残基の側鎖アミノ基、好ましくはL ys又はOrn間のラクタム架橋がある。また、CRF様ファミリーの天然に存在する残基、即ち、His，Gly，Leu，Gln及びAlaはCRFの32位に相当するその位置に存在することができるが、ここにはα−アミノ酸が許容される。しかしながら、そのラクタム架橋によって結合された残基間の領域内の32位に塩基性及び／又は芳香族D-異性体残基又は等価物があることが好ましい、例えば、D-His、D-Arg、D- Tyr、imBzlD-His、D-Nal、D-Pal、D-Dpr(Nic)、D-Dpr(イソプロピル)、D-Aph、D -Amp、D-Har、D-Agl(Nic)、D-Lys(イソプロピル)、D-Orn、D-Dbu、D-Dpr、D-Hly 、D-Hly(Nic)、D-Orn(Nic)、D-Orn(イソプロピル)、D-(アルキル)Arg、D-(ジアルキル)Arg、D-Lys(Nic)、D-(ジアルキル)Har又は匹敵するD-異性体。しかしながら、D-Ala、D-Glu、D-Asn、Aib、Asn、Pal、Nal、Phe及びTyrのような他の種々の残基も存在させることができる。第２環化結合の選択が組込まれる場合、20 位のGluと23位のLys間のラクタム架橋が最も好ましい。D-異性体は、22位に含まれてもよい。これらのペプチドは、また、12位にD-Phe、D-Tyr又はD-Leu又は等価D-異性体、例えばD-Cpa、D-2Nal又はD-3Palの好ましい任意の置換があり、例えば、21及び38位に天然に存在するMetを置換したノルロイシンがある。ペプチドを標識することが所望される場合にはD-Tyr¹²が好ましく、D-Tyrが¹²⁵Iで標識される場合には一般的には更に安定な構造等価物であると考えられるのでHis³²又はD-His³² をAsn，D-Asn又はD-Alaに、Lys³⁶をArgに置換することが好ましい。他の任意の置換も、以前に教示されたように分子全体に行われ、後に記載される特定のペプチドの機能上の等価物であると考えられる。例えば、27位のLeu残基はα炭素原子上のメチル基、即ち、CMLで置換され、CML²⁷が好ましい。CRF分子全体、例えば14位、15位、19位及び37位の他のLeu残基はCMLで置換されてもよく、CML¹⁷を存在させることもできる。単独及び前述の置換と組合わせたかかる置換は、共に生物作用能を増強し及び／又は作用の持続期間を延ばすと考えられるが、個々の効果は30〜33側鎖架橋或いはかかる架橋と32位の適切なD-異性体との組合わせよりはるかに小さいと思われる。前に示されたように、これらの改良されたCRF拮抗剤は、未変性CRF様ペプチド又はその類縁体のＮ末端を短くしかつ所望の置換を組込むことによりつくられる。好ましくは、未変性分子のＮ末端から始まる8〜11残基の配列が削除される。例えば、哺乳動物CRFが短縮される場合、得られた分子はそれに応じてCRF(9-41) 、CRF(10-41)、CRF(11-41)又はCRF(12-41)と呼ばれ、CRF(11-41)及びCRF(12-41) 類縁体が好ましい。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容しうる液体又は固体担体に分散されるかかるCRF拮抗剤又はその非毒性付加塩が含まれる。かかる製剤は、生理的pHにおける溶解度が高いことから便利である。本発明によれば、かかるペプチド又はその薬学的に許容しうる付加塩の哺乳動物、特にヒトへの投与は、プロオピオメラノコルチン(POMC)遺伝子のACTH、β−エンドルフィン、β−リポトロピン、コルチコステロン及び他の産物の分泌の調節及び／又は気分、行動及び胃腸作用及び自律神経系活性に働きかけるために行われる。例えば、それらのCRF拮抗剤は、高ACTHレベルを低下させてストレス誘発うつ病及び不安のようなストレス関連病を治療するために、静脈内に注射される場合に血圧を上げるために、胃腸管への血流を減じるために、即ち、特に腹部の腸症候群及び胃腸病に罹っている患者を治療するために、及び炎症疾患;免疫抑制；ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染症; アルツハイマー病；神経性食欲不振症；出血性ストレス；薬剤及びアルコール離脱症状群；薬物依存、及び不妊症を治療するために投与される。本ペプチドは、また、CRFレセプターに対する親和性が高いことからCRFレセプターに結合及び／又はそれを活性化する更に強力な分子を薬剤スクリーニングする有効な方法の基準となる。好適実施態様の詳細な説明ペプチドを定義するために用いられる命名法は、Schroder & Lubke，“The Pe ptides”，Academic Press(1965)に明記されており、慣用的表記によればアミノ基は左に、カルボキシル基は右にある。標準の３文字略号は、α−アミノ酸残基を確認するために用いられ、アミノ酸残基は異性体形をとり、特にことわらないかぎりアミノ酸のＬ形である。例えば、Ser=L-セリン、Orn=L-オルニチン、Nle= L-ノルロイシン、Nva=L-ノルバリン、Agl=アミノグリシン、Abu=L-2-アミノ酪酸、Dbu=L-2,4-ジアミノ酪酸、Dpr=L-2,3-ジアミノプロピオン酸、Hly=L-ホモリシン及びHar=L-ホモアルギニン。更に、次の略号が用いられる。 CML=CαCH₃-L-ロイシン;Aib=-10CaCH₃-L-アラニン又は2-アミノイソ酪酸; Nal=L-β-(1-又は2-ナフチル)アラニン;Pal=L-β-(2-,3-又は4-ピリジル)アラニン;Cpa=L−(2-、3-、又は4-クロロ)フェニルアラニン;Aph=L-（2-、3-、又は4- アミノ）フェニルアラニン;Amp=（2-、3-、又は4-アミノメチル）フェニルアラニン;imBzlHis=イミダゾールベンジルヒスチジン;及びNic=3-カルボキシピリジン（又はニコチン酸）。一般的には、本CRF拮抗剤は12位（ペプチドが伸長されなければＮ末端である）にD-異性体が含まれ、好ましくは32位にD-異性体が含まれ、次のアミノ酸配列を有するか又はその非毒性等価塩である。（YはH又は炭素原子12個まで、好ましくは炭素原子１〜７個を有するアシル化剤、例えばAc、For、Acr又はBzであり;R₁₃はHis、Tyr又はGluであり;R₁₄はCML又は Leuであり;R₁₅はLeu又はCMLであり;R₁₇isGlu、CML、Asn又はLysであり;R₁₈iはVa l、Nle又はMetであり;R₁₉はLeu、CML、Ile、Ala又はAibであり;R₂₀はGlu、D-Glu 、Cys又はHisであり;R₂₂はAla、D-Ala、Aib、Thr、D-Thr、Glu又はD-Gluであり; R₂₃はArg、Cys、Orn又はLysであり;R₂₄はAla又はAlbであり;R₂₅はGlu又はAspであり;R₂₆はGln、Asn又はLysであり;R₂₇はLeu又はCMLであり;R₂₈はAla又はAlbであり;R₂₉はGln、Aib又はGluであり;R₃₀はGlu又はCysであり;R₃₁はAla又はAibであり;R₃₂はHis、D-His、又はCys以外のα−アミノ酸のD-又はL-異性体であり;R₃ ₃ はLys、Orn又はCysであり;R₃₄はAsn又はAibであり;R₃₆はLys、Orn、Arg、Har又はLeuであり;R₃₇はCML、Leu又はTyrであり;R₃₉はGlu、Aib又はAspであり;R₄₀はI le、Aib、Thr、Asn、Glu、Ala、Val、Leu、Nle、Phe、Nva、Gly又はGlnであり;R₄₁ はAla、Ile、Gly、Val、Leu、Nle、Phe、Nva又はGlnであり;Thrのような単一アミノ酸、Leu-Thrのようなジペプチド、Asp-Leu-ThrのようなトリペプチドはＮ末端に含まれてもよく;D-Phe₁₂はD-Leu、D-Tyr、D-Cpa、D-Nal又はD-Palのような他のD-アミノ酸、又はPhe又はTyrで置換することができる;但し、R₃₀がGluである場合、R₃₃はLys又はOrnであり、R₃₀ がCysである場合、R₃₃はCysであり;第２環化結合はR₂₀とR₂₃間に存在することができる。）Ｎ末端のかかる任意のアシル化の代わりとして、スルホンアミドが形成されるか、又は糖質又は脂質が作用の持続期間及び溶解度をモデュレートするために付加される。前に示されたように、32位における残基の選定に幅があり、 R₃₂に適切な追加の残基の例としてはAsn、Har、Arg、Nal、imBzlHis、Tyr、Ala 、Leu、Val、Ser、Thr、Cpa、Pal、Lys、Phe及びGlnのD-及びL-異性体、並びにA ib、Gly、D-Dpr(Nic)、D-Dpr(イソプロピル)、D-Aph、D-Amp、D-Lys(Nic)、D-Ag l(Nic)、D-Hys(イソプロピル)、D-Orn、D-Dbu、D-Dpr、D-Hly、D-Hly(Nic)、D-O rn(Nic)、D-Orn(イソプロピル)、D-(アルキル)Arg、D-(ジアルキル)Arg又はD-( ジアルキル)Harが挙げられる。第２環化結合が存在する場合には、両結合がCys- Cysであることは好ましくない。好ましいCRF拮抗剤の他の群は、次のアミノ酸配列（その非毒性塩を含む）を有する。（YはAc又は水素であり;R₁₂はD-Phe又はD-Tyrであり;R₁₃はHis、Tyr又はGluであり;R₁₄はLeu又はCMLであり;R₁₅はLeu又はCMLであり;R₁₇はGlu又はCMLであり;R₁₈ はVal、Nle又はMetであり;R₁₉はLeu又はCMLであり;R₂₀はHis、Cys又はGluであり ;R₂₂はAla、D-Ala、Aib、Thr、Asp又はGluであり;R₂₃はArg、Cys、Orn又はLysであり;R₂₄はAla又はAibであり;R₂₅はAsp又はGluであり;R₂₆はGln、Asn又はLysであり;R₂₇はLeu又はCMLであり;R₂₈はAla又はAibであり;R₂₉はGln、Aib又はGluであり;R₃₀はGlu又はCysであり;R₃₁はAla又はAibであり;R₃₂はHis、D-His、Aib、D -Arg、D-2Nal、D-3Pal、imBzlD-His、Gly、Tyr、D-Tyr、Leu、D-Leu、Ala又はD- Alaであり;R₃₃はLys、Orn又はCysであり;R₃₄はAsn又はAibであり;R₃₆はLys、Orn 、Arg、Har又はLeuであり;R₃₇はCML、Leu又はTyrであり;R₃₉はGlu、Alb又はAsp であり;R₄₀はIle、Aib、Thr、Glu、Asn又はGlnであり;R₄₁はAla、Ile、Val又はP heであり;Thr、Leu-Thr又はAsp-Leu-ThrはＮ末端に含まれてもよい;但し、 R₃₀がGluである場合、R₃₃はLys又はOrnであり、R₃₀がCysである場合、R₃₃はCys であり;第２環化結合はR₂₀とR₂₃間に存在させることができる。）好ましいCRF拮抗剤の別の群は、次のアミノ酸配列（その非毒性塩を含む）を有する。（YはAc又はHであり;R₁₂はD-Phe又はD-Tyrであり;R₁₈はVal又はNleであり;R₁₉は CML、Leu、Ile、Ala又はAibであり;R₂₀はGlu、D-Glu、Cys又はHisであり;R₂₁はN le又はMetであり;R₂₂はAla、D-Ala、Aib又はThrであり;R₂₃はArg、Cys、Orn又は Lysであり;R₂₄はAla又はAibであり;R₂₅はAsp又はGluであり;R₂₇はLeu又はCMLであり;R₂₈はAla又はAibであり;R₃₀はGlu又はCysであり;R₃₁はAla又はAibであり;R₃₂ はD-His、imBzlD-His、D-Arg、D-2Nal、又は他の塩基性及び／及び芳香族α− アミノ酸のD-異性体であり;R₃₃はLys、Orn又はCysであり;R₃₄はAlb又はAsnであり;R₃₉はGlu又はAspであり;R₄₁はAla又はIleであり;Thr、Leu-Thr又はAsp-Leu-T hrはＮ末端に含まれてもよい;但し、第２環化結合はR₂₀とR₂₃間に存在することができる。）ペプチドがr/hCRFに極めて似ていることが所望される場合、次の選定の全部又は大部分が組込まれる。R₁₈はValであり、R₂₂はAlaであり、R₂₃はArg であり、R₂₄はAlaであり、R₂₅はGluであり、R₂₈はAlaであり、R₃₉はGluであり、 R₄₁はIleである。更に好ましい拮抗剤の群は、r/hCRF及びoCRFの配列によるものであり、この10 年にわたって行われた合成のために、ヒツジCRFに対応する位置の残基のいずれもが生物作用能を著しく変えずにr/hCRFのアミノ酸配列に置換されることが同様に示された。その群は、次のアミノ酸配列（その非毒性塩を含む）を有する。（YはAc、H、Ac-Thr又はH-Thrであり;R₁₈はVal又はNleであり;R₂₀はGlu、D-Glu 、Cys又はHisであり;R₂₂はAla、D-Ala又はThrであり;R₂₃はArg、Cys、Orn又はLy sであり;R₂₅はAsp又はGluであり;R₂₉はGln又はGluであり;R₃₀はGlu又はCysであり;R₃₂はHis、D-His 、D-Arg、imBzlD-His、D-Nal、D-Glu、D-Ala、D-Pal、D-Dpr(Nic)、D-Dpr(イソプロピル)、D-Aph、D-Amp、D-Har、D-Agl(Nic)、D-Lys(イソプロピル)、D-Orn、 D-Dbu、D-Dpr、D-Hly、D-Hly(Nic)、D-Lys（Nic）、D-Orn(Nic)、D-Orn(イソプロピル)、D-(アルキル)Arg、D-(ジアルキル)Arg又はD-(ジアルキル)Harであり;R₃₃ はLys、Cys又はOrnであり;R₃₄はAsn又はAibであり;R₃₆はLys又はLeuであり;R₃ ₉ はGlu又はAspであり;R₄₀はIle又はGluであり;R₄₁はIle又はAlaであり;Leu又はA sp-LeuはＮ末端でThrに結合されてもよい;但し，R₃₀がCysである場合、R₃₃はCys であり;R₃₀がGluである場合にはR₃₃はOrn又はLysであり;Ｎ末端のD-PheをD-Tyr 又はD-Leu又はPheに置換することができ、第２環化結合はR₂₀とR₂₃間に存在することができる。）特に好ましいCRF拮抗剤の群は、次のアミノ酸配列（その非毒性塩を含む）を有する。（YはAc、H、Ac-Thr又はH-Thrであり;R₁₂はD-Phe又はD-Tyrであり;R₂₃はArg又は Lysであり;R₃₀はCys又はGluであり;R₃₃はCys、Lys又はOrnであり;Leu又はAsp-Le uはＮ末端に含まれてもよく、His³²はD-His、imBzlD-His、D-Arg、D-Tyr、D-Nal 、D-Pal、D-Asn、D-Lys、D-Dpr(Nic)、D-Dpr(イソプロピル)、D-Aph、D-Amp、D- Har、D-Phe、D-Cpa、D-Agl(Nic)、D-Lys(イソプロピル)、D-Orn、D-Dbu、D-Dpr 、D-Hly、D-Hly(Nic)、D-Orn(Nic)、D-Orn(イソプロピル)、D-(低級アルキル)Ar g、D-Lys(Nic)、D-(低級アルキル)Amp、D-(低級ジアルキル)Arg又はD-(低級アルキル)Harで置換されてもよく、好ましくは置換される;但し、R₃₀がCysである場合、R₃₃はCysであり、R₃₀がGluである場合、R₃₃はLys又はOrnであり;第２環化結合はGlu₂₀とR₂₃間に存在することができる。）高ACTHレベルを低下させかつ血圧を上げるという観点から特に生物作用能があるとみなされるその群の個々の類縁体は、次のものである。 D-Tyr¹²が存在する場合、ペプチドは¹²⁵Iを用いて便利に放射能標識される。他の特に好ましいCRF拮抗剤の群は、次のアミノ酸配列（その非毒性塩を含む）を有する。（YはAc、H、Ac-Thr又はH-Thrであり;R₁₂はD-Phe又はD-Tyrであり;R₁₄、R₁₅、R₁ ₉ 、R₂₇及びR₃₇は独立してLeu又はCMLであり;R₁₇はGlu又はCMLであり;R₂₃はArg又はLysであり;R₃₀はGlu又はCysであり;R₃₂はD-His、imBzID-His、D-Arg、D-Asn、 D-Tyr、D-Pal、D-Nal又は他の塩基性及び／又は芳香族D-異性体α−アミノ酸であり;R₃₃はLys、Orn又はCysであり;Leu又はAsp-LeuはＮ末端でThrに結合されてもよく、R₁₄、R₁₅、R₁₇、R₁₉、R₂₇及びＲ₃₇の少なくとも１つはCMLである;但し、R₃₀がCysである場合、R₃₃はCysであり、R₃₀がGluである場合、R₃₃はLys又はOr nである。）高ＡＣＴＨレベルを低下させかつ血圧を上げるという観点から特に生物作用能があるとみなされるその群の個々の類縁体は、次のものである。本ペプチドは、固相法のみ、部分的固相法、フラグメント縮合又は古典的溶液添加のような適切な方法によって合成される。種々のアミノ酸部分の不安定な側鎖基を化学反応がその位置で起こらないように最後に除去されるまで防止する適切な保護基で保護することはペプチドの化学合成に共通している。通常、アミノ酸又はフラグメント上のα−アミノ酸を、その物質がカルボキシル基で反応する間保護し、引き続き、そのα−アミノ保護基を選択的に除去して次の反応をその位置で行わせることも共通している。従って、合成の工程として、ペプチド鎖内の所望の配列に位置したアミノ酸残基の各々を含み、種々のそれらの残基が側鎖保護基を有する中間体化合物が生成されることは共通している。例えば、１つの好ましい群からのペプチド類縁体の化学合成は、はじめに次のアミノ酸配列の中間体の形成が含まれる。 X¹は水素又はα−アミノ酸保護基である。X¹によって企図されるα−アミノ保護基は、ポリペプチドの段階的合成の技術において有用であることが既知であるものである。X¹によって包含されるα−アミノ保護基の種類は、（1）Ｎ末端にのみ用いられることが好ましいアシル型保護基、例えば、ホルミル(For)、アクリリル(Acr)、ベンゾイル(Bz)及びアセチル(Ac);（2）芳香族ウレタン型保護基、例えば、ベンジルオキシカルボニル(Z)及び置換Z、例えば、p-クロロベンンジルオキシカルボニル、p-ニトロベンジルオキシカルボニル、p-ブロモベンジルオキシカルボニル、p-メトキシベンジルオキシカルボニル;（3）脂肪族ウレタン保護基、例えば、t-ブチルオキシカルボニル(BOC)、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル;（4）シクロアルキルウレタン型保護基、例えば、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、及びシクロヘキシルオキシカルボニル;及び(5)チオウレタン型保護基、例えば、フェニルチオカルボニルである。BOC及びFmocが２つの好ましい α−アミノ保護基である。 X²は、Thr及びSerのヒドロキシル基の保護基であり、アセチル(Ac)、ベンゾイル(Bz)、tert-ブチル、トリフェニルメチル（トリチル）、テトラヒドロピラニル、ベンジルエーテル(Bzl)及び2,6-ジクロロベンジル(DCB)からなる種類から選ばれることが好ましい。最も好ましい保護基はBzlである。X²は水素であることができ、ヒドロキシル基上に保護基がないことを意味する。 X³はArg又はHarのグアニジノ基の保護基であり、ニトロ、p-トルエンスルホニル(Tos)、Z、アダマンチルオキシカルボニル及びBOCからなる種類から選ばれることが好ましく、又は水素である。Tosが最も好ましい。 X⁴は水素又はAsn又はGlnのアミド基に対する保護基、好ましくはキサンチル（ Xan）である。Asn又はGlnは、ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)の存在下に側鎖保護なしで結合されることがよくある。 X⁵は水素又はAsp又はGluのβ−又はγ−カルボキシル基に対するエステル形成保護基であり、シクロヘキシル(OChx)、ベンジル(OBzl)、2,6-ジクロロベンジル、メチル、エチル及びt-ブチル(Ot-Bu)のエステルより選ばれることが好ましい。BOC方策に対してOChxが好ましい。 X⁶は水素又はLys又はOrnの側鎖アミノ置換基の保護基である。適切な側鎖アミノ保護基の具体例は、Z、2-クロロベンジルオキシカルボニル(2Cl-Z)、Tos、t- アミルオキシカルボニル(Aoc)、BOC及び上に示された芳香族又は脂肪族ウレタン型保護基である。BOC方策に対して2Cl-Zが好ましい。 Hisが存在する場合、X⁷は水素又はTos又は2,4-ジニトロフェニル(DNP)のようなイミダゾール窒素の保護基であり、Tyrが存在する場合、X⁷は水素又はDCBのようなヒドロキシル基の保護基である。Metが存在する場合、イオウは場合によっては酸素で保護される。 X⁸はCysのスルフヒドリル基の保護基、好ましくはp-メトシキベンジル(MeOBzl) 、p-メトキシベンジル、アセトアミドメチル、トリチル又はBzl;又は保護基X⁶を同時に除去せずに除去可能なアミノ側鎖の適切な保護基、例えば、Fmocのような塩基不安定基;又は保護基X⁵を同時に除去せずに除去可能なカルボキシル側鎖の適切な不安定保護基、例えばOFm(フルオレニルメチルエステル）のような塩基不安定基である。また、環状形がCys-Cys結合に等価であると考えられるカルバ又はジカルバから生じるといった場合には、30位と33位の残基間、又は20位と23位の残基間の直接結合とすることができる。側鎖アミノ保護基の選定は、合成中のα−アミノ基の脱保護で除去されないものでなければならない以外は重要ではない。従って、α−アミノ保護基と側鎖アミノ保護基は同じであるはずはない。 X⁹はNH₂、エステルのような保護基又は固体樹脂支持体、好ましくは次のアミノ酸配列によって示されるもの:-NH-ベンズヒドリルアミン(BHA)樹脂支持体及び -NH-パラメチルベンズヒドリルアミン(MBHA)樹脂支持体に結合する固相合成に用いられる固定結合である。BHA又はMBHA樹脂からの切断は、CRF類縁体アミドを直接与える。かかる樹脂のメチル誘導体を用いることによりメチル置換アミドがつくられ、等価物であると考えられる。中間体のアミノ酸配列において、X¹、X²、X³、X⁴、X⁵、X⁶、X⁷及びX⁸の少なくとも１種は保護基であり、X⁹は樹脂支持体も含まれる。各R基に対して選ばれる個々のアミノ酸は、上で示され当該技術において一般に既知であるように結合される保護基があるかを決定する。ペプチドの合成に用いられるべき個々の側鎖を選定するにあたり、次のルールを伴う。（a）保護基は合成の各工程でα−アミノ保護基を除去するために選定される試薬及び反応条件下に安定でなければならない、(b)保護基は保護特性を保持しなければならず、カップリング条件下に分離してはならない、(c)側鎖保護基はペプチド鎖を変えない反応条件下に所望のアミノ酸配列を含む合成の完了時に除去可能でなければならない。Ｎ末端が修飾される場合、Yで表された炭素原子12個以下を有するアシル基が存在することが好ましく、アセチル(Ac)、ホルミル(For)、アクリリル(Acr)及びベンゾイル(Bz)が好ましいアシル基である。しかしながら、Yは適切な糖質又は脂質とすることもでき、一般的には等価物であると考えられる。従って、１態様においては、下記の工程を含む化合物の製造方法が提供される。（a）上で定義された少なくとも１種の保護基を有するペプチド中間体（X¹、X² 、X³、X⁴、X⁵、X⁶、X⁷及びX⁸は各々水素又は保護基であり、X⁹は保護基又は樹脂支持体又はNH₂に対する固定結合である）を形成する工程、（b）特に既に形成されなかった場合には環化結合を形成する工程、（c）前記ペプチド中間体から保護基又は固定結合を分離する工程、（d）この時に環化結合を任意に形成する工程、及び(e)場合によっては、得られたペプチドをその非毒性付加塩に変換する工程。ペプチドは、Merrifield，J ．Am．Chem．Soc.，85，ｐ2149(1964)に記載されるような固相合成を用いて調製されることが好ましい。即ち、CRF拮抗剤ペプチドは、端的な方法で調製され、生物活性が簡便に試験される。これにより、用時調製及びCRF拮抗剤ペプチドの評価が容易になる。固相合成は、Rivierらの1981 年１月21日に発行された米国特許第4,244,946号に一般的に示されるようにペプチドのＣ末端から保護α−アミノ酸を適切な樹脂にカップリングすることにより始められる。ヒトCRFに基づく拮抗剤のかかる出発材料は、α−アミノ保護Ileを MBHA樹脂に結合することにより調製される。 BOCで保護されたIleは、塩化メチレン及び／又はジメチルホルムアミド（DMF ）及び／又はN-メチルピロリドン(NMP)を用いてBHA樹脂に結合される。BOC-Ile を樹脂支持体に結合した後に、塩化メチレン中トリフルオロ酢酸(TFA)、TFAのみ又はジオキサン中HCIを用いるようにα−アミノ保護基が除去される。好ましくは、塩化メチレン中50容量％ TFAが０〜５重量％の1,2エタンジチオールと共に用いられる。脱保護は、約０℃〜室温で行われる。個々のα−アミノ保護基を除去するための他の標準切断試薬及び条件は、Schroder & Lubke，“The Peptides”，Vol．1，72-75(Academic Press 1965)及び周知のバラニー−メリフィールドテキストに記載されるように用いられる。 Ileのα−アミノ保護基を除去した後、残りのα−アミノ酸と側鎖保護アミノ酸が上で定義された中間体化合物を得るために所望の順序で段階的に結合される。合成において各アミノ酸を別個に付加する代わりとして、固相反応器に添加する前に相互に結合されるものもある。適切なカップリング試薬の選定は、当該技術の範囲内である。N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)及びN,N’-ジイソプロピルカルボジイミド(DICI)がカップリング試薬として特に適切である。ペプチドの固相合成に有用な活性化試薬又はカップリング試薬は、ペプチド技術において周知である。適切な活性化試薬の例は、N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド及びN-エチル-N’-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドのようなカルボジイミドである。ペプチドカップリングにおける他の活性化試薬及びその使用は、前記Schroder & Lubke，Chap.III及びKapoor，J ．Phar．Sci.，59，p p 1-27(1970)に記載されている。P-ニトロフェニルエステル(ONp)もカップリングのAsn又はGlnのカルボキシル端を活性化するために用いられる。例えば、BOC- Asn(ONp)はDMFと塩化メチレンの50％混合液中１当量のHOBtを用いて一晩結合される。各保護アミノ酸又はアミノ酸配列は約３倍過剰量で固相反応器に導入され、カップリングはジメチルホルムアミド(DMF):CH₂Cl₂(1:1)の媒体又はCH₂Cl₂単独中室温で行われる。また、カップリングは、NMP又はトルエン:DMSO(70:30)の混合液中約70℃までの高温で行われる。カップリングが手で行われる場合には、合成の各段階におけるカップリングの成功はE．Kaiserら，Anal ．Biochem．34，595( 1970)に記載されるようにニンヒドリン反応でモニターされる。不完全なカップリングが生じる場合には、次のアミノ酸のカップリングの前のα−アミノ保護基を除去する前にカップリング手順が繰り返される。カップリング反応は、Rivier ら，Biopolymers, 17，pp.1927-1938，(1978)に報告されるようなプログラムを用いてベックマン990自動シンセサイザーでのように自動的に行われる。所望のアミノ酸配列が完了した後に、下記のように樹脂に結合されつつ環化結合を形成することが所望されない限り中間体ペプチドが樹脂支持体から除去される。除去は、液体フッ化水素(HF)のような試薬で処理することにより行われ、ペプチドを樹脂から切断するだけでなくなお存在する場合には（最終ペプチドに存在するように企図されるアシル基でないかぎり）残存する側鎖保護基X²、X³、X⁴ 、X⁵、X⁶及びX⁷及びα−アミノ保護基X¹を全て切断してペプチドを得る。切断にフッ化水素を用いる場合、アニソール又はクレゾール及び硫化メチルエチルが捕捉剤として反応容器に含まれる。Metが配列内にある場合、BOC保護基はトリフルオロ酢酸(TFA)/エタンジチオールで切断された後にペプチドを樹脂から切断して S-アルキル化を除去する。 CRFペプチド類縁体の環化工程が30位と33位の残基間に所望される結合の種類によることは当然のことである（及び二環式分子が形成される場合には20位と 23位のものに対しても同様である）。L-Cysが30位と33位の双方に含まれる場合、たいていは樹脂から切断し保護基の全てをペプチドから除去した後に環化工程を行うほうが便利である。ペプチドの環状形は、好ましくはRivierら，Biopolym ers, Vol．17，1927-38，(1978)に記載されるようにフェリシアン化物を用いて酸化するか又は空気酸化することにより、又は他の既知の方法により得られる。アミド環化結合（ラクタム架橋）を行うために、米国特許第5,064,939号及び米国特許第5,043,322号に開示されるように部分的保護ペプチドが樹脂に結合されたまま環化が行われる。かかる手順は、ペプチド中間体にAsp、Glu及び／又は Lysのような他の残基が側鎖保護を保持しつつ２つの所望の側鎖間にアミド環化結合を効果的に生成する。 30位残基の側鎖カルボキシル基と33位残基の側鎖アミノ基間のアミド結合又は等価結合であると考えられるその逆でのアミド結合を介して環化する場合、米国特許第5,043,322号に示されるようにMBHA又はBHA樹脂上の保護ペプチドを合成すると共にペプチドがなお樹脂に結合されたまま個々のカルボン酸側鎖のベンジルエステルをヒドラジドに誘導化してから選択的に脱保護したアミノ側鎖と反応させることが好ましい。好ましくは、アミド結合架橋に含まれるべき残基のカルボキシル側鎖の塩基不安定保護基、例えば、OFmを用い、含まれるべき他の残基上のアミノ側鎖の保護基としてFmocを用いることにより環化が達成される。１位残基上のα−アミノ保護基はアシル化されていてもいなくても及び他の側鎖保護基は、全て２つの塩基不安定基がピペリジン等を用いて除去されつつ適切に保たれる。その選択的除去の後、環化を達成する反応は、アミド結合のかなり完全な生成を行うBOPで処理することにより行われる。２ラクタム架橋が分子に組込まれる場合には、30-33架橋が合成中の箇所で行われた後に23位残基を付加することが好ましく、米国特許第5,064,939号に教示されるような合成プロトコールも用いられる。環化後、ペプチドは完全に脱保護され、HFのような試薬を用いて樹脂から切断される。任意により、まずBOC保護基がTFAを用いてＮ末端から除去される。また、かかるアミド架橋によるペプチドの環化も米国特許第4,115,554号(1978 年９月19日);同第4,133,805号(1979年１月９日);同第4,140,767号(1979年２月20 日);同第4,161,521号(1979年７月17日);同第4,191,754号(1980年３月４日);同第 4,238,481号(1980年12月９日);同第4,244,947号(1981年１月13日);及び同第4,26 1,885号（1981年４月14日）の教示を用いて行われる。候補的ペプチドが何のCRF活性を示すかを求めるために単層培養内のラット下垂体前葉細胞を用いて端的分析が行われる。用いられる手順はEndocrinology，9 1，562(1972)に一般的に示されるものである。該分析は、候補的ペプチドがCRF アゴニストとしての活性を示しかかる細胞上のCRFレセプターを活性化することによりACTH分泌を促進するかがわかり、この方法では固有のCRF活性が高用量の使用により測定される。候補物が攻撃用量と共に投与される場合に強力なCRF拮抗剤特性を示すかを求めるためにも実質的に同じ分析が用いられる。候補的CRF拮抗剤ペプチドは、また、Perrin，M.ら，Endocrinology，118，117 1-1179(1986)に記載されるように既知のCRFレセプターを用いる結合分析において容易に評価される。CRFレセプター及び結合分析の詳細は、本明細書において後述される。通常、結合分析は、ヒトCRF-RAに親和性の高い（シクロ30-33）[I¹ ²⁵ -D-Tyr¹²，Glu³⁰，Lys³³，Nle^21,38]-r/hCRF(12-41)又はD-His³²を有するその類縁体のような放射性リガンドを用いてヒトCRF-RAと行われる。例えば、最初に命名された化合物のhCRF-RAlに対する結合のK_Dは2.0ナノモル(1.4-2.9)であり、匹敵するD-Phe¹²類縁体と実質的に同じである。かかる代表的な結合分析について使用するCRF-RAレセプターはChenら，P.N.A.S.，90，8967-8971（1993年1 0月）に記載されている。それらの環状ペプチドのいくつか、特に32位のD-アミノ酸残基を有するものはCRF-RAのようなCRFレセプターに対してそのような高い結合親和性を示すことから、スクリーニング分析において使用するのに特に有効である。かかる分析は、標識環状CRF類縁体、好ましくは高親和性を有するそのような標識環状CRF拮抗剤を用いてペプチド又は他の形の潜在的CRF様リガンをスクリーンするために有利に用いられる。下記の実施例Ｉは、固相法によるCRF拮抗剤の好ましい合成法を示すものである。実施例Ｉ次のアミノ酸配列:を有する（シクロ30-33）[D-Phe¹²，Nle^21,38，Glu³⁰，Lys³³]-r/hCRF(12-41)の合成は、約0.43〜0.46ミリ当量／ｇ樹脂の置換範囲を有するMBHA塩酸塩樹脂により段階的方法で行われる。合成は、適切なプログラムを用いて好ましくは次のとおりベックマン990Bペプチド自動シンセサイザーで行われる。 BOC−Ileのカップリングにより、樹脂１ｇあたり約0.35ミリモルの置換が得られる。用いられる溶媒を、全て好ましくは不活性ガス、例えば、ヘリウム又は窒素をスパージすることにより注意して脱ガスする。脱保護及び中和した後、ペプチド鎖が樹脂上に段階的に蓄積される。通常、樹脂１ｇあたり塩化メチレン中１〜２ミリモルのBOC保護アミノ酸＋塩化メチレン中１当量の２モルDCCを２時間用いる。BOC-Arg(Tos)が結合される場合、50%DMF と塩化メチレンの混合液を用いる。BzlをSerのヒドロキシル側鎖保護基として用いる。BOC-Asn(Xan)又はBOC-Gln(Xan)は、DMFと塩化メチレンの50%混合液中１当量のDCC及び２当量のHOBtの存在下に結合される。ラクタム架橋の一部であるかによって2Cl-Z又はFmocをLys側鎖の保護基として用いる。Argのグアジニノ基及びHisのイミダゾールを保護するためにTosを用い、Gluの側鎖カルボキシル基を環化反応に部分的に用いるかによってOChx又はOFmで保護する。合成の終わりに、次の組成物が得られる。残基30と33の次の環化（ラクタム化）は上で言及した方法及び次に詳細に記載される方法で行われる。ジクロロメタン(DCM)(2×)及びジメチルホルムアミド(D MF)(2×)で洗浄した後、Glu³⁰及びLys³³のOFmc/Fmoc基を各々DMF中20%ピペリジン(1×1分及び2×10分）で除去し、引き続きDMF(2×)、CH₂Cl₂中Et₃N(1×)、メタノール(MeOH)(2×)及びDCM(2×)で洗浄する。ジメチルホルムアミド(DMF)中過剰量のジイソプロピルエチルアミン(DIEA)の存在下に３倍過剰量のベンゾトリアゾール-1-yl-オキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP)と室温で反応させることによりペプチド−樹脂を環化する。洗浄後、環化を４時間２回以上、次に場合によっては１２時間１回繰り返す。反応はカイザーニンヒドリンテスト(E．Kaiserら,“Color test for detection of fre e terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides(ペプチド固相合成における遊離末端アミノ基検出の呈色試験)”，Anal Biochem（1970 ）34:595-98）で続けられ、通常、24時間以内に完了する。 Nα-BOC保護基を除去した後、完全に保護されたペプチド−樹脂を乾燥する。約２ｇをアニソール（0.6ml）の存在下に無水HF（２０ml）で切断する。粗ペプチドを沈殿し、無水ジエチルエーテル（４５０mlずつ３回）で洗浄し、ろ過し、 CH₃CN/H₂0（60:40）中３８０ml（ｒ回）の0.1% TFAで樹脂から抽出し、凍結乾燥して粗生成物を得る。凍結乾燥した粗ペプチドを、ウォーターズアソシエイト（マサチューセッツ州ミルフォード）プレプLC 3000システム、ウォーターズアソシエイト600Eシステムコントローラ、島津SPD-6A UV分光光度可変波長検出器（検出は２３０nmとした）、ウォーターズ1000プレパックモジュール、及びフィッシャー（マサチューセッツ州レキシントン）レコードオールシリーズ5000ストリップチャートレコーダー（チャート速度0.25cm/分）から構成される装置による分取用逆層HPLC（RHP LC）で精製する。最後のペプチド精製は、TEAP pH2.25、及び0.1％ TFA及び／又はTEAP pH6.5及び0.1% TFAのバッファーを用いて２又は３工程で行われる。粗ペプチドを、まずウォーターズポリエチレンスリーブ及びフリット及びバイダックC₁₈シリカゲル(The Separations Group，カルフォルニア州ヘスペリア;細孔サイズ300Å，粒径15〜20μm)を用いて実験室で充填された分取用逆層HPLC カートリッジ(5×30cm)に充填された４００mlのバッファーB:トリエチルアンモニウムホスフェート(TEAP)(pH2.25)(1:4v/v)に溶解する。そのペプチドをバッファーB:バッファーA中60%CH₃CNを用いて30〜60％Bの勾配で溶離する。バッファー A(トリエチルアンモニウムホスフェート(TEAP)，pH2.25)及びB(A中CH₃CN)を流速９５ml／分で９０分間ポンプで送る。合計５０〜１００mlを含む画分を均一条件 (61% B、保持時間約2.84分）下にスクリーンし、化合物を含む画分を同定しプールする。第２工程では、プールした画分を１６０mlのH₂Oで希釈し、バッファーAとして :0.1％TFA/H₂O及びBとして:CH₃CN/H₂O(60:40)中0.1%TFAを用いて勾配40〜70%で９０分（保持時間約６７分）溶離する。合計３０〜５０mlを含む画分をスクリーンし、化合物を含む画分をプールし、凍結乾燥して最終生成物ペプチドを得る。この方法で合成及び精製したペプチドのナトリウムＤ線における比旋光度をパーキンエルマーモデル241旋光計で [α]_D ²²＝-62.4°±1.0(c=1，1%酢酸中) （H₂O及びTFAに対する補正なし）として測定する。その純度は約９８％である。純度を、更に、質量分析法(MS)及び毛管ゾーン電気泳動(CZE)で確認する。ペプチドのアミノ酸分析［110℃24時間4Nメタンスルホン酸加水分解後］は２個のシリーズ10LCポンプ、ISS-100試料インゼクター、RTC１カラムオーブン、カラトススペクトロフロー980蛍光検出器、及びLCI-100インテグレーターを含むパーキンエルマーLCシステム（コネチカット州ノルウォーク）で行われる。ピアス AA511イオン交換カラムを６０℃に維持し、５２℃でo-フタルアルデヒドによるカラム後誘導化を行う。内部標準γ−アミノ酪酸を含む試料を注入し、注入５分後に０〜100% Bの勾配に25分間、次に100% Bに15分間かける。流速は、0.5ml／分であり、A及びBバッファーは、各々ピアスピコバッファー(pH2.20)及びベックマンミクロカラムクエン酸ナトリウムバッファー(pH4.95)である。この分析により、予想アミノ酸比が得られる。合成を環化工程を含めずに繰り返して匹敵する線状ペプチドを生成する。生成ペプチドの試験管内生物作用能は、次のとおり測定される。雄のスプラグ −ダウレイラットのラット下垂体前葉をコラーゲナーゼで分離し、２％胎児ウシ血清(FBS)を含有する培地で平板培養（48ウェルプレート中0.16×106細胞／ウェル）する。平板培養の３日後に、細胞を0.1％ウシ血清アルブミン(BSA)を含有する新たな培地で３回洗浄し、１時間インキュベートする。１時間プレインキュベートした後、細胞を１回以上洗浄し、１nMoCRFの存在下に試験ペプチドを加える。３時間のインキュベーションの終わりに培地を集め、ACTHレベルをラジオイムノアッセイ(Diagnostic Products Corporation)で求める。上記の合成の環状ペプチド生成物の生物作用能は、本“標準”ペプチド、即ち、[D-Phe¹²，Nle^21,38 ]r/hCRF(12-41)より約３３倍大きい（12-82,信頼範囲）。匹敵する線状ペプチドを合成し、生物作用能が標準より１０％小さいことがわかる（0.01-0.16）。これは、試験管内効力の約３００倍の差になる。ペプチドを投与するとACTH及びβ−エンドルフィン様免疫活性（β-END-LI)の分泌を抑制し、阻害持続期間が特に長い。これらのCRF拮抗剤を試験するために用いられる生体内分析は、副腎摘出(ADX)ラットを用いる。成体雄のスプラグーダウレイラット(230-250g)の副腎をハロタン麻酔のもとでロンバーアプローチ（ lombar approach）により摘出する。食事を飲料水中0.9％NaCl及びオレンジで補足する。実験の２日前に、C．Rivierら，Endocrinology，110，272-278(1982)に記載されるようにラットに頸静脈カニューレを取り付ける。実験の朝に、ヘパリン添加した食塩水を満たしたラインに接続し、ラットを個々にバケツに入れ、２時間放置する。実験用に、まず0.3mlの血液試料を採取し、試験溶液を注入(0.2- 0.5ml容量で)し、次に、血液試料を約１５、４５、９０及び１２０分に得る。それらの血液試料を遠心分離し、分離した血漿をACTH値を分析するまで凍結する(- 20℃)。血漿ACTHレベルをC．Rivierら，J．Neuroscience，14，1985(1994)に記載されるように測定する。１mg/kg体重のレベルの生体内試験の結果として、１５分のタイムで血清中のA CTHレベルを低下させるのに環状CRF拮抗剤は標準CRF拮抗剤より効果的である。注入後４５分では、環状化合物は１５分レベルより更にACTHレベルを下げ、標準 CRF拮抗剤の作用は自然に消滅し、レベルは対照ラットと実質的に同じである。９０分では、ACTHレベルは環状化合物で処理したラットについてはほぼその低レベルで保たれ、対照ラット及び標準CRF拮抗剤で処理したものよりかなり低い。注入後１２０分では、ACTHレベルはほとんど正常に戻る。0.3mg/kg体重のレベルで試験した場合、結果は１５及び４５分とほとんど同じである。しかしながら、９０分では、標準CRF拮抗剤で処理したラットよりなお改善されるが、１mg/kg体重のレベルで注入された場合に示されるほど有意ではない。更に一連の試験を行い、ラットに標準CRF拮抗剤を３mg/kgのレベルで注射し、２組の他のラットに環状CRF拮抗剤を0.1mg/kg及び0.03mg/kgのレベルで注射する。結果は、１５及び４５分の前の２つの試験とほとんど同じであり、0.03mg/kg 注入でさえ標準CRF拮抗剤の３mg/kg注入より改善が顕著である。９０分では、３ mg/kgの標準を注入したラットよりなおぎりぎりの改善がある。しかしながら、９０分経過時にほぼ試験の開始時のレベルに戻る。試験から、標準CRF拮抗剤の量の１／１００のレベルで用いられた場合でさえ、環状化合物はなお45分の時間にわたってかなり良好であることがわかる。全体的に、これらのデータから、環状ペプチドが従来報告されたほぼ最良である実験標準より生体内に末梢投与された後に１０倍を超える効力があることがわかる。0.1mg/kgレベルの試験では本ペプチドは１２０分後になおかなり活性である。実施例ＩA 三重のバッチを用い合成をD-Pheで終わる代わりにＮ末端を伸長して実施例Ｉの合成を繰り返す。追加の３残基、即ち、Thr，Leu及びAspを連続して加える。各々を添加した後に、最初の樹脂量の１／３を除去する。切断後、次の３種のペブチドが生成する。各ペプチドのナトリウムＤ線における比旋光度を前述のように測定する。結果は次の通りである。 CRF(11-41)類縁体[α]_D ²²=-47.6° ± 1.0； CRF(10-41)類縁体[α]_D ²²=-38.5° ± 1.0；及び CRF(9-41)類縁体[α]_D ²²=-35.3 ± 1.0；３種の結果は１０％酢酸中ｃ=1の場合であり、H₂O及びTFAについての補正はない。質量分光法(MS)及び毛管ゾーン電気泳動により確認された各ペプチドの純度は、少なくとも約９５％である。各ペプチドの生物作用能を前述のように試験管内で測定し、実験用標準ペプチド、即ち、[D-Phe¹²，Nle^21,38]r/hCRF(12-41)と比較する。結果を下記に示す。 r/hCRF(11-41)類縁体= 標準の40.3倍(27.78-72.16); r/hCRF(10-41)類縁体= 標準の31.6倍(13.53-65.20);及び r/hCRF(9-41)類縁体= 標準の33.8倍(12.52-77.05)。実施例ＩB 実施例Ｉ及びIAを繰り返し、各々酢酸無水物を用いてＮ末端をアセチル化して次の４種のペプチドを生成する。質量分光法(MS)及び毛管ゾーン電気泳動で確認された各ペプチドの純度は、少なくとも約９５％である。上記ペプチドのナトリウムＤ線における比旋光度を前述のように測定する。結果は次の通りである。 CRF(11-41)類縁体[α]_D ²⁰=-30.8° ± 1.0； CRF(10-41)類縁体[α]_D ²⁰=-29.9° ± 1.0；及び CRF(9-41)類縁体[α]_D ²⁰=-31.1 ± 1.0；結果は全て１０％酢酸中ｃ=1の場合であり、H₂O及びTFAについての補正はない。各ペプチドを投与するとACTH及びβ-END-LIの分泌を抑制し、CRF(11-41)類縁体は標準の約６４倍の試験管内生物作用能を示す(32.8-128.6)。CRF(10-41)類縁体は約３４倍の生物作用能を示す(12.5-77)。実施例ＩC 実施例Ｉの合成を繰り返し、D-PheをD-Tyrに置き換えて次のペプチドを生成する。ペプチドのナトリウムＤ線における比旋光度を前述のように[α]_D ²²=-61.4° ±1.0（10%酢酸中ｃ=0.5、H₂O及びTFAについての補正なし）として測定する。MS 及びCZEで確認された純度は約９８％である。前述のように求めたペプチドの生物作用能は実験用標準、即ち、[D-Phe¹²，Nle^21,38]rCRF(12-41)の約5.6倍(3.4- 9.4)である。環状ペプチドの一部は¹²⁵Iで容易に標識される。実施例II 残基33がLysの代わりにOrnである以外は上記実施例Ｉに記載されるように次のアミノ酸配列: を有する（シクロ30-33）[D-Phe¹²，Nle^21,38，Glu³⁰，Orn³³]-r/hCRF(12-41)の合成を行う。本ペプチドを投与するとACTH及びβ-END-LIの分泌が抑制される。実施例II A 実施例IIの合成を繰り返し、D-PheをD-Tyrに置き換えてアミノ酸配列: を有する次のペプチド:(シクロ30-33)[D-Tyr¹²，Nle^21,38，Glu³⁰，Orn³³]-r/hC RF(12-41)を生成する。本ペプチドを投与するとACTH及びβ-END-LIの分泌を抑制する。次に、本ペプチドの一部を¹²⁵Iでヨウ化して競合薬剤スクリーニング分析に使用するリガンドを得る。実施例II B 実施例Ｉの一般合成を用いてアミノ酸配列: を有する次のペプチド:(シクロ30-33)[D-Tyr¹²，Nle^21,38，Glu³⁰，Asn³²，Lys³ ³ ，Arg³⁶]-r/hCRF(12 -41)を生成する。本ペプチドのナトリウムＤ線における比旋光度を前述のように[α]_D ²²=-47.3 °±1.0（10%酢酸中ｃ=1、H₂0及びTFAについての補正なし）として測定する。質量分光法(MS)及び毛管ゾーン電気泳動で確認された純度は約９８％である。本ペプチドは、標準ペプチド、[D-Phe¹²，Nle^21,38]rCRF（12-41）より生物作用能があり、容易に¹²⁵Iで標識され、薬剤スクリーニング分析に有用である。実施例II C 実施例Ｉに示される一般合成を用いてアミノ酸配列:を有する次のペプチド:(シクロ30-33)[D-Tyr¹²，Glu¹³，Lys^17,33，Nle^21,38，G lu³⁰，Asn³²，Arg³⁶]-r/hCRF(12-41)を生成する。本ペプチドのナトリウムＤ線における比旋光度を前述のように[α]_D ²²=-47.0 °±1.0（10%酢酸中ｃ=1、H₂O及びTFAについての補正なし）として測定する。質量分光法(MS)及び毛管ゾーン電気泳動で確認された純度は約９８％である。本ペプチドは、標準ペプチド、[D-Phe¹²，Nle^21,38]rCRF（12-41）より生物作用能が大きい。本ペプチドは、容易に¹²⁵Iで標識され、薬剤スクリーニング分析に有用である。実施例II D 実施例Ｉの一般合成を用いてアミノ酸配列: を有する次のペプチド:(シクロ30-33)[D-Tyr¹²，Nle^21,38，Glu³⁰，Asn³²，Lys³ ³ ]-r/hCRF(12-41)を生成する。本ペプチドを投与するとACTH及びβ-END-LIの分泌が抑制される。本ペプチドは容易に¹²⁵Iで標識され、薬剤スクリーニング分析に有用である。実施例III アミノ酸配列: を有するペプチド（シクロ30-33）[D-Phe¹²，Nle^21,38，Cys^30,33]r/hCRF(12-41 )を合成する。前述の合成プロトコールを用いてHFで切断される完全に保護されたペプチド− 樹脂を生成する。沈殿しジエチルエーテル（４８０mlずつで３回）で洗浄した後、そのペプチドを水（２００ml）と5.0％Ac0H（１００ml）で抽出する。得られた溶液を4.0リットルの脱ガスした水に注入し、NH₄OHでpH6.8〜7.0に調整する。混合液が濁るにつれて、CH₃CN（３００ml）を加えて沈殿を避ける。次に、混合液を大気中４℃で攪拌し、４８時間後に環化が完了する（エルマン試験）。AcOh でpH5.0に調整し、得られた溶液をバイオレックス70カラム（１２０ml）に充填する。カラムを0.5％AcOH（２００ml）で洗浄し、ペプチドを５０％AcOHで溶離する。画分を集め、ニンヒドリン陽性物質を希釈し、凍結乾燥する（８０mg）。精製は、３工程で行われる。まず、本ペプチドをバッファーA(TEAP pH2.25，3 00ml）に溶解し、バッファーBとしてA中60%CH₃CNを用いて勾配30〜60%Bで60分溶離する。画分を均一条件(53%B)下にスクリーンし、化合物を含む画分をプールする。第２工程では、プールした画分をH₂0で希釈し、バッファーA:TEAP(pH6.0)及びB:A中60%CH₃CNを用いて勾配30〜55%で60分溶離する。画分を再び均一条件(53% B)下にスクリーンし、プールした画分をH₂Oで希釈し、バッファーA:0.1%TFA/H₂O 及びB:CH₃CN/H₃O(60:40)中0.1%TFAを用いて勾配30〜60%Bで20分溶離する。生成物を含む画分をプールし、凍結乾燥して生成ペプチドを得る。本ペプチドを投与するとACTH及びβ-END-LIの分泌が抑制される。実施例IV 実施例Ｉの合成を繰り返し、His³²をD-Hisに置き換えてアミノ酸配列: を有する次のペプチド: (シクロ30-33)[D-Phe¹²，Nle^21,38，Glu³⁰，D-His³²，Lys³³]-r/hCRF(12-41)を生成する。本ペプチドのナトリウムＤ線における比旋光度を前述のように [α]_D ²²=-47.0°±1.0（10%酢酸中ｃ=1、H₂O及びTFAについての補正なし）として測定する。質量分光法(MS)及び毛管ゾーン電気泳動で確認された純度は約９８％である。前述のように求めた本ペプチドの生物作用能は、標準ペプチド、[D-P he¹²，Nle^21,38]rCRF(12-41)の約80.3倍(41.58-173.2)である。以後これをペプチドIVと呼び、生体内試験により本ペプチドが１２０分間活性のままであることがわかる。実施例IVA 実施例Ｉの合成を繰り返し、D-PheをD-Tyrに置き換えHis³²をD-Hisに置き換えてアミノ酸配列: を有する次のペプチド: (シクロ30-33)[D-Tyr¹²，Nle^21,38，Glu³⁰，D-His³²，Lys³³]−r/hCRF(12-41)を生成する。実施例Ｉに記載された試験管内試験により、本ペプチドがACTH及びβ-END-LI の分泌を抑制することがわかる。次に、本ペプチドの一部を¹²⁵Iでヨウ化して競合薬剤スクリーニング分析に有用なリガンドを得る。CRFレセプターに対する結合親和性が高いことがわかる。実施例IVB Ｎ末端をアセチル化する以外は実施例IVの合成を繰り返してアミノ酸配列: を有する次のペプチド:(シクロ30-33)[Ac-D-Phe¹²，Nle^21,38，Glu³⁰，D-His³² ，Lys³³]-r/hCRF(12-41)を生成する。本ペプチドのナトリウムＤ線における比旋光度を前述のように [α]_D ²⁰=-30.1°±1.0（10%酢酸中ｃ=1、H₂O及びTFAについての補正なし）として測定する。質量分光法(MS)及び毛管ゾーン電気泳動で確認された純度は約９８％である。本ペプチドの生物作用能をペプチドIVと平行される分析で前述のように求め、ペプチドIVの生物作用能の約1.24倍(0.41-3.34)を示す。生体内試験により、ペプチドIVよりACTHの抑制が大きいことがわかる。実施例IVC Thrを付加することによりＮ末端を延長する以外は実施例IVの合成を繰り返してアミノ酸配列: を有する次のペプチド:(シクロ30-33)[D-Phe¹²，Nle^21,38，Glu³⁰，D-His³²，Ly s³³]-r/hCRF(11-41)を生成する。本ペプチドのナトリウムＤ線における比旋光度を前述のように [α]_D ²⁰=-39.1℃±1.0（10%酢酸中ｃ=1、H₂O及びTFAについての補正なし）として測定する。質量分光法(MS)及び毛管ゾーン電気泳動で確認された純度は約98％である。本ペプチドは、標準、即ち、[D-Phe¹²，Nle^21,38]rCRF(12-41)より生物作用能が大きい。実施例IVD Thrを付加してＮ末端を延長してからそれをアセチル化する以外は実施例IV の合成を繰り返してアミノ酸配列: を有する次のペプチド:(シクロ30-33)[Ac-Thr¹¹，D-Phe¹²，Nle^21,38，Glu³⁰，D -His³²，Lys³³]-r/hCRF(11-41)を生成する。本ペプチドのナトリウムＤ線における比旋光度を前述のように [α]_D ²⁰=-23.0°±1.0（10%酢酸中ｃ=1、H₂O及びTFAについての補正なし）として測定する。質量分光法(MS)及び毛管ゾーン電気泳動で確認された純度は約９８％である。本ペプチドの生物作用能はペプチドIVの約3.08倍(1.06-7. 84)である。0.1mg/kgレベルの生体内試験により、６０、９０及び１２０分においてペプチドIVよりかなり有効であることがわかる。実施例V アミノ酸配列: を有する（シクロ30-33）[D-Phe¹²，Nle^21,38，Glu³⁰，D-His³²，Orn³³]-r/hCRF (12-41)の合成を、残基33がLysの代わりにOrnである以外は実施例Ｉに記載されるように行う。本ペプチドを投与するとACTH及びβ-END-LIの分泌が抑制される。実施例Ｖ A 実施例Ｉの合成を繰り返し、His³²をD-Argに置き換えてアミノ酸配列: を有する次のペプチド:(シクロ30-33)[D-Phe¹²，Nle^21,38，Glu³⁰，D-Arg³²，Ly s³³]-r/hCRF(12-41)を生成する。本ペプチドのナトリウムＤ線における比旋光度を前述のように [α]_D ²⁰=-53.7°±1.0（10%酢酸中ｃ=1、H₂O及びTFAについての補正なし）として測定する。質量分光法(MS)及び毛管ゾーン電気泳動で確認された純度は約９８％である。前述のように求めた本ペプチドの生物作用能は、標準ペプチド、[D-P he¹²，Nle^{21, 38}]rCRF(12-41)の約６０倍である。実施例Ｖ B His³²をD-2Nalに置き換え、実施例Ｉの合成を繰り返してアミノ酸配列: を有する次のペプチド: (シクロ30-33)[D-Phe¹²，Nle^21-38，Glu³⁰，D-2Nal³²，Lys³³]-r/hCRF(12-41)を生成する。本ペプチドのナトリウムＤ線における比旋光度を前述のように [α]_D ²⁰=-40.9°±1.0（10%酢酸中ｃ=1、H₂O及びTFAについての補正なし）として測定する。質量分光法(MS)及び毛管ゾーン電気泳動で確認された純度は約９８％である。前述のように求めた本ペプチドの生物作用能は、標準ペプチド、[D-P he¹²，Nle^21,38]rCRF(12-41)の約１８倍である。実施例Ｖ C 実施例Ｉの合成を繰り返し、His³²をimBzlD-Hisに、Leu¹⁵をCαMeLeuに置き換えてアミノ酸配列: を有する次のペプチド:(シクロ30-33)[D-Phe¹²，CML¹⁵，Nle^21,38，Glu³⁰，imBz lD-His³²，Lys³³]-r/hCRF(12-41)を生成する。本ペプチドのナトリウムＤ線における比旋光度を前述のように [α]_D ²⁰=-34.2°±1.0（10%酢酸中ｃ=1、H₂O及びTFAについての補正なし）として測定する。質量分光法(MS)及び毛管ゾーン電気泳動で確認された純度は約９８％である。前述のように求めた本ペプチドの生物作用能は、標準ペプチド、[D-P he¹²，Nle^21,38]rCRF(12-41)の約23.5倍(14.4-39.3)である。実施例Ｖ D His³²をD-Gluに置き換え、実施例Ｉの合成を繰り返してアミノ酸配列: を有する次のペプチド:(シクロ30-33)[D-Phe¹²，Nle^21,38，Glu³⁰，D-Glu³²，Ly s³³]-r/hCRF(12-41)を生成する。本ペプチドのナトリウムＤ線における比旋光度を前述のように [α]_D ²⁰=-48.6°±1.0（10%酢酸中ｃ=1、H₂O及びTFAについての補正なし）として測定する。質量分光法(MS)及び毛管ゾーン電気泳動で確認された純度は約９８％である。前述のように求めた本ペプチドの生物作用能は、標準ペプチド、[D-Phe¹²，Nle^21,38]rCRF(12-41)の約１０である。実施例VI アミノ酸配列: 有する(ビシクロ20-23，30-33)[D-Phe¹²，Nle^21,38，Lys^23,33，Glu30]-r/hCRF( 12-41)の合成を、残基30と33のラクタム架橋が完了した後に残基23をペプチド− 樹脂に付加する以外は実施例Ｉに一般的に記載されるように行う。示された手順及び条件を用いて旋光度を測定し、[α]_D ²⁰=-42.0°±1.0（10% 酢酸中ｃ=0.5、H₂O及びTFAについての補正なし）であることがわかる。実施例Ｉに記載された試験管内試験により、実験用標準の約8.3倍(3.65-18.32 )の効力が示される。本ペプチドを投与するとACTH及びβ-END-LIの分泌が抑制される。実施例VI A アミノ酸配列: を有する(ビシクロ20-23，30-33)[D-Phe¹²，Nle^21,38，D-Ala²²，Lys^23,33，Glu³⁰ ，D-His³²]-r/hCRF(12-41)の合成を、His³²をD-Hisに置き換え、Ala²²をD-Ala に置き換える以外は上記実施例VIに一般的に記載されるように行う。本ペプチドを投与するとACTH及びβ-END-LIの分泌が抑制される。実施例VII アミノ酸配列: を有するペプチド（シクロ30-33）[D-Phe¹²，Nle^21,38，Cys^30,33，D-His³²]r/h CRF(12-41)を合成する。実施例IIIに記載されたプロトコールを用いて完全に保護されたペプチド−樹脂を生成し、これをHFで切断し、環化し、精製し、凍結乾燥して生成ペプチドを得る。合成を繰り返してペプチド:(シクロ30-33)[D-Phe¹²，Nle^21,38，Cys^30,33，D- 2Nal³²]r/hCRF(12-41)を得る。本ペプチド拮抗剤の各々を投与するとACTH及びβ-END-LIの分泌が抑制される。実施例VII A 下記式:を有するペプチド（シクロ30-33）[D-Phe¹²，Nle^18,21，Glu³⁰，D-His³²，Lys³³ ]-コイウロテンシンI(12-41)を合成する。実施例Ｉに示された一般手順の試験により、本環状化合物がACTH及びβ-END-L Iの分泌を抑制することがわかる。実施例VII B 下記式: を有するペプチド(シクロ29-32)[D-Leu¹¹，Nle¹⁷，Glu²⁹，D-His³¹，Lys³²]-ソーバジン(11-40)を合成する。実施例Ｉに示された一般手順の試験により、本環状化合物がACTH及びβ-END-L Iの分泌を抑制することがわかる。実施例VII C 下記式: を有する(シクロ30-33)[D-Phe¹²，Glu³⁰，D-His³²，Lys³³]-αヘリックスCRF(12 -41)を合成する。実施例Ｉに示された一般手順の試験により、本環状化合物がACTH及びβ-END-L Iの分泌を抑制することがわかる。実施例VIII 実施例IVの合成を繰り返し、Leu¹⁵をCαMeLeuを置き換えてアミノ酸配列:を有する次のペブチド:（シクロ30-33）[D-Phe¹²，CML¹⁵，Nle^21,38，Glu³⁰，D- His³²，Lys³³]-r/hCRF(12-41)を生成する。本ペプチドのナトリウムＤ線における比旋光度を前述のように [α]_D ²²=-39.4°±1.0（10%酢酸中ｃ=0.5、H₂O及びTFAについての補正なし）として測定する。質量分光法(MS)及び毛管ゾーン電気泳動で確認された純度は約９８％である。前述のように求めた本ペプチドの生物作用能は、標準の約20.3倍(1 1.5-37.0)である。実施例VIII A 実施例IVの合成を繰り返し、LeuHをCaMeLeuに置き換えてアミノ酸配列: を有する次のペプチド:(シクロ30-33)[D-Phe¹²，CML¹⁴，Nle^21,38，Glu³⁰，D-Hi s³²，Lys³³]-r/hCRF(12-41)を生成する。本ペプチドのナトリウムＤ線における比旋光度を前述のように [α]_D ²²=-31.6°±1.0（10%酢酸中ｃ=1、H₂O及びTFAについての補正なし）として測定する。質量分光法(MS)及び毛管ゾーン電気泳動で確認された純度は約９８％である。前述のように求めた本ペプチドの生物作用能は、標準、[D -Phe¹²，Nle^21,38]rCRF(12-41)の約１５倍である。実施例VIII B 実施例IVの合成を繰り返し、Leu¹⁹をCαMeLeuに置き換えてアミノ酸配列:を有する次のペプチド:（シクロ30-33）[D-Phe¹²，CML¹⁹，Nle^21,38，Glu³⁰，D- His³²，Lys³³]-r/hCRF(12-41)を生成する。本ペプチドのナトリウムＤ線における比旋光度を前述のように [α]_D ²=-35.3°±1.0（10%酢酸中ｃ=1、H₂O及びTFAについての補正なし）として測定する。質量分光法(MS)及び毛管ゾーン電気泳動で確認された純度は約９８％である。前述のように求めた本ペプチドの生物作用能は、標準ペプチド、[D-Phe¹² ，Nle^21,38]rCRF(12-41)の約4.5倍である。実施例VIII C 実施例IVの合成を繰り返し、Leu²⁷をCαMeLeuに置き換えてアミノ酸配列: を有する次のペプチド:（シクロ30-33）[D-Phe¹²，Nle^21,38，CML²⁷，Glu³⁰，D- His³²，Lys³³]-r/hCRF(12-41)を生成する。本ペプチドのナトリウムＤ線における比旋光度を前述のように [α]_D ²²=-39.1°±1.0（10%酢酸中ｃ=1、H₂O及びTFAについての補正なし）として測定する。質量分光法(MS)及び毛管ゾーン電気泳動で確認された純度は約９８％である。前述のように求めた本ペプチドの生物作用能は、標準の約53.6倍である(26.4-112.3)。生体内試験により、６０及び９０分のペプチドIVより著しく有効であることがわかる。実施例VIII D 実施例IVの合成を繰り返し、Leu³⁷をCαMeLeuに置き換えてアミノ酸配列:を有する次のペプチド:（シクロ0-33）[D-Phe¹²，Nle^{21, 38}，Glu³⁰，D-His³²， Lys³³，CML³⁷]-r/hCRF(12-41)を生成する。本ペプチドのナトリウムＤ線における比旋光度を前述のように [α]_D ²²=-31.8°±1.0（10%酢酸中ｃ=1、H₂O及びTFAについての補正なし）として測定する。質量分光法(MS)及び毛管ゾーン電気泳動で確認された純度は約９８％である。前述のように求めた本ペプチドの生物作用能は、標準の約１６倍である。実施例IX 実施例IVの合成を繰り返し、Leu²⁷をCαMeLeuに置き換えＮ末端をアセチル化してアミノ酸配列: を有する次のペプチド: （シクロ30-33)[Ac-D-Phe¹²，Nle^21,38，CML²⁷，Glu³⁰，D-His³²，Lys³³]-r/hCR F(12-41)を生成する。本ペプチドのナトリウムＤ線における比旋光度を前述のように [α]_D ²⁰=-33.7°±1.0（10%酢酸中ｃ=1、H₂O及びTFAについての補正なし）として測定する。質量分光法(MS)及び毛管ゾーン電気泳動で確認された純度は約９８％である。本ペプチドは、標準によって示されたものより生物作用能が大きい。実施例IX A 実施例IVを繰り返し、Leu²⁷をCαMeLeuに置き換えThrを付加してＮ末端を延長してアミノ酸配列: を有する次のペプチド:(シクロ30-33)[D-Phe¹²，Nle^21,38，CML²⁷，Glu³⁰，D-Hi s³²，Lys³³]-r/hCRF(11-41)を生成する。本ペプチドのナトリウムＤ線における比旋光度を前述のように [α]_D ²⁰=-41.0°±1.0（10%酢酸中ｃ=1、H₂O及びTFAについての補正なし）として測定する。質量分光法(MS)及び毛管ゾーン電気泳動で確認された純度は約９８％である。本ペプチドは、標準より生物作用能が大きい。実施例IX B 実施例IVを繰り返し、Leu²⁷をCαMeLeuに置き換え、Thrを付加してＮ末端を延長し、それをアセチル化してアミノ酸配列: を有する次のペプチド:(シクロ30-33)[Ac-Thr¹¹，D-Phe¹²，Nle^21,38，CML²⁷，G lu³⁰，D-His³²，Lys³³]-r/hCRF(11-41)を生成する。本ペプチドのナトリウムＤ線における比旋光度を前述のように [α]_D ²⁰=-23.7°±1.0（10%酢酸中ｃ=1、H₂O及びTFAについての補正なし）として測定する。質量分光法(MS)及び毛管ゾーン電気泳動で確認された純度は約９８％である。本ペプチドの生物作用能は、実施例IVに比べてペプチドIVの約1.4倍であり、生体内では６０、９０及び１２０分のACTH低下にかなり良好である。実施例IX C 実施例Ｉの合成を繰り返し、Leu²⁷をCαMeLeuに置き換えＮ末端をアセチル化してアミノ酸配列: を有する次のペプチド:（シクロ30-33）[Ac-D-Phe¹²，Nle^21,38，CML²⁷，Glu³⁰ ，Lys³³]-r/hCRF(12-41)を生成する。本ペプチドのナトリウムＤ線における比旋光度を前述のように [α]_D ²⁰=-43.8°±1.0（10%酢酸中ｃ=1、H₂O及びTFAについての補正なし）として測定する。質量分光法(MS)及び毛管ゾーン電気泳動で確認された純度は約９８％である。本ペプチドは、標準より生物作用能が大きい。実施例X 実施例Ｉに一般的に示された手順を用いて、次のCRF拮抗剤も調製される。これらのペプチドは、種々の刺激に対する応答においてACTH及びβ-END-LIの分泌を抑制するのに生物作用能がある。実施例XI 実施例Ｉに一般的に示された手順を用いて、次のCRF拮抗剤も調製される。これらのペプチドは、種々の刺激に対する応答においてACTH及びβ-END-LIの分泌を抑制するのに生物作用能がある。実施例XII 実施例Ｉに一般的に示された手順を用いて、次のCRF拮抗剤も調製される。これらのペプチドは、種々の刺激に対する応答においてACTH及びβ-END-LIの分泌を抑制するのに生物作用能がある。好ましくは、環状CRF拮抗剤は、本質的にはCRFレセプターを活性化しない。例えば、実施例ＩのペプチドＩは、最大用量で投与された場合に約３％以下の固有 CRF活性を有するにすぎない。一般的には、ペプチドの固有活性が未変性化合物の約２０％以下である場合にCRFレセプターをほとんど活性化しないと考えられる。好ましい拮抗剤の固有活性は約１５％以下である。しかしながら、固有活性は簡単には拮抗剤としてのその効力と釣り合うべき１要因である。 CRFは、下垂体−副腎皮質軸を深く刺激し、CRF拮抗剤は、ACTH及び内因性グルココルチコイド産生の高いタイプの患者においてその軸の機能を抑制するのに有効である。例えば、CRF拮抗剤は、下垂体クッシング病又はCRF感受性腫瘍をもつ患者において下垂体−副腎機能を調節するのに有効である。本発明によって提供された改良CRF拮抗剤の好ましい一員は、CRFレセプターを著しく活性化せずにそのレセプターに対して高親和性で結合する。即ち、ヒツジCRFの１５％未満の固有活性又は闘争性を示す。ほとんどの他の調節ペプチドは、内分泌系、中枢神経系及び胃腸管に影響を及ぼすことがわかった。ACTH及びβ-END-LI分泌は、ストレスに対する哺乳動物の応答の“必須条件”であることから、CRFが身体のストレス応答の多くの伝達因子として脳に著しく影響を及ぼすことは驚くべきことではなかった。従って、脳に送達されたCRF拮抗剤は、気分、学習及び行動、例えば、薬物依存並びに薬物及びアルコール離脱を変えるのにも用途があるにちがいない。更に、脳における CRF拮抗剤は、高血圧症、神経性食欲不振症、出血性ストレス、不妊症、性欲減退、インポテンス及び高血糖症のタイプを含む内因性CRFが与えるストレス誘発症状を改善するにちがいない。末梢に投与されたCRF拮抗剤がACTH、β−END、β −リポトロピン、他のプロオピオメラノコルチン遺伝子産物及びコルチコステロンのレベルを低下させることから、拮抗剤の投与はこれらの物質の全ての脳に対する影響を低下させて記憶、気分、痛みの識別等、更に詳細には警戒心、抑うつ及び／又は不安に影響を及ぼすと共に免疫系、胃腸管及び副腎皮質成長及び機能をモデュレートするために用いられる。また、HIV感染及びアルツハイマー病を治療するために用いられる。 CRF関連ペプチドは、全て腸間膜血管床を拡張することがわかった。CRF拮抗剤は、また、哺乳動物、特にヒトの胃腸管への血流を減じるために有効であるにちがいない。また、CRFは胃酸産生に影響することから、CRF拮抗剤は腸症候群及び炎症性疾患を含む胃腸機能をモデュレートするのに有効であるにちがいない。 CRF拮抗剤又はその非毒性付加塩と薬学的に許容しうる担体とを混合した医薬組成物は、ヒトを含む哺乳動物に静脈内に、皮下に、筋肉内に、経皮的に、例えば、経鼻的に、脳室内的に又は経口的に投与される。本ペプチドは、少なくとも約９０％の純度、好ましくは少なくとも約９８％の純度でなければならない。しかしながら、低い純度も有効であり、ヒト以外の哺乳動物に十分に用いられる。その純度は、企図されたペプチドが全て同様のペプチド及びペプチド断片が存在するものを一定の重量％構成することを意味する。ヒトへの投与は、内因性グルココルチコイド産生を抑制するために又は上記の使用可能性に対して医師により用いられる。投与は、錠剤、菓子錠剤、散剤、シロップ剤、注射用液剤等の種々の剤形にすることができる。必要量は、治療される個々の症状、症状の程度及び所望される治療の期間によって異なり、一日に多数回投薬される。中枢神経系内の内因性CRFのストレス関連作用を遮断するためには、CRF拮抗剤を脳室又は髄液に送達することが必要である。また、血液−脳関門を移行することができる拮抗剤を修飾する手段が見出されなければならない。非経口投与については、落花生油、水性プロピレングリコール、又は滅菌水溶液の液剤が用いられる。適切に緩衝化したかかる水溶液が静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適切である。滅菌水性媒体が容易に入手できる。かかるペプチドは、しばしば酸付加塩又は金属錯体、例えば、亜鉛、鉄、カルシウム、バリウム、マグネシウム、アルミニウム等との薬学的に許容しうる非毒性塩として投与される（本用途のためには付加塩と考えられる）。具体的なかかる酸付加塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、ケイ皮酸塩、硫酸塩、スルファミン酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩、タンニン酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、アルギン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩等であり、慣用的な方法で調製される。有効成分が錠剤として投与される場合には、その錠剤はトラガント、コーンスターチ又はゼラチンのような結合剤又は賦形剤；アルギン酸のような崩壊剤；及びステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤を含むことができる。液体としての投与が所望される場合には、甘味剤及び／又は香味剤が用いられ、等張食塩水、リン酸塩緩衝溶液等の静脈内投与が行われる。本ペプチドは、医師の指導によって一回又は複数回で投与されなければならず、医薬組成物は、通常は、作用の持続を延ばすことができる薬学的に許容しうる担体を含む。有効用量は、一般的には、医師にたいてい既知である、企図された投与経路及び患者の年齢及び体重のような他の要因、及び治療される病気に基づく。通常、用量は、宿主動物の体重１kgあたり本ペプチド約0.01〜約１０mgである。炎症性疾患の治療については、通常、約0.1〜約１００mg/kgが用いられ、胃腸病並びに神経性食欲不振症、出血性ストレス、薬物及びアルコール離脱症候群の治療及び不妊症の治療については、約0.1〜約５０mg/kgが用いられる。一日量は、１回又は３回までに分けて投与される。前に述べたように、CRFレセプターはいまではクローン化されており、上記Che nらの論文、Perrin，M．ら，P.N.A.S，92，2969-2973（March 1995）、及びLove nberg，T．ら，P.N.A.S.，92，836-840(January 1995)に開示されている。結合親和性は、リガンドとレセプター間の相互作用の強度を表すために用いられる用語である。CRFレセプターに対する結合親和性を示すために、本発明のペプチドは、当該技術において周知の結合分析実験において¹²⁵I-放射能標識oCRF又は[D- Tyr¹²，Nle^21,38]-r/hCRF(12-41)のような既知の親和性を有するトレーサーリガンドを用いて容易に評価される。かかる分析の結果から、各リガンドがCRFレセプターに結合する親和性が示され、Ki，既知の標準に相対する阻害結合親和性定数として表される。Ki（阻害結合親和性定数）は、“標準”又は“トレーサー” 放射性リガンドを用いて求められるので、レセプター又は結合タンパク質からトレーサーの置換を測定し、そのトレーサーに対して最も適切に表される。しかしながら、それらの分析が比較的低濃度のレセプター等による特定の条件下に注意深く行われるかぎり、Kiの計算値は解離定数K_Dとほとんど同じである。解離定数 K_Dは、レセプターの結合部位の１／２（５０％）を占めるのに要するリガンドの濃度等を表す。単一のトレーサーのみが標識、例えば、¹²⁵Iで標識されるのに必要とすることからKiを試験することは特に効率がよい。CRFレセプターに対して高結合親和性を有するあるリガンドは、有効な結合部位の少なくとも５０％を結合するのにほとんどリガンドの存在を必要としないのでそのリガンドとレセプターに対するK_D値は小さな数である。一方、個々のCRFレセプターに対して低結合親和性を有するあるリガンドは、部位の５０％を結合するリガンドの比較的高レベルの存在を必要とするのでそのリガンドとレセプターに対する K_D値は大きな数である。個々のレセプタータンパク質に関して、K_Dが約１０nM以下のCRF類縁体ペプチドは、約１０nMより大きくないリガンド（即ち、CRF類縁体ペプチド）の濃度カルセプタータンパク質の活性結合部位の少なくとも５０％を占めるのに必要とすることを意味する。かかる数値は、¹²⁵Iで標識された標準及び約0.8nMを超えないレセプター（約１０〜２０ピコモルレセプター／mg膜タンパク質）を用いて得られた結果からかなり求められる。本発明によって提供された好ましいペプチドは、レセプター結合部位の少なくとも５０％を占める（又は結合する）ために約１０ナノモル以下のリガンド濃度が必要とされるような結合親和性(K_D)を有し、それらは親和性が高いとみなされる。それらのCRF類縁体ペプチドの結合親和性は、約２nM以下のものがある。通常、本用途のためには約５ナノモル以下の解離定数が強力な親和性を示すとみなされ、約２ナノモル以下のK_Dは極めて強力な親和性を示す。例えば、実施例ICの環状ペプチドは極めて強力な親和性でCRF-RAを結合し、K_D=約2.0ナノモルを有する。また、CRF類縁体ペプチドはCRF-RA及びCRF -RBレセプターの２つのファミリーの１つに親和性がかなり高いものがあるので生物学的作用が選択的であることが特に有利であると考えられる。 CRFレセプターを用いるこれらの結合分析は、実施するのに端的であり、かかるペプチドが有効なCRF拮抗剤であるらしいかを求めるために最初に同定又は合成されたペプチドで容易に行われる。かかる結合分析は、当業者に周知のような種々の方法で行われる。かかる分析の詳細な例は、Perrin，M．ら，Endocrinolo gyの論文に示されている。実施例IC又はIV Aのペプチドを用いる競合的結合分析は、候補が有効な拮抗剤であるかを求めるにあたって第１工程として候補的ペプチドが種々のCRFレセプター、例えば、CRF-RA、CRF-RB_L及びCRF-RBS_Sの各々に対して親和性が高いかを評価するために特に企図される。かかる分析において、適切な環状CRF拮抗剤は、放射性同位元素、例えば¹²⁵I、又は酵素又は他の適切な標識のような容易に検出される物質で適切に標識される。競合的結合分析の使用は、新規な薬剤の候補をスクリーニングするために、例えば、新規なCRF様ペプチド又はCRFレセプターに対して結合親和性の大きい又は選択的な他の化合物を同定するために特に有効とみなされ、従って、候補は薬剤として潜在的に有効である。分析では、標識ペプチドを置換する候補的拮抗剤の能力が求められる。前述のかかるスクリーニング分析は、潜在的CRFアゴニストをスクリーンするために放射能標識環状CRF拮抗剤、例えば、（シクロ30-33）[I¹²⁵ -D-Tyr¹²，Nle^21,38，Glu³⁰，D-His³²，Lys³³]r/hCRF(12-41)と用いられる。高親和性を有する標識CRF拮抗剤を用いる分析は、CRFの強力な拮抗剤をスクリーンするために用いられる。また、酵素又は他の適切な標識で標識される。本明細書に用いられる温度は全て℃であり、比率は全て容量である。低級アルキルは、Ｃ₁〜Ｃ₆を意味する。本発明を本発明者に現在わかった最良の方法を構成する好適実施態様について記載してきたが、当業者に明らかな種々の変更及び修正が下記の請求の範囲に示される発明の範囲から逸脱することなく行われる。例えば、薬学的に許容しうる塩及び他の匹敵する製剤は、詳細に挙げられていないが請求された本物質の等価物であることは明らかである。更に、詳細な説明の最初の一般式に示されたCRF ペプチド鎖の他の位置での置換及び修飾も、拮抗剤の効力を減じることなく行われる。この分野での開発により、分子内の13-15位、17-19位、24-29位、34位、3 6位、37位及び39〜41位の指定された種々の残基を有するペプチドがCRF活性を示すことがわかった。結果として、配列内の他の箇所での置換（記載された30-33 ラクタム結合を有する環状ペプチドのような）の結果として生物作用能が改善された特定のアミノ酸配列を有するr/hCRF拮抗剤は、多くの指定された置換が分子内の他の位置に組込まれるとしてもその改善された生物作用能を保持することが当該技術において十分に容認される。Ｎ末端のD-Pheの代わりにL-Phe又はTyr又は前述のものと一般的に類似した他の適切なD-異性体、例えば、D-Cpaも存在させることができ、等価であると考えられる。r/hCRF(12-41)のＮ末端は、Thr又は Ser、Leu-Thr又はSer-Leu、又はAsp-Leu-Thr又は他の適切な単一残基又はジ又はトリペプチドで伸長されるか及び／又は炭素原子１２個以下、好ましくは７個以下を有するアシル基、例えば、アセチルでアシル化され、かかる変更は等価なCR F拮抗剤を生成すると考えられる。Ala³¹をD-Ala³¹に置き換えることができ、未変性配列より良好に生物作用能を保持するので31位の等価物とみなされる。Ｃ末端の単純アミドの代わりに、低級アルキル置換アミド、即ち、炭素原子１〜４個、例えば、メチルアミド又はエチルアミドが組込まれる。ジスルフィド環化結合の代わりとして、カルバ又はジカルバ結合が用いられ（米国特許第4,115,554号参照）、等価結合とみなされる。等価ラクタム結合も側鎖Lys³⁰と Glu³³を結合することによりつくられる。しかしながら、上記に示された結合が好ましい。30-33ラクタム環化結合をつくるために反応されるアミノ基又は30-33 位の残基の１つのα−アミノ基はメチル基を加えるようにアルキル化される。かかる変更は等価な環状ペプチドを生じると考えられる。同様に、Amp、Aph、Lys 、Hly、Orn、Dbu、Dpr、Arg、Har又はAglのD-又はL-異性体が32位に存在する場合、ラクタム結合をつくる側鎖アミノ基は、低級アルキル基（C₁〜C₅）、例えば、メチル、エチル、イソプロピル又はイソブチルでアルキル化されてもよい。このような上記のペプチドは、全て本発明の範囲内であるとみなされる。¹²⁵Iで標識するために、例えば、Ｎ末端に、D-Tyrが含まれる場合、His³²又はD-His³²又はLys³⁶の代わりにAsn³²又はD-Asn³²又はD-Ala³²又はArg³⁶に置き換えることが好ましく、これらは等価物と考えられる。本発明の種々の特徴は下記の請求の範囲で強調される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】 1. 下記式を有する、CRFレセプターを著しく活性化せずにそのレセプターに結合するCRF拮抗剤環状ペプチド。式中、AはCRF様ファミリーの選択ペプチドの対応する配列の18〜21アミノ酸残基の配列であり; Xaa_cは環化結合で結合される側鎖を有するアミノ酸残基であり;XaaはCys以外の天然α−アミノ酸残基であり;D-XaaはD-異性体α−アミノ酸の残基であり;BはCRF様ファミリーの前記選択ペプチドのＣ末端部分の最後の８アミノ酸残基の配列であり、AはＮ末端で又はその近傍で天然α−アミノ酸のD-異性体を含むことができ、前記選択ペプチド配列におけるMetをNleに置換することができる。 2. 下記のアミノ酸配列を有する請求項１記載のCRF拮抗剤環状ペプチド。式中、R₁₂はD-Phe又はD-Tyrであり;R₃₀はGlu又はCysであり;R₃₂はHis、D-His 、D-Arg、D-Nal、D-Pal、imBzlD-His、D-Tyr又はD-Alaであり;R₃₃はLys、Orn 又はCysである;但し、R₃₀がCysである場合、R₃₃はCysであり、R₃₀がGluである場合、R₃₃はLys又はOrnであり、Ｎ末端はAsp-Leu-Thr、Leu-Thr又はThrで伸長することができる。 3. 下記のアミノ酸配列を有する請求項２記載のCRF拮抗剤環状ペプチド。 4. 下記のアミノ酸配列を有する請求項２記載のCRF拮抗剤環状ペプチド。 5. 下記のアミノ酸配列を有する請求項２記載のCRF拮抗剤環状ペプチド。 6. CRFレセプターをほとんど活性化せずにかかるレセプターに高親和性で結合するCRFレセプターに対する拮抗剤をスクリーニングする方法であって、下記工程を含む方法。 CRFレセプター、適切な標識を含む請求項２記載のペプチド、及び候補的拮抗剤を用いて競合的結合分析を行う工程及び前記標識ペプチドを置換する前記候補的拮抗剤の能力を求める工程。 7. 前記標識ペプチドが(シクロ30-33)¹²⁵I-D-Tyr¹²，Nle^21.38，Glu³⁰，Lys³³- r/hCRF(12-41)、又は(シクロ30-33)¹²⁵I-D-Tyr¹²，Nle^21.38，Glu³⁰，D-His³² ，Lys³³-r/hCRF(12-41)である請求項６拮抗剤のスクリーニン方法。 8. 下記のアミノ酸配列を有するCRF拮抗剤環状ペプチド。式中、YはH又は炭素原子７個までを有するアシル化剤であり;R₁₃はHis、Tyr又はGluであり;R₁₄はCML又はLeuであり;R₁₅はLeu又はCMLであり;R₁₇はGlu、CML 、Asn又はLysであり;R₁₈はVal、Nle又はMetであり;R₁₉はLeu、CML、Ile、Ala 又はAibであり;R₂₀はGlu、D-Glu、Cys又はHisであり;R₂₂はAla、D-Ala、Aib、 Thr、D-Thr、Glu又はD-Gluであり;R₂₃はArg、Cys、orn又はLysであり;R₂₄はAla又はAibであり; R₂₅はGlu u又はAspであり;R₂₆はGln、Asn又はLysであり;R₂₇はLeu又はCMLであり;R₂₈はA la又はAibであり;R₂₉はGln、Aib又はGluであり;R₃₀はGlu又はCysであり;R₃₁は Ala又はAibであり;R₃₂はHis、D-His、又はCys以外のα−アミノ酸のD-又はL- 異性体であり;R₃₃はLys、Orn又はCysであり;R₃₄はAsn又はAibであり;R₃₆はLys 、Orn、Arg、Har又はLeuであり;R₃₇はCML、Leu又はTyrであり;R₃₉はGlu、Aib 又はAspであり;R₄₀はIle、Aib、Thr、Asn、Glu、Ala、Val、Leu、Nle、Phe、N va、Gly又はGlnであり;R₄₁はAla、Ile、Gly、Val、Leu、Nle、Phe、Nva又はGl nであり;Thr、Leu-Thr又はAsp-Leu-ThrをＮ末端に含めてもよく;D-PheをD-Leu 、D-Tyr、D-Cpa、D-Nal又はD-Pal、又はPhe又はTyrで置換することができる; 但し、R₃₀がGluである場合、R₃₃はLys又はOrnであり、R₃₀がCysである場合、がCysである場合R₃₃はCysであり;第２環化結合はR₂₀とR₂₃間に存在することができる。 9. R₃₂がHis、D-His、D-Arg、D-Nal、imBzlD-His、D-Tyr、D-Asn、D-Cpa、D-Ph e、D-Pal、D-Lys、D-Dpr、D-Aph、D-Amp、D-Har、D-Dbu、D-Hly、D-Lys(Nic) 、D-Dpr(Nic)、D-Agl(Nic)、D-Orn(Nic)、D-Hly(Nic)、D-Lys(イソプロピル) 、D-Orn(イソプロピル)、D-Dpr(イソプロピル)、D-(低級アルキル)Arg、D-(低級ジアルキル)Arg、D-(低級アルキル)Har又はD-(低級アルキル)Ampである請求項８記載のCRF拮抗剤環状ペプチド。 10．下記のアミノ酸配列を有する請求項８記載のCRF拮抗剤環状ペプチド。 11．下記のアミノ酸配列を有する請求項８記載のCRF拮抗剤ペプチド。 12．下記のアミノ酸配列を有する請求項８記載のCRF拮抗剤環状ペプチド。 13．下記のアミノ酸配列を有する請求項８記載のCRF拮抗剤環状ペプチド。式中、YはAc又はHであり;R₁₂はD-Phe又はD-Tyrであり;R₁₈はVal又はNleであり ;R₁₉はCML、Leu、Ile、Ala又はAibであり;R₂₀はGlu、D-Glu、Cys又はHisであり;R₂₂はAla、D-Ala、Aib又はThrであり;R₂₃はArg、cys、orn又はLysであり; R₂₄はAla又はAibであり;R₂₅はAsp又はGluであり;R₂₇はLeu又はCMLであり;R₂₈ はAla又はAibであり;R₃₀はGlu又はCysであり;R₃₁はAla又はAibであり;R₃₂はD- His imBzlD-His、D-Arg、D-2Nal、又は他の塩基性及び／又は芳香族α−アミノ酸のD-異性体であり;R₃₃はLys、Orn又はCysであり;R₃₄はAib又はAsnであり; R₃₉はGlu又はAspであり;R₄₁はAla又はIleであり;Thr、Leu-Thr又はAsp-Leu-Th rをＮ末端に含めてもよい;但し、第２環化結合をR₂₀とR₂₃間に存在させることができる。 14．R₁₈がValであり、R₂₂がAlaであり、R₂₃がArgであり、R₂₄がAlaであり、R₂₅がGluであり、R₂₈がAlaであり、R₃₉がGluであり、R₄₁がIleである請求項11記載のCRF拮抗剤環状ペプチド。 15．下記のアミノ酸配列を有する請求項８記載のCRF拮抗剤環状ペプチド。式中、YはAc、H、Ac-Thr又はH-Thrであり;R₁₈はVal又はNleであり;R₂₀はGlu、 D-Glu、Cys又はHisであり;R₂₂はAla、D-Ala又はThrであり;R₂₃はArg、Cys、Or n又はLysであり;R₂₅はAsp又はGluであり;R₂₉はGln又はGluであり;R₃₀はGlu又はCysであり;R₃₂はHis、D-His、D-Arg、imBzlD-His、D-Nal、D-Glu、D-Ala、 D-Pal、D-Dpr(Nic)、D-Dpr（イソプロピル）、D-Aph、D-Amp、D-Har、D-Agl(N ic)、D-Lys(イソプロピル)、D-Orn、D-Dbu、D-Dpr、D-Hly、D-Hly(Nic)、D-Ly s(Nic)、D-Orn（Nic）、D-Orn(イソプロピル)、D-(アルキル)Arg、D-(ジアルキル)Arg又はD-(ジアルキル)Harであり;R₃₃はLys、Cys又はOrnであり;R₃₄はAs n又はAibであり;R₃₆はLys又はLeuであり;R₃₉はGlu又はAspであり;R₄₀はIle又はGluであり;R₄₁はIle又はAlaであり;Leu又はAsp-LeuはＮ末端でThrに結合されてもよい;但し、R₃₀がCysである場合、R₃₃はCysであり;R₃₀がGluである場合、R₃₃はOrn又はLysであり;Ｎ末端のD-PheをD-Tyr又はD-Leu又はPheに置き換えることができ、第２環化結合をR₂₀とR₂₃間に存在させることができる。 16．下記のアミノ酸配列を有する請求項８記載のCRF拮抗剤環状ペプチド。式中、YはAc、H、Ac-Thr又はH-Thrであり;R₁₄、R₁₅、R₁₉、R₂₇及びR₃₇は独立してLeu又はCMLであり;R₁₇はGlu又はCMLであり;R₂₃はArg又はLysであり;R₃₀は Glu又はCysであり;R₃₂はHis、Asn、D-His、 imBzlD-His、D-Arg、D-Ala、D-Nal又は他の塩基性及び／又は芳香族D-異性体 α−アミノ酸であり;R₃₃はLys、Orn又はCysであり;Leu又はAsp-LeuはＮ末端で Thrに結合されてもよい;但し、R₃₀がCysである場合、R₃₃はCysであり、R₃₀がG luである場合、R₃₃はLys又はOrnである。 17．下記のアミノ酸配列を有する請求項８記載のCRF拮抗剤環状ペプチド。式中、YはAc、H、Ac-Thr又はH-Thrであり;R₂₇はLeu又はCMLであり;R₃₂はCys以外のα−アミノ酸のL-又はD-異性体であり、Leu又はAsp-LeuはＮ末端でThrに結合されてもよい。 18．R₃₂がHis、D-His、imBzlD-His、D-Arg、D-Nal又は他の塩基性及び／又は芳香族D-異性体α−アミノ酸である請求項17記載のCRF拮抗剤環状ペプチド。 19．YがAc-Thrであり;R₂₇がCMLであり、R₃₂がHis、D-His又はD-Argである請求項 17記載のCRF拮抗剤環状ペプチド。 20．下記のアミノ酸配列を有する請求項８記載のCRF拮抗剤環状ペプチド。式中、YはAc、H、Ac-Thr又はH-Thrであり;R₃₂はHis、D-His、Asn、D-Asn又はD -Alaであり、R₃₆はLys又はArgである。 21．下記の工程を含むCRFレセプターに対するリガンドのスクリーニング方法。 CRF拮抗剤環状ペプチド、適切な標識を含む請求項13記載のCRF拮抗剤環状ペプチド、及び候補的リガンドを用いて競合的結合分析を行う工程及び前記標識ペプチドを置換する前記候補的リガンドの能力を求める工程。