KR970009353B1

KR970009353B1 - 초고활성 인체 인슐린 동족체

Info

Publication number: KR970009353B1
Application number: KR1019890700480A
Authority: KR
Inventors: 지. 캇소야니스 파나요티스; 피. 슈바르쯔 제랄드
Original assignee: 마운트 시나이 스쿨 오브 메디신 오브 더 시티 유니버시티 오브 뉴욕; 베쓰 에씨히
Priority date: 1987-07-17
Filing date: 1988-07-07
Publication date: 1997-06-10
Also published as: KR920700227A; AU2126988A; WO1989000580A1; US4992418A; DK13990A; AU616131B2; JP2729498B2; FI98731B; HUT54178A; EP0382732A1; HU205145B; DE3887338T2; EP0382732B1; JPH02504274A; DK13990D0; FI900249A0; DE3887338D1; FI98731C

Abstract

내용 없음.

Description

초고활성 인체 인슐린 동족체

제1도는 CM-셀룰로오스 컬럼으로부터의 조(組) 인체[10-아스파르트산] B 사슬 S-술포네이트의 용리를 나타내는 크로마토그램 도면임.

제2도는 인체 A 사슬 S-술포네이트와 인체[10-아스파르트산] B 사슬 S-술포네이트와의 배합 혼합물의 용리를 나타낸 HPLC 크로마토그램 도면임. 판넬 A는 초기의 크로마토그래프적 분리를 나타내며 판넬B는 판넬 A에 나타난 32,33분경에 용리된 피크의 물질을 재크로마토그래피 처리한 것을 나타낸 도면임.

제3도는 [10-아스파르트산-B] 인체 인슐린(_O)과 소의 인슐린(·)에 의한¹²⁵I-인슐린의 쥐의 간 플라스마 인슐린 섭수체에의 결합의 경쟁적 저해를 나타낸 그래프임.

제4도는 쥐의 지방세포에서의 지방생합성 자극에 미치는 [10-아스파르트산-B] 인체 인슐린과 소의 인슐린의 영향을 나타내는 도면임.

제5도는 CM-셀룰로오스 컬럼으로부터의 조인체 데스-펜타펩티드(B26-B30]-[Asp10, Tyr -α-카르복사미드 25] B 사슬 S-술포네이트의 용리를 나타낸 크로마토그램 도면임.

제6도는 인체 A 사슬 S-술포네이트와 인체 데스-펜타펩티드(B-26-B30)-[Asp10, Tyr-α-카르복사미드 25] B-술포네이트와의 배합 혼합물의 용리를 나타낸 HPLC 크로마토그램 도면임. 판넬 A는 초기 크로마토그래피 분리를 나타내는 도면이고 판넬B는 판넬 A에서 나타난 36.86분경의 용리 피크의물질을 재크로마토그래피 처리한 것을 나타낸 도면임.

제7도는 데스-펜타펩티드(B26-B30)-[Asp^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드]인체 인슐린(_O)과 소의 인슐린(o)에 의한¹²⁵1-인슐린의 쥐의 간 플라스마 인슐린 섭수체에의 결합의 경쟁적 저해를 나타낸 도면임.

제8도는 쥐의 지방세포에서의 지방 생합성 자극에 미치는 데스-펜타펩티드(B26-B30)-[ Asp^B10,Tyr^B25-α-카르복사미드]인체 인슐린과 소의 인슐린의 양향을 나타내는 도면임.

본 출원은 1987년 7월 17일자 출원된 미합중국 출원번호 제074,558호의 일부 계속출원임을 밝혀둔다.

본 발명은 신규의 초고활성 인슐린 동족체 및 당뇨병 치료를 위한 이들의 약리적 조성물로서의 용도에 관한 것이다.

인슐린은 척추동둘에 있어서 성장 및 대사의 핵심적인 역할을 하는 호르몬이다. 인슐린 부재시에는 많은 세포가 포도당과 아미노산을 정상적으로 이용할 수 없게 되어 심각한 대사적 교란이 발생된다. 사람에 있어서 포도당을 대사시킬 수 없으면 탄수화물, 지방 및 단백질 대사가 비정상적으로 되는 만성복합 대사질환인당뇨병이 된다. 임상적으로 가장 완전히 발현된 상태에서 당뇨병은 인슐린 혹은 인슐린 활성이 절대적으로 또는 상대적으로 결여되어 있다는 것으로 특징지어지고 당뇨, 케톤뇨, 발육부진 및 음성적인 질소균형과 관계있다. 이러한 상태는 케톤체 생산에 필요한 지질 보유량이 결여된 데서 비롯되는 영양분 흡수부족( inanition)이나 또는 지방산이 과도한 산화에 기인하는 급성적인 대사적 애시도시스(acidosis)에 의해 급기야는 사망에 이르게 한다. 필수영양분 흡수부족, 즉 인애니션이란 장기적이고도 심각한 음식물 섭취부족에서 비롯된 현저한 쇠약, 극도의 체중손실 및 대사저하로 특징지어지는 상태로 정의된다. Doland's Illustrated Medical Dictionary, 25판.

1920년대의 인슐린의 발견 및 정제 그리고 이것과 당뇨병과의 관계는 이 질병에 개재할 수단을 제공해 주었다. 예컨대 Bliss, The Discovery of Insulin(1983), University of Chicago Press, Chicago, I11 참고. 오늘날, 당뇨병 환자에게 인슐린을 투여하는 것은 이 질병을 치료하는 최우선의 치료 수단이 되었다.

인슐린은 6000달톤의 폴리펩티드로서 불변의 디술파이드 결합에 의해 서로 연결된 A 및 B라 명령된 2개의 짧은 펩티드 사슬로 이루어져 있다. 거의 모든 인슐린 연구에 있어서, 아미노산 21개의 길이인 A 사슬은 내부의 디술파이드 결합도 함유한다. B 사슬은 그 길이가 30개의 아미노산에 달한다. 많은 진핵단백질과 마찬가지로, 인슐린은 일단 전구체 형태로 합성되어 후에 2개의 성숙한 폴리펩티드 사슬의 활성 호르몬으로후 합성된다.

인슐린의 직접적인 전구체는 프로인슐린으로서 이것은 인접한 염기잔기쌍에 의해 C-펩티드라 불리는 약 31 아미노산으로 된 연결 펩티드에 연결된 B 및 A 사슬로 이루어진 단일 사슬의 폴리펩티드이다. 프로인슐린 분자의 3가지 펩티드의 순서는 NH₂-B 사슬-Arg-Arg-C-펩티드-Lys-Arg-A 사슬-COOH이다.

그러나, 인슐린 mRNA의 번역 산물은 세포막을 통과하거나 그에 삽입되는 특징을 갖는 단백질인 24개 아미노산으로된 커다란 소수성 시그날 펩티드를 그의 NH₂말단에 함유하는 프로인슐린인 프리프로인슐린(preproinsulin)이다.

프리프로인슐린은 췌장 전반에 걸쳐 분포하는 랑게르한스섬 사이에 위치하는 췌장 베타세포에서 합성된다. 시그날 펩티드의 제거는 소포체에서 일어나며 이와함께 완전히 뭉쳐진 산화 프로인슐린으로 되어 분비형 과립으로 패키징되기 위해 골지체로 운반된다. 뭉쳐진 프로인슐린은 디술파이드 결합에 의해 안정화된다. 분비형 과립으로 성숙되는 동안, 뭉쳐진 프로인슐린 분자는 특이적인 단백질 분해효소에 의해 짝지어진 염기 잔기에서 절단되어 인슐린과 C-펩티드를 방출시킨다.

상술한 바와 같이, 당뇨병 치료는 당뇨병 환자에게 조절량의 인슐린을 투여하는 것을 포함한다. 이렇게 투여되는 인슐린은, 대부분 동물의 췌장, 특히 소와 돼지의 췌장으로부터 얻어왔다. 소와 돼지의 인슐린은 인체 인슐린과 동일한 방식으로 서의 동일한 강도로서 호르몬의 생체 항상성을 유지시키는 기능을 하지만, 이들은 외래 단백질이기 때문에, 이들의 유효성을 저하시키는 면역반응을 이끌어낼 수 있다. 최근에는, 재조합DNA 기술에 의해 생산된 인체 인슐린은 동물의 인슐린을 사용할때 나타나는 나쁜 면역적 문제점들을 야기하지 않을것으로여겨진다. 그러나, 자연적인 인체 인슐린을 구할 수는 있으나, 당뇨병 환자에게 이 호르몬을 투여하는 것이 항상 정상적인 대사활동으로 회복시키지는 못하였다. 따라서 보다 활성이 우수한 대체적인 인슐린이나 또는 당뇨병 치료를 위한 다른 수단이 필요하게 되었다.

혈통적인 프로인슐린과다증(hyperproinsulinemia)은 혈청중에 프로인슐린-유사분자가 현저히증가하는 것으로 특징지어지는 유전적 질환이다. 이 희귀한 질병에는 3가지 유형이 있는 것으로 밝혀졌다. 그중 두가지에서는 구조적으로 비정상적인 프로인슐린-유사분자가 관찰되었다. 이러한 유전적 결함은 프로인슐린에 있어서 아미노산 치환을 일으키는 돌연변이로 밝혀졌는데 이는 인슐린을 생성시키는 단백질 가수분해에 의한 프로인슐린의 불완전 분해를 초래한다.

세번째 유형의 병에 걸린 사람은 프로인슐린과 크기가 거의 동일한 프로인슐린-유사분자를 생산하였으며이는 섭수체 결합분석에서 정상적인 프로호르몬과 비슷하게 행동하였다. 이 세 번째 유형의 병에 걸린 두사람으로부터 얻은 클론된 인슐린 유전자의 배열 분석결과 이것은 인슐린의 B 사슬의 위치 10에 해당하는 위치에서 프로인슐린 분자의 히스티딘이 아스파르트산으로 치환된 단일의 암호 변이가 발생한 것으로 밝혀졌다. Chan외, Proc, Natl. Acad. Sci.(1987), 84권. pp2194-2197. 이 변이는 프로인슐린이 인슐린으로 계속 가동되는 것을 저해하여, 결국 변이 프로인슐린이 축적되는 결과를 초래한다. 이러한 변이가 계속적인 가공을 억제하는 정확한 경로는 현재 알려져 있지 않다. 요즈음 이 변이 프로인슐린에 해당하는 인체 인슐린 동족체인 [10-아스파르트산-B] 인체 인슐린이 합성되 자연산 인슐린보다 더 강력한 활성을 갖는 것으로밝혀졌다.

또한 인슐린의 B사슬의 카르복실 말단의 성분들이 인슐린의 생물 활성에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 특히, B25 부위는 인슐린 동족체의 강도에 있어서도 어떤 역할을 하는 것으로 나타났다.

인슐린의 B-사슬의 C-말단 펜타펩티드 배열을 제거하고, 새로이 형성된 C-말단의 카르복실기, Phe B25를 아미드화시키면 동족체인 데스-펜타펩티드(B25-B30)-[Phe^B25-α-카르복사미드]인슐린이 생성되며, 이는 자연산 호르몬에 필적할만한 강도를 나타낸다. Nakagawa외, J.Biol. Chem., 261:7331-41(1986); Cosmatos외, Int. J. Pept. Prot. Res, 14:457-71(1979); Casareto외, Biol. Chem. Hoppe-Seyler,368:709-16(1987)참고 Phe B25를 몇가지 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것과 이 치환된 인슈린의 B26-B30 부위를 다양하게 변형시키면 거의 불활성인 것에서부터 자연산 인슐린보다 활성이 높은 것이 이르기까지 다양한 강도를 갖는 동족체가 만들어진다. Nakagawa외, J. Biol. Chem., 261, 상기 문헌; Casareto외, 상기 문헌; Nakagawa,외, J.Biol. Chem., 262:10254-58(1987) 참고. 이중에서, 데스-펜타펩티드(B26 - B30)-[Tyr^B25-a-카르복사미드]인슐린과 그의 His^B25동족체는 인슐린보다 270-300%나 더큰 활성 강도를 나타낸다. 이러한 연구에 기초하여, 인슐린의 B25 아미노산 잔기가 섭수체와 상호반응함으로써, 호르몬-섭수체 결합에 관련된 인슐린 분자의 아직 정의되지 않은 영역에서 형태적 변형을 개시한다는 설이 제안되어 왔다. B25-섭수체의 상호반응은 B25 잔기에 대한 변형의 특성과 B 사슬 C-말단 영역이 변형된 정도에 의존하여 C-말단 B-사슬 영역에 의해 양성적으로나 혹은 음성적으로 변형될 것이다. Nakagawa외, J. Biol. Chem., 261, 상기 문헌; Casareto, 상기 문헌; Nakagawa외, J. Biol . Chem. 262, 상기문헌

또다른 인체 인슐린 동족체인 데스-펜타펩티드(B26-B30)-[Asp^B20,Tyr^B25-α-카르복사미드]인슐린도 합성되었으며 자연산 인슐린보다 훨씬 큰 강도를 나타내었다.

본 발명에 따라, 다음의 구조를 갖는 초고활성의 인슐린 동족체[10-아스파르트산-B] 인체 인슐린이 제공된다.

이 인슐린 동족체(여기서 10-아스파르트산-B)는 B 사슬의 위치 10에 히스티딘을 갖는 자연산 인체인슐린보다 그 강도가 훨씬 크다.

본 발명에 따라, 다음의 구조를 갖는 초고활성 인슐린 동족체 데스-펜타펩티드(B26-B30)- [Asp^B10,Tyr^B25-α-카르복사미드]인체 인슐린[여기서 Asp^B10동족체)도 제공된다.

B 사슬의 10위치에서의 변화에 덧붙여 B26-B30 부분이 제거되고 Phe B25는 Tyr-α-카르복사미드로 대치되었다. 이 인슐린 동족체는 [10-아스파르트산-B]인체 인슐린보다도 더 강한 활성을 나타낸다.

또다른 동족체인 데스-페타펩티드(B26-B30)-[Glu^B10, Tyr^B25-α-카르복사미]인체 인슐린(여기서 Glu^B10동족체)은 위치 B10에 Asp를 갖는 전기의 동족체들과는 달리 B10 위치에 Asp 대신 Glu를 함유하며 다음의 구조를 갖는다.

이 인슐린 동족체는 자연산의 인슐린보다 적어도 20배는 더 활성적이다.

데스-펜타펩티드(B26-B30)-[X^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드]인슐린 분자(여기서 X는 치환될 잔기임)에 있어서 B10 아미노산 잔기(X)를 α-아미노-아디프산이나 또는 고급 동족체 또는 심지어 다른 비자연산의 산성 아미노산으로 치환하면 활성 강도가 더 큰 인슐린 동족체가 될 것으로 믿어지고 있다. 또한 B10위치에서 치환된 산성 아미노산 골격의 소수적 특성은 이 동족체들에 의해 나타내지는 보다 강한 강도에 기여하는 인자로 여겨지고 있다. 결과적으로 고리구조 혹은 열린 사슬구조로, 또한 유리카르복실이나 기타 전하를 띤 부분을 내는, 소수성 골격을 갖는 여러가지 아미노산으로 B10 아미노산 잔기(X)를 치환해도 고도로 강력한 기타의 인슐린 동족체가 만들어진다.

본 발명은 또한 [10-아스파르트산-B]인체 인슐린, 데스-펜타펩티드(B26-B30)-[Asp^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드]인체 인슐린, 데스-펜타펩티드(B26-B30)-[Glu^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드] 혹은 고급 B10 동족체로 이루어진 군에서 선택된 앤체 인슐린 동족체의 치료적 유효량과 약리적으로 허용되는 담체로 이루어진 당뇨병 환자의 치료에 이용되는 약리적 조성물에도 관련된다.

더우기, 본 발명은 [10-아스파르트산-B]인체 인슐린, 데스-펜타펩티드(B26-B30)-[Asp^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드]인체 인슐린, 또는 기타의 상술한 어떠한 B10 동족체중에서 선택된 인체 인슐린 동족체의 치료적 유효량과 함께 약리적으로 허용되는 담체를 인슐린 요법을 필요로하는 당뇨병 환자에게 투여하는 것으로 이루어지는 당뇨병의 치료법에도 관계한다.

본 발명은 다음의 구조를 갖는 초고활성 인슐린 동족체 [10-아스파르트산-B]인체 인슐린을 제공한다.

본 발명은 또한 다음의 구조를 갖는 초고활성의 인슐린 동족체인 데스-펜타펩티드(B26-B30)-[Asp^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드]인체 인슐린과

GluB¹⁰, α-아미노-아디프산^B10또는 고급 B10 동족체도 제공한다.

인슐린 동족체라는 용어는 인체(및 기타 다른 종) 인슐린의 기본적인 A 사슬 및 B 사슬 구조를 가지면서 자연산 인슐린에 존재하는 것과 동일한 위치에서 시스테인 잔기 절반의 모두를 함유하는 단백질을 말한다. 그러므로, 인슐린 동족체는 자연산 인슐린의 디술파이드 결합 배열을 유지한다. 유용한 인슐린 동족체는 이 분자의 하나 또는 양 사슬 모두에서 한가지 이상의 아미노산을 첨가, 결실, 치환 또는 변형시킴으로써 자연산 인슐린과 차이가 날 수 있으나, 인슐린 강도의 적어도 어떤 부분은 유지하여야만 한다. Katsoyannis, Treatment of Early Diabetes(1979), pp319-327, Plenum Publ. Corp. ; Blondell, Adv. Prot. Chem(1972), 26권, pp.330-362 참고.

B 사슬의 위치 10에서 히스티딘이 아스파르트산이나 글루탐산으로 치환되거나/또는 B26 -B30 부분이Tyr-α-카르복사미드와 함께 PheB25 치환에 의해 제거됨으로써 인체 인슐린과 구별되는 본 발명의 인슐린 동족체들은 예기치 않게도, 특히 당뇨병 치료에 사용될때 자연산 인슐린보다 훨씬 큰 강도를 갖는 것으로 밝혀졌다.

[10-아스파르트산-B]인체 인슐린, 데스-펜타펩티드(B26-B30)-[Asp^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드]인체 인슐린 또는 기타의 B10-치환 동족체들은 관련기술분야에 숙련된 자들에게 잘 알려진 여러가지 기술에 의해 생산될 수 있다. 예컨대, 인슐린 동족체의 성분인 A 및 B 사슬은 고상 펩티드 합성기술과 고체기술, 예컨대 단편 축합기술과 같은 공지의 펩티드 합성기술에 의해 합성할 수 있다. 펩티드 합성기술로 Erickson및 Merrifield, The Proteins(1976), 2권 제3장, Academic Press, New York ; Blake외. Proc. Natl. Acad Sci(1983), 80권, pp1556-1559참고. 인체 인슐린 동족체는 또한 본래의 췌장 인슐린이나 재조합 인슐린을 환원적 혹은 산화적으로 아황산분해처리하여 분리시킨 인간이나 돼지의 A 사슬을 [10-아스파르트산], 데스-펜타펩티드(B26-B30)-[Asp10, Tyr-α-카르복사미드 25] 또는 Glu^B10B 사슬 또는 펩티드합성기술이나 재조합 DNA 기술로 제조한 그의 동족체와 결합시켜 제조할 수도 있다. 돼지와 사람의 인슐린의 A 사슬은 그 아미노산 배열이 서로 동일하기 때문에, [10-아스파르트산-B]인체 인슐린, 데스-펜다펩티드(B26-B30)-[Asp^B10,Tyr^B25-α-카르복사미드] 또는 Glu^B10,인체 인슐린 동족체를 제조하는 어떠한 방법에서도 사람의 A 사슬 대신 돼지의 A 사슬을 용히가게 사용할 수 있는 것으로 알려져 있다. 또다른 A 사슬 동족체도 본 발명의 변경된 B 사슬과 결합시킬 수 있다.

위치 10에 아스파르트산, 글루탐산, 또는 α-아미노-아디프산 또는 고급 동족체를 가지거나/또는 B26-B30 부위가 제거되고 위치 25에서 phe 대신 Tyr-α-카르복사미드로 인체 인슐린 B 사슬을 제조하는 재조합 DNA 기술에는 B 사슬 아미노산 배열과 같은 것을 암호화하는 생체외 합성 DNA의 클로닝 및 발현을 들수 있으나 이에 한정시키는 것은 아니다. 다른 한편, 인체 인슐린 B 사슬을 발현시키는 세균과 같은 생명체는 생체외 부위-지향된 돌연변이 기술중 그 어느것에 의해서도 변형된 B 사슬을 생산하도록 유도될 수 있다. 에컨대 Smith, Ann, Rev, Genet.(1985), 19권, pp423-463 ; Botstein외. Science(1985),29권, pp1193-1201 참고.

일반적으로, [10-아스파르트산-B]인체 인슐린, 데스-펜타펩티드(B26-B30)-[Asp^B10,Tyr^B25-α-카르복사미드]인체 인슐린, 또는 기타 B10 변형 동족체들을 제조하려면, 공지기술에 의해 얻은 사람이나 돼지의 인슐린 A 사슬을 편리한 기술을 사용하여 제조한 변형된 사람의 B 사슬과 결합시킨다, A 사슬과 변형된 B사슬은 그들의 안정된 S-술포네이트 형태로 있는 것이 바람직하며 이것을 다음 공지의 절차로 재결합시켜 본연의 활성적인 인체 인슐린 동족체를 생성시킬 수 있다. 공지의 재결합 기술로는 Katsoyannis의 미합중국 특허 제3,420,810호와 Chance등의 미합중국 특허 제4,421,685호를 들 수 있다.

예컨대, 미합중국 특허 제4,421,685호는 인슐린을 생성하는 단일단계로된 공정을 제공하는데 이 공정은 수성매질중에서 디티오트레이톨이나 시스테인과 같은 티올 환원제의 존재하에서 S-술포네이트화된 A 사슬과 S-술포네이트화된 B 사슬을 한데 합치는 것을 포함한다. 재조합기술의 공정의 조건에는 (1) pH는 약 8내지 12 (2) 총 단백질 농도 약 0.1 내지 50mg/ml 및 (3) 혼합물에 존재하는 총 A 및 B 사슬 S-술포네이트에 존재하는 각각의 S-SO₃기당 약0.4 내지 2,5개의 SH기를 생산하는 농도만큼의 티올 환원제가 포함된다. [10-아스파르트산-B]인체 인슐린, 데스-펜타펩티드(B26-B30)-[Asp^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드]인체 인슐린, 또는 기타의 어느 B¹⁰치환 동족체의 생성은 인슐린 S-S 결합을 형성하게 하는 산소원을 제공하는 환경에서 약 0 내지 25℃의 온도에서 반응을 유지함으로써 일어난다.

일단 재조합 반응이 완결되면, 인슐린 동족체는 기술분야에 숙련된 자에게는 잘 알려진 여러가지 기술에의 순도 및 활성 측정을 위해 분리 및 분석될 수 있다. 인슐린과 인슐린 동족체의 순도 측정에 흔이 사용되는 기술은 고속 액체 크로마토그래피( HPLC), 겔 여과 및 이온-교환 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 기술이다. 생성물의 순도는 그중에서도 HPLC, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 아미노산 분석 및 아미노산 배열분석등과 같은 열러기술로 측정할 수 있다.

일반적으로, 인슐린 동족체는 어떤 잔기의 인슐린 활성은 유질하지만, 이러한 동족체의 강도는 대개 그 자연산 인슐린의 강도의 일부분일 따름이다. 미합중국 약전 기준에서 사람, 소 및 돼지의 인슐린은 단백질 mg당 약 25-26IU(국제단위)이다. 놀랍게도 [10-아스파르트산-B]인체 인슐린은 인슐린 강도를 측정한 분석실험결과 자연산 인슐란보다 약 4-6배나 더 강력했고, 데스-펜타펩티드[B26-B30]-[Asp^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드]인체 인슐린은 자연산 인슐린보다 약 11-13배 더 강력했고 Glu^B10동족체는 자연산 인슐린보다 약 20배가 더 강했다.

인슐린 강도를 측정하는 표준 분석법에는 그중에서도 (1) 인슐린의 상대적인 강도를 세포막, 예컨대 쥐의간플라스마 막 단편에 존재하는 인슐린 섭수체에 특이적으로 결합하는¹²⁵1-인슐린의 50%를 대체시키는데 요구되는 인슐린 대 인슐린 동족체의 비율로 정의하는 인슐린 인슐린 방사능 섭수체 분석; (2) [3-³H]글루코오스의 유기-추물물질(예컨대 지질)로의 최대 전환의 50%를 달성하는데 요구되는 인슐린 대 인슐린동족체의 비율로서 상대 인슐린 강도를 정의하는, 예컨대 쥐의 지방세포에 행하는 지방생합성 분석; (3)글루코오스-1-[¹⁴C]의 [¹⁴CO₂]로의 최대 전환의 50%를 달성하는데 요구되는 인슐린 대 인슐린 동족체의비율로서 상대 인슐린 강도를 정의하는 분리시킨 지방 세포에서의 글루코오스 산화 분석법; (4) 인슐린 또는 인슐린 동족체가¹²⁵I-인슐린과 경쟁적으로 특이적인 항-인슐린 항체에 결합하는 유효성을 측정함으로써 인슐린 동족체의 면역성을 측정하는 인슐린 방사능 면역분석법; 및 (5) 특이한 인슐린 섭수체를 갖는것으로 알려진 배양 임파구와 같은 세포에 인슐린 또는 인슐린 동족체가 결합하는 것을 측정하는 기타분석법, 상기의 (1),(2) 및 (5)의 분석법과 같이, 상대적인 인슐린의 강도를 측정하는 표준 분석법에서, [10-아스파르트산-B]인체 인슐린은 자연산 인슐린보다 4-6배 강한 것으로 측정되었고, 데스-펜타펩티드(B26-B30)-[Asp^B10,Tyr^B25-α-카르복사미드]인체 인슐린은 자연산 인슐린보다 11-13배 더 강력한 것으로 밝혀졌으며 Glu^B10동족체는 자연산 인슐린 보다 20배 더 강력하였다.

본 발명의 인체 인슐린 동족체는 또한 당뇨병 환자에게 투여하기 위해 약리적 조성물로 조성될 수 있다. 약리적 조성물은 [10-아스파르트산-B]인체 인슐린, 데스-펜타펩티드(B26-B30) -[Asp^B10,Tyr^B25-α-카르복사미드]인체 인슐린 또는 기타의 어떤 B10 동족체 중에서 선택한 인체 인슐린 동족체를 당뇨병 환자에 있어서 호르몬의 생체 항상성을 얻는 것을 촉진시키는데 치료적으로 유효한 양만큼 함유하고 약리적으로허용되는 담체로 함께 함유된다. 당뇨병 치료용의 모든 인슐린 조제와 마찬가지로, 각 환자에 있어 호르몬의 생체 항상성을 얻는데 적절한 치료적 유효량만큼 활성 화합물을 측정하여야 한다. 고려하여야 할 인자로는 당뇨병 증상의 위중도와 조성물의 투여경료를 들 수 있다. 궁극적으로는 당뇨병 환자를 치료하는 각 의사가약리적 조성물의 양 및 투여경로에 대한 자유재량권을 갖는다. 자연산 인슐린은 대개 1일에 체중 1kg중 인체 인슐린 활성이 약 0.02 내지 약 5단위가 되도록 하는 치료량으로 주어진다. 예컨대 미합중국 특히 제4,652,547호 참고.

이 신규의 인슐린 동족체들은 생체외에서 자연산 인슐린보다 더 강력하기 때문에, 당뇨병 환자에 있어 생체 항상성을 달성하는데 필요한 이들의 치료량은 현재 당뇨병 치료에 사용되는 자연산 인슐린의 치료량보다적을 것으로 믿어진다. 덧붙어, 이 인슐린 동족체들의 또 다른 중요한 장점은 당뇨병 환자의 혈액으로부터의청소율이 빠르다는 것이다.

[10-아스파르트산-B)인체 인슐린은 인슐린 섭수체에 자연산 인슐린보다 약 5배가 더 단단히 결합하고,데스-펜타펩티드(B26-B30)-[Asp^B10, Tyr²⁵-a-카르복사미드]인체 인슐린은 11 내지 13배, 그리고Glu^B10동족체는 20배나 더 단단히 결합하는 것으로 나타났기 때문에, 이 인슐린 동족체들은 자연산 인슐린보다 더 빠른 속도로 환자의 혈액으로부터 청소될 것으로 믿어진다. 결과적으로, 당뇨병 치료에 있어서, 순환인슐린의 발육 촉진 효과와 연관된 혈관독성은 [10-아스파르트산-B)인체 인슐린, 데스-펜타펩티드(B26-B30)-[Asp^B10,Tyr^B25-a-카르복사미드]인체 인슐린, Glu^B10동족체, 또는 기타의 a-아미노-아디프산또는 고급 B10동족체를 사용함으로써 감소시킬 수 있을 것으로 믿어진다.

[10-아스파르트산-B)인체 인슐린, 데스-펜타펩티드(B26-B30)-[Asp^B10, Tyr^B25-a-카르복사미드]인체 인슐린, GluB10동족체 또는 기타 a-아민-아디프산이나 고급 B10동족체 중에서 선택한 인슐린 동족체의치료적 유효량을 함유하는 약리적 조성물을 인슐린 치료를 요하는 당뇨병 환자에게 비경구적으로 투여할 수 있다. 바람직게는 이 조성물은 근육내, 피하 또는 정맥내로 투여하는 것이 좋다. 이 조성물은 또한 환자의코속으로 분무하는 방식으로 투여해도 된다. 다른 한편, 장기간의 조절적인 생체 항상성을 위해서는 환자에투여하기 위해 조성물을 이식가능한 펌프에 삽입시켜야 한다. 장기간동안 환자에게 조절적인 양으로 약물을제공하는이러한 이식가능한 장치는 기술분야에 알려져 있다. 이 조성물은 환자에게 해롭지 않아야 하는 약리적으로 허용되는 담체를 추가로 함유한다. 이 담체는 또한 조성물의 활성성분, 즉, 인체 인슐린 동족체에어떠한 악영향도 미쳐서는 안된다. 적합한 담체와 활성성분으로서 약리적 유효량 만큼의 [10-아스파르트산-B)인체 인슐린 또는 데스-펜타펩티드(B26-B30)- [Asp^B10, Tyr^B25-a-카르복사미드]인체 인슐린 또는 Glu^B10동족체를 인슐린 함유 조성물을 제공하는 미합중국 특허 제4,652,547호에서 찾을 수 있다.

본 발명을 다음의 특정 실시예를 들어 더욱 상세히 설명할 것이지만 결코 본 발명의 이 실시예들에 한정시키는 것은 아니다. [10-아스파르트산-B]인체 인슐린과 데스-펜타펩티드(B26-B30)-[Asp^B10,Tyr²⁵-a-카르복사미드]의 특정예의 합성방법을 나타내었으나, Glu^B10, a-아미노-아디프산^B10또는 기타의 고급B10동족체의 합성에도 동일한 공정을 사용할 수 있다.

[10-아스파르트산-B]인체 인슐린의 합성

[10- 아스파르트산-B]인체 인슐린을 단면 축합기술을 이용한 펩티드 합성에 의해 합성하였다(예컨대, 일반적 기술로는 Blake 외, Proc, Natl, Acad. Sci. (1983), 80권, pp. 1556-1559 참고). 모든 중간체 펩티드유도체의 동질성은 박층 크로마토그래피에 의해 6060실리카겔(Eastman Chromatogram Sheet)상에서 확인되었다. 크로마토그램을 전개시키는데 사용된 용매계는 클로로포름-메탄올-물이었다(45:10:1; 80:10:1; 및 200:75:13).

[10-아스파르트산-B]인체 인술린을 Chance 등의 미합중국 특허 제4,421,685호에 기재된 바와 같이 디티오트레이톨의 존재하에서 인슈린 A사슬의 S-술포네이트화 형태를 인체 인슐린[10-아스파르트산] B사슬의 합성적인 S-술포네이트화 유도체와 결합시켜 제조하였다. 돼지의 인슐린의 상응하는 사슬과 동일한S-술포네이트화 인체 A사슬(Nicol외, Nature(1960), 181권, pp. 484-485)은 Katsoyannis등의 Biochem-istry(1967), 6권 pp. 2635-2624에 기재된 바와 같이 돼지의 인슐린을 산화적 아황산분해 처리하고 컬러크로마토그래피에 의해 얻어진 S-술포네이트화된 A 및 B사슬을 분리함으로써 제조하였다. S-술포네이트화된 인체[10-아스파르트산] B사슬의 합성은 Schwartz와 Katsoyannis의 J. Chem. Soc. Perkin, Trans. I(1973), pp. 2894-2901에 기재된 바와 같이 S-술포네이트화된 자연산 인체 B사슬의 합성 후에 행하였다.

C-말단의 헥사데카펩티드(배열 B¹⁵-B³⁰)를 인접한 헥사펩티드(배열 B⁹-B¹⁴)와 커플링시켜보호된 B사슬 동족체를 생성시키며, 이것을 액체와 불화수소에 노출시키고 얻어진 술포히드릴 유도체를 산화적으로 아황산 분해 처리하면 [10-아스파르트산] B사슬의 S-술포네이트화된 형태가 제공된다.

표 I은 펩티드 합성에 이용된 화합물 몇가지와 아미노산 보호기 그리고 해당하는 약칭은 나타낸 것이다.

A S-술포네이트화 [10-아스파르트산] B사슬의 합성

Z·Glu(cHex)·OH, DCHA(화합물 I)

이 화합물은 상응하는 Boc-유도체(Peninsula Laboratories)를 트리플루오로초산으로 탈보호시킨 다음얻어진 산물응 카르보벤조실화시켜 제조하였다. 얻어진 유도체를 에테르로부터 디시클로헥실아민 염으로서결정화시켰다;

융점 131-132℃, 분석.

CHN0의

계산치(%):C; 86.4, H; 8.88, N; 5.4

실슥치(%):C; 68.3, H; 9.11, N; 5.1

Z·Glu(cHex)-Ala·OBut(화합물 II)

화합물 I(9.8g)을 0.2N H2SO4와 에틸 아세테이트 사이에서 분배시켜 유기층을 분리하고, 물로 세척한 다음 건조시키고(MgSO4) 건조하기까지 농축시켰다. 0℃까지 냉각시킨 DMF (30ml) 중의 나머지의 용액에H·Ala·OBu[Schwartz 및 Katsoyannis의 상기 문헌에 기재된 바와 같이 Z·Ala·OBu(5.6g)로부터 제조함]를 첨가하고 이어서 HOBT(2.3g)와 DCC (3.7g)를 첨가하였다. 실온에서 24시간후, 부산물인 요소를 걸러내고 여과물을 에틸 아세테이트(500ml)로 희석한 다음 1M NaHCO, 물, 0.2N HCl 및 물의 순서로 연속세척하고 감압하에서 건조상태에 이르기까지 건조 및 농축시켰다. 생성물은 박층 크로마토그래피에서 균질한 오일[8g(90%)]로서 얻어졌으며 추가적인 특징화없이 화합물 3의 합성에 이용하였다.

Z·Val-Glu(cHex)-Ala·OBu(화합물 3)

메탄올(150ml)중의 화합물 3(8g)를 3시간 동안 10% Pd/C 촉매(2g)를 이용하여 수소첨가 처리하였다.

촉매를 걸러내고 여과물을 감압하에서 건조상태까지 농축시켰다. 잔사를DMF(30ml) Z·Val·OH(4.1g),HOBT(2.7g) 및 DOC(3.3g)의 활성 혼합물(아미노 성분을 첨가하기에 앞서 실온에서 30분간 활성화시킴)과혼합시켰다. 24시간후 생성물을 화합물 2의 경우와 유사한 방식으로 분리시켰다; 오일, 8.7g(85%). 이 물질은 박층 크로마토그래피에서 균질하였으며 추가적인 특징화없이 다음의 합성 단계에 사용하였다.

Z·Leu-Val-Glu(chex)-Ala·OBu(화합물 IV)

화합물 3(8g)을 상술한 바와 같이 수소첨가시키고 얻어진 유상의 잔사를 DMF(30ml)에 용해시켰다. 이용액에 Z-류신 p-니트로페닐 에스테르(5.5g) 및 HOBT(1.8g)를 첨가하였다. 48시간 후, 혼합물을 에틸아세테이트(250ml)로 희석하고 0.5N NHOH, 물, 0.2N HC1 및 물의순서로 연속적으로 세척하고 건조시켜(MgSO) 진공 농축시켜 건조상태로 하였다. 잔사를 95% 에탄올로 결정화시켰다;

중량 8.4g(88%);

융점 190-194°; [a]D-20.3°(c1,DMF). 분석.

CHN0의

계산치(%):C; 63.2, H;8.31, N; 8.0

실측치(%):C; 62.9, H;8.37, N; 8.1

Boc·Asp(cHex)-Leu-Val-Glu(cHex)-Ala OBu(화합물 V)

화합물 IV(1.5g)를 전술한 바와 같이 수소첨가시키고 잔사를 DMF(10ml)중의 Boc·Asp (cHex)·OH(Peninsula Laboratories)(0.8g), HOBT(0.34g) 및 DCC(0.52g)의 활성 혼합물(아미노산 성분을 첨가하기전에 실온에서 30분간 활성화시킴)에 첨가하였다. 24시간 후 반응 혼합물을 화합물 2의 경우와 같이 가공시키고 생성물을 에틸 아세테이트 석유 에테르로부터 재침전에 의해 정제하였다;

중량 1.5g(85%);

융점 203-205°; [a]D-8.9°(c1,DMF).

CHN0

계산치(%):C; 61.0, H; 8.72, N; 8.1

실측치(%):C; 60.7, H; 8.56, N; 7.8

Boc·Asp(cHex)-Leu-Val-Glu(cHex)-Ala OH(화합물 VI)

트리플루오로초산(10ml) 중의 화합물 V(1g)의 용액을 실온에서 2시간 보관한 다음 건조할 때까지 진공농축시키고 잔사를 차가운 에테르로 분쇄하였다. 생성된 고상의 탈보호된 펜타펩티드 트리플루오로초산염을여과시키고 KOH로 건조시켰다. DMF(10m1)중의 Boc·Ser (Bzl)·OH(1.2g), HOBT(0.5g) 및 DCC(0.6g)의 활성 혼합물을 준비하고, 30분 정치시킨 다음, 혼합물을 N-메틸모르폴린(0.13m1)이 함유된 DMSO(10m1) 중의 펜타펩티드 트리플루오로초산염 용액으로 여과시켰다. 24시간 후 반응 혼합물을 차가운 물(100m1)로 희석하고 침전된 생성물을 걸러내어 건조시키고 아세테이트-석유 에테르로부터 재침전시켰다;

중량 0.9g(90%);

융점 200-203°; [a]D-17.8°(c1, DMF). 분석.

CHN0

계산치(%):C; 60.8, H; 7.96, N; 8.5

실측치(%):C; 61.4, H; 8.25, N; 8.7

산 가수분해후의 아미노산 비율; AspSerGluValLeu.

Boc·Ser(Bz1)-Asp(cHex)-Leu-Val-Glu-(cHex)-Ala-Leu-Tyr(Bz1)-Leu-Val-Cys

(Dpm)-Gly-Glu(Bz1)-Arg(NO)-Gly-Phe-Tyr(Bz1)-Thr-Pro-Lys(Z)-Thr(Bz1(화합물 V2)

Schwartz 등의 Int. J. Pept. Protein Res. (1981), 17권, pp. 243-255에 따라 제조한 인체 인슐린 B 사슬의 부분적으로 보호된 헥사데카펩티드(배열 B-B)의 유리염기(400mg), 화합물 VI(494mg) 및 HOBT(80mg)의 현탁액을 용액이 될때까지 교반하였다. DCC(100mg)를 첨가한 후, 이 용액을 4℃에서 48시간 동안 교반한 다음 95% 에탄올(150ml)로 희석하였다. 침전된 도코사펩티드(배열 B-B)를 걸러내고, 95%에탄올로 세척하여 건조시켰다; 중량 450mg(88%). 산으로 가수분해시킨 후 아미노산 분석을 행하자 다음의 몰비로 표현된 조성이 얻어졌다.

AspThrSerGlyAlaValLeuTyrPheLysArg(Cys는 측정되지 않음 ).

H·Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(SO)-Gly-Ser-Asp-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-

Leu-Val-Cys(SO)-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr·OH(인체 인슐린[10-아스파르트산] B사슬 S-술포네이트) (화합물 VIII)

트리플루오로초산-초산(7:3 v/v) (10ml)의 혼합물 중의 화합물 VII(400mg)의 용액을 실온에서 1시간도안 저장한 다음 에테르로 회석하였다. 도코사펩티드의 침전된 트리플루오로초산염을 걸러내고, 에테르로세척한 다음 건조시켰다. 트리에틸아민(0.1ml)이 함유된 DMF(6ml)이 함유된을(6ml)와 N-메틸피롤리돈(6ml) 중의 이 생성물의 용액을 에테르로 희석하고 건조시켰다. 이 생성물과 Schwartz 및 Katsoyannis, J. Chem. Soc. PerkinTrans. I(1973) pp. 2894-2901에 따라 제조한 Boc·Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Dpm)-GlyOH를 DMF (5ml)와 HOBT(90mg)을 함유하는 DMSO(5ml)와의 혼합물에 용해시킨 다음 DCC(100mg)를첨가하였다. 실온에서 48시간 후, 혼합물을 1N NHOH(5ml)가 함유된 냉수(250ml)에 붓고 침전된 보호된트리아콘타펩티드를 여과시킨 다음 세척하고(물, 50% 메탄올 및 메탄올), 건조시킨 DMF-메탄올로부터 재침전시켰다:중량 400mg(90%).

이 생성물을 인체 인슐린 B사슬-술포네이트의 합성에 대한 Schwartz와 Katsoyannis의 상기 문헌에 기재된 바와 같이 액체 불화수소로 탈보호시킨 다음 산화적으로 아황산 분해 처리하여 S-술포네이트화된[10-아스파르트산] B사슬로 전환시켰다. 보호된 트리아콘타펩티드 (200mg)를 m0크레졸(1m1)이 함유된무수 액체 불화수소(9ml)로 0℃에서 1시간 동안 처리하였다. 다음 불화수소를 제거하고 잔사를 에틸 아세테이트와 석유 에테르로 연속적으로 분쇄하였다. 8M 구아니딘 염화수수(20ml) 중의 이 생성물 용액에 0.1MTris-HCl(pH8.8)로 완충시킨 아황산나트륨(700mg)과 테트라티오산나트륨(500mg)을 첨가하였다. 실온에서 3시간후반응혼합물을 예컨대 Spectrapo

막튜빙 제3호와 같은 투석튜빙내에 위치시켜 증류수(각 4L)를 4회 갈아가면서 4℃에서 24시간 동안 투석시킨 다음 동결건조시켰다.

정제를 위해 동결건조된 물질을 3ml의 요소 아세테이트 완충액(0.04M 아세테이트-8M 요소,pH4.0)에용해시키고 CM 셀룰로오스 컬럼(2.5×40cm)에 적용시켜 동일한 완충액으로 이소크래틱하게 용리시켰다.

예컨대 Katsoyannis외, Biochemistry(1967), 6권 pp. 2635-2642 참고. 컬럼 용리물을 분광광도계(ISCO 모델 U-5A)로 모니터하자 제1도에 나타난 용리 유형이 얻어졌다. 주된 피크(125-168ml)의 용리물을 수집하여 상기와 같이 투석처리하고 동결건조시키자 S-술포네이트화 [10-아스파르트산] B사슬이 백색 분말로서 수득되었다:중량 22mg. 산 가수분해후의 정제된 사슬에 행한 아미노산 분석결과 이론적으로 예상했던값과 일치하는 몰비율로 다음의 조성이 얻어졌다:

Asp_2.1Thr_2.1Ser_1.1Glu_3.0Gly_2.9Ala_1.0Val_3.0Leu_3.8Tyr_1.8Phe_2.9Lys_1.1His_1.0Arg_0.9(Cys는 측정되지 않음).

B.[10-아스파르트산-B] 인체 인슐린의 합성 및 분리

4℃로 냉각된 pH10.6 0.1M 글리신 완충액 10ml 중의 S-술포네이트화된 인체(돼지) A사슬(40mg) 및S-술포네이트화된 인체 [10-아스파르트산-B]사슬(20mg) 용액에, 디티오트레이톨(7mg)을 첨가하였다.

4℃에서 24시간 후 혼합물을 초산(1m1)으로 희석하고 얻어진 침전물을 원심분리(Internation al Centri-fuge, 모델 HN; 3000rpm) 처리하여 제거하였다. 활성물질이 함유된 상등액을 0.45μ 셀룰로오스 아세테이트 필터(Sartorius사제)를 통해 통과시키고 LKB액체 크로마토그래피 시스템에 연결된 Vydac

218TP 컬럼(0.45×25cm)을 이용하여 역상 HPLC로 처리하였다. 70분에 걸쳐 0.1% 트리플루오로초산 중의 2-프로판올의 10-50%선형 구배로 하여 0.5m1/분의 유속으로 뱃취(batches: 각각 약 5mg의 단백질)를 크로마토그래피 처리하였다.

크로마토그래피 유형을 제2A도에 나타내었다. 실시예 2-4에 기재한 바와 같은 생물분석결과 약 32.3분경에 용리된 물질만이 실질적인 인슐린 활성을 갖는 것으로 나타났다. 이러한 동일한 크로마토그래피 조건하에서 소의 인슐린은 30분경에 용리되었다. 활성물질을 함유하는 단편을 농축시키고 동일한 컬럼과 0.1% 트리플루오로초산 중의 20-35%의 2-프로판올 선형구배를 이용하여 0.5m1/분의 유속으로95분동안 제크로마토그래피 처리하였다. 용리유형은 제2B도에 나타내었다. 약 27.2분경에 용리된, 활성물질을 함유하는 단편을 수집 농축하여실시예 2-4에 기재된 생물분석 연구에 이용하였다. 이 동일한 크로마토그래피 조건하에서 소의 인슐린은 약 38분경에 용리되었다. 상술한 A 및 B사슬의 배합 혼합물로부터, 2mg의 고순도 생성물을 얻었다. 산 가수분해후, 정제 합성물질의 아미노산 분석결과, 이론적 예상치와 잘 일치되는 조성을 다음의 몰비로 얻었다:

Asp_4.0Thr_2.8Ser_3.1Pro_1.0Glu_7.0Gly_4.0Ala_1.1Val_3.4Ile_1.4Leu_5.9Tyr_3.6Phe_2.9Lys_1.1His_1.0Arg_1.0(Cys는 측정되지 않음).

실시예2

인슐린 섭수체 결합분석에 의한 [10-아스파르트산-B]인체 인슐린의 강도 분석

쥐의 간 플라즈마 막을 이용하는 섭수체 결합분석은 Kitagawa 등의 Biochemistry(1984), 23권 pp.1405-1413에 기재된 바와 같이 행하였다. 쥐의 간 플라스마 막은 Horvat 등의 Biochem. Biophys. Acta(1975).382권, pp. 609-620에 기재된 바와 같이 제조하였다.

트리플리케이트 0.2ml 정치액은¹²⁵I-인슐린, 3×10^-10M, 실시예 1에서와 같이 제조한 [10-아스파르트산-B]인체 인슐린 또는 표식하지 않은 인슐린, 및 0.6% 단편 V 소의 혈청 알부민을 함유하는 pH7.4의 0.1M 인산나트륨 중의 플라스마막(단백질 20-40μg)을 함유하였다. 24 ℃에서 45분간 정치시킨 다음, 혼합물을 0.1% 단편 V 소의 혈청 알부민이 함유된 pH7.4의빙냉 0.1M 인산나트륨 2.0ml로 희석하고 즉시로 셀룰로오스-아세테이트 필터를 통해 여과시켰다.

필터를 빙냉 완충액으로 2회 세척한 다음, 방사능을 Filtron-X

을 이용하여 섬광계수기로 측정하였다.정치액이 1×10^-5M의 비표식 인슐린을 함유할때 필터상에 남아있는 방사능으로 정의하는 비특이적 결합은모든 값으로부터 뺐다. 상대강도는 섭수체 조제에¹²⁵I-인슐린의 특이적인 결합을 50% 저해하는데 요구되는 인슐린 대 [10-아스파르트산-B)인체 인슐린의 농도비로서 얻었다.

제3도는 쥐의 간 플라스마 막에서 인슐린 섭수체와 결합하는데 있어서¹²⁵I-인슐린과 경쟁하는 소의 인슐린(●) 및 [10-아스파르트산-B]인체 인슐린(O)의 능력을 도시한 도면이다.

최대치의 백분율로 표시한, 결합의 저해를 경쟁자 농도의 기능으로서 플콧팅하였다. 제3도에 나타난 자료포인트는 4회 수행한 대표적인 분석에서 3회분의 평균치를 나타낸다. 이 분석에서 최대 결합은 입력 방사능의 8.2%에 달하였다.

제3도로부터 알 수 있는 바와 같이, [10-아스파르트산-B]인체 인슐린과 소의 인슐린의 투여량 반응 곡선은 근본적으로 평행하였다. 그러나, 상기와 같이 계산한 [10-아스파르트산-B]인체 인슐린의 강도는 소의 인슐린에 비해 약 534±146%였다.

실시예3

지방생합성 분석에 의한[10-아스파르트산-B]인체 인슐린의 인슐린 강도 분석

인슐린 동족체의 강도를 측정하는 지방생합성 분석은 Kitagawa 등의 상기 문헌에 기재된 바와 같이 수행하였다. 이 분석에서는[3-³H] 글루코오스를 지질로 전환시키는데 있어서의 소의 인슐린의 능력에 비교하여 인슐린 동족체의 능력을 측정하였다.

지방세포는 체중 200-300g인 수컷 쥐로부터 얻은 부고환 및 신장주위의 지방 패드를 1.0mg/m1의 클라게나제와 함께 37℃에서 60분간 정치시킨 다음, 가아제, 이어서 미세한 실크를 통해 여과시킴으로써 조제하였다. 세포는 사용전 현탁시키기 전에 임상 원심분리기에서 부상시킴으로써 2회 세척하였다. 정치 매질로는 기체상에서 95% O₂-5% CO₂를 이용하고 0.5mM 글루코오스, 지방산이 없는 3% 소의 혈청 알부민 및 칼슘주천량의 절반을 함유하는 krebs-Ringer의 중탄산염을 이용하였다. 3중의 지방생 합성 정치액은 1.0ml의지방세포 현탁액(20-40mg 건조 중량세포)과 소의 인슐린 또는 실시예 1에서와 같이 제조한 [10-아스파르트산-B]인체 인슐린을 함유하였다. [3-³H]글루코오스를 첨가하기전에 세포를 37℃에서 45분동안 예비정치시켰다. 정치는 60분동안 계속하였고 0.2ml의 5N H₂SO₄와 0.2ml의 옥수수유를 첨가하여 중지시켜 지질 추출을 도왔다. 섬광계수기에서 방사능을 측정하기 전에 실온에서 30분간 10ml의 Soluscint-0

로 시료를 추출하였다. 이러한 조건하에서, [3-³H]글루코오스는 섬광 플루오르를 함유하는 유기상으로 추출하지 않았으며 본질적으로 계수되지 않았다, 지방생합성의 0 및 100% 자극은 각각 9.1×10^-10M 인슐린(5.5ng/ml)의 부재 및 존재의 경우 관찰된 방사능으로 정의하였다, 상대강도는 지방생합성의 자극의 최대치의 50%를 생산하는데 필요한 인슐린대[10-아스파르트산-B]인체 인슐린의 농도 비율로서 얻었다.

제4도는 분리된 쥐의 지방세포에 있어서 [3-³H]글루코오스가 싱시예1에서처럼 제조됨 [10-아스파르트산-B]인체 인슐린(○)과 소의 인슐린(●)에 의해 유기-추출성물질(즉, 지질)로 전환되는 것의 자극을 도시한 도면이다. 최대치의 백분율로 표시한 자극을 아고니스트(agonist)농도 기능으로서 플롯팅하였다, 자료 포인트는 4회 수행한 대표적인 분석에서 3회분의 측정치의 평균을 나타낸다. 이 분석에서, 0% 및 100%자극은 각각 시간당 세포 mg당 0.3 및 3.5mm의 글루코오스를 가리킨다.

제4도에 나타난 자료들은 [10-아스파르트산-B]인체 인슐린이 분석에 있어서 완전한 아고니스트였음과 자연산 소의 인슐린과 동일한 지방생합성 최대자극에 달하였음을 나타낸다. 그러나, [10-아스파르트산-B]인체 인슐린의 상대강도는 소의 인슐린에 비해 435±144%인 것으로 계산되었다,

실시예2의 섭수체 결합분석 및 본 지방생합성 분석에서 [10-아스파르트산-B]인체 인슐인에 대해 계산된 강도값은 통계적으로 차이가 없는 것으로 측정되었다(0.4P0.3Student's t-test).

그러므로, [10-아스파르트산-B]인체 인슐린은 생체외에서 자연산 인슐린보다 강도가 약5배나 더 큰 초고활성 인슐린임이 분명하다.

실실예 4

[10-아스파르트산-B]인체 인슐린의 방사능 면역분석

Kitagawa 등의 상기 문헌에 기재된 바와같은 방사능 면역 분석법을 수행하여 (10-아스파르트산-B)인체 인슐린이 자연산 인슐린과 면역학적으로 구별될 수 있는지를 평가하였다.

돼지의 인슐린에 대한 기니 피그의 항혈청과 염소의 항-기니 퍼그-γ-글로불린을 분석용 완충액(인산나트륨, 0.04M, pH 7.6, 0.154M NaCl, 0.1% 젤라틴 및 0.01% 티메로살 함유)에 1 . 25로 희석하여 사용하였다. 중복 분석 튜브에는 총 부피 0.8ml로 0.1ml빈의 항-인슐린 항혈청, 0.072ng의¹²⁵l-인슐린, 및 소의 인슐린(0.06-0.36ng) 또는 실시예 1에서처럼 제조한 (10-아스파르트산-B)인체 인슐린(1-4.Ong)이 함유되었다. 실온에서 하룻밤 정치시킨후, 침전된 항체(염소의 항-기니 피그-γ-글로불린) 0.2ml를 첨가하고, 튜브를 실온에서 하룻밤 더 정치시켰다. 면역 침전물을 셀룰로오스-아세테이트 필터상에 수집하고 빙냉시킨 분석용 완충액 1.Oml 부분으로 2회 연속 세척하였다. 필터를 건조시키고 방사능을 Filtron-X

에서 섬광계 수기로 측정하였다. C₀/C₁,의 곧은 직선 플롯이 Hales 등의 Biochem. J.(1963), 88권, pp.137-146에 기재된

선형 퇴화 분석에 의해 작성되고, (10-아스파르트산-B)인체 인슐린의 소의 인슐린에 대한 상대적 강도를 이러한 플롯의 기울기의 비율로서 얻었다.

합성 [10-아스파르트산-B]인체 인슐린은 방사능 면역분석에서 소나 돼지의 인슐린과 거의 동일한 강도를 나타내었다. 이 결과는 B¹⁰위치에서 히스티딘이 아스파르트산으로 대치된 것은 이 분자의 면역원적 결정인자에 심각한 영향을 미치지 않았음을 가리키는 것이다.

실시예 5

데스-펜타펩티드(B26- B3O) - [Asp^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드)인체 인슐린의 합성 스-펜타펩티드(B26-B3O)-(Asp^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드)인체 인슐린을 단편 축합기술을 이용한펩티드 합성에 의해 합성하였다(예컨대, 일반기술은 Blake외, Proc. Natl. Acad. Sci.(1983), 80권, PP.1556-1559 참고). 모든 중간체 펩티드 유도체의 동질성은 6060 실리카겔(Eastman Chromatogram 쉬트)상에서 박층 크로마토그래피로 화인하였다. 크로마토그램을 전개하는데 사용한 용매계는 클로로포름-메탄올-물(45 : 10 : 1 ; 89 : 10 : 1 ; 및 200 : 75 . 13)이었다.

데스-펜타펩티드(B26-B3O)-(Asp^B10, Tyr^B25-카르복사미드)인체 인슐린은 Chance 등의 미합중국특허 제4,421,685호에 기재된 바와같이 디티오트레이톨의 존재하에서 인체 인슐린 A 사슬의 S-술포네이트화된 형태와 인체 인슐린 데스-펜타펩티드(B26-B3O)-[Asp10, Tyr.-α-카르복사미드 25] B 사슬의 합성적인 5-술포네이트화된 유도체를 결합시켜 제조하였다. 돼지 인슐린의 A 사슬과 동일한 S-술포네이트화된 인체 인슐린의 A 사슬(Nicol 등, Nature(1960), 181권, PP.484-485)은 Katsoyannis 등의 Biochem-istry(1967), 6권, pp.2635-2624에 기재된 바와같이 돼지의 인슐린을 산화적으로 아황산 분해 처리하고 결과된 5-술포네이트화된 A 및 B 사슬을 컬럼 크토마토그래피 처리하여 분리시킴으로써 제조하였다. S-술포네이트화된 이중 변형 B 사슬의 합성은 Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85'2149-54(1963)과 Barany등, The Peptides, Gross 등, 편집, 2'1-284, Academic Press(New York, 1980)에 기재된 바와같이 고상지지체로서 4-메틸-벤즈히드릴아민 수지(0.Smmol 아민/g' 1g)를 이용하여 단계적인 고상 합성으로 수행하였다. Boc기는 벤질옥시카르보닐기에 의해 보호된 N-말단 페닐알라닌 관기를 제외하고는 Nα 보호에 이용하였 다.

표 Ⅱ는 펩티드 합성에 이용된 화합물과 아미노산 보호기를 나타낸다.

Merrifield 등의 Biochem., 21 . 5020-31(1982)에 따라 3배 과량으로 활성화된 보호 아미노산(디메틸포름아미드 중의 1-히드록시벤조트리아졸-디시클로헥실카르보디이미드)을 이용하여 매뉴얼 이중 커플링 프로토콜에 따랐다. 반응의 완결을 Kaiser 등의 Anal. Biochem., 34 : 595-98(1970)의 정성적인 닌히드린 테스트에 의해 모니터하자 각각의 이중 결합후에 음성적 이었다.

사슬을 배치시킨후 펩티드-수지를 염화메틸렌과 메탄올로 세척한다음 최종 중량이 3.Og이 될때까지 건조시켰다 이 생성물의 일부분(700mg)을 Tam 등의 J. Am. Chem. Soc., 105 : 6442-55(1983)에 따라 로우-하이 불화수소 공정에 의해 탈보호시켰다. 첫번째 공정에서는 펩티드-수지를 p-크레졸(1ml), 디메틸술과이드(6.5ml) 및 액체 불화수소(2.5rml)의 혼합물로 처리하였다. 0℃에서 2시간후 혼합물을 진공 농축시키고관사를 0℃에서 1시간동안 액체 불화수소(10ml)로 처리하였다. 다음 불화수소를 제거하고 관사를 에틸 아세테이트와 석유 에테르로 분쇄하였다. 아황산나트륨(700mg)과 테트라티오산나트륨(500mg)을 0.1M Tris·Hcl(pH 8.8)로 완충시킨 8M 구아니딘 염화수소(20m1)중의 이 생성물의 현탁액에 첨가하였다. 실온에서 3시간후 반응 혼합물을 여과시켜 수지를 제거하고, 여과물을 Spectrapor막 튜빙 제 3호에 위치시켜 4℃에서 24시간동안 증류수(각 4리터)를 4회 갈아 투석시켰다. 추석물을 동결건조시켜 250mg의 백색 분말로서 조5-술포네이트화된 B 사슬 동족체를 얻었다.

동결건조된 물질을 0.02M Tris · HCI, pH 7.5가 함유된 물 . 2-프로판을(2 : 1, v/v)의 혼합물에 용해시키고 LKB 액체 크로마토그래피계에 연결된 Synchropak AX200 컬럼(1×25cm)상에서 고속 이온교환 크로마토그래피로 정제하였다. 각 70mg의 단백질 뱃취를 상기 용매중의 0.5M 염화나트륨의 0-80% 선형 구배로서 1.5m1/분의 유속으로 140분간 크로마토그래피 처리하였다. 제 5도에 크로마토그래피 유형을 나타내었다.

주된 피크(약 60분경)의 용리액을 초기부피의 약 50%가 될때까지 진공농축시키고, 증류수에 대해 투석한다음(Spectrapor 막 튜빙 제 3호) 동결건조시켰다. 조물질 250mg으로부터 정제된 생성물 150mg을 백색의 복슬복슬안 분말로 얻었다. 산 가부분해후 정제된 S-술포네이트화 B 사슬 동족체의 아미노산 분석을 행하자, 이론적 예상치(괄호안에 표시)와 잘 일치하는 몰비율로 다음의 조성이 얻어졌다 .

1.9(2)l.0 (1)3.0 (3)3.0 (3)1.1 (1)2.7(3)3.8 (4)1.9 (2)2.0 (2)0.9 (1)1.0 (1) 고정 되지 않음) .

실시예 6

데스-펜타펩티드(B26-B3O)-(Asp, Tyr-α-카르복사미드)인체 인슐린의 합성 및 분리 디티오트레이톨(3.5mg)을 PH 10.6의 0.1M 글리신 완충액 6ml중의 S-술포네이트화된 인체(돼지) A 사슬(20mg)과 S-술포네이트화된 인체 데스-펜타펩티드(B26-B3O) -(Asp10, Tyr-α-카르복사미드 25) B사슬(10mg)의 용액에 첨가하고, 4℃까지 냉각시켰다. 4℃에서 24시간후 혼합물을 빙초산(1ml)으로 희석하고 결과된 침전물을 원심분리(인터내셔날 원심분리기, Model HN ; 3000rpm)에 의해 제거하였다. 활성물질을 함유하는 상등액을 0.45α 셀룰로오스 아세테이트 일터(Sartorius사제)를 통해 통과시키고 LKB 액체크로마토그래피계에 연결된 Vydac

218 TP 컬럼(0.45×25cm)을 이용하여 역상 HPLC로 처리하였다. 가각 5mg 단백질의 뱃취를 0.1% 트리플루오로초산중의 2-프로판올의 10-50% 선형구배로서 0.5m1/분의 유속으로 70분간 크로마토그래피 처리하였다. 이 크로마토그래피 유형을 제6A도에 나타내었다. 인슐린 분석에서와 같이 측정한 활성물질이 함유된 분획을 농축하고 동일한 컬럼과 0.1% 트리플루오로초산 중의 2-프로판올의 20-35% 선형구매를 이용하여 0.5m1/분의 유속으로 110분간 재크포마토그래피시켰다. 이 용리 유형은 제6B도에 나타난 바와같다. 약 63.1분경에 용출된, 활성물질을 함유하는 단편을 수집하여 동결건조시켰다.

상술한 A 및 B 사슬의 혼합물로부터, 고순도 생성물 1.4mg을 얻었다. 산 가수분해후 정제된 합성물질의 아미노산 분석을 하자, 이론적 예상치와 잘 일치하는 다음의 몰비율로 다음과 같은 조성물이 얻어졌다.

^Asp4.1 (4)^Thr0.9 (1)^Ser3.0 (3)^Glu7.0 (7)^Gly3.8 (4)^Ala1.1 (1)^Val13.3 (4)^Ile1.4 (2)^Lau6.0 (6)^Tyr3.8 (4)^Phe2.0 (2)^His1.0 (1)(1)(시스테인은 측정되지 않음).

실시예 7

인슐린 섭수체 결합분석에 의한 데스-펩타펩티드(B26-B3O)-[AspB10**, Tyr^B25-α-카르복사미드)인체 인슐린의 강도 분석 동일한 분석을 실시예 2에서와 같이 행하였다.

제7도는 쥐의 간 플라스마 막에서 인슐린 섭수체에 결합하는데 있어서¹²⁵I-인슐린과 경쟁하는 소의 인슐린(●) 및 데스-펩타펩티드(B26-330) -(Asp^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드)인체 인TBF린(

)의 능력을 도시한 것이다. 최대치의 백분율로 표시한 결합의 저해를 경쟁자 농도의 기능으로서 플롯팅하였다. 제 7도에 나타난 자료 포인트는 3가지의 상이한 합성화합물 조제를 이용하여 4회 수행한 대표적인 분석에 있어서 3회 분의 측정 평균치를 나타낸다. 이 분석에서, 경쟁자 부재시에는¹²⁵I-인슐린의 결합은 입력 방사능의 9.1%에 달하였고, 비특이적 결합은 총결합의 9.6%에 달하였다.

제 7도에서 알 수 있는 바와같이, 합성 화합물은 자연산 인슐린의 경우 요구되는 농도보다 10배 낮은 농도에서 특이적으로 결합된¹²⁵인슐린의 50%를 나타내었다. 그러나, 상기와 같이 계산한 데스-펜타펩티드(B26-B3O) -[Asp^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드1인체 인TBF린의 강도는 소의 인슬린에 비했을때 약 1166±31.2%였 다.

실시 예 8

지방생합성 분석에 의한 데스-펜타펩티드(B26-B3O)-[Asp^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드]인체 인슐린의 강도 분석 동일한 분석을 실시예 3에서와 같이 행하였다.

제 8도는 분리된 쥐의 지방세포에 있어서 실시에 5에서 제조한 데스-펜타펩티드(B26-B3O) -[Asp^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드]인체 인슐린(

)과 소의 혈청 인슐린(

)에 의한 (3-3**H)글루코오스의 유기-추출성 물질(즉, 지질)로의 자극을 나타낸다. 최대치의 백분율로 표시한 자극은 아고니스트 농도의 기능으로서 플롯팅하였다. 자료 포인트는 합성화합물의 3가지 상이한 조제를 이용하여 4회 수행한 대표적인 분석에 있어서 3회분의 측정치의 평균을 나타낸다. 이 분석에서, 0%와 100% 자극은 각각 시간당 mg 세포당 11.4차 78.8nmol 글루코오스를 가리키는 것이다.

제8도에 나타난 자료는 데스-펜타펩티드(B26-B3O)-[Asp^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드]인체 인슐린이 자연산 소의 인슐린의 경우에 도구되는 농도보다 훨씬 낮은 농도에서 지 방생합성의 절반-최대 자극을 냄을 보여준다. 데스-펜타펩티드(B26-B3O)-(Asp^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드)인체 인슐린의 상대 강도는 소의 인슐린에 비해 1352±114%인 것으로 계산되었다. 지 방생합성의 칙대 자극은 두 화합물 모두에서 동일하였다.

그러므로, 데스-펜타펩티드(B26-B3O)-(Asp^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드)인체 인슐린은 생 체외에서 자연산 인슐린보다 그 강도가 11-13배나 더 강한 초고환성 인슐린인 것이 분명하다.

Asp^B10동족체와 동일한 공정으로 제조한 분리시킨 데스-펩타펩티드(B26-B3O) -[Glu^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드]인체 인슐린은 자연산 인슐린보다 20배나 더 큰 강도를 나타내었다.

실시예 9

데스-펜타펩티드(B26-B3O)-(Asp^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드)인체 인슐린의 방사능 면역분석 동일한 분석을 실시에 4에서와 같이 행하였다.

합성 데스-펜타펩티드(B26-B3O)-[Asp^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드]인체 인슐린은 방사능 면역분석에서 소의 인슐린과 거의 동일한 강도를 나타내었다. 이 결과는 인슐린 섭수체에 보다 강하게 결합하게 하고 부수적으로 합성화합물에 의해 나타나지는 생체외의 보다 높은 인슐린 유사환성을 나타내는 구조적 차이점 이 이 분자의 면역원적 결정인자에 심각한 영향을 끼치지 않았음을 가리키는 것이다.

실시예에 대한 토론

전 X-선 분석은 B¹⁰위치의 히스티딘이 인슐린 단량체의 표면에 위치한다는 것과 이것이 아연 인슐린 육량체(헥사머)의 생성에 중요한 것임을 가리켜준다. 예컨대 Blondell외, Adv. Prot. Chem.(1972, 26권, PP.279-402 참고. 이전의 연구들은 B¹⁰위치의 히스티딘을 류신, 리신, 또는 아스파라긴으로 대치하면 자연산 호르몬에 비해 샘플 강도라 약 14-45% 감소된 합성 인슐린 동족체가 생산된다고 하였다. 예컨대, Schwartz외, J. Chem. Res.(5), pp.220-221, J. Chem. Res.(M), pp.2453-2469(1977) , Schwartz외, 1.Prot. Chem.(1982), 1권, pp,177-189'Burke외, Int. J. Protein Res(1984), 23권, PP.394-401 참고. 이 연구들로부터 B¹⁰자체의 친수성은 인슐린의 생물활성을 결정하는데 비교적 중요한 것이 아니며 이 위치에 강한 염기성 아미노산 관기가 존재하면 해롭다는 것으로 결론지어졌다. 더우기 히스티딘 관기의 독특한 특성인 생리적 pH 근방에서의 프로들 부가 또는 프로들이 부가되지 않은 상태로 존재할 수 있는 능력은 생물활성이 높기 위한 B¹⁰위치에서의 요구사항인 것으로 믿어졌다. 예컨대, Burke외, 상기 문헌 참고. 생리적인 pH에서는 B¹⁰위치에서 음전하를 띄게 될 [10-아스파르트산-B]인체 인슐린은 실시 예에서 나타난 바와같이 생체외 실험에서 자연산 인슐린보다 몇배 더 활성적인 것으로 밝혀졌다.

[10-아스파르트산-B]인체 인슐린의 초고활성은 분명히 인슐린 섭수체에로의 더 강한 결합으로부터 기인한 것이다. 섭수체에 대한 동족체의 더 강한 결합은 아마도, 동족체가 섭수체에 결합하기에 더 유리하게 형태가 변형된 때문인 것으로 믿어지며, 이것은 B¹⁰위치에서 음전하와 연관된 분자내(intramolecular) 상호작용으로부터 기인한다(예컨대, 염다리). 다른한편, 보다 강한 결함은 양전하를 띤 섭수체의 보체 표면과 의 직접적인 상호작용에 기인할 수도 있다. 제 2도에 나타난 바와같이 역상-HPLC에서, 두가지 크로마토그래피 조건하에서, [10-아스파르트산-B]인체 인슐린은 자연산 인슐린보다 질린 늦게 용출되었다. 이러한 양상은 합성 동족체가 보다 무극적인(apolar) 분자임을 나타내는 것이다. 자연산 인슐린과 [10-아스파르트산-B]인체 인슐린 사이에 나타나는 극성의 큰 차이는 하나의 친수성 관기를 다른것으로 대치한 탓이라고는 할수 없다. 극성의 차이에 대한 가장 그럴듯한 설명은 동족체가 인슐린 섭수체에 더 강하게 결합되도록 하는 것으로 믿어지는 형태변화를 극성이 반영한다는 것이다.

데스-펜타펩티드(B26-B3O)-(Asp^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드)인체 인슐린은 2가지 변형을 일으키는데, 이 변형들은 인슐린 분자에 각각 도입되면, 자연산 호르몬보다 더 강도가 높은 동족체를 만든다. 이러한 개별적인 변형이란 (i) B26-B3O 부분의 제거와 Phe B25를 Tyr-α-카르복사미드로 대체시키는 것과 (ii) His B10을 Asp로 대체시키는 것을 말한다. 이 동족체, 데스-펜타펩터드(B26-B3O)-[Asp^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드]인체 인슐린은 이제까지 기재된 것중 가장 강도높은 인슐린 동족체이다. 이것의 생물환성은 상기의 어떤 변형이 단독으로만 일어난 동족체의 개선된 강도의 합보다도 더 크다. 이러한 발견은 B25와 BIO 부위가 인슐린의 특정한 섭수체 결합영역의 형태를 변화시켜 섭수체 결합친화도가 높은 상태로 만들게 한다는 제안을 한다. 사실, 여러가지 조직에서의 인슐린-섭수체 복합체의 고 결합상수(약 109 M-¹)는 몇가지 결합 종의 협동작용을 요하는 것으로 나타난다. 510 위치의 히스티딘 관기는 그 섭수체에 의한 인슐린 인식에 기여하는 것으로 제시된 잔기들중의 하나는 아니다. Blundell외, Adv. Protein Chem.,26 : 279-482(1972) , Blundell외, Nature(London), 257 : 197-203(1975) ; Pollen외, Nature(London), 259 . 369-72(1976) 참고. 그러나, Schwart2외, J. Chem. Res.220∼21(1977) : Schwartz외, J. Protein Chem., 1 . 177-89(1982) : 및 Burke외, Int. J. Pept. Prot. Res. 23 . 394-401(1984)에 기재된 바와같이 [Leu^B10]-, [Asn^B10]-, 및 [Lys^B10]인슐린의 강도 감소분만 아니라 [Asp^B10]인슬린((10-아스파르트산-B)인슐린)의 강도 증가는 이 위치에서의 치환이 결과적인 분자가 인슐린 섭수체와 작용하여 생물반응을 개시하는 능력에 깊은 영향을 미칠 수 있음을 증명하는 것이다. 810 부위가 섭수체-결합 영역의 구성 분인지,또는 니 부위의 변형이 말단 결합 영역에 영향을 미치는지의 여부는 얻을수 있는 자료로부터는 명확히 결정할 수 없다. 본 발명의 동족체의 매우 높은 강도를 규명하기 위한 많은 모델이 제안될 수 있다. B25 및 B10부위는 각각 그 위치에서 변형이 일어나면 본 발명의 동족체를 섭수체 결합에 고친화적인 상태로 유도하는, 인슐린의 특정한 섭수체-결합영역의 성분일 수 있다. 덧붙여, B25 및 B1O 변형은 인슐린의 중요한 섭수체 결합영역을 구성하는 기타의 특정한 영역의 형태에 독립적으로 그리고 협동적으로 유리하게 영향을 미칠 수 있다.

Claims

다음의 구조식을 갖는 초고활성 인슐린 동족체.
다음의 구조식을 갖는 초고활성 인슐린 동족체.
데스-펜타펩티드(B26-B3O)-(Asp^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드)인체 인슐린 및 데스-펜타펩티드 (B26-B3O) -(Glu^B10, Tyr^B25-α-카르복사미드)인체 인슐린 중에서 선택된 초고활성 인체 인슐린 동족체의 치료적 유효량과 약리적으로 허용되는 담체로 이루어짐을 특징으로 하는 당뇨병 치료제 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 조성물이 근육내 투여용인 것이 특징인 당뇨병 치료제 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 조성물이 피하투여용인 것이 특징인 당뇨병 치료제 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 조성물이 정맥내 투여용인 것이 특징인 당뇨병 치료제 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 조성물이 이식가능한 펌프에 의한 투여용인 것이 특징인 당뇨병 치료제 조성물.
제3항에 있어서,비강 분무 투여용인 것이 특징인 당뇨병 치료제 조성물.