FI98731C - Menetelmä superaktiivisten insuliinianalogien valmistamiseksi - Google Patents

Description

98731

MENETELMÄ SUPERAKTIIVISTEN INSULIINIANALOGIEN VALMISTAMISEKSI

Tämä hakemus on jatko-osa US-hakemukselle sarjanumeroltaan 074,558, jätetty 17.7.1987.

Tämä keksintö koskee menetelmää uusien superaktiivisten insu-liinianalogien valmistamiseksi.

Insuliini on homooni, jolla on avainrooli kasvun ja aineenvaihdunnan säätelyssä selkärankaisilla. Insuliinin puuttuessa tapahtuu vaikeita aineenvaihdunnan häiriöitä monien solujen epäonnistuessa käyttämään hyväksi glukoosia ja aminohappoja normaalisti. Kyvyttömyys glukoosin muuttamiseen aineenvaihdunnassa johtaa ihmisessä diabetes mellitukseen, joka on monimutkainen krooninen aineenvaihduntasairaus, jossa esiintyy epänormaalia hiilihydraattien, rasvan ja proteiinien aineenvaihduntaa. Täydellisimmin ilmenevässä kliinisessä muodossaan diabetes mellitukselle on tunnusomaista absoluuttinen tai suhteellinen insuliinin tai insuliinin toiminnan puute, ja siihen liittyvät sokerivirtsaisuus, ketonivirtsai-suus, kasvun keskeytyminen ja negatiivinen typpitasapaino.

Nämä olosuhteet voivat lopulta johtaa kuolemaan, joka johtuu akuutista aineenvaihdunnan asidoosista, jonka puolestaan aiheuttaa rasvahappojen rajoittamaton hapettuminen, tai riutumisesta, joka johtuu ketoniaineiden synnyttämiseen tarvittavien riittävien lipidivarastojen puutteesta. Riutuminen määritellään tilana, jolle on tunnusomaista merkittävä heikkous, äärimmäinen laihtuminen, ja aineenvaihdunnan heikentyminen, joka johtuu pitkäaikaisesta ja vaikeasta ravinnon riittämättömyydestä. Borland's Illustrated Medical Dictionary, 25th Edition.

Insuliinin keksiminen ja puhdistaminen 1920-luvulla sekä sen yhdistäminen diabetes mellitukseen antoivat mahdollisuuden sairauteen puuttumiseen. Katso esim. Bliss, The Discovery of Insulin (1983), University of Chigaco Press, Chigaco, 111. Nykyään insuliinin antaminen diabetes-potilaille on 2 98731 ensisijainen terapeuttinen keino sairauden kontrolloimiseksi.

Insuliini on 6000 daltonin polypeptidi, joka koostuu kahdesta lyhyestä peptidiketjusta, joita nimitetään A:ksi ja B:ksi, ja jotka ovat sitoutuneet toisiinsa muuttumattomilla disulfi-disilloilla. Lähes kaikissa tutkituissa insuliineissa ketju A, joka on pituudeltaan 21 aminohappoa, sisältää myös sisäisen disulfidisillan. Ketju B on pituudeltaan 30 aminohappoa. Kuten monet eukaryoottiset proteiinit, insuliini syntetisoidaan prekursorimuodossa, joka sen jälkeen synteettisesti prosessoidaan valmiiksi kahden polypeptidiketjun aktiiviseksi hormoniksi.

Insuliinin välitön prekursori on proinsuliini, yksiketjuinen polypeptidi, joka koostuu ketjuista B ja A sitoutuneina noin 31 aminohapon yhdistävään peptidiin, jota kutsutaan C-pepti-diksi, vierekkäisten emäksisten jäännösparien avulla. Kolmen peptidin järjestys proinsuliinimolekyylissä on NH2-B-ketju-Arg-Arg-C-peptidi-Lys-Arg-A-ketju-COOH. Insuliinin mRNA:n translaatiotuote on kuitenkin preproinsuliini, joka on proinsuliini, joka sisältää NH2-päässään 24 aminohapon voimakkaasti hydrofobisen signaalipeptidin, jolle ovat tunnusomaisia proteiinit, jotka joko siirtyvät solukalvojen läpi tai inser-toidaan niihin.

Preproinsuliini syntetisoituu haiman beetasoluissa, jotka ovat Langerhansin saarekkeissa, jotka ovat hajaantuneet kautta koko haiman. Signaalipeptidin poistaminen ilmenee karkeassa endoplasmaverkossa täysin taittuneen hapettuneen proinsu-liinin kulkeutuessa Golgin laitteseen pakkautuakseen eritys-rauhasiin. Taittunutta proinsuliinia stabiloivat disulfi-disidokset. Eritysrauhasten kypsyessä taittunut proinsu-liinimolekyyli lohkeaa spesifisten proteaasien vaikutuksesta pariutuneissa emäsjäännöksissä vapauttaen insuliinia ja C-peptidiä.

Kuten edellä on todettu, hoito diabetes mellitukseen käsittää kontrolloitujen insuliinimäärien antamisen potilaalle. Näin

II

3 98731 annettu insuliini on enimmäkseen peräisin eläinten haimoista, erityisesti naudoilta ja porsailta. Naudan ja porsaan insuliinit toimivat säilyttäen hormonaalisen homeostaasin samalla tavalla kuin ihmisen insuliini suunnilleen samalla tehokkuudella, mutta koska ne ovat vieraita proteiineja, voi tapahtua immunologinen reaktio, joka vähentää niiden käyttökelpoisuutta. Viime aikoina on yhdistelmä-DNA-tekniikalla saatu ihmisen insuliini lisätty terapeuttiseen välineistöön. Yhdistelmä-DNA-tekniikalla tai muulla menetelmällä saadun ihmisen insuliinin käyttö ei todennäköisesti tuota haitallisia immunologisia ongelmia, jotka liittyvät eläininsuliinien käyttöön. Jopa silloin kun on ollut saatavissa luonnollista ihmisen insuliinia, ei hormonin antaminen diabetekseen kuitenkaan ole aina ollut riittävää normaalin aineenvaihdunnan säilyttämiseksi. Niinpä esiintyy tarvetta vaihtoehtoisista insuliineista, joilla on paremmat vaikutukset, tai muista hoitokeinoista diabetekseen.

Suvuittain esiintyvä veren liiallinen proinsuliinipitoisuus on geneettinen häiriö, jolle on tunnusomaista merkittävä kasvu seerumin proinsuliinin kaltaisissa molekyyleissä. Tämä harvinainen sairaus on identifioitu kolmesta suvusta. Kahdessa suvuista todettiin rakenteellisesti epänormaali proinsuliinin kaltainen molekyyli. Geneettinen vika identifioitiin mutaatioksi, joka aiheuttaa aminohapposubstituution proinsu-liinissa, joka puolestaan johtaa proinsuliinin epätäydelliseen lohkeamiseen insuliinia muodostavien proteaasien vaikutuksesta .

Kolmannen suvun sairauden vaikutuksen alaiset jäsenet tuottivat proinsuliinin kaltaisen molekyylin, joka oli suunnilleen saman kokoinen kuin proinsuliini ja joka käyttäytyi kuin normaali prohormoni reseptoriinsitoutumiskokeissa. Kahdelta tämän kolmannen suvun sairauden vaikutuksen alaiselta jäseneltä saatujen kloonattujen insuliinigeenien sekvenssianalyysi paljasti yhden koodittavan mutaation, joka korvasi histi-diinin asparagiinihapolla proinsuliinimolekyylissä kohdassa, joka vastaa insuliinin B-ketjun asemaa 10. Chan et ai., Proc.

4 98731

Natl. Acad. Sei. (1987), voi. 84, pp. 2194-2197.

Mutaation uskottiin inhiboivan proinsuliinin prosessoitumista edelleen insuliiniksi johtaen näin mutanttiproinsuliinin akkuimiloitumiseen. Nykyään ei tunneta tarkkaa tapaa, jolla mutaatio inhiboi edelleen prosessoitumista. Ihmisen insuliinin analogi, 10-asparagiinihappo-B-ihmisen insuliini, joka vastaa tätä mutanttiproinsuliinia, on nyt syntetisoitu ja sillä on osoitettu olevan suurempi teho kuin luonnon insuliineilla .

On myös havaittu, että insuliinin B-ketjun karboksipään osat näyttävät myös vaikuttavan insuliinin biologiseen aktiivisuuteen. Spesifisesti näyttää kohta B25 vaikuttavan insuliinia-nalogien voimakkuuteen.

Insuliinin B-ketjun C-pään pentapeptidisekvenssin eliminointi ja juuri muodostuneen C-pään, Phe B25:n, karboksyyliryhmän amidointi johtaa analogiin des-pentapeptidi(B26-B30)-[PheB25-β-karboksamidi]insuliini, jolla on osoitettu olevan vertailukelpoinen voimakkuus luonnonhormonin kanssa. Katso Nakagawa et ai., J. Biol. Chem., 261:7332-41(1986); Cosmatos et ai., Int. J. Pept. Prot. Res., 14:457-71(1979); Casareto et ai., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 368:709-16 (1987). Phe B25:n korvautuminen useilla muilla aminohappojäännöksillä, sekä näiden substituoitujen insuliinien B26-B30-segmentin eri modifikaatiot johtivat analogeihin, joiden voimakkuus vaihteli lähes täydellisestä inaktiivisuudesta suurempaan voimakkuuteen kuin luonnon insuliinilla. Nakagawa et ai., J. Biol. Chem., 261, edellä; Casareto et ai., edellä; Nakagawa et ai., J. Biol.

Chem. 262:10254-58 (1987). Näiden joukossa des-pentapepti- di(B26-B30)-[TyrB25-a-karboksamidi]insuliinilla ja sen His B25-analogilla on noin 270-300% suurempi voimakkuus kuin insuliinilla. Näihin tutkimuksiin perustuen on ehdotettu, että insuliinin B25-aminohappojäännös vuorovaikuttaa reseptorin kanssa, jolloin syntyy konformaatiomuutoksia insuliinimo-lekyylin vielä määrittelemättömillä alueilla, jotka liittyvät hormonireseptorin sitoutumiseen. B25-reseptorin vuorovaikutus 5 98731 voidaan B-ketjun alueen C-pään vaikutuksella moduloida positiivisella tai negatiivisella tavalla, riippuen B25-jäännök-selle suoritettujen modifikaatioiden luonteesta ja siitä, missä määrin B-ketjun C-pääalue on muuttunut. Nakagawa et ai., J. Biol. Chera., 261, edellä; Casareto, edellä; Nakagawa et ai., J. Biol. Chem., 262, edellä.

FI-patenttihakemuksesta 863512 tunnetaan nopeavaikutteisia ihmisinsuliinianalogeja, joilla on kaava: A-ketju

Of *J(c '·Ύ*·μΓ1 λ • * * 4 * · rJ · ♦ ίο n ij u t« ij n ir ia i« soi n |__/ ' * * ‘ * · r * ·» n II II M II H ff II n N 11 11 11 I. 11 1· 11 1· 11 lo B-ketju * jossa kaavassa Al-A21-ketjussa voi olla muunnos (eri ihmisin-suliinin aminohappotähde on korvattu toisella aminohappotähteellä) kohdassa A8, A9, AIO, A13 ja A21, sekä Bl-B30-ketjussa kohdassa Bl, B2, B5, B9, BIO, B12, B14, B16, B17, B18, B20, B26, B27 ja B29. Näistä insuliinianalogeista tutkittiin GluB27-, AspB9,GluB27-, IleB12-, GluB27,AspA21-, AspB9-, AspA21,AspB9,GluB27-, HisA8,AspB9,GluB27-, AspBIO- ja AspB8-ihmisinsuliinianalogien biologista voimakkuutta ja puoliintu-misaikaa. Lupaavampiin kuului AspBIO-ihmisinsuliini ja sillä todettiin olevan lyhyempi puoliintumisaika kuin ihmisen insuliinilla ja biologinen voimakkuus, joka on verrattavissa ihmisen insuliiniin. Tämän insuliinianalogin ovat tämän keksinnön tekijät määrittäneet 4-6 kertaa voimakkaammaksi kuin luonnon insuliini (katso vertailuesimerkki 1).

Julkaisusta Int. J. Peptide Protein Res., 23 (1984), tunnetaan insuliinijohdannaisia, joissa B10-asemassa on histidii- 6 98731 nin tilalla Asn, Leu tai Lys. Näiden insuliinianalogien on todettu olevan vähemmän aktiivisia kuin luonnon insuliini.

Keksinnön kuvaus Tämän keksinnön mukaisesti tarjotaan käyttöön menetelmä supe-raktiivisten insuliinianalogien valmistamiseksi, joka käsittää aminohapot A1-A21 sisältävän A-ketjun ja des-pentapepti-di-(B26-B30)-[XB10, TyrB25-a-karboksamidi]-B-ketjun, jolla on kaava: ,--—s‘s-1

I I

H-Gly-Il*-v*l-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Leu-Cys-Ser-

S

s L*u-Tyr-Gln-L*u-Glu-A*n-Tyr-Cys-Asn-OH H-Phe-Val-Asn-Gln-His-L«u-Cys-Gly-S*r- X -Leu-Val-GIu-Ala-Leu- s

S

Tyr-L«u-Val-CjS-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Tyr(NH2) jossa X on Asp, Glu tai α-aminoadipiinihappo tai sen korkeampi homologi.

Verrattuna ihmisen insuliiniin B-ketjun kohdassa 10 on histi-diinin sijasta Asp, Glu tai α-aminoadipiinihappo tai sen korkeampi homologi ja lisäksi segmentti B26-B30 on eliminoitu ja PheB25 on korvattu Tyr-a-karboksamidilla. Tällä insuliini-analogilla on merkittävästi suurempi voimakkuus kuin luonnollisella ihmisen insuliinilla.

Uskotaan, että kohdassa BIO korvautuneen happaman aminohapon rungon hydrofobinen luonne on avustava tekijä näiden analogien osoittamalle suuremmalle voimakkuudelle. Sen mukaisesti

II

7 98731

BlO-aminohappojäännöksen (X) korvautuminen erilaisilla aminohapoilla, joilla on hydrofobinen runko, rengasrakenteessa tai avoimessa ketjussa, siten että mukana on myös vapaa kar-boksyyli tai muu varauksellinen osa, voi myös johtaa muihin erittäin voimakkaisiin insuliinianalogeihin.

Termi insuliinianalogi viittaa proteiiniin, jossa on perus-A-ketju ja B-ketjurakenne ihmisen (ja muiden lajien) insuliinista ja joka sisältää kaikki puolikysteiinijäännökset samassa kohdassa kuin on luonnon insuliinissa. Niinpä insu-liinianalogeissa on luonnoninsuliinien disulfidisiltarakenne.

Käyttökelpoiset insuliinianalogit voivat erota luonnon insuliineista siten, että on lisätty, deletoitu, korvattu tai muunnettu yksi tai useampi aminohappo yhdessä tai molemmissa molekyylin ketjuissa, mutta sen on pitänyt säilyttää ainakin osa insuliinin voimakkuudesta. Katso esim. Katsoyannis, Treatment of Early Diabetes (1979), pp. 319-327, Plenum Pubi.

Corp.; Blondell, Adv. Prot. Chem. (1972), voi. 26, pp. 330-3-62.

Keksinnön mukaiset insuliinianalogit voidaan valmistaa millä tahansa monista menetelmistä, jotka ovat alan ammattimiehille tuttuja. Esimerkiksi insuliinianalogin ketjut A ja B voidaan syntetisoida millä tahansa tunnetulla peptidisynteesimenetel-mällä, kuten kiinteäfaasipeptidisynteesimenetelmät ja liuos-menetelmät, esim. fragmenttikondensaatio. Katso esim. Erickson ja Merrifield, The Proteins (1976), voi. 2, chapter 3, Academic Press, New York; Blake et ai. Proc. Natl. Acad. Sei. (1983), voi. 80, pp. 1556-1559, jossa kuvataan peptidien synteesimenetelmiä. Keksinnön mukaiset insuliinianalogit voidaan myös valmistaa yhdistämällä ihmisen tai porsaan A-ketju, joka on eristetty kokonaisen haimainsuliinin tai yhdistelmäinsu-liinin pelkistyksen tai hapettavan sulfitolyysin jälkeen, ja des-pentapeptidi-(B26-B30)-[XB10, TyrB25-e-karboksamidi]-B-ketju, jossa X tarkoittaa samaa kuin yllä, joka B-ketju on valmistettu peptidien synteesimenetelmällä tai yhdistelmä-DNA-menetelmillä. On tunnettua, että porsaan ja ihmisen insu 8 98731 liinin A-ketjut ovat toistensa kanssa identtisiä aminohapposekvenssiltään, niin että porsaan A-ketju voi helposti korvata ihmisen A-ketjut missä tahansa menetelmässä.

Yhdistelmä-DNA-menetelmiä keksinnön mukaisen insuliinianalo-gin B-ketjun valmistamiseksi, ovat, mutta ei näihin rajoittuen, tällaista B-ketjun aminohapposekvenssiä koodattavan in vitro-syntetisoidun DNA:n kloonaus ja ilmentäminen. Vaihtoehtoisesti voidaan organismi, kuten bakteerit, joka ilmentää ihmisen insuliinin B-ketjua, indusoida tuottamaan modifioitu B-ketju millä tahansa in vitro kohtasuunnatun mutageneesin tekniikalla. Katso esim. Smith, Ann. Rev. Genet. (1985), voi.

19, pp. 423-463; Botstein et ai., Science (1985), voi. 229, pp. 1193-1201.

Yleisesti, keksinnön mukaisessa menetelmässä des-pentapepti-di-(B26-B30)-[XB10, TyrB25-a-karboksamidi)-ihmisen insuliinin valmistamiseksi, yhdistetään millä tahansa tunnetulla tekniikalla saatu A-ketju, edellä mainittujen modifioitujen B-ket-jujen kanssa, jotka on valmistettu millä tahansa sopivalla menetelmällä. Ketju A ja modifioitu B ovat edullisesti stabiloiduissa S-sulfonoiduissa muodoissaan, jotka sitten voidaan yhdistää tunnetuilla menetelmillä, jolloin muodostuu ehjä aktiivinen ihmisen insuliinianalogi. Tunnettuja yhdistämisme-netelmiä on esitetty US-patentissa nro 3 420 810 (Katsoyan-nis) ja US-patentissa nro 4 421 685 (Chance et ai.). Esimerkiksi US-patentti nro 4 421 685 esittää yksivaiheisen prosessin insuliinin muodostamiseksi, joka menetelmä käsittää sen, että yhdistetään S-sulfonoitu A-ketju ja S-sulfonoitu B-ketju pelkistimenä toimivan tiolin, kuten ditiotreitolin tai kyste-iinin, läsnäollessa vesipitoisessa väliaineessa. Reaktio-olosuhteet ovat (1) pH noin 8-12, (2) kokonaisproteiinipitoi-suus noin 0,1-50 mg/ml, ja (3) tiolipelkistintä konsentraa-tio, joka tuottaa noin 0,4-2,5 SH-ryhmää kutakin seoksessa olevan A- ja B-ketjun S-sulfonaateissa läsnäolevaa S-S03-ryh-mää kohti. Halutun insuliinianalogin muodostus tapahtuu reak-tiolämpötilassa noin 0-25 °C, ympäristössä, jossa on happilähde, jolloin insuliinin S-S-sidosten muodostuminen on 9 98731 mahdollista.

Kun ketjujen yhdistämisreaktio on tapahtunut, insuliinianalo-gi voidaan eristää ja tutkia sen puhtaus ja aktiivisuus monilla eri menetelmillä, jotka ovat tuttuja alan ammattimie-hille.

Tavallisesti käytettyjä menetelmiä insuliinin ja insulii-nianalogien puhdistamiseksi ovat kromatografiset menetelmät, kuten korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC), geelisu-odatus ja ioninvaihtokromatografia. Tuotteen puhtaus voidaan määrittää eri menetelmillä, kuten muun muassa HPLC, polyak-ryyliamidigeelielektroforeesi, aminohappoanalyysi ja aminohappo s ekvento int i.

Vaikka insuliinianalogit yleensä säilyttävät jonkin verran jäännösinsuliiniaktiivisuutta, on näiden analogien voimakkuus tavallisesti vain osa luonnon insuliinin voimakkuudesta.

Ihmisen, naudan ja porsaan insuliinien voimakkuus USP-stan-dardeissa on noin 25-26 IU (kansainvälistä yksikköä) mg:aa kohti proteiinia. Yllättäen todettiin kokeissa, jotka mittaa-vat insuliinin voimakkuutta, että des-pentapeptidi-(B26-B30)-[AspBlO, TyrB25-a-karboksamidi]-ihmisen insuliini on noin 11-13 kertaa voimakkaampi kuin luonnon insuliini ja että vastaava GluBlO-analogi on 20 kertaa voimakkaampi kuin luonnon insuliini. Määritettiin myös aikaisemmin tunnetun AspBlO-ihmisinsuliinin voimakkuus, jolle saatin arvo 4-6 kertaa voimakkaampi kuin luonnon insuliini (vertailuesimerkki 1).

Standardikokeita insuliinin voimakkuuden määrittämiseksi ovat muun muassa (1) insuliinin radioreseptorikokeet, joissa insuliinin suhteellinen voimakkuus määritellään sinä insuliinin suhteena insuliinianalogiin, joka vaaditaan korvaamaan 50% 125I-insuliini, joka on spesifisesti sitoutunut insuliini-reseptoreihin, joita on läsnä solukalvoissa, esim. rotan maksan plasman kalvofraktiossa; (2) rasvansyntykokeet, jotka suoritetaan esimerkiksi rotan rasvasoluilla, joissa suhteellinen insuliinin voimakkuus määritellään insuliinin suhteena 10 98731 insuliinianalogiin, joka tarvitaan saavuttamaan 50% [3-3H]-glukoosin maksimikonversiosta orgaanisesti uutettavaksi materiaaliksi (s.o. lipideiksi); (3) glukoosin hapettumiskokeet eristetyissä rasvasoluissa, jossa insuliinianalogin suhteellinen voimakkuus määritellään insuliinin suhteena insulii-nianalogiin, jotta saavutetaan 50% maksimikonversiosta glu-koosi-l-[14C] :n muuttuessa [14C02]:ksi; (4) insuliinin radio-immunokokeet, joilla voidaan määrittää insuliinianalogien immunogeenisuus mittaamalla tehokkuus, jolla insuliini tai insuliinianalogi kilpailee 125I-insuliinin kanssa sitoutumisessa spesifisiin anti-insuliini-vasta-aineisiin; ja (5) muut kokeet, joilla mitataan insuliinin tai insuliinianalogin sitoutumista soluihin, kuten viljellyt imusolut, joissa tiedetään olevan spesifisiä insuliinireseptoreita. Standardiko-keissa suhteellisen insuliinivoimakkuuden mittaamiseksi, esim. kokeet (1), (2) ja (5) edellä, määritettiin Asp-B10-ihmisen insuliinin olevan noin 4-6 kertaa aktiivisempi kuin luonnon insuliinit, keksinnön mukaisen des-pentapeptidi-(B26-B30)-[AspB10, TyrB25-o-karboksamidi]-ihmisen insuliinin todettiin olevan 11-13 kertaa voimakkaampi kuin luonnon insuliinit ja keksinnön mukainen vastaava GluBlO-analogi oli 20 kertaa voimakkaampi kuin luonnon insuliini.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut ihmisen insu-liinianalogit voidaan myös muodostaa farmaseuttisiksi koostumuksiksi annettaviksi diabetes-potilaille. Farmaseuttinen koostumus sisältää keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetun ihmisen insuliinianalogin, joka on terapeuttisesti tehokas edistämään hormonaalisen homeostaasin saavuttamista diabetes-potilaassa, yhdessä farmaseuttisen kantajan kanssa. Kuten kaikilla insuliinivalmisteilla, joita on tarkoitus käyttää diabeteksen hoitoon, vaikuttavan aineen riittävät määrät hormonaalisen homeostaasin saavuttamiseksi yksittäisissä potilaissa tulee määrittää. Huomioonotettavia seikkoja ovat diabeteksen vaikeus ja koostumuksen antotapa. Viime kädessä on diabetes-potilasta kulloinkin hoitavalla lääkärillä toimintavapaus päättää farmaseuttisen koostumuksen määrä ja antotapa. Luonnon insuliineja annetaan potilaalle yleensä

II

11 98731 sellainen terapeuttinen annostus, että saadaan noin 0,02 -noin 5 yksikköä ihmisen insuliiniaktiivisuutta kilogrammaa kohti ruumiinpainoa päivässä. Katso esim. US-patentti nro 4 652 547.

Koska nämä uudet insuliinianalogit ovat voimakkaampia kuin luonnon insuliini in vitro, uskotaan, että niiden terapeuttiset määrät, jotka riittävät saamaan aikaan homeostaasin diabetes-potilaassa, ovat pienempiä kuin luonnon insuliinien terapeuttinen määrä, joka nyt käytetään hoidettaessa diabetesta. Lisäksi näiden insuliinianalogien toinen tärkeä etu on nopeampi puhdistuma diabetes-potilaiden verestä. Tiedetään, että insuliinin puhdistumista verestä säätelee insuliinin reseptori soluissa. Koska des-pentapeptidi-(B26-B30)-[AspB10, TyrB25-a-karboksamidi]-ihmisen insuliinin on osoitettu sitoutuvan 11-13 kertaa ja vastaavan GluBlO-analogin 20 kertaa tiukemmin kuin luonnon insuliinit, uskotaan, että nämä insuliinianalogit puhdistuvat potilaiden verestä nopeammin kuin luonnon insuliinit. Sen mukaisesti diabetes-potilaiden hoidossa uskotaan, että verisuonten toksisuutta, joka liittyy kiertävän insuliinin kasvua edistäviin vaikutuksiin, voidaan vähentää käyttämällä keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja insuliinianalogeja.

Farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät terapeuttisesti vaikuttavan määrän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja insuliinianalogia, voidaan antaa parenteraalisesti diabetespotilaalle, joka on insuliinihoidon tarpeessa. Edullisesti koostumusta annetaan lihakseen, ihon alle tai suoneen. Koostumusta voidaan antaa potilaalle myös nenäsuihkeena. Vaihtoehtoisesti, jos halutaan pitkäaikaisesti kontrolloitu homeostaasi, voidaan koostumus liittää istutepumppuun potilaalle antamista varten. Tällaiset istutettavat laitteet, jotka antavat lääkettä kontrolloidun annostuksen potilaalle pitkänä ajanjaksona, tunnetaan alalla. Koostumus sisältää lisäksi farmaseuttisesti sopivan kantajan, joka ei saa olla haitallinen vastaanottavalle potilaalle. Kantajalle ei myöskään saa olla mitään haitallista vaikutusta koostumuksen 98731 12 valloittavaan komponenttiin, s.o. ihmisen insuliinianalogiin. Sopivia kantajia ja muita lisäaineita farmaseuttisiin koostumuksiin, jotka sisältävät terapeuttisesti vaikuttavia määriä keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettua insulii-nianalogia vaikuttavana aineena, voidaan löytää US-patentista nro 4 652 547, jossa annetaan insuliinia sisältäviä koostumuksia.

Lyhyt kuvaus piirroksista

Kuva 1 on kromatogrammi, joka esittää epäpuhtaan ihmis [AsplOJ-B-ketjun S-sulfonaatin eluoitumisen CM-sellu-loosakolonnista.

Kuva 2 on HPLC-kromatogrammi, joka esittää ihmis-A-ketjun S-sulfonaatista ja ihmis[AsplO]-B-ketjun sulfonaatista muodostuvan yhdistelmän eluoitumisen. Osa A esittää alkuperäisen kromatografisen erotuksen. Osa B esittää osassa A esitetyn materiaalin uudelleenkromatografioimisen piikissä, joka elu-oituu ajassa 32,32 min.

Kuva 3 on graafinen esitys kilpailevasta inhiboinnista 125l-insuliinille, joka sitoutuu rotan maksan plasman insuliini-reseptoreihin [AspBIO]-ihmisen insuliinilla (o) ja naudan . insuliinilla (o).

Kuva 4 on graafinen esitys, joka osoittaa [AspBIO]-ihmisen insuliinin ja naudan insuliinin vaikutuksen rasvasynnyn stimulointiin rotan rasvasoluissa.

Kuva 5 on kromatogrammi, joka esittää epäpuhtaan ihmisen des-pentapeptidi-(B26-B30)-[AspBIO, TyrB25-«-karboksamidi]-B-ket-jun S-sulfonaatin eluoitumisen CM-selluloosakolonnista.

Kuva 6 on HPLC-kromatogrammi, joka osoittaa ihmisen A-ketjun S-sulfonaatista ja ihmisen des-pentapeptidi-(B26-B30)-[AspBIO, TyrB25-o-karboksamidi]-B-ketjun S-sulfonaatista muodos- li 13 98731 tuneen yhdistelxnäseoksen eluoitumisen. Osa A esittää alkuperäisen kromatografisen erotuksen. Osa B esittää osassa A esitetyn materiaalin uudelleenkromatografioimisen piikissä, joka eluoituu ajassa 36,86 min.

Kuva 7 on graafinen esitys 125I-insuliinin rotan maksan plasman insuliinireseptoreihin sitoutumisen kilpailevasta inhi-boinnista des-pentapeptidi-(B26-B30)-[AspB10, TyrB25-«-kar-boksamidi]-ihmisen insuliinin (o) ja naudan insuliinin (·) vaikutuksella.

Kuva 8 on graafinen esitys des-pentapeptidi-(B26-B30)-[AspBIO, TyrB25-a-karboksamidi]-ihmisen insuliinin ja naudan insuliinin vaikutuksesta rasvansynnyn stimuloimiseen rotan rasvasoluissa.

Keksintöä valaistaan edelleen seuraavilla spesifisillä esimerkeillä, joiden ei ole millään tavoin tarkoitettu rajoittavan keksinnön piiriä. Vaikka spesifisiä tietoja annetaan des-pentapeptidi-(B26-B30)-[AspBIO, TyrB25-a-karboksamidi]-ihmisen insuliinin synteesille, samaa menettelyä käytetään syntetisoimaan GluBlO-, a-aminoadipiinihappoB10- ja muut korkeammat B10-homologit.

Vertailuesimerkki 1

AspBIO-ihmisen insuliinin synteesi 10-Asparagiinihappo-B-ihmisen insuliini syntetisoitiin pepti-disynteesillä käyttäen fragmenttikondensaatiotekniikkaa.

(Katso esim. Blake et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (1983), voi. 80, pp. 1556-1559 yleisestä tekniikasta). Kaikkien väli-tuotepeptidijohdannaisten homogeenisuus varmistettiin ohut-kerroskromatografiällä 6060 silikageelillä (Eastman Chromato-gram-levy). Käytetyt liuotinjärjestelmät kromatogrammien kehittämiseksi olivat kloroformi-metanoli-vesi (45:10:1; 89:10:1; ja 200:75:13).

14 98731 f10-Asparagiinihappo-Bjihmisen insuliini valmistettiin yhdistämällä ihmisen insuliinin A-ketjun S-sulfonoitu muoto ihmisen insuliinin [jLO-asparagiinihappoT} B-ketjun synteettisen S-sulfonoidun johdannaisen kanssa ditiotreitolin läsnäollessa, kuten on esitetty US-patentissa nro 4 421 685 (Chance et ai.)· S-sulfonoitu ihmisen A-ketju, joka on identtinen porsaan insuliinin vastaavan ketjun kanssa (Nicol et ai, Nature (1960), voi. 181, pp. 483-485), valmistettiin porsaan insuliinin hapettavalla sulfitolyysillä ja erottamalla saadut S-sulfonoidut A- ja B-ketjut pylväskromatografialla, kuten on kuvattu julkaisussa Katsoyannis et ai., Biochemistry (1967), voi. 6, pp. 2635-2624. S-sulfonoidun ihmisenJTlO-asparagiini-happojB-ketjun synteesi suoritettiin S-sulfonoidun luonnon ihmisen B-ketjun synteesin jälkeen, kuten on kuvattu julkaisussa Schwartz and Katsoyannis, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I (1973), pp. 2894-2901. C-pään heksadekapeptidi (sekvenssi b15_b30) Uitettiin viereiseen heksapeptidiin (sekvenssi b9-b14), jolloin saatiin C-pään dokosapeptidi (sekvenssi b9_b30). Tämä puolestaan liitettiin N-pään oktapeptidiin (sekvenssi βΙ-Β9), jolloin saatiin suojattu B-ketjun analogi, josta saatiin nestemäisellä vetyfluoridilla ja saadun sulf-hydryyliryhmän käsittelyllä S-sulfonoitu muoto jjLO-asparagii-nihappo^B-ketjusta.

Taulukko I antaa joitakin yhdisteistä ja aminohappojen suoja-ryhmistä, joita käytetään peptidien synteesissä ja mainitsee niistä käytetyt lyhenteet.

Taulukko I

Yhdiste Lyhenne bentsyyli Bzl tertiäärinen butoksikarbonyyli Boc tertiäärinen butyyli Bufc sykloheksyyli cHex

disykloheksyyliamiini DCHA

dimetyyliformamidi DMF

dimetyylisulfoksidi DMSO

is 98731

difenyylimetyyli DPM

N,N1-disykloheksyylikarbodi-imidi DCC

1-hydroksibentsotriatsoli HOBT

bentsyylioksikarbonyyli Z

A. S-Sulfonoitujen LlO-asparagiinihappo]B-ketjujen synteesi Z.Glu(cHex).QH,DCHA (Yhdiste I) Tämä yhdiste valmistettiin vastaavasta Boc-johdannaisesta (Peninsula Laboratories) poistamalla suojaus trifluorietikka-hapolla ja karbobentsyloimalla saatu yhdiste, saatu johdannainen kiteytettiin eetteristä disykloheksyylisuolana; sp. 131-132°C. Anal. lask. ¢3^48^06: He : C, 86,4; H, 8,88; N, 5,4. Löydetty; C, 68,3; H, 9,11; N, 5,1.

Z .Glu( cHex) -Ala .QBu^· (Yhdiste II)

Yhdiste I (9,8 g) annettiin jakaantua 0,2 N H2S04:n ja etyyliasetaatin välille ja orgaaninen kerros erotettiin, pestiin vedellä, kuivattiin (MgSC>4) 3a konsentroitiin kuiviin. Jäännöksen liuokseen DMFjssä (30 ml), joka oli jäähdytetty 0°C;een, lisättiin H.Ala.OBu*-:tä £joka oli valmistettu Z.Ala.OBu^iSta (5,6 g) Schwartz and Katso^yannisin, edellä, ohjeen mukaarj, jonka jälkeen lisättiin HOBT:tä (2,3 g) ja DCCttä (3,7 g). Kun oli pidetty 24 h huoneenlämmössä, urea-sivutuote suodatettin pois ja suodos laimennettiin etyyliasetaatilla (500 ml) ja pestiin peräkkäin 1 M NaHC03:lla, vedellä, 0,2 N HCl:llä ja vedellä, kuivattiin ja konsentroitiin alipaineessa kuiviin. Tuote saatiin öljynä {ji g (90%)[J , joka oli homogeenistä ohutkerroskromatografiällä osoitettuna ja käytettiin yhdisteen lii synteesiin ilman lisäkarakterisoin-tia.

Z.Val-Glu(cHex)-Ala.OBu^ (Yhdiste lii)

Yhdistettä II (8 g) metanolissa (150 ml) hydrattiin 10% Pd/c-katalyytillä (2 g) 3 h. Katalyytti suodatettiin pois 16 98731 ja suodos konsentroitiin alipaineessa kuiviin. Jäännös sekoitettiin aktiiviseoksen kanssa, jossa oli Z.Vai.OH (4,1 g), HOBT (2,7 g) ja DCC (3,3 g) DMFissä (30 ml) (aktivoitu 30 min huoneenlämmössä ennen aminokomponentin lisäämistä). 24 tunnin kuluttua tuote eristettiin samalla tavalla kuin yhdisteelle II on kuvattu; öljy, 8,7 g (85%). Tämä aine oli homogeenista ohutkerroskromatografian mukaan ja käytettiin seuraavaan syn-teesivaiheeseen ilman lisäkarakterisointia.

Z.Leu-val—Glu (cHex)-Ala.QBut (yhdiste iv)

Yhdiste lii (8 g) hydrattiin kuten edellä on kuvattu ja saatu öljyinen jäännös liuotettiin DMFrään (30 ml). Tähän liuokseen lisättiin Z-leusiini-p-nitrofenyyliesteriä (5,5 g) ja HOBT:tä (1,8 g). 48 tunnin kuluttua seos laimennettiin etyyliasetaatilla (250 ml), pestiin peräkkäin 0,5 N NH40H:lla, vedellä, 0,2 N Helillä ja vedellä, kuivattiin (MgS04) ja konsentroitiin kuiviin vakuumissa. Jäännös kiteytettiin 95% etanolista; paino 8,4 g (88%); sp. 190-194°C;(α]δ6-20.3e(c 1, DMF). Analyysi: laskettu C37H58N4O9:Ile C, 63,2; H, 8,31; N, 8,0. Löydetty: C, 62,9; H, 8,37; N, 8,1.

Boc.Asp(cHex)-Leu-Val-Glu(cHex)-Ala.QBut: (Yhdiste y) • Yhdiste IV (1,5 g) hydrattiin kuten aikaisemmin on kuvattu ja jäännös lisättiin aktiiviseokseen, jossa oli Boc.Asp(cHex).OH (Peninsula Laboratories) (0,8 g), HOBT (0,34 g) ja DCC (0,52 g) DMFissä (10 ml) (aktivoitu 30 minuuttia huoneenlämmössä ennen aminokomponentin lisäämistä). 24 tunnin kuluttua reak-tioseos käsiteltiin kuten yhdisteelle n on kuvattu, ja tuote puhdistettiin uudelleenkiteyttämällä etyyliasetaatin ja pet— rolieetterin seoksesta; paino 1,5 g (85%); sp 203-205°;(α]δ6-8·9β (c 1, DMF) . Analyysi: Laskettu C44H75N5O12:He : C, 61,0; H, 8,72; N, 8,1. Löydetty C, 60,7; H, 8,56; N, 7,8.

Boc.Ser(Bzl)-Asp(CHex)-Leu-Val-Glu(cHex)-Ala.OH (Yhdiste vi) 17 98731

Yhdisteen V (1 g) liuosta trifluorietikkahapossa (10 ml) säilytettiin huoneenlämmössä 2 h ja konsentroitiin sitten kuiviin vakuumissa ja jäännös trituroitiin kylmän eetterin kanssa. Muodostunut kiinteä pentapeptiditrifluorietikkahappo, josta oli suojaus poistettu, suodatettiin ja kuivattiin KOH:lla. Aktiiviseos, jossa oli Boc.Ser(Bzl).OH (1,2 g), HOBT (0,5 g) ja DCC (0,6 g) DMF:ssä (10 ml) valmistettiin ja 30 minuutin inkuboinnin jälkeen seos suodatettiin liuokseen, jossa oli pentapeptiditrifluorietikkahappoa DMS0:ssa (10 ml), joka sisälsi N-metyylimorfoliinia (0,13 ml). 24 tunnin kuluttua reaktioseos laimennettiin kylmällä vedellä (100 ml) ja saostunut tuote suodatettiin pois, kuivattiin ja saostettiin uudelleen etyyliasetaatin ja petrolieetterin seoksesta: paino 0,9 g (90%); sp. 200-203°; [0]26-i7.8* (c 1, DMF).

Analyysi: Laskettu C50H78N6O14:lie: C, 60,8; H, 7,96; N, 8,5. Löydetty: C, 61,4; H, 8,25; N, 8,7. Aminohapposuhteet happohydrolyysin jälkeen, Asp^Ser,,^Glu^Ala^Val^Leu^.

Boc.Ser(Bzl)-Asp( cHex)-Leu-Val-Glu(cHex)-Ala-Leu-Tyr(Bzl)-Leu-Val-Cys(Dpm)-Gly-Glu(Bzl)-Arg(N02)-Gly-Phe-Phe-Tyr(Bzl)-Thr-pro-Lys(Z)-Thr(Bzl).OBzl (Yhdiste VII)_

Suspensiota, jossa oli vapaata emästä osittain suojatusta heksadekapeptidistä (sekvenssi b15_b30) ihmisen insuliinin B~fcetjusta (400 mg) valmistettuna Schwartz et ai.;n mukaan, int. j. pept. protein Res. (1981), voi. 17, pp. 243-255, yhdistettä VI (494 mg) ja H0BT:tä (80 mg), sekoitettiin kunnes liukeneminen tapahtui. DCC:n (100 mg) lisäyksen jälkeen tätä seosta sekoitettiin 4°C:ssa 48 h ja laimennettiin sitten 95% etanolilla (150 ml). Saostunut dokosapeptidi (sekvenssi B^-B30) suodatettiin pois, pestiin 95% etanolilla ja kuivattiin: paino 450 mg (88%). Aminohappoanalyysi happohydrolyysin jälkeen antoi seuraavan koostumuksen moolisuhteissa ilmaistuna Aspi.iThr 2 _„serχ_„Glu2 _1Pro1_ 0Gly2 _ 2Ala0 _ jVa^ _ 9

LeU2.9Tyrl.9Phe2.0^=1.1^0.7 (Cys;ä ei määritetty).

18 98731 H·Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(SO3)-Gly-ser-Asp-Leu-val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-val-Cys(SO3)-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr .OH (Ihmisen insuliinin {[lO-asparagiinihappcf]-B-ketjun S-sulfonaatti (Yhdiste VIII)

Yhdisteen VII (400 mg) liuosta seoksena trifluorietikkahapon ja etikkahapon (7:3, v/v) (10 ml) kanssa säilytettiin huoneenlämmössä 1 h ja laimennettiin sitten eetterillä. Saostunut dokosapeptidin trifluorietikkahapposuola suodatettiin pois, pestiin eetterillä ja kuivattiin. Tämän tuotteen liuos N-metyylipyrrolidonissa (6 ml) ja DMF:ssä (6 ml), joka sisälsi trietyyliamiinia (0,1 ml), laimennettiin eetterillä ja kuivattiin. Tämä tuote ja Boc.phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Dpm)-Gly.OH, valmistettu Schwartz and Katsoyannisin menetelmän mukaan, j. chem. Soc. perkin Trans. I (1973), pp. 2894-2901, (500 mg) liuotettiin seokseen, jossa oli DMF (5 ml) ja DMSO (5 ml), joka sisälsi HOBT:tä (90 mg), ja sitten lisättiin DCC:tä (100 mg). Kun seosta oli pidetty 48 h huoneenlämmössä, se kaadettiin kylmään veteen (250 ml), joka sisälsi 1 N NH4OH (5 ml) ja saostunut suojattu triakontapeptidi suodatettiin pois, pestiin (vesi, 50% metanoli ja metanoli), kuivattiin ja saostettiin uudelleen DMF-metanolista: paino 400 mg (90%).

Tämä tuote muutettiin S-sulfonoiduksi £l0-asparagiinihappoj-B-ketjuksi poistamalla suojaus nestemäisellä vetyfluoridilla, ja sen jälkeen hapettavalla sulfitolyysillä, kuten on kuvattu julkaisussa Schwartz and Katsoyannis, edellä, ihmisen insuliinin B-ketjun S-sulfonaatin synteesiä varten. Suojattu triakontapeptidi (200 mg) käsiteltiin vedettömällä nestemäisellä vetyfluoridilla (9 ml), joka sisälsi m-kresolia (1 ml), 0°C:ssa 1 h. Vetyfluoridi poistettiin sitten ja jäännös tri-turoitiin peräkkäin etyyliasetaatin ja petrolieetterin kanssa. Tämän·tuotteen liuokseen 8 M guanidiinihydrokloridissa (20 ml), puskuroitu 0,1 M Tris-HCl:llä (pH 8,8), lisättiin natriumsulfiittia (700 mg) ja natriumtetrationaattia (500 mg). 3 tunnin kuluttua huoneenlämmössä ollut reaktioseos li is 98731 pantiin dialyysiputkeen, esim. SpectraporR-membraaniputki nro 3, dialysoitiin vaihtaen tislattua vettä neljä kertaa (4 1 kerrallaan) 4°C:ssa 24 h, ja lyofilisoitiin.

Puhdistusta varten lyofilisoitu materiaali liuotettiin 3 mitään urea-asetaattipuskuria (0,04 M asetaattia - 8 M ureaa, pH 4,0) ja pantiin CM-selluloosakolonniin (2,5x40 cm), joka eluoitiin isokraattisesti samalla puskurilla. Katso esim. Katsoyannis et ai, Biochemistry (1967), voi. 6, pp. 2635-2642. Kolonnista ulos virtaavaa nestettä seurattiin spektro-fotometrillä (ISCO Model U-5A), joka antoi kuvassa 1 annetun eluoitumiskuvion. Pääpiikin eluaatti (125-168 ml) kerättiin, dialysoitiin kuten edellä, ja lyofilisoitaessa saatiin S-sul-fonoitu [lO-asparagiinihappoJB-ketju valkoisena jauheena: paino 22 mg. Puhdistetun ketjun aminohappoanalyysi happohyd-rolyysin jälkeen antoi seuraavan moolisuhteina ilmaistun koostumuksen, joka on sopusoinnussa teoreettisesti odotettujen arvojen kanssa: ASp2.lThI2.1Serl.lProl. lGlu3.0Gly2.9Alal.0Val3.0Leu3.8

Tyr1.8 Fhe2.9Lysl.lHis1.0Ar90.9 (Cys:ä ei määritelty).

B. |jLO-Asparagiinihappo-Bjihmisen insuliinin synteesi ja eristys_

Liuokseen, jossa oli s-sulfonoitua ihmisen (porsaan) A-ketjua (40 mg) ja S-sulfonoitua ihmisen £lO-asparagiinihappo-ETJketjua (20 mg) 10 ml:ssa 0,1 M glysiinipuskuria, pH 10,6, joka oli jäähdytetty 4°C:een, lisättiin ditiotreitolia (7 mg). 24 tunnin kuluttua 4°C:ssa liuos laimennettiin etikkahapolla (1 ml) ja saatu sakka poistettiin sentrifugoimalla (International Centrifuge, Model HN; 3000 rpm). Aktiivisen materiaalin sisältävä supernatantti vietiin läpi 0,45 yu:n selluloosa-ase-taattisuodattimen (Sartorius) ja sille suoritettiin käänteis-faasi-HPLC käyttäen VydacR 218 TP-kolonnia (0,45 x 25 cm), joka oli yhdistetty LKB-nestekromatografiajärjestelmään. Erät (n. 5 mg proteiinia kussakin) kromatografioitiin virtausnopeudella 0,5 ml/min 10-50 % lineaarigradientilla 20 9 8 7 31 2-propanolia 0,1% trifluorietikkahapossa 70 minuutin aikana. Kromatografiakuvio on esitetty kuvassa 2A. Esimerkeissä 2-4 kuvatuissa biologisissa kokeissa osoitettiin, että vain materiaalilla, joka eluoitui noin 32,3 minuutissa, oli olennaista insuliiniaktiivisuutta. Näissä samoissa kromatografiaolo-suhteissa naudan insuliini eluoitui ajassa 30 min. Aktiivisen materiaalin sisältävä fraktio konsentroitiin ja kromatografi-oitiin uudelleen käyttäen samaa kolonnia ja 20-35% lineaari-gradienttia 2-propanolia 0,1% trifluorietikkahapossa virtausnopeudella 0,5 ml/min 85 minuutin aikana. Eluoitumiskuvio on esitetty kuvassa 2B. Aktiivisen materiaalin sisältävä fraktio, joka eluoitui ajassa 47,2 min, kerättiin, konsentroitiin ja käytettiin esimerkeissä 2-4 kuvattuihin biologisiin tutkimuksiin. Näissä samoissa kromatografiaolosuhteissa naudan insuliini eluoitui ajassa noin 38 min. Edellä kuvatusta A- ja B-ketjujen yhdistelmäseoksesta saatiin 2 mg erittäin puhdistettua tuotetta. Puhdistetun synteettisen materiaalin amino-happoanalyysi happohydrolyysin jälkeen antoi seuraavan koostumuksen, ilmaistuna moolisuhteissa, joka sopii hyvin yhteen teoreettisesti odotettujen arvojen kanssa:

Asp4.0Thr2.8Ser3.lPr°l.0G1u7.0Gly4.0Alal.1 Val3.4Ilel.4LeU5.9TyI3.6Phe2.9LySl.lHlSl.0Atgl.0 (Cys:ä ei määritelty).

Vertailuesixnerkki 2 [j.O-Asparagiinihappo-Blihmisen insuliinin voimakkuuden analysoiminen insuliinin reseptoriinsitoutumiskokeella

Suoritettiin reseptoriinsitoutumiskokeet käyttäen rotan maksan plasmamembraaneja, kuten Kitagawa et ai. ovat kuvanneet, Biochemistry (1984), voi. 23, pp. 1405-1413. Rotan maksan plasmamembraanit valmistettiin, kuten Horvat et ai. ovat kuvanneet, Biochem. Biophys. Acta (1975), voi. 382, pp. 609-620.

Lyhyesti kerrottuna, inkuboitiin kolme 0,2 ml:n näytettä, li 21 98731 jotka sisälsivät 125i_insuliinia, 3 x 10_i0 M, leimaaraatonta insuliinia tai [_10-asparagiinihappo-Bj ihmisen insuliinia, valmistettuna kuten esimerkissä 1, sekä plasmamembraaneja (20-40 pg proteiinia) 0,1 M natriumfosfaatissa, pH 7,4, joka sisälsi 0,6% fraktion V naudan seerumin albumiinia. Kun oli inkuboitu 45 min 24°C:ssa, seokset laimennettiin 2,0 ml :11a jääkylmää 0,1 M natriumfosfaattia, pH 7,4, joka sisälsi 0,1% fraktion v naudan seerumin albumiinia ja suodatettiin välittömästi selluloosa-asetaattisuodattimien läpi. Suodattimet pestiin kahdesti jääkylmällä puskurilla, kuivattiin, ja sitten radioaktiivisuus laskettiin tuikelaskurissa käyttäen Filtron-x^iää. Ei-spesifinen sitoutuminen, määriteltynä suodattimien jäävänä radioaktiivisuutena, kun inkuboinnit sisälsivät 1 x 10-^ M leimaamatonta insuliinia, oli alentunut kaikista arvoista. Suhteellinen voimakkuus saatiin leimaamat-toman insuliinin konsentraation suhteena £l0-asparagiinihap-po- B] ihmisen insuliiniin, joka vaadittiin inhiboimaan 50% 125i_insuiiinin spesifisestä sitoutumisesta reseptorivalmis-teeseen.

Kuva 3 esittää naudan insuliinin (·) ja JlO-asparagiinihap-ρο-β]ihmisen insuliinin (o) kykyä kilpailla 125j_insuliinin kanssa sitoutumisessa insuliinireseptoreihin rotan maksan plasmamembraaneissa. sitoutumisen inhibointi, ilmaistuna prosentteina maksimista, kuvattiin funktiona kilpailijan konsentraatiosta. Kuvassa 3 esitetyt pisteet edustavat keskiarvoa kolmesta määrityksestä kyseisessä kokeessa, joka suoritettiin neljä kertaa. Maksimisitoutuminen näissä kokeissa oli 8,2% syöttöradioaktiivisuudesta.

Kuten kuvasta 3 voidaan nähdä, annosvastaavuuskäyrät JjO-aspa-ragiinihappo-fTj ihmisen insuliinille ja naudan insuliinille olivat oleellisesti samansuuntaiset. ^10-Asparagiinihappo-B] ihmisen insuliini laskettuna kuten edellä on esitetty, oli kuitenkin noin 534±146% suhteessa naudan insuliiniin.

22 9 8 7 31

Vertailuesixnerkki 3 jj.O-Asparagiinihappo-Bjihmisen insuliinin voimakkuuden analysointi rasvansyntykokeilla_

Rasvansyntykokeet insuliinianalogin voimakkuuden mittaamiseksi suoritettiin kuten julkaisussa Kitagawa et ai., edellä, on kuvattu. Kokeilla mitattiin insuliinianalogin kykyä naudan insuliiniin verrattuna muuttaa [j3- 3 »] -glukoosia lipideiksi.

Rasvasolut valmistettiin inkuboimalla lisäkiveksen ja munuaista ympäröiviä rasvapehmusteita, jotka oli saatu urosrotil-ta, jotka painoivat 200-300 g, 1,0 mg/ml:n kanssa kollagenaa-sia 60 min 37°C:ssa, jonka jälkeen suodatettiin harsokankaan läpi ja sitten hienosilmäisen silkin läpi. Solut pestiin kahdesti vaahdottamalla kliinisessä käytössä olevassa sentrifuu-gissa ennen käyttöön tarkoitettua suspensiota, inkubointi-väliaine oli Krebs-Ringerin bikarbonaatti, joka sisälsi puolet suositellusta kalsiumista, 0,5 mM glukoosia ja 3% rasva-happovapaata naudan seerumin albumiinia, sekä 95% O2 - 5% CO2 kaasufaasina. Kolme rasvansyntyinkubointia sisälsivät 1,0 ml rasvasolususpensiota (20-40 mg kuivapainoltaan olevia soluja) ja naudan insuliinia tai jj.0-asparagiinihappo-Bj ihmisen insuliinia, valmistettuna kuten esimerkissä 1. Solut esi-inkuboi-tiin 45 min 37°C ennen kuin lisättiin jj3-3Hj-glukoosia. Inku-bointia jatkettiin 60 min ja pysäytettiin lisäämällä 0,2 ml 5 N H2SO4 ja 0,2 ml maissiöljyä lipidien uuttamisen auttamiseksi. Näytteet uutettiin 10 ml:11a Soluscint-O^ 30 min huoneenlämmössä ennen kuin radioaktiivisuus laskettiin tuikelas-kurissa. Näissä olosuhteissa jj3-3Hj-glukoosi ei uuttunut orgaaniseen faasiin, joka sisälsi tuikefluoreja ja se oli olennaisesti laskematon. Rasvansynnyn 0% ja 100%:n stimuloitumi-nen määritettiin radioaktiivisuutena, joka havaittiin ilman insuliinia sekä siten, että läsnä oli 9,1 x 10~10 M insuliinia (5,5 ng/ml), tässä järjestyksessä. Suhteellinen voimakkuus saatiin insuliinin konsentraatiosuhteena 23 98731 jlo-asparagiinihappo-e] ihmisen insuliinin määrään, joka vaadittiin tuottamaan 50% rasvansynnyn maksimistimulaatiosta.

Kuva 4 esittää [3-3hJ-glukoosin orgaanisesti uutettavaksi materiaaliksi (esim. lipideiksi) muuttumisen stimulaatiota eristetyissä rotan rasvasoluissa esimerkin 1 tavalla valmistetun ^10-asparagiinihappo-Bj ihmisen insuliinin (o) ja naudan insuliinin (·) avulla. Stimulaatio, ilmaistuna prosentteina maksimista, piirrettiin agonistikonsentraation funktiona.

Pisteet edustavat keskiarvoa kolmesta määrityksestä kussakin kokeessa, jotka suoritettiin neljä kertaa. Kokeissa 0% ja 100% stimulaatio viittaavat 0,3 ja 3,5 nmooliin glukoosia mg:aa kohti soluja tunnissa, tässä järjestyksessä.

Kuvassa 4 esitetyt tiedot osoittavat, että JjLO-asparagiini-happo-ejihmisen insuliini oli täydellinen agonisti kokeissa saavuttaen saman rasvansynnyn maksimistimulaation kuin luonnon naudan insuliini. jjLO-Asparagiinihappo-lTJihmisen insuliinin suhteelliseksi voimakkuudeksi laskettiin kuitenkin arvo 435±144% suhteessa naudan insuliiniin.

Voimakkuusarvojen, jotka laskettiin j^lO-asparagiinihappo-Bj ihmisen insuliinille esimerkin 2 reseptoriin sitoutumisko-keissa ja tässä rasvansynnyssä, määritettiin olevan ei-tilas-tollisesti erilaisia (0,4 > p > 0,3 Studentin t-testillä).

Niinpä on helposti ilmeistä, että ^10-asparagiinihappoJihmisen insuliini on superaktiivinen insuliini, jolla in vitro-voimakkuus on noin viisi kertaa suurempi kuin luonnon insuliinilla .

Vertailuesimerkki 4

LiO-Asparagiinihappo-Bl ihmisen insuliinin radioimmunokoe

Julkaisussa Kitagawa et ai., edellä, kuvatut radioimmunokoe-; analyysit suoritettiin sen määrittämiseksi, oliko 24 9 8 7 31 jlO-asparagiinihappo-eJ ihmisen insuliini immunologisesta erotettavissa luonnon insuliinista.

Marsun antiseerumia porsaan insuliinille vuohen antimarsu-^globuliinia käytettiin 1:25 laimennuksena koepuskurissa (natriumfosfaatti, 0,04 M, pH 7,6, joka sisälsi 0,154 M NaCl, 0,1% gelatiinia, ja 0,01 % timerosalia). Kahdet koeputket, jotka sisälsivät 0,1 ml anti-insuliiniantiseerumia, 0,072 ng 125i_insuiiinia ja naudan insuliinia (0,06-0,36 ng) tai £l0-asparagiinihappo-B^ ihmisen insuliinia, valmistettuna kuten esimerkissä 1 (1-4,0 ng) kokonaistilavuudessa 0,8 ml. Kun oli inkuboitu huoneenlämmössä yön yli, lisättiin 0,2 ml saostavaa vasta-ainetta (vuohen antimarsu- ^-globuliini), ja putkia inkuboitiin edelleen yön yli huoneenlämmössä, immuunisakat kerättiin selluloosa-asetaattisuodattimille ja pestiin kahdesti peräkkäin 1,0 ml:n erillä jääkylmää koepuskuria. Suodattimet kuivattiin ja radioaktiivisuus laskettiin tuikelas-kurissa Filtron-XR:ssä. C0/Ci:n suoralla olevat pisteet konstruoitiin lineaarisella regressioanalyysillä, kuten julkaisussa Hales et ai., Biochem. J. (1963), voi. 88, pp. 137-146 on kuvattu, ja jjLO-asparagiinihappo-B~jihmisen insuliinin voimakkuus suhteessa naudan insuliiniin saatiin näiden pisteiden kulmakertoimien suhteena.

Synteettisellä ^10-asparagiinihappo-BT]ihmisen insuliinilla oli suunnilleen sama voimakkuus kuin naudan tai porsaan insuliinilla radioimmunokokeissa. Tämä tulos osoitti, että aspa-ragiinihapon korvautumisella histidiinillä asemassa B1(^ ei ollut merkittävää vaikutusta molekyylin immunogeenisiin determinantteihin .

Esimerkki 5

Desp-pentapeptidi (B26-B30)-fAspBIO, TyrB25-o(k-karboks-amidij ihmisen insuliinin synteesi

II

25 9 8 7 31

Des-pentapeptidi (B26-B30)-jAspBIO, TyrB25-o(_karboksami-di]ihmisen insuliini syntetisoitiin peptidisynteesillä käyttäen fragmenttikondensaatiotekniikkaa. (Katso esim. Blake et ai., Proc. Natl., Acad. Sei. (1983), voi. 80, pp. 1556-1559 yleisestä tekniikasta.) Kaikkien välituotepeptidijohdannaisten homogeenisuus varmistettiin ohutkerroskromatografiällä 6060 silikageelillä (Eastman Chromatogram-1evy). Käytetyt liuotinjärjestelmät kromatogrammien kehittämiseksi olivat kloroformi-metanoli-vesi (45:10:1; 89:10:1; ja 200:75:13).

Des-pentapeptidi (B26-B30)-[~AspB10, TyrB25_o^_]carboks-amidiTjihmisen insuliini valmistettiin yhdistämällä ihmisen insuliinin A-ketjun S-sulfonoitu muoto ihmisen insuliinin des-pentapeptidi (B26-B30)-^AsplO, Tyr-^-karboksamidi25jihmisen insuliinin synteettisen S-sulfonoidun johdannaisen kanssa ditiotreitolin läsnäollessa, kuten US-patentissa nro 4 421 685 (Chance et ai.) on esitetty. S-sulfonoitu ihmisen A-ketju, joka on identtinen vastaavan porsaan insuliinin ketjun kanssa (Nicol et ai, Nature (1960), voi. 181, pp. 483-485), valmistettiin porsaan insuliinin hapettavalla sulfito-lyysillä ja erottamalla saadut S-sulfonoidut A- ja B-ketjut pylväskromatografiällä, kuten julkaisussa Katsoyannis et ai., Biochemistry (1967), voi. 6, pp. 2635-2624 on kuvattu. S-sulfonoidun kahdesti modifioidun B-ketjun synteesi suoritettiin ' vaiheittaisella kiinteäfaasisynteesillä käyttäen 4-metyyli- bentshydryyliamiinihartsia kiinteänä kantajana (0,5 mmol amiinia g:aa kohti; 1 g), kuten on kuvattu julkaisuissa Merrifield, j. Am. chem. soc., 85:2149-54 (1963) ja Barany et ai., "The peptides". Gross et ai., eds., 2^1-284, Academic Press (New York, 1980). Boc-ryhmää käytettiin N^-suojaukseen paitsi, että N-terminaalifenyylialanyylijäännökselle, joka suojattiin bentsyylioksikarbonyyliryhmällä.

Taulukossa il annetaan joitakin yhdisteitä ja aminohapon suojaryhmiä, joita käytettiin peptidien synteesissä.

26 9 8 7 31

Taulukko II

Yhdiste suojattu bentsyyli seriini sykloheksyyli glutamiini- ja asparagii- nihapot bentsyylioksimetyyli histidiini 2,6-diklooribentsyyli tyrosiini N^-p-tolueenisulfonyyli arginiini 4-metyylibentsyyli kysteiini

Seurattiin käsikirjan kaksoiskytkennän työjärjestystä julkaisun Merrifield et ai., Biochem., 2JL:5020-31 (1982) mukaan käyttäen aktivoituja suojattuja aminohappoja (1-hydroksibent-sotriatsoli-disykloheksyylikarbodi-imidi, dimetyyliformami-dissa) kolminkertaista ylimäärää. Reaktion valmistumista seurattiin kvalitatiivisella ninhydriinikokeella julkaisusta Kaiser et ai., Anal. Biochem., 34:595-98 (1970) ja se oli negatiivinen jokaisen kaksoiskytkennän jälkeen.

Kun ketju oli liitetty, peptidihartsi pestiin perusteellisesti metyleenikloridilla ja metanolilla ja kuivattiin sitten lopulliseen 3,0 g:n painoon. Erästä tätä tuotetta (700 mg) poistettiin suojaus matala-korkea-vetyfluoridimenetelmällä (low-high hydrogen fluoride procedure) Tam et al.tn mukaan, J. Am. Chem. Soc., 105:6442-55 (1983). Ensimmäisessä vaiheessa peptidihartsi käsiteltiin seoksella, jossa oli p-kresolia (1 ml), dimetyylisulfidia (6,5 ml) ja nestemäistä vetyfluori-dia (2,5 ml). Kun seosta oli pidetty 2 tuntia 0°C:ssa, se konsentroitiin vakuumissa ja jäännös käsiteltiin nestemäisellä vetyfluoridilla (10 ml) 1 tunti 0°C:ssa. Vetyfluoridi poistettiin sitten ja jäännös trituroitiin etyyliasetaatin ja petrolieetterin kanssa. Natriumsulfiittia (700 mg) ja nat-riumtetrationaattia (500 mg) lisättiin tämän tuotteen suspensioon 8M guanidiinihydrokloridissa (20 ml), joka oli puskuroitu 0,1 M Tris-HCl:llä (pH 8,8). Kun reaktioseosta oli pidetty 3 tuntia huoneenlämmössä se suodatettiin hartsin poistamiseksi ja suodos pantiin

II

98731 27

Spectrapor-membraaniputkeen nro 3, ja dialysoitiin vaihtaen tislattua vettä neljä kertaa (4 litraa kerrallaan) 4°C:ssa 24 tuntia. Dialysaatin lyofilisaatio antoi epäpuhtaan S-sulfo-noidun B-ketjun analogin valkoisena jauheena, joka painoi 250 mg.

Lyofilisoitu materiaali liuotettiin seokseen, jossa oli vettä :2-propanolia (2:1, v/v), ja joka sisälsi 0,02 M Tris-HCl, pH 7,5, ja puhdistettiin korkean erotuskyvyn nesteioninvaih-tokromatografialla Synchropak AX 300-kolonnilla (l x 25 cm), joka oli liitetty LKB nestekromatografiajärjestelmään. Erät, joissa kussakin oli noin 70 mg proteiinia, kromatografioi-tiin virtausnopeudella 1,5 ml/min 0-80% lineaarigradientilla 0,5 M natriumkloridia edellämainitussa liuottimessa, 140 minuutin ajan. Kromatografiakuvio on esitetty kuvassa 5. Pää-piikin kohdalla ulosvirtaava neste (noin 60 min) konsentroitiin vakuumissa noin 50%:iin alkuperäisestä tilavuudestaan, dialysoitiin tislattua vettä vastaan (Spectrapor membraani-putki nro 3) ja lyofilisoitiin. 250 g:sta epäpuhdasta materiaalia saatiin 150 mg puhdistettua tuotetta valkoisena kuohkeana jauheena. Puhdistetun S-sulfonoidun B-ketjun aminohap-poanalyysi happohydrolyysin jälkeen antoi seuraavan koostumuksen, ilmaistuna moolisuhteissa, ja sen ollessa sopusoinnussa teoreettisesti odotettujen arvojen (esitetty suluissa) kanssa.

ASP1.9(2)Se r1.0(1)Glu3.0(3)Gly 3.0(3)Alal.1(1) Val2.7(3)LeU3.8(4)Tyr1.9(2)Phe2.0(2)HiS0.9(l)Arg1.0(l) (Kysteiiniä ei määritetty).

Esimerkki 6

Des-pentapeptidi (B26-B30)-[AspB10, TyrB25-<>;-karboks-amidij ihmisen insuliinin synteesi ja eristys_

Ditiotreitolia (3,5 g) lisättiin S-sulfonoituun ihmisen (porsaan) A-ketjuun (20 mg) ja S-sulfonoituun ihmisen 28 98731 des-pentapeptidi (B26-B30 ) - ^AsplO, Tyr-<7^ -karboksamidi25_J : n B-ketjuun (10 mg) 6 ml:ssa 0,1 M glysiinipuskuria, pH 10,6, joka oli jäähdytetty 4°C:een. Kun seosta oli pidetty 4°C:ssa 24 tuntia, se laimennettiin jääetikalla (1 ml) ja saatu sakka poistettiin sentrifugoimalla (International Centrifuge, Model HN; 3000 rpm). Supernatantti, joka sisälsi aktiivisen materiaalin, vietiin läpi 0,45 yu selluloosa-asetaattisuodattimen (Sartorius) ja sille suoritettiin käänteisfaasi-HPLC käyttäen VydacR 218 TP-kolonnia (0,45 x 25 cm), joka oli yhdistetty LKB-nestekromatografiajärjestelmään. Erät, joissa kussakin oli noin 5 mg proteiinia, kromatografioitiin virtausnopeudella 0,5 ml/min 10-50% lineaarigradientilla 2-propanoli 0,1% trifluorietikkahapossa 70 min. Kromatografiakuvio on esitetty kuvassa 6A. Aktiivisen materiaalin sisältämä fraktio, määritettynä insuliinikokeilla, konsentroitiin ja kromatografioitiin uudelleen käyttäen samaa kolonnia ja 20-35% lineaarigradiaenttia 2-propanoli 0,1% trifluorietikkahapossa virtausnopeudella 0,5 ml/min 110 minuutin ajan. Eluoitumis-kuvio on esitetty kuvassa 6B. Aktiivisen materiaalin sisältävä fraktio, joka eluoitui noin 63,1 minuutissa, kerättiin ja lyofilisoitiin. Edelläkuvatusta A- ja B-ketjujen seoksesta saatiin 1,4 mg erittäin puhdistettua tuotetta. Puhdistetun synteettisen materiaalin aminohappoanalyysi happohydrolyysin jälkeen antoi seuraavan koostumuksen, moolisuhteina ilmaistuna, hyvin sopusoinnussa teoreettisesti odotettujen arvojen mukaan.

Asp4.1(4)Thr0.9(l)Ser3.0(3)Glu7.0(7)Gly3.8(4)Alal.l(l)

Val3.3(4)Ile1.4(2)Leu6.0(6)Tyr3.8(4)Phe2.0(2)His1.0(l)

Arg0.9(l) (Kysteiiniä ei määritetty).

Esimerkki 7

Des-pentapeptidi (B26-B30)-[AspBl°, TyrB25_o( -karboks-amidi3ihmisen insuliinin voimakkkuuden analysoiminen insu-liinin reseptoriinsitoutumiskokeella_ li 29 98731 Käytettiin samaa koetta kuin esimerkissä 2.

Kuva 7 esittää naudan insuliinin (·) ja des-pentapeptidi (B26-B30)-[AspBIO, TyrB25_<^-karboksamidijihmisen insuliinin (o) kykyä kilpailla 125i_insuliinin kanssa sitoutumisessa insuliinireseptoreihin rotan maksan plasmamembraaneis-sa. Sitoutumisen inhiboituminen, ilmaistuna prosentteina maksimista, on piirretty kilpailijan konsentraation funktiona. Kuvassa 7 esitetyt pisteet edustavat keskiarvoa kolmesta määrityksestä kuvaavassa kokeessa, joka suoritettiin neljä kertaa käyttäen kolmea eri valmistetta synteettistä yhdistettä.

Näissä kokeissa 125i_insuiiinin sitoutuminen kilpailijan poissaollessa oli 9,1 % syötetystä radioaktiivisuudesta, ja ei-spesifinen sitoutuminen oli 9,6% kokonaissitoutumisesta.

Kuten kuvasta 7 voidaan nähdä, synteettinen yhdiste syrjäytti 50% spesifisesti sitoutuneesta i25i-insuliinista konsentraa-tiolla, joka oli yli 10 kertaa alhaisempi kuin konsentraatio, joka tarvittiin luonnon insuliinille. Des-pentapeptidi (B26-B30)-[äspb1°, TyrB25_o^-karboksamidijihmisen insuliinin voimakkuus edellä esitetyllä tavalla laskettuna oli kuitenkin noin 1166±31,2% suhteessa naudan insuliiniin.

Esimerkki 8

Des-pentapeptidi (B26-B30)-jAspB10, TyrB25_o^-karboksamidijihmisen insuliinin voimakkuuden analysointi rasvan-syntykokeilla__ Käytettiin samaa koetta kuin esimerkissä 3.

Kuva 8 osoittaa^3-3Hj-glukoosin orgaanisesti uutettavaksi materiaaliksi (s.o. lipideiksi) muuttumisen stimuloitumisen eristetyissä rotan rasvasoluissa des-pentapeptidi (B26-B30)-^SpB10f TyrB25_Q^-karboksamidijesimerkin 5 tavalla valmistetun ihmisen insuliinin (o) ja naudan insuliinin (·) 98731 30 vaikutuksesta. Stixnuloituminen, ilmaistuna prosentteina maksimista, piirrettiin agonistikonsentraation funktiona. Käytetyt pisteet edustavat keskiarvoa kolmesta määrityksestä kuvaavissa kokeissa, jotka suoritettiin neljä kertaa käyttäen kolmea eri valmistetta synteettistä yhdistettä. Kokeissa 0% ja 100% stimulointi viittaavat 11,4 ja 78,8 nmooliin glukoosia mg:aa kohti soluja tunnissa, tässä järjestyksessä.

Kuvassa 8 esitetyt tiedot osoittavat, että des-pentapepti-di(B26-B30)-[AspB10, TyrB25-a-karboksamidi]-ihmisen insuliini sai aikaan rasvansynnyn stimuloitumisen, joka oli puolet maksimaalisesta, paljon alhaisemmalla konsentraatiolla kuin mikä vaadittiin luonnolliselle naudan insuliinille. Des-pen-tapeptidi-(B26-B30)-[AspBlO, TyrB25-a-karboksamidi]-ihmisen insuliinin suhteellisen voimakkuuden laskettiin olevan 1352±114% suhteessa naudan insuliiniin. Rasvansynnyn maksimaalinen stimulointi oli sama molemmilla yhdisteillä.

Niinpä on selvästi ilmeistä, että des-pentapeptidi-(B26-B30)-[AspBlO, TyrB25-a-karboksamidi]-ihmisen insuliini on superak-tiivinen insuliini, jonka in vitro-voimakkuus on 11-13 kertaa suurempi kuin luonnon insuliinilla.

Eristetty des-pentapeptidi-(B26-B30)-[GluB10, TyrB25-o-kar-boksamidi]-ihmisen insuliinilla valmistettuna identtisellä menetelmällä kuin vastaava AspBIO-analogi, oli voimakkuus noin 20 kertaa suurempi kuin luonnon insuliinilla. Des-penta-peptidi-(B26-B30)-[GluBlO, TyrB25-a-karboksamidi]-ihmisen insuliinin aminohappoanalyysi happohydrolyysin jälkeen antoi:

AfPa.O Thr1.0 Ser3.8 Glu8.3 GlY4.2 Ä^a1.3 Val3.4 I^ei.4 phei.7 Hisj i Arglal.

(Kysteiiniä ei määritetty).

Esimerkki 9

Des-pentapeotidi-(B26-B30\-ΓAspBlO, TvrB25-a-karboksamidi1-ihmisen insuliinin radioimmunokoeanalvvsit 98731 31 Käytettiin samaa koetta kuin esimerkissä 4.

Synteettinen des-pentapeptidi-(B26-B30)-[AspBIO, TyrB25-a karboksamidi]-ihmisen insuliini oli suunnilleen yhtä voimakas kuin naudan insuliini radioimmunokokeissa. Tämä tulos osoittaa, että rakenteellisilla eroilla, jotka saivat aikaan voimakkaamman sitoutumisen insuliinireseptoriin sekä samanaikaisesti synteettisellä yhdisteellä olevan suuremman in vitro-insuliininkaltaisen aktiivisuuden, ei ollut merkittävää vaikutusta molekyylin immunogeenisiin determinantteihin.

Esimerkkien tarkastelu

Aikaisemmat röntgensädeanalyysit ovat osoittaneet, että asemassa BIO oleva histidiini on insuliinimonomeerin pinnalla ja on tärkeä sinkki-insuliiniheksameerien muodostukselle. Katso esim. Blondell et ai., Adv. Prot. Chero. (1972), voi. 26, pp. 279-402. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että asemassa BIO olevan histidiinin korvaaminen leusiinilla, lysii-nillä tai asparagiinilla sai aikaan synteettisiä insuliin-ianalogeja, joilla oli alhaisempi biologinen voimakkuus, n. 14-45%, suhteessa luonnon hormoniin. Katso Schwartz et ai., J. Chem. Res. (S), pp. 220-221, J. Chem. Res. (M), pp. 2453-2469 (1977); Schwartz et ai., J. Prot. Chem. (1982), voi. 1, pp. 177-189; Burke et ai., Int. J. Protein Res.

(1984), voi. 23, pp. 177-189; Burke et ai., Int. J. Protein Res. (1984), voi. 23, pp. 394-401. Näistä tutkimuksista on vedetty se johtopäätös, että hydrofiilisyys asemassa BIO sinänsä oli suhteellisen merkityksetöntä määritettäessä insuliinin biologista aktiivisuutta ja että voimakkaasti emäksisen aminohappojäännöksen läsnäolo tuossa asemassa oli haitallista. On edelleen ehdotettu, että histidiinijäännöksen ainutlaatuisen ominaisuuden kyetä olemaan joko protonoidussa tai protonoitumattomassa tilassa lähellä fysiologista pH-arvoa uskottiin olevan vaatimuksena asemassa BIO suuremmalle biologiselle aktiivisuudelle. Katso esim. Burke et ai., edellä. 10-Asparagiinihappo-B-ihmisen insuliinin, jolla fysiologisessa pH-arvossa olisi negatiivinen varaus asemassa 98731 32 BIO/ havaittiiin olevan useita kertoja aktiivisempi kuin luonnon insuliini in vitro-kokeissa, kuten vertaluesimerkissä 1 osoitettiin.

10-Asparagiinihappo ihmisen insuliinin superaktiivisuus ilmeisesti johtuu voimakkaammasta sitoutumisesta insuliini-reseptoriin. Uskotaan, että analogin voimakkaampi sitoutuminen reseptoriin saattaa johtua muutoksesta analogin konfor-maatiossa, joka on suotuisampi sitoutumiselle reseptoriin, mikä puolestaan johtuu molekyylinsisäisistä vuorovaikutuksista, jotka liittyvät negatiiviseen varaukseen asemasSa BIO (esim. suolasilta). Vaihtoehtoisesti voimakkaampi sitoutuminen voi johtua suorasta vuorovaikutuksesta komplementaarisen pinnan kanssa reseptorissa, joka sisältää positiivisen varauksen. Käänteisfaasi-HPLC:ssä, kuten kuvassa 2 on osoitettu, 10-asparagiinihappo-B ihmisen insuliini eluoitui kaksien kromatografisten olosuhteiden aikana merkittävästi myöhemmin kuin luonnon insuliini. Tämä käytös osoitti, että synteettinen analogi oli apolaarisempi molekyyli. Suurta eroa polaa-risuudessa, joka on luonnon insuliinin ja 10-asparagiini-happo-B-ihmisen insuliinin välillä, ei voida kuvata yhden hydrofiilisen ryhmän korvautumisella toisella. Uskotaan, että kohtuullisin selitys erolle polaarisuudessa on se, että se heijastaa muutosta konformaatiossa, jonka uskotaan johtavan analogin voimakkaampaan sitoutumiseen insuliinireseptoriin.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetussa des-pentapep-tidi-(B26-B30)-[AspB10, TyrB25-o-karboksamidi]-ihmisen insuliinissa yhdistyy kaksi muunnosta, jotka erikseen liitettyinä insuliinimolekyyliin johtavat analogeihin, joilla on suurempi voimakkuus kuin luonnon hormonilla. Nämä erilliset muunnokset ovat (i) B26-B30-segmentin eliminointi ja Phe25:n korvaaminen Tyr-a-karboksamidilla, ja (ii) His BIO:n korvaaminen Aspilla. Tämä analogi, des-pentapeptidi-(B26-B30)-[AspB10, TyrB25-o-karboksamidi]-ihmisen insuliini on myös keksinnössä kuvatun vastaavan GluBlO-analogin kanssa voimakkain insuliinianalogi, joka tähän mennessä on kuvattu. Sen biologinen aktiivisuus on suurempi kuin pelkästään jommankumman muunnoksen sisältävillä

II

98731 33 analogeilla olevien suurempien voimakkuuksien summa. Tämä havainto antaa aiheen ehdottaa, että kohdat B25 ja BIO voivat moduloida insuliinin erillisten reseptoriin sitoutumisaluei-den konformaation tiloiksi, joissa reseptoriin sitoutumisen affiniteetti on suuri. Itse asiassa insuliinireseptorikom-pleksin suuri assosioitumisvakio erilaisissa kudoksissa (noin ΙΟ9 ΜΓ1) näyttäisi vaativan useiden sitoutumiskohtien sovittua toimintaa. Histidiinijäännös kohdassa BIO ei ole yksi jäännöksistä, joiden on ehdotettu avustavan insuliinin tunnistusta reseptoriensa taholta. Blundell et ai., Adv. Protein Chem., 26:279-482 (1972); Blundell et ai., Nature (London) 257:197-203 (1975); Pulien et ai., Nature (London), 259:369--72 (1976). AspB10-insuliini(10-asparagiinihappo-B-insulii-nin) suurempi voimakkuus sekä Leu BIO-, Asn BIO- ja Lys B10-insuliinien pienempi voimakkuus, jotka on kuvattu julkaisuissa Schwartz et ai., J. Chem. Res., 220-21 (1977); Schwartz et ai., J. Protein Chem., 1:177-189 (1982); ja Burke et ai., Int. J. Pept. Prot. Res., 23:394-401 (1984), osoittavat, että substituutioilla tässä asemassa voi olla hyvin suuria vaikutuksia saatujen molekyylien kykyyn vuorovaikuttaa insu-liinireseptorin kanssa ja aloittaa biologinen reaktio. Se, onko kohta BIO reseptoriin sitoutumisalueen elementti, vai vaikuttavatko muunnokset tässä kohdassa keskipisteestä erillään olevaan sitoutumisalueeseen, eivät voi olla yksikäsitteisesti määriteltyjä seikkoja saatavista tiedoista. Monia malleja voidaan ehdottaa näiden analogien erittäin suurten voimakkuuksien saamiseksi. Kohdat B25 ja BIO voivat olla insuliinin erillisten reseptoriin sitoutumisalueiden elementtejä, jotka voidaan erikseen moduloida suorittamalla muunnoksia kohdissa B25 ja BIO, jotka vastaavasti johtavat näissä analogeissa suuren affiniteetin käsittäviin tiloihin reseptoriin sitoutumisessa. Lisäksi B25- ja BIO-muunnokset voivat itsenäisesti ja yhdessä vaikuttaa suotuisasti muiden erillisten alueiden konformaatioon, jotka sisältävät insuliinin tärkeitä reseptoriin sitoutuvia alueita.

Claims (4)

98731

1. Menetelmä lääkeaineena käyttökelpoisen insuliinianalogin valmistamiseksi, joka käsittää aminohapot A1-A21 sisältävän A-ketjun ja des-pentapeptidi-(B26-B30)-[XBl0, TyrB25-a-kar-boksamidi]-B-ketjun, jolla on kaava: I—1-ss-1 I . I H-Gly-Il*-Val-Glu-Gln-Cys'-Cya-Thr-Sec-Leu-Cys-Ser- S s „ l*u-Tyr-Gln-Ltu-Glu-Asn-Tyr-Cys-A*n-OH H-Phe-Val-Aan-Gln-His-L«u-Cy*-Gly-S«r- X -Leu-Val-Glu-Ala-Leu- S Tyr-L*u-Va1-C|a-G1y-Glu-Ar g-Gly-Phe-Tyc(NHj) jossa X on Asp, Glu tai α-aminoadipiinihappo tai sen korkeampi homologi, tunnettu siitä, että liitetään vastaavat aminohapot ja peptidifragmentit sopivaan järjestykseen käyttäen tavanomaisia kiinteä- tai nestefaasimenetelmiä, kuten fragmenttikondensaatiotekniikkaa,

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liitetään tiolipelkistimen läsnäollessa sulfonoi-tu A-ketju, joka sisältää aminohapot A1-A21 ja sulfonoitu des-pentapeptidi-(B26-B30)-[XBl0, TyrB25-a-karboksamidi]- B-ketju, jossa X on Asp, Glu tai α-aminoadipiinihappo tai sen korkeampi homologi.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käyttämällä kiinteäfaasipeptidisyn- teesimenetelmää syntetisoidaan A-ketju, joka sisältää aminohapot A1-A21 ja des-pentapeptidi-(B26-B30)-[XB10, TyrB25-a- ii 98731 karboksamidi]-B-ketju, jossa X on Asp, Glu tai α-aminoadi-piinihappo tai sen korkeampi homologi.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, jossa käytetään kiin-teäfaasipeptidisynteesimenetelmää des-pentapeptidi-(B26-B30)-[XB10, TyrB25-a-karboksamidi]-B-ketjun, jossa X on Asp, Glu tai α-aminoadipiinihappo tai sen korkeampi homologi, valmistamiseksi ja suoritetaan pelkistys tai hapettava sulfitolyysi kokonaiselle haimainsuliinille A-ketjun valmistamiseksi. 98731 KRAV