HU205145B

HU205145B - Process for producing new superactive insulin analogs and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient

Info

Publication number: HU205145B
Application number: HU884792A
Authority: HU
Inventors: Panayotis G Katsoyannis; Gerald P Schwartz
Original assignee: Sinai School Medicine
Priority date: 1987-07-17
Filing date: 1988-07-07
Publication date: 1992-03-30
Also published as: WO1989000580A1; DE3887338T2; AU2126988A; HUT54178A; DE3887338D1; FI98731C; EP0382732B1; JPH02504274A; KR920700227A; FI900249A0; JP2729498B2; DK13990A; KR970009353B1; FI98731B; AU616131B2; DK13990D0; EP0382732A1; US4992418A

Description

A találmány tárgya eljárás új, szuperaktív inzulinanalógok és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására.

Az inzulin a gerincesek növekedésének és metabolizmusának szabályozásában kulcsszerepet játszó hormon. Inzulin hiányában komoly metabolikus zavarok jelentkeznek annak következtében, hogy sok sejt nem képes á glükóz és az aminosavak normális hasznosítására. A glükóz metabolizálására való képtelenség emberben diabétesz mellituszhoz vezet, amely egy olyan komplex krónikus metabolikus rendellenesség, amelyben a szénhidrát, zsír és fehéqe metaholizmus rendellenes. Legkifejezettebb klinikai formájában a (tiabetes mellhúsra az jellemző, hogy az inzulin vagy inzulin aktivitás abszolút vagy relatív hiánya áll fenn, amely cukor- és acetonürítéssel, a növekedés leállásával és negatív nitrogén egyensúllyal jár. Ezek a körülmények végül a zsírsavak korlátozatlan oxidációja által okozott akut metabolikus acidőzis folytán halálhoz vezethetnek, vagy a ketontestek képződéséhez szükséges elegendő lipidtartalék hiányában kiéhezettséghez vezethetnek. A kiéhezettség olyan állapotként definiálható, amelyre határozott gyengeség, rendkívüli tömegveszteség jellemző, és a metaholizmus a tartós és súlyos táplálék elégtelenség folytán csökken (Dorland’s Hlustrated Medical Dictionary, 25. kiadás).

Az inzulinnak és tisztítási módjának az 1920-as években való felfedezése és a diabetes mellhússal való kapcsolatba hozása lehetőséget nyújtott a betegségbe; való beavatkozásba. [Bliss, The Discovery of Insulin (1983), University of Chicago Press, Chicago, Hl.]. Najainkban a diabeteszes betegek inzulinnal való kezelése e betegség kezelésének elsődleges terápiás eszköze.

Az inzulin egy 6000 dalton molekulatömegű polipeptíd, amely két rövid peptidláncból, Az A és B'peptidláncokból áll, amelyek egymáshoz állandó diszulfíd hidakkal kötődnek. Szinte minden tanulmányozott inzulinban a 21 aminosavból álló A lánc egy belső diszulfid hidat is tartalmaz. A B lánc hossza 30 aminosav. Mint sok más eukariőta-fehéqe, az inzulin is prekurzor formájában szintetizálődik, amely poszt-szintetikus úton alakul az érett, két polipeptid láncot tartalmazó aktív hormonná.

Az inzulin közvetlen prekurzora a proinzulin egy egyetlen láncból álló polipeptid, amely a B és az A láncokat egy összekapcsoló peptiddel összekötve tartalmazza, amely összekapcsoló peptid, a C peptid mintegy 31 aminosavból áll, és a B és A láncokhoz egy-egy pár bázikus aminosav-maradék révén kapcsolódik. A három peptid sorrendje a proinzulin molekulában a következő: ΝΗ^-(Β lánc)-Arg-Arg-C-peptid-LysAxg-(A lánc)-COOH. Az inzulin mRNS transzlációs terméke azonban a preproinzulűi, amely olyan proinzulin, amely az amino-terminálison egy 24 aminosavból álló, nagyrészt hidrofób szignál-peptidet tartalmaz, amely az olyan fehéqékre jellemző, amelyek a sejtmembránon áthatolnak vagy abba beépülnek.

A preproinzulűi a hasnyálmirigy szövetében diszpergált Langerhans szigetekben lévő pankreász-sejtekben szintetizálődik. A szignál-pepiid eltávolítása a durva endoplazmatikus retikulumban történik, majd a teljesen összehajtogatódott oxidált proinzulin a Golgi-apparátusba jut, ahol szekréciós granulumokká alakul. Az összehajtogatódott proinzulint diszulfíd köté5 sek stabilizálják. A szekréciós granulumok érése során az összehajtogatódott proinzulin molekulákat a bázikus aminosav maradék párok mentén specifikus proteázok hasítják, így az inzulin és a C peptid válik szabaddá.

Amint azt az előzőekben már ismertettük, a diabétesz mellitusz terápiájának részeként a diabéteszben szenvedő betegnek szabályozott mennyiségű inzulint adagolnak. Az így adagolt inzulin többnyire állati pankreászból, nevezetesen marha vagy sertés pankre15 ászból származik. A marha és sertés inzulinok a hormonális homeosztázis fenntartásában a humán inzulinhoz hasonló módon, körülbelül hasonló hatékony- Á sággal működnek, de minthogy ezek idegen fehérjék, ’ immunológiai választ válthatnak ki, ami a hatékony20 ságukat csökkenti. Újabban rekombináns DNS eljárással előállított humán inzulinnal gazdagodott a terápia fegyvertára. A rekombináns DNS eljárással, vagy egyéb eljárásokkal előállított humán inzulin használata nem váltja ki azokat a kedvezőtlen immunológiai hatásokat, amelyek az állati inzulinok használatának velejárói. Azonban még a természetes humán inzulin hozzáférhetősége esetén sem mindig elegendő a hormon adagolása a diabéteszben szenvedő beteg normális metaboíizmusának helyreállítására. így szüksége30 sek jobb aktivitású alternatív inzulinok vagy más, a diabéteszben szenvedő betegek kezelésére alkalmas eszközök.

A családi (örökletes) hipeiproinzulinémia genetikus rendellenesség, amelyre az jellemző, hogy a szé35 rumban a proinzulin-szerű molekulák mennyisége jelentősen megnövekedett. Három, ezt a ritka rendellenességet mutató család vizsgálata során kettőnél szerkezetileg rendellenes proinzulin-szerű molekula volt található. A genetikus defektet olyan mutációként 40 azonosították, amely a proinzulin egy aminosavjának helyettesítését okozza, ennek következtében a proinzulinnak proteázok által inzulinná történő hasítása nem tökéletes.

A harmadik család érintett tagjainál a proinzulin- * nal mintegy azonos méretű proinzulin-szerű molekula képződött, amely ieceptorkötő vizsgálatokban a normális prohormonnak megfelelően viselkedett Ennek a harmadik családnak két érintett tagjától nyert klónozott inzulin gének szekvencia analízise arra derített fényt hogy egyetlen kód-mutáció folytán a proinzulin molekula B láncának 10-helyzetének megfelelő, egy aszparaginsav hisztidinre cserélődik [Chan és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 2194-2197 oldal,

1987]. A mutáció feltehetőleg megakadályozza a pro55 inzulin felgyülemlését eredményezi. Annak a pontos módját hogy a mutáció hogyan akadályozza a proinzulinnak inzulinná való további átalakulását, még nem ismerjük. Egy humán inzulin analógot a [B10-aszparaginsav]-humán-inzulint, szintetizáltunk, amely megfelel az előbbi mutáns proinzulinnak, és amely a

HU 205 145 Β természetes inzulinoknál nagyobb aktivitást mutat.

Azt is felismertük, hogy az inzulin B láncának karboxil terminálisán lévő elemek ugyancsak befolyásolják az inzulin biológiai aktivitását Különösen a B25 hely tűnik befolyásolónak az inzulin analógok aktivitását illetően.

Az inzulin B láncának C-terminális pentapeptidjét eliminálva, és az újonnan képzett C-terminális, a Phe B25 karboxilcsoportját amidálva egy olyan analóg, a dez-pentapeptid(B26-830)-[Phe ^B25-a- kaiboxamid]inzulin nyerhető, amely a természetes hormon aktivitásával összehasonlítható aktivitással bír [Nakagawa és mtsai, J. Bioi. Chem. 261, 7332-41 (1986); Cosmatos és mtsai., Int J. Pept. Prot. Rés., 14 , 457-71 (1979); Casareto és mtsai.. Bioi. Chem. Hoppe-Seyler, 368, 709-16 (1987)]. A phe B25-nek néhány más aminosav maradékkal való helyettesítése, valamint ezen helyettesített inzulinok B26-B30 szegmensének különféle módosítása olyan analógokat eredményezett, amelyek aktivitása a szinte teljes inaktivitástól a természetes inzjlinénál nagyobb aktivitásig terjed [Nakagawaés mtsai., J. Bioi. Chem., 261, ld. fent; Casareto és mtsai., ld. fent; Nakagawa és mtsai., J. Bioi. Chem., 262; 10254-58 (1987)]. Ezek közül a dez-pentapeptíd(B26-B30)-[Tyr ^B25-a-karboxamid]inzulin és ennek His®²⁵ analógja az inzulinhoz mérten 270300%-os aktivitással bír. Ezen vizsgálatok alapján feltételezték, hogy az inzulin B25 aminosav maradéka a receptorral kölcsönhatásba lép, ezáltal olyan szerkezeti változásokat indít meg az inzulin molekula eddig még nem meghatározott területein, amelyek érintik a hormon-receptor kötődést. A B25-receptor kölcsönhatás pozitív vagy negatív módon befolyásolható a B lánc C-terminális területe révén, attól függően, milyen természetű módosításokat hajtunk végre a B25 maradékon, és a B lánc C-termináis területe megváltoztatásának mértékétől függően [Nakagawa és mtsai., J. Bioi. Chem., 261, ld. fent; Casareto, ld. fent; Nakagawa és mtsai., J. Bioi. Chem.262. éd- femt-].

Szintetizáltak egy másik humán inzulin-analógot is, a dez-pentapeptid-(B26-B30X-[Asp^B1°, Tyi®²⁵-»· karboxamidj-inzulint, amely a természetes inzulinokénál nagyobb aktivitásúnak bizonyult.

Á találmány tárgya egy szuperaktív inzulin analóg, az © képletű [B10-aszparaginsav]-humán-inzulin előállítása. Ez az inzulin-analóg (a továbbiakban „10-aszparaginsav-B”) lényegesen nagyobb aktivitással bír, mint a természetes humán inzulin, amely a B lánc 10helyzetében hisztidint tartalmaz.

A találmány tárgyát képezi továbbá a (Π) képletű szuperaktív inzulin-analóg, a dez-pentapeptid-(B26B30)-[Asp®^lö, Tyr^B25-a-karboxamid]-humán-inzulin (a továbbiakban „Asp®¹⁰ analóg”) előállítása is. Ebiben az inzulinban a B lánc 10-helyzetében végrehajtott változtatáson kívül a B26-B30 szegmenst elimináltuk, és a Phe B25-t Tyr-a-karboxamiddal helyettesítettük. Ez az inzulin-analóg még nagyobb aktivitással bír, mint a [B lO-aszparaginsav] humán inzulin.

A találmány tárgyát képezi továbbá a (ΠΙ) képletű analóg, a dez-pentapeptid-(B26-B30)-[Glu^B1°,

Tyr^B25-a-karboxamid]-humán inzulin (a továbbiakban „Glu®¹⁰ analóg”) előállítása is, amely vegyület az előbbi analógtól abban tér el, hogy a B10-helyzetben Asp helyett Glu-t tartalmaz. Ez az inzjlin analóg legalább 20-szor aktívabb, mint a természetes inzulin.

A találmány tárgyát képezi diabéteszben szenvedő betegek kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítása is, amely készítmények terápiásán hatásos mennyiségű [B10-aszparaginsav]-humán-inzulint, dez-pentapeptid-(B26-B3O)-[Asp®¹⁰, Tyr®²⁵karboxamid]-humán inzulint, dez-pentapeptid-(B26B30)-[Glu®¹⁰, Tyt^^-a-karboxamidJ-humán-inzu lint tartalmaznak hatóanyagként, és emellett gyógyászati célra alkalmas hordozóanyagot tartalmaznak.

A következőkben röviden ismertetjük az ábrákat.

Az 1. ábrán nyers humán [BlÖ-aszparaginsav] B lánc S-szulfonátnak CM-cellulóz oszlopról való eluációját bemutató kromatogram látható. Az ábrán a 278 nm-nél mért abszorpciót mutatjuk be az elfolyó térfogat függvényében.

A 2. ábrán humán A lánc S-szulfonát és humán [BlO-aszparaginsav] B lánc S-szulfonát kombinációs elegyének nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással kapott kromatogramja látható. A 2a. ábra a kezdeti kromatográfiás elválasztást mutatja, míg a 2b. ábrán a 2a. ábrán 32,32 percnél kapott csúcs ismételt kromatografálásának eredménye látható, a 278 nmnél mért, abszorpciót matatjuk be az elúciós idő függvényében.

A 3. ábrán ¹²⁵J-Ínzulin patkánymáj plazma inzulin-receptorokhoz való kötődésének kompetitív gátlását mutatjuk be [B10-aszparaginsav]-humán-inzulin és marha-inzulin esetén, a kötés gátlást (a maximum %-ában) a kompetitor koncentráció függvényében mutatjuk be, az üres karikával jelzett körbe a módosított humán inzulinra, a kitöltött karikával jelzett marha inzulinra vonatkozik.

A 4. ábra [B10-aszparaginsav]-humán-inzulin és marha-inzulin patkány adipociták lipogenezisére kifejtett hatását mutatja grafikusan. A lipogenezis stímulálását (a maximum %-ában) az agonista koncentráció függvényében mutatjuk be. Az üres karikával jelzett görbe a módosított humán inzulinra, a kitöltött karikával jelzett marha inzulinra vonatkozik.

Az 5. ábrán a nyers humán dez-pentapeptid-(B26B30)-[Aspl0, Tyr-a-karboxamid25] B lánc S-szulfonát CM-cellulóz oszlopról való eluálását bemutató kromatogram. A 278 nm-nél mért abszoipciót az elúciós idő függvényében mutatjuk be.

A 6. ábra humán A lánc S-szulfonát és humán dezpentapeptid-©26-B30)-[Aspl0, Tyr-a-karboxa mid25]-B-lánc-S-szulfönát kombnációs elegyének kelúcióját bemutató kromatogram, amely nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással készült. A 6a. ábrán az első kromatográfiás elválasztás látható, a 6b. ábrán az a. ábra 36,86 perc időnél lejött eluátumának ismételt kromatografálásával kapott eredményt mutatjuk be. Az ábrákon a 278 nm-nél mért abszoipciót az elúciós idő függvényében mutatjuk be.

A 7. ábra¹²⁵ J-inzulin patkánymáj plazma inzulin3

HU 205 145 Β receptorokhoz való kötődésének kompetitív gátlását mutatja be dez-pentapeptid-(B26-B3O)-[Asp®¹⁰, Tyr®^-a-karboxamid]-humán-inzulin és marha-inzulin esetén. A gátlás %-os értékét a kompetítor koncentráció függvényében mutatjuk be. Az üres karikával jelzett görbe a módosított humán inzulinra, a kitöltött karikával jelzett marha inzulinra vonatkozik.

A 8. ábrán dez-pentapeptid-(B26-B3O)-[Asp®¹⁰, Tyr^B25-a-a-karboxamid]-humán-inzulin és marhainzulin hatását látjuk lipogenezis stimulálására patkány adipocitákban. A lipogenezis stimulálását (a maximum %-ában) az agonista koncentráció függvényében mutatjuk be.

A találmány tárgya eljárás szuperaktív inzulin analógok, az (Γ) képletú |B10-aszparaginsav]-humán-inzulin és a (Π) képletú dez-pentapeptid-(B26-B30)[Asp®¹⁰, Ty^^-a-a-karboxamidj-humán-inzulin és a (ΓΠ) képletú Glu®¹⁰ homológ előállítására.

Inzulin analóg olyan .proteint értünk, amelynek alapvető A lánc és B lánc szerkezete az emberi (és más fajok) inzulinnal azonos helyzetben tartalmaz. így az inzulin analógok megőrzik a természetes inzulinok diszulfid híd elrendezését. A hasznos inzulin analógok abban térhetnek el a natív inzulinoktól, hogy a molekula egyik vagy mindkét láncában egy vagy több aminosav többletként szerepel, hiányzik, más aminosavval helyettesített vagy módosított, de legalább részben meg kell őriznie az inzulin hatását [lásd a Katsoyannis, Treatment of Early Diabetes (1979), 319-327. oldal,· Plenum Publ. Corp.; és a Blondell, Adv. ProL Chem., 26,330-362 (1972) szakirodalmi helyen],

A találmány szerint előállított inzulin analógok abban különböznek a humán inzulintól, hogy a B lánc 10-helyzetében aszparaginsavat tartalmaznak, vagy aszparaginsavat vagy glutaminsavat tartalmaznak a B lánc 10-helyzetú hisztidinje helyett, és emellett a B26-B30 szegmens hiányzik belőlük, és aPheB25 hely Tyr-a-karboxamiddal helyettesített. Ezek a vegyületek nem várt módon sokkal'hatásosabbak, mint a természetes inzulinok, különösen hatásosabbak azoknál, amelyek a diabétesz terápiájában használatosak.

A [B10-aszparaginsav]-humán-inzulin, a dez-pentapeptid-(B26-B3O)-[Asp®¹⁰, Tyr^-a-karboxamid]-humán-inzulin vagy más B¹®-helyettesített analógok számos, szakember számára ismert eljárással előállíthatók. Például az inzulin analóg A és B lánc komponenseinek előállítása a peptidszintézis végrehajtására ismerten alkalmazott bármely eljárással végrehajtható, köztük a szilárd fázisú peptidszintézis eljárásokkal és oldatban végrehajtott eljárásokkal, például fragmens kondenzációval [lásd például az Erickson és Merrifield, The Proteins (1976), 2. kötet, 3. fejezet Academic Press, New York, és Blake és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 1556-1559 (1983) szakirodalmi helyeken]. A humán-inzulin analógok előállíthatok humán- vagy sertés-inzulin A láncának [10-aszparaginsav], dez-pentapeptid-OB26-B30)-[Asp®¹⁰, Tyr-akarboxamid25] vagy Glu®¹® B lánccal való kombinálásával, a B lánc előállítható peptid-szintézis eljárásokkal. Ismeretes, hogy a humán és a sertés inzulin A lánca aminosav szekvenciájában azonos egymással, így a sertés inzulin A lánca pótolhatja a humán inzulin A láncát minden olyan eljárásban, amelyben [10-aszparaginsav-B]-humán-inzulin, dez-pentapeptid(B26-B3O)-[Asp®¹⁰, Tyr^-a-karboxamid] vagy Glu^B1®-humán-inzulin-analógokat állítunk elő. A lánc kombinálható a találmány szerint megváltoztatott B lánccal.

A [B10-aszparaginsav]-humán-inzulin, a dez-pentapeptid-(B26-B30)-[Asp^B1®, Tyi^-a-karboxamid]-humán-inzulin előállítására bármely ismert eljárással előállított humán vagy sertés inzulin A láncot bármely alkalmas eljárással előállított módosított humán B lánccal kombinálunk. Az A lánc és a módosított B lánc előnyösen stabilizált S-szulfonált formájúak, amelyek ismert eljárásokkal az inaktív humán inzulin analógokká rekombinálhatők. Ismert rekombinációs eljárások szerepelnek például a 3 420 810 számú [Katsoyannis] és a 4 421685 számú (Chance és munkatársai) amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban. Például a 4 421685 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban olyan egyetlen lépésből álló eljárást ismertetnek inzulin előállítására, amelyben az S-szulfonált A láncot és az S-szulfonált B láncot egy tiol redukálószer jelenlétében, például ditiotreitol vagy cisztein jelenlétében vizes közegben hozzák érintkezésbe. A rekombináció körülményei: 1)’ pH= 8-12, 2) az össz-protein koncentráció 0,150 mg/ml és 3) a tiol redukálőszer olyan koncentrációban van jelen, amely mintegy 0,4-2,5 SH csoportot eredményez az elegyben lévő összes S-szulfonált A és B lánc minden egyes S-SO₃ csoportjára számítva. A [B10-aszparaginsav]-humán-inzulin, a dez-pentapeptid-(B26-B3O)-[Asp®¹⁰, Tyi^-a-karboxamidj-hu mán-inzulinanalóg képződése akkor következik be, ha a reakcióelegyet 0 és 25 ’C közötti hőmérsékleten tartjuk oxigénforrást biztosító környezetben, hogy az inzulin S-S kötései kialakuljanak.

Ha a rekombinációs reakció befejeződött, az inzulin-analóg elkülöníthető, tisztasága és aktivitása szakember számára ismert különféle eljárásokkal ellenőrizhető. Az inzulin és inzulin analógok tisztítására szokásosan alkalmazott eljárások kromatográfiás eljárások, például nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárás (HPLC), gélszúrés vagy ioncserléő kromatográfía. A termék tisztasága számos eljárással ellenőrizhető, köztük HPLC eljárással, poliakrilamid gél elektroforézissel, aminosav analízissel és aminosav szekvencia vizsgálattal.

Bár az inzulin analógok általában megőriznek némi maradék inzulin aktivitást, az ilyen analógok aktivitása általában a természetes inzulinokénak csak egy töredéke. A humán, marha és sertés inzulinok aktivitása az Amerikai Egyesült Államokban érvényes szabványok szerint mintegy 25-26 nemzetközi egység/mg fehérje. Nem várt módon a [B10-aszparaginsav]-humán-inzulin az inzulin aktivitási vizsgálatokban 4-6szor aktívabbnak bizonyult a természetes inzulinokénál, a dez-pentapeptid-(B26-B3O)-[Asp®¹⁰, Tyi®²⁵a-karboxamid]-humán-inzulin 11-13-szor aktívabb4

HU 205 145 Β nak bizonyult a természetes inzulinnál.

Az inzulin aktivitásának vizsgálatára alkalmas módszerek többek között az 1) inzulin radioreceptor vizsgálat, amelyben egy inzulin relatív aktivitását úgy határozzák meg, hogy mérik az inzulin és inzulin analóg ahhoz szükséges arányát, hogy a sejtmembránokon, például patkánymáj plazma membrán frakción jelen lévő inzulin receptorokhoz fajlagosan kötődő ¹²⁵ J-inzulin 50%-át helyettesítse; 2) Űpogenezis vizsgálat amelyet például patkány adipocitákon végeznek, amelyben az inzulin relatív aktivitását az inzulinnak az inzulin analóghoz való azzal az arányával határozzák meg, amely ahhoz szükséges, hogy a [3-³H] glükóz szerves-extrahálható anyaggá (például lipidekké) való maximális átalakulásának 50%-át elérje; 3) glükóz oxidációs vizsgálat izolált zsírsejtekben, amelyekben az inzulin-analóg relatív aktivitását az inzulinnak az inzulin-analóghoz való azzal az arányával határozzák meg, amely a glükózrf-[¹⁴C] [¹⁴CO₂]-dá való maximális átalakulásának 50%-a eléréséhez szükséges; 4) inzulin radioimmuno-vizsgálat, amellyel az inzulin-analógok immunogenitása határozható meg annak a hatékonyságnak a mérésével, amellyel az inzulin-analóg a ¹²⁵J-inzulinnal a fajlagos anti-inzulin antitestekhez való kötődésben verseng; és 5) egyéb olyan vizsgálatok, amelyekben az inzulin vagy inzulinanalógok ismerten fajlagos inzulin detektorokkal bíró sejtekhez, például tenyésztett limfocitákhoz való kötődését mérik. A relatív inzulin aktivitás mérésére szolgáló standard vizsgálatokban például az előzőekben ismertetett 1), 2) és 5) vizsgálatokban a [BlO-aszparaginsavj-humán-inzulin 4-6-szor aktívabbnak bizonyult a természetes inzulinnál, a dez-pentapeptid(B26-B3O)-[Asp®¹⁰, Tyr^B25-a-karboxamid]-humáninzulin 11-13-szor hatásosabbnak bizonyult a természetes inzulinoknál, és a Glu®¹⁰ analóg 20-szor aktívabbnak bizonyult a természetes inzulinnál.

A találmány szerint előállított humán inzulin analógok diabeteszes betegek kezelésére alkalmas gyógyászati készítményekké formálhatók. A gyógyászati készítmények [B10-aSzparaginsav]-humári-inzulm, a dez-pentapeptid-(B26-B30)-[Asp ®¹⁰, Tyr^B25-a-karboxamid] vagy [Glu®¹⁰, Tyr^B25-a-karboxamid]-hu mán-inzulin analógot tartalmaznak olyan mennyiségben, amely terápiásán hatásos a diabeteszes beteg hormonális egyensúlya elérésének elősegítésére. A fenti készítmények a megadott hatóanyagok mellett gyógyászati célra alkalmas hordozóanyagokat is tartalmaznak. Mint minden más, a diabétesz kezelésére szolgáló inzulin esetén, a találmány szerint előállított készítmények esetén is az adott beteg hormonális egyensúlyának eléréséhez szükséges alkalmas terápiás hatóanyag mennyiséget betegenként kell meghatározni. A terápiás mennyiség meghatározásánál figyelembe kell venni a diabeteszes állapot súlyosságát, és a készítmény adagolásának módját. A beteget kezelő adott orvos döntésére van bízva a gyógyászati készítmény mennyiségének, és az adagolás módjának meghatározása.

A természetes inzulinokat általában olyan terápiás dózisban adják a betegnek, amely 0,02-5 egység humán inzulin aktivitás (testtömeg kg/nap) értéket eredményez (lásd a 4 652 547 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban).

Mivel a találmány szerint előállított új inzulin analógok in vitro jóval hatékonyabbak a természetes inzulinnál, feltehetően a diabeteszes beteg egyensúlyának elérésére szükséges terápiás mennyisége kevesebb, mint a diabétesz kezelésére napjainkban használt természetes inzulinok terápiás mennyisége. A találmány szerint előállított inzulin analógok további fontos előnye, a diabeteszes beteg véréből való gyorsabb kiválasztás. Ismeretes, hogy az inzulin kiválasztását (clearance) a vérből a sejteken lévő inzulin receptorok közvetítik. Mivel a [B10-aszparaginsav]-humán-inzulin az inzulin receptorokhoz mintegy 5-szor szorosabban kötődik, a dez-pentapeptid-(B26-B3O)-[Asp®¹⁰, Tyr^B25-a-karboxamid]-humán-inzulin 11-13-szor, a Glu®¹⁰ analóg 20-szor szorosabban kötődik, mint a természetes inzulin, feltehető, hogy ezek az inzulin analógok a beteg véréből gyorsabban választódnak ki, mint a természetes inzulinok. Ennek következtében feltehető, hogy a diabeteszes betegek kezelése során a keringő inzulin növekedésgátló hatásával kapcsolatos ér-toxicitás csökken, amennyiben a [BlO-aszparaginsav]-humán-inzulinnal dez-pentapeptid-(B26-B30)[Asp®¹⁰, Tyr®²⁵-a-karboxamid]-humán-inzulin, a Glu® ¹⁰ analóggal, kezeljük a beteget.

- A terápiásán hatásos mennyiségű [B10-aszparaginsav]-humán-inzulin, dez-pentapeptid-(B26-B30)[Asp® ¹⁰, Tyr®²⁵-a-karboxamid]-humán-inzulin, Glu®¹⁰ analóg hatóanyagot tartalmazó készítmények az inzulin kezelésre szoruló diabeteszes betegnek parenterálisan adagolhatok. Előnyösen intramuszkiúárisan, szubkután vagy intravénásán adagoljuk ezeket a készítményeket. A készítmények adagolhatok a betegnek orrba fújt permet formájában is. Más eljárás szerint, hosszú időtartamú szabályozott egyensúly bizosítására a készítmények implantálhatő szivattyúba építve alkalmazhatók. Az ilyen implantálható eszközök, amelyek biztosítják, hogy a hatóanyag hosszú időtartamon keresztül szabályozottan jusson a betegbe, szakember számára ismertek. A készítmények a hatóanyagon kívül gyógyászati célra alkalmas hordozóanyagot is tartalmaznak, amelyek nem lehetnek károsak a betegre. A hordozóanyagnak nem szabad kedvezőtlen hatást gyakorolnia a készítmény hatóanyagára, azaz a humán-inzulin analógra sem. A terápiásán hatékony mennyiségű [B10-aszparaginsav]-humáninzulint vagy dez-pentapeptid-(B26-B3O)-[Asp®¹⁰, Tyr^B25-a-karboxamid]-humán-inzulint, vagy Glu®¹⁰analógot hatóanyagként tartalmazó készítmények megfelelő hordozóanyagai és egyéb adalékanyagai például a 4 652 547 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban az inzulintartalmú készítmények hordozóanyagaiként és adalékanyagaiként leírt anyagok. ' »

A találmányt a továbbiakban nem korlátozó példákban mutatjuk be közelebbről. Bár a példákban a [B10-aszparaginsav]-humán-inzulin és a dez-penta5

HU peptid-(B26-B3O)-[Asp^B10, Tyr^-a-karboxamid]humán-inzulin előállítását újuk le, azonos eljárások alkalmazhatók a Glu.⁸¹⁰ , az a-B10 homológok előállítására is.

2. példa [BlO-AszparaginsavJ-humán-inzulin előállítása

A [B10-aszparaginsav]-humán-inzulint fragmenskondenzációs eljárást alkalmazó peptídszmtézis eljárással állítjuk elő [lásd például a Blake és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 1556-1559 (1983) szakirodalmi helyen]. Minden peptidszármazék köztitermék homogenitását vékonyrétegkromatográfiás eljárással 6060 jelölésű szilikagél lemezen (Eastman kromatográfiás lemez) vizsgáljuk. A kromatogram kifejlesztéséhez alkalmazott oldószer kloroform, metanol és víz (45:10:1; 89:10:1; és 200:75:13) arányú elegye.

A [B10-aszparaginsav]-humán-inzulint S-szulfonált humán inzulin A láncának szintetikus humán inzulin [10-aszparaginsav Blánc] S-szulfonált származékával ditiotreitol jelenlétében a 4 421685 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban szereplő eljárás szerint végzett kombinálásával állítjuk elő. Az S-szulfonált humán A láncot, amely a megfelelő sertés inzulin lánccal azonos, [Nicol és mtsai., Natúré, 181, 483-485 (1960)] sertés inzulinból oxidatív szulfitolízissel, majd a kapott S-szulfonált A és B láncok [Katsoyannis és mtsai, Biochemistry, 6, 26352624 (1967)] eljárása szerint oszlopkromatográfíás eljárással való elválasztásával állítjuk elő. Az S-szulfonált humán-[10-aszparaginsav] B láncot az S-szulfonált természetes humán B láncból Schwartz és Katsoyannis [J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 2894-2901 old. (1973)] eljárásával állítjuk elő. A C-terminális hexadekapeptid (B^l5-B³⁰ szekvencia) szomszédos hexapeptiddel (B⁹-B¹⁴) való kapcsolása révén a C-terminális dokozapeptídet (B⁹-B³⁰) nyeq'ük. Ezt ezután az N-terminális ókfapeptiddel (B^B⁸) kapcsolva nyerjük a védett B lánc analógot amelyet folyékony hidrogén-fluoriddal reagáltatunk, majd a kapott szulfhidril-száimazékot oxidatív szulfitolízisével nyerjük az S-szulfonált [10-aszparaginsav] B láncot.

Az I. táblázatban felsorolunk a peptídek szintézisében alkalmazott néhány vegyületet és amino védőcsoportot, és megadjuk ezek alkalmazott rövidítését.

2. táblázat

benzil-csoport	Bzl
tercier-butoxi-karbonil-csoport	Boc
tercier-butil-csoport	Bu^l
cikfohexil-csoport	cHex
dicilohexil-amin	DCHA
dimetil-formamid	DMF
Dimetil-szulfoxid	DMSO
difenil-metil-csoport	DPM
Ν,Ν’-diciklohexiI-karbodiimid	DDC
1-hidroxi-benzotriazol	HOBT
benzH-oxi-karbonil-csoporí	Z
A. S-szulfonált [10-aszparaginsav] B	lánc szinté-

zise

Z: Glu(cHex):OHJDCHA (L vegyület) előállítása

145 B 2

Ezt a vegyületet a megfelelő Boc-származékból (Peninsula Laboratories) állítjuk elő a védőcsoportnak trifluor-écetsawal való eltávolításával, és a kapott terméknek benziloxí-karbonilezésével. A kapott származékot éterből diciklohexil-amin-sőja formájában kristályosítjuk. A kapott termék olvadáspontja 131— 132’C.

Elemzési eredmények a C^H^NjOg képlet alapján:

számított: C:86,4,H:8,88,N:5,4%, talált: C:68,3,H;9,11,N:5,1%.

Z: Glu(cHex)-Ala. OBu¹ (2. vegyület)

9,8 g 1. vegyületet 0,2 n kénsav és etil-acetát között megosztunk, a szerves fázist elkülönítjük, vízzel mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, majd szárazra pároljuk. A visszamaradó oldatot 30 ml DMF-ban oldjuk, 0 ‘C hőmérsékletre hűtjük és hozzáadunk 5,6 g Z-Ala-OBu'-ból Schwartz és Katsoyannis (lásd fent) eljárásával előállított H.Ala.OBif-t, majd

2.3 g HOBT-t és 3,7 g DCC-t adunk hozzá. Az elegyet 24 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk állni, majd kiszűrjük belőle a karbamid mellékterméket, a szűrletet 500 ml etil-acetáttal hígítjuk, és egymást követően 1 mől/Iiteres nátrium-hidrogén-karbonáttal, vázéi, 0,2 n hidrogén-kloriddal, majd vázéi mossuk, szárítjuk, majd vákuumban szárazra pároljuk. 90%-os hozammal 8 g terméket nyerünk olaj formájában, amely vékonyrétegkromatográfiás vásgálat alapján homogénnek báonyul. Ezt a terméket a 3. vegyület előállítására további ellenőrzés nélkül alkalmazzuk.

Z.Val-Glu(cHex)-Ala.OBu^t (3. vegyület) előállítása g 2. vegyületet 150 ml metanolban 2 g 10% fémtartalmú szénhordozős palládiumkataláátor jelenlétében 3 órán át hidrogénezünk. Ezután a katalizátort kiszűrjük, és a szűrletet vákuumban szárazra pároljuk. A visszamaradó elegyet4,l gZ.Val.OH,2,7 gHOBT és

3.3 g DCC 30 ml DMF-ban készült aktiváló elegyével elegyítjük (az aktiválást szobahőmérsékleten 30 percig végezzük az amino-komponens hozzáadását megelőzően). 24 óra múlva a terméket a 2. vegyületre leírt módon elkülönítjük. 85%-os hozammal 8,7 g olajat nyerünk. Ez az anyag vékonyrétegkromatogrúfiás vizsgálat tanúsága szerint homogén, a következő szintézislépésben további jellemzés nélkül alkalmazzuk.

Z.Leu-Val-Glu(cHex)-Ala.OBu^l (4. vegyület) előállítása g 3. vegyületetazelőzőekbenleírtmódonhidrogénezünk, majd a kapott olajos maradékot 30 ml DMFban oldjuk. A kapott oldathoz 5,5 g Z-Ieucin-(p-nitrofenil)-észtert és 1,8 g HOBt-t adunk. 48 óra elteltével az elegyet 250 ml etil-acetáttal meghígítjuk, majd egymást követően 0,5 n ammónium-hídroxiddal, vízzel, 0,2 n hidrogén-kloriddal, majd vízzel mossuk, magnézium-szuláton szárítjuk, majd vákuumban szárazra pároljuk. A visszamaradó anyagot 95%-os etanolból kristályosítjuk. így 88%-os hozammal 8,4 g terméket nyerünk, amelynek olvadáspontja 190-194 ’C, [01^0=-20,3^0=1, DMF).

Elemzési eredmények a Ο₃₇Η₅₈Ν₄Ο9 képlet alapján:

HU 205 145 B számított: C: 63,2,H: 8,31,N: 8,0% talált: C:62,9,H:8,37,N:8,1%.

BocAspCcHexJ-Ifeu-Val-GluícHejO-Ala.OBu¹ (5. vegyiilet) előállítása

1,5 g 4. vegyületet az előzőekben leírt módon hidrogénezünk, és a visszamaradó anyagot hozzáadjuk 10 ml DMF-ban lévő 0,8 gBoc.Asp(cHex).OH (Peninsula Laboratories), 0,34 g HOBT és 0,52 g DCC (az amino komponens hozzáadása előtt 30 percig szobahőmérsékleten aktivált) aktiváló elegyhez. 24 óra múlva a reakcióelegyet a 2. vegyületnél leírt módon feldolgozzunk, a terméket etil-acetát és petroléter elegyéből való ismételt kicsapással tisztítjuk. így 85%-os hozammal 1,5 g terméket nyerünk, amelynek olvadáspontja 203-205 ’C, [a]²⁶D=-8,9’(e=l, DMF).

Elemzési eredmények a C₃₄₄H₇₅N₅O₁₂ képlet alapján:

számított: C:61,0,H:8,72,N:8,l%, talált: C: 60,7, H: 8,56,N: 7,8%.

Boc.Ser(Bzl)-Asp(cHex)-Leu-Val-Glu(cHex)-Ala .OH (6. vegyiilet) előállítása g 5. vegyűlet 10 ml trifluor-ecetsavban készült oldatát 2 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd vákuumban szárazra pároljuk, és a visszamaradó anyagot hideg éterrel eldörzsöljük. A szilárd, védőcsoporttól megfosztott pentapeptid-trifluor-ecetsav sót kiszűrjük, majd kálium-hidroxidon szárítjuk. Aktiváló elegyet készítünk 1,2 g Boc.Ser (Bzl).OH-ból, 0,5 g HOBT-ból és 0,6 g DCC-ből 10 ml DMF-ban, majd 30 perces inkubálás után az elegyet beleszűrjük a pentapeptid trifluor-ecetsav-só 10 ml DMSO-ban készült, 0,13 ml N-metil-morfolint tartalmazó oldatába. 24 óra múlva a reakcióelegyet 100 ml hideg vízzel meghígítjuk, majd a kicsapódott terméket kiszűrjük, szárítjuk, majd etil-acetát és petroléter elegyéből ismételten kicsapjuk. így 90%-os hozammal 0,9 g terméket nyerünk, amelynek olvadáspontja 200-203 ’C.

[a]²⁶D=-17,8°(c=l,DMF).

Elemzési eredmények a C₅₀H₇₈N₆O₁₄ képlet alapján:

számított: C:60,8,H: 7,96,N: 8,5%, talált: C: 61,4,H: 8,25,N: 8,7%.

Az aminosav arány savas hidrolízist követően a következő: Asp₁₀Ser_{0 g}GlUj ₀Alai oValj jLeuj ₀.

Boc.Ser(Bzl)-Asp(cHex)-Leu-Val-GÍu(cHex)-Ala -Leu-Tyr(Bzl)-leu-Val-Cys(Dpm)-Gly-Glu(Bzl)-Arg (NO₂)-Gly-Phe-Phe-Tyr(Bzl)-Thr-Pro-Lys(Z) Thr(Bzl)-OBzl (7. vegyűlet) előállítása

Schwartz és mtsai [Int. J. Pept. Protein Rés. 17, 243-255 (1981)] eljárásával előállított 400 mg humán inzulin B lánc részlegesen védett hexadekapeptidet (B¹⁵-B³⁰ szekvencia) szabad bázis formájában, 494 mg 6. vegyületet és 80 mg HOBT-t tartalmazó szuszpenziót oldódásig keverünk. Az oldathoz 100 mg DCC-t adunk, majd 4 ’C hőmérsékleten 48 órán át keverjük, ezután 150 ml 95%-os etanollal meghígítjuk. A kicsapott dokozapeptidet (B⁹-B³⁰ szekvencia) kiszűrjük, 95%-os etanollal mossuk, majd szárítjuk, így 88%-os etanollal mossuk, majd szárítjuk. így 88%2 os hozammal 450 mg terméket nyerünk. Hidrolízist követően végzett aminosav analízis alapján az alábbi, mólarányokban megállapított összetételt határoztuk meg:

Asp_ltlThr_2t0Ser₁₀Glu₂₁Pro₁₀Gly_2i2Ala_0>9Val_lt9L eu₂ gTyq ₉Phe₂ oLysj y Arg_{0 7}. (A ciszteint nem vizsgáltuk.

H.Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(SO ₃) Gly-SerAsp-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys(SO ₃) -Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr.

OH (humán inzulin [10-aszparaginsav] B lánc S-szulfonát) (8. vegyűlet) előállítása

400 mg 7. vegyűlet 10 ml 7:3 térfogatarányú trifluor-ecetsav -ecetsav elegyben készült oldatát szobahőmérsékleten 1 órán át tároljuk, majd éterrel meghígítjuk. A dokozapeptíd kicsapott trifluor-ecetsavas sóját kiszűrjük, éterrel mossuk, majd szárítjuk. A terméknek 6 ml, 0,1 ml trietil-amint is tartalmazó N-metilpirrolidonban és 6 ml DMF-ban készült oldatát éterrel meghígítjuk és szárítjuk. Ezt a terméket és 500 mg Schwartz és Katsoyannis [J. Chem, Soc. Perkin Trans.

I. 2894-2901 (1973)] eljárásával készült Boc-PheVal-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Dpm)-Gly.OH-t 90 mg HOBT-t tartalmazó 5 ml DMF és 5 ml DMSO elegyben oldjuk, majd 100 mg DCC-t adunk hozzá. Az elegyet 48 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd 5 ml 1 n ammónium-hidroxidot tartalmazó 250 ml hideg vízbe öntjük, és a kicsapódott védett triakontapeptidet kiszűrjük, vízzel 50%-os metanollal, majd metanollal mossuk, szárítjuk, majd DMF és metanol elegyéből ismételten kicsapjuk. így 90%-os hozammal 400 mg terméket nyerünk.

Ezt a terméket a védőcsoportnak folyékony hidrogén-fluoriddal való eltávolításával, majd ezt követően Schwartz és Katsoyannis (lásd fent) humán inzulin B lánc S-szulfonát előállítására leírt eljárásával végzett oxidatív szulfitolízissel S-szulfonált [10-aszparaginSav] B lánccá alakítjuk. 200 mg védett triakontapeptidet 1 ml m-krezolt tartalmazó 9 ml vízmentes folyékony hidrogén-fluoriddal regagáltatunk 0 ’C hőmérsékleten 1 órán át. Ezután a hidrogén-fluoridot eltávolítjuk, és a visszamaradó anyagot egymást követően etil-acetáttal, majd petroléterrel eldörzsöljük. Ezt a terméket 20 ml 8 mól/literes guanidin-hidrügén-kloridban oldjuk, majd az oldathoz 700 mg nátrium-szulfitot és 500 mg nátrium-tetrationátot adunk. Az elegyet 3 órán át szobahőmérsékleten reagáltatjuk, majd dialízis csőbe, például Spectrapoi^ membrán No. 3 csőbe helyezzük, egyenként 4 liter vízzel szemben 4 ’C hőmérsékleten 24 órán át dializáljúk, a műveletet négyszer ismételjük meg, majd a terméket liofilizáljuk.

Tisztítás céljára a liofilizált anyagot 3 ml karbamid-acetát pufferben oldjuk (0,04 mól/titer acetát - 8 mól/liter karbamid, pH= 4,0) és az oldatot 2,5 x 40 cmes CM-cellulóz oszlopra visszük, amelyet azonos pufferrel izokratikusan eluálunk. [Lásd például a Katsoyannis és mtsai, Biochemistry 6,2635-2642 (1967) szakirodalmi helyen.] Az oszlopról elfolyó eluátumot spektrofotométerrel (ISCO Model U-5A) ellenőrizve

HU 205 145 Β az 1. ábrán bemutatott elúciős mintát kapjuk. A fő csúcs eluátumát (125-168 ml) gyűjtjük, az előzőekben leírt módon dializáljuk, és liofilizálás után 22 mg Sszulfonált [10-aszparaginsav] B láncot nyerünk belőle fehér por formájában. A tisztított lánc savas hidrolí- 5 zist követő aminosav analízise a következő mólarányokban megadott összetételt eredményezte, amely arányok az elméletileg kaphatónak megfelelnek: Asp₂ iThr₂₁ SerjjPro ijGh^oGty^ Α&ι,ο Val₃₀L eu3,8+yr_ligPhe_2i9Lys₁₁His_li0Arg_0i9 (a ciszteint nem 10 határoztuk meg).

B. [B10-aszparaginsav]-humán-inzulin szintézise és elkülönítése mg S-szulfonált humán (sertés) A lánc és 20 mg S-szulfonált humán [B10-aszparagmsav]-lánc 10 ml 15 0,1 mől/literes pH= 10,6-os glicin-pufferben készült oldatához 4 ’C hőmérsékleten 7 mg ditiotreitolt adunk. Az elegyet 24 órán át 4 ’C hőmérsékleten tartjuk, majd 1 ml ecetsavval meghígítjuk, és a kapott csapadékot centrifugálással (Intemational Centrifuge, 20 Model HN; 3000 fordulat/perc) eltávolítjuk. Az aktív anyagot tartalmazó felülúszót 0,45 μ-os cellulóz-acetát szűrőn (Sartorius) átengedjük, majd fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás rendszerhez kapcsolt 0,45 x 25 cm-es Vydac^R 218 TP oszlop alkal- 25 mazásával végzünk. Egyenként mintegy 5 mg fehéqet tartalmazó adagokat kromatografáljuk 0,5 ml/perc áramlási sebességgel 2-propanolnak 0,1%-os trifluorecetsavban 10-50%-ig növekvő lineáris gradiensével· 70percen át A kapottkromatogramot a 2a. ábrán mu- 30 tatjuk be. A 2-4. példákban leírt biológiai vizsgálatok kimutatták, hogy csak a mintegy 32,3 percnél lejövő eluátum tartalmaz lényeges inzulinaktivitást. Azonos kromatográfiás körülmények mellett a marha inzulin 30 percnél eluálódik. Az aktív anyagot tartalmazó 35 frakciókat besűrítjük, és azonos oszlopon ismételten kromatografáljuk, ebben az esetben 0,1%-os trifluorecetsavas 2-propanolt alkalmazunik 20-35%-ig lineárisan növekvő gradiens szerint 0,5 ml/perc áramlási sebességgel 85 percen át. Az elúciós mintát a 2b. ábrán 40 mutatjuk be. Az aktív anyagot tartalmazó frakció mintegy 47,2 percnél eluálódik, ezt a frakciót összegyűjtjük, besűrítjük és a 2-4. példákban leírt biológiai vizsgálatokhoz használjuk fel. Azonos kromatográfiás körülmények között a marha inzulin mintegy 38 perc- 45 nél eluálódik. Az A és B láncok előzőekben leírt kombinálásának eredménye 2 mg nagy tisztaságú termék.

A tisztított, szintetikus úton előállított anyag savas hidrolízist követő aminosav analízise révén a következő, mőlarányokban kifejezett összetételt állapítottuk 50 meg, amely jő egyezésben van az elméletileg várható értékekkel:

Asp4£Thr_2tgSer_3ilPro_lt0Glu_7i0Gly5_i0Ala_ltl Val₃₄Ilej ,4Leu_5i9Tyr_3i6Phe2_i9^Lys_I)iHisi_iOArg_ljo (á ciszteint nem határoztuk meg). ’ 55

2. példa [B10-aszparaginsav]-humán inzulin aktivitásának vizsgálata inzulin receptor kötődési vizsgálattal

A receptor kötődési vizsgálatot patkánymáj plazma 60 membrán alkalmazásával végezzük Kitagawa és mtsai [Biochemistry 23, 1405-1413 (1984)] eljárásával. A patkánymáj plazma membránokat Horvat és mtsai [Biochem. Biophys. Acta5S2,609-620 (1975)] eljárásával nyerjük.

Röviden összefoglalva, három párhuzamos, 0,2 mles mintát inkubálunk, amelyek mindegyike 3xl0’¹⁰mól/liter¹²⁵ J inzulint, jelzetlen inzulint vagy az 1. példa szerint előállított [10-aszparaginsav-B] humán inzulint, és 0,6% marha szérum albumin V frakciót tartalmazó, 0,1 mól/literes pH= 7,4-es nátrium-foszfátban lévő, 2040 μg fehérjének megfelelő plazma membránt tartalmaz. Az elegyet 45 percig 24 'C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 2,0 ml jéghideg, 0,1% marha szérum albumin V frakciót tartalmazó 0,1 mól/literes, pH= 7,4-es nátrium-foszfáttal meghígítjuk, és azonnal cellulőz-acetát szűrőn szűrjük. A szűrőket a jéghideg pufferrel kétszer mossuk, szárítjuk, majd radioaktivitásukat szcintílláeiós számlálóval, Fiítron-X^R alkalmazásával mérjük. Minden értékből levonjuk a nem specifikus kötődést, amelyet annak a mintának a szűrőn maradó radioaktivitásával határozunk meg, amely lxlO'⁵ mól/liter jelzetten inzulint tartalmaz az inkubációs elegyben. A relatív aktivitást a ¹²⁵J-inzulin receptor készítményhez való fajlagos kötődésének 50%-os gátlásához szükséges jelzetlen inzulin és ugyanezt a gátlást kiváltó [10-aszparaginsav-B] humán inzulin koncentrációjának arányaként nyerjük.

A 3. ábrán marha inzulin és [10-aszparaginsav-B] humán inzulin ¹²⁵J-inzulinnal patkánymáj-plazma membrán inzulin receptoraihoz való kötődésben való versengési képességét mutatjuk be. A kötődés gátlását a maximum %-ában kifejezve ábrázoljuk a kompetitor anyag koncentrációjának függvényében (kompetitív gátlás). A 3. ábrán szereplő adatpontok három meghatározás átlagát jelentik egy olyan vizsgálatban, amelyet négyszer ismételtünk. Ezekben a vizsgálatokban a maximális kötődés a bevitt radioaktivitás 8,2%-át teszi ki.

Amint az a 3. ábráról látható, a [10-aszparaginsavB] humán inzulin és a marha inzulin dózis - hatásgörbéje lényegében párhuzamos. A [10-aszparaginsav-B] humán inzulinnak marha inzulinhoz viszonyított aktivitása - az előzőek szerint számolva - mintegy 543+ 146%.

3. példa [B10-aszparaginsav]-humán-inzulin aktivitásának vizsgálata lipogenezis vizsgálattal

Az inzulin-analógok aktivitásának meghatározását szolgáló lipogenezis vizsgálatokat Kitagawa és munkatársai (lásd fent) eljárásával végeztük. A vizsgálattal az inzulin analógnak azt a képességét hasonlítjuk marha inzulinéhoz, ahogy a [3-³H]-glükőzt lipidekké alakítja.

Adipocitákat úgy nyerünk, hogy 200-300 g testtömegű hím patkányokból nyert mellékhere és vese körüli zsúpámákat 1,0 mg/ml kollagenázzal 60 perce nát 37 ’C hőmérsékleten inkubálunk, majd az elegyet gé8

HU 205 145 Β zen, ezt követően sűrű szitájú selymen szűrjük át. A sejteket felhasználásra való szuszpendálást megelőzően klinikai centrifugán kétszer flotáljuk. A sejtek inkubálásához Krebs-Ringer hidrogén-karbonát oldatot alkalmazunk, amely az ajánlott kalciumnak a felét, 0,5 pmól/liter glükózt és 3%zsírsavmentes marha szérum albumint tartalmaz, az inkubálásnál alkalmazott gázfázis 95% oxigént és 5% szén-dioxidot tartalmaz. A lipogenezis vizsgálatot három párhuzamos minta inkubálásával végezzük, A minták 1,0 ml adipocita szuszpenziót (20-40 mg száraz sejttömeg) és marha inzulint vagy az 1. példa szerint előállított [B10-aszparaginsav]-humán-inzulint tartalmaznak. A sejteket a [3-³H] glükóz adagolása előtt 37 ’C hőmérséklete n45 percen át inkubáljuk. Az inkubálást a glükóz hozzáadása után 60 percig folytatjuk, majd a reakciót 0,2 ml 5 n kénsav hozzáadásával állítjuk le, és 0,2 ml kukoricaolajat adunk az elegybe a lipidek extrakciójának elősegítésére. A mintákat 10 ml Soluscint-O^R-val 30 percig szobahőmérsékleten extraháljuk, mielőtt a radioaktivitást szcintillációs számlálóval mérnénk. Ezen körülmények mellett a [3-³H] glükóz nem extrahálódik a szcintillátort tartalmazó szerves fázisba, így lényegében nem járul hozzá a mért értékhez. Az inzulin nélkül, illetve a 9,lxlO'¹⁰ mól/liter (5,5 ng/ml) inzulin jelenlétében észlelt radioaktivitást határozzuk meg, mint a lipogenezis fokozásának 0 és 100%-át. A relatív aktivitást a lipogenezis maximális fokozásának 50%-a eléréséhez szükséges inzulin és [10-aszparginsav B] humán inzulin koncentráció-arányaként kapjuk.

A 4, ábrán [3-³H] glükóznak szerves-extrahálható anyagokká (azaz lipidekké) való átalakulásának fokozását mutatjuk be izolált patkány adipocitákban az 1. példa szerint előállított [B10-aszparaginsav]-humáninzulin és marha-inzulin hatására. A lipogenezis fokozását a maximum %-ában kifejezve az agonista koncentráció függvényében ábrázoljuk. Az adat pontok három meghatározás átlagát jelentik olyan vizsgálatban, amelyet négyszer ismételtünk. A vizsgálatokban a 0% és 100% stimulálás 0,3 illetve 3,5 nmól glükóz/mg sejt/óra értéknek felel meg.

A 4. ábrán látható értékek azt mutatják, hogy a [10aszparaginsav-B] humán inzulin a vizsgálatokban teljes agonistaként hat, a lipogenezisnek ugyanazt a maximális fokozását éri el, mint a természetes marha inzulin.

A [B10-aszparaginsav]-humán-inzulin relatív aktivitását azonban számítások szerint a marha-inzulinénak 435+ 144%-aként állapítottuk meg.

A [B10-aszparagrnsav]-humán-inzulinnak a 2. példa szerinti receptor kötődési vizsgálatban, valamint a jelen lipogenezis vizsgálatban kapott aktivitási értékeit nem találtuk statisztikailag különbözőnek (Student t-teszttel 0,4p0,3).

így nyilvánvalóvá válik, hogy a [B10-aszparaginsavj-humán-inzulin szuperaktív inzulin, aamely in vitro a természetes inzulin aktivitásának mintegy ötszörösével bír.

4. példa [B10-aszparaginsav]-humán-inzulin radioimmunológiai vizsgálata

Kitagawa és mtsai (lásd fent) eljárásával radioimmunológiai vizsgálatot végzünk annak megállapítására, hogy a [B10-aszparaginsav]-humán-inzulin immunológiailag megkülönböztethető-e a természetes inzulintól.

Sertés inzulin elleni tengerimalac antiszérűmot és kecske anti-tengerimalac-y-globulint alkalmazunk a vizsgálati pufferben 1:25 hígításban. Pufferként 0,04 mól/literes pH= 7,6-os nátrium-foszfát puffért alkalmazunk, amely 0,154 mól/liter nátrium-kloridot, 0,1% zselatint és 0,01% thimerosalt is tartalmaz. Párhuzamos vizsgálatokat végzünk, egy-egy cső 0,1 ml antiinzulin antiszérűmot, 0,072 ng ¹²⁵J-inzulint és 0,06-0,36 ng marha-inzulint vagy 1-4,0 ng, az 1. példa szerint előállított [BlO-aszparaginsavj-humán-inzulint tartalmaz 0,8 ml össz-térfogatban. Az elegyet éjszakán át szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd 0,2 ml precipitáló antitestet (kecske anti-tengerimalac-y-globulin) adunk hozzá, és a csöveket éjszakán át szobahőmérsékleten tovább inkubáljuk. Az immunprecipitátumot cellulóz^acetát szűrőn gyűjtjük, és egymást követően kétszer 1,0-1,0 ml jéghideg vizsgálati pufferrel mossuk. A szűrőket szárítjuk, és a radioaktivitást szcintillációs számlálón mérjük (FiltronX^R-ban). A Cj/Cj pontokból alkotott egyenes alapján lineáris regressziós analízist végzünk Hales szerint [Biochem. J. SS, 137-146 (1963)] és a [BlO-aszparaginsav]-humán-inzulinnak a marha-inzulinhoz viszonyított aktivitását a fenti pontokból adott egyenesek meredekségének arányaként adjuk meg,

A szintetikusan előállított [B10-aszparaginsav]-humán-inzulin mintegy azonos aktivitást mutatott a radioimmunológiai vizsgálatban marha és sertés inzulinnal szemben. Ez az eredmény azt jelzi, hogy a B¹⁰helyzetben lévő hisztidinnek aszparaginsavra történő kicserélése nem okozott jelentős hatást a molekula immunogén determinánsaira.

5. példa dez-pentatpeptid-(B26-B30)-[Asp ^B1°, Tyr⁸²⁵α-karboxamid] -humán-inzulin előállítása

Dez-pentatpeptid-(B26-B30)-[Asp ^B1°, Tyr^-akarboxamid]-humán-inzulint állítunk elő peptidszintézissel fragmens kondenzációs eljárást alkalmazva. [Lásd például a Blake és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci,, 80, 1556-1559 (1983) szakirodalmi helyen.] Minden peptidszármazék köztitermék homogenitását vékonyrétegkromatográfiás vizsgálattal ellenőrizzük 6060 jelű szilikagél lemezen (Eastman kromatográfiás lemez). A kromatogram kifejlesztésére oldószer-rendszerként kloroform, metanol és víz elegyét alkalmazzuk (45:10:1; 89:10:1; és 200:75:13 arányban).

dez-pentatpeptid-(B26-B30)-[Asp ^B1°, Tyr⁰²⁵-»· karboxamid]-humán-inzulint állítunk elő az S-szulfonált-humán-inzulin A láncnak a szintetikusan előállított S-szulfonált-humán-inzulindez-pentapeptid (B26-B30)-[Aspl0, Tyr-a-karboxamid 23] B lánccal

HU 205145 Β ditíotreitol jelenlétében a 4 421 685 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett módon végzett kombinálásával. Az S-szulfonált humán A láncod amely a sertés inzulin megfelelő láncával azonos [Nicol és mtsai., Natúré, 181, 483-485 (1960)] sertés-inzulin oxidatív szulfitolízisével állítjuk elő, és a kapott S-szulfonált A és B láncokat Katsoyannis és mtsai [Biochemistry 6, 2635-2624 (1967)] oszlopkromatográfiás eljárásával különítjük el egymástól. Az S-szulfonált, kétszeresen módosított B lánc szintézisét lépésenkénti szilárd fázisú szintézissel valósítjuk meg, amelyhez szilárd hordozóként 1 g

4-metil-benzhidril-amin gyantát (0,5 mmól amin/g) alkalmazunk a Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, 2149-54 (1963) és Bárány és mtsai „The Peptides”, kiadó Gross és mtsai, 2,1-284, Academic Press (New York, 1980) szakirodalmi helyen leírt eljárások szerint Az N védelmére Boc csoportot alkalmazunk, kivéve az N-terminális fenilalanin-egységet, amelyet benzil-oxi-karbonil-csoporttal védünk.

A Π. táblázatban néhány, a peptidszintézis során alkalmazott védendő vegyületet és aminosav védőcsoportot tüntetünk fel.

II. táblázat

Védőcsoport	Védett vegyület
benzil-csoport	szerin
cildohexil-csoport	glutaminsav ésaszparaginsav
benzil-oxi-metil-csoport	hisztidin
2,6-diklőr-benzil-csoport Νθ-ρ-toluol-	tirozin
szulfonil-csoport	arginin
4-metil-benzil-csoport	cisztein

Manuális, kettős kapcsolási eljárást követünk Merrifíeld és mtsai eljárásával [Biochem., 21, 5020-31 (1982)] aktivált védett ariúnosavaknak (1-hidroxibenzotriazol-dicikloheyil-karbodiimid dimetil-formamidban) háromszoros feleslegben való alkalmazásával. A reakció lejátszódását kvalitatív ninhidrin teszttel Kaiser és mtsai eljárásával [Anal. Biochem., 34: 595-98 (1970)1 követjük nyomon, a teszt minden kettős kapcsolás után negatív.

A lánc kialakítása után a gyantához kötött peptidet metilén-kloriddal és metanollal alaposan kimossuk, majd 3,0 g végső tömegig szántjuk. Ennek a terméknek egy 700 mg-os részéről a védőcsoportokat alacsony-magas hidrogén-fluorid eljárással Tam és munkatársai szerint [J. Am. Chem. Soc., 105, 6442-55 (1983)] eltávolítjuk. Az első lépésben a peptid-gyantát 1 ml p-krezolt, 6,5 ml dimetíl-szulfidot és 2,5 ml folyékony hídrogén-fluoridot tartalmazó eleggyel reagáltatjuk. Az elegyet 2 órán át 0 °C hőmérsékleten tartjuk, majd vákuumban bepároljuk, és a visszamaradó anyagot 10 ml folyékony hidrogén-fluoriddal 1 órán át 0 ’C hőmérsékleten reagáltatjuk. Ezután a hidrogén-fluoridot eltávolítjuk, és a visszamaradó anyagot etil-acetáttal és petroléterrel eldöizsöljük. A terméket

0,1 mól/literes, pH= 8,8-as trisz-HCl pufferrel pufferolt 20 ml 8 mól/literes guanidin-hidrogén-kloridban szuszpendáljuk, és a szuszpenziőhoz 700 mg nátriumszulfitot és 500 mg nátrium-tetrationátot adunk. Az elegyet 3 órán át szobahőmérsékleten reagáltatjuk, majd kiszűrjük belőle a gyantát, és a szűrletet Spectrapor No 3 membrán csőbe helyezzük, és egyenként 4 liter vízzel szemben a víz négyszeri váltásával 4 ’C hőmérsékleten 24 órán át dializáljuk. A dializátum liofilizálásával 250 mg nyers S-szulfonált B lánc analógot nyerünk fehér por formájában.

A liofilizált anyagot 0,02 mól/liter pH= 7,5-ös trisz.HCi puffért tartalmazó, 2:1 térfogatarányú víz 2-propanol elegyben oldjuk, és nagynyomású folyadékkromatográfiás ioncserélő eljárással tisztítjuk, amelyet LKB folyadékkromatográfiás rendszerhez kapcsolt Synchropak AX 300 oszlopon (1x25 cm) végzünk Mintegy 70 mg fehéqét tartalmazó adagokat kromatografálunk, az előzőekben említett oldószert alkalmazzuk 0,5 mól/liter nátrium-klorid 0-80% közötti lineáris gradiensével, 1,5 ml/perc áramlási sebességgel 140 percen át. A kromatogramot az 5. ábrán mutatjuk be. A fő csúcsot kitevő eluátumot (mintegy 60 percnél jön le) vákuumban eredeti térfogatának mintegy felére sűrítjük be, desztillált vízzel szemben dializáljuk (Spectrapor No 3 membráncső), majd liofilizáljuk. A 250 mg nyerstermékből 150 mg tisztított terméket nyerünk fehér, laza por formájában. A tisztított S-szulfonált B lánc analóg savas hidrolízist követő aminosav analízise a következő, mólarányokban kifejezett összetételt eredményezte, amely összetétel az elméleti értékek alapján várt összetételnek megfelelő, az elméleti értékeket zárójelben tüntetjük fel: ^1,9)20 ^Serl,0(l)^^lu3,0(3) ^3,0(3) ^V^2,7(3)^Leu318(4)Ty^rli9(2)Phe2_i0(’2)HÍS_0i9(₁)Arg_li0

Φ (A ciszteint nem határoztuk meg.)

5. Példa

Dez-pentatpeptid-(B26-B30)-[Asp ^B1°, Tyr²⁵a-karboxamid]-humán-inzulin elállítása és elkülönítése mg S-szulfonált humán (sertés) A lánc és 10 mg

S-szuifonált humán dez-pentapeptid-(B26-B30)[AsplO, Tyr-a-karboxamid25] B lánc 6 ml 0,1 mól/literes, pH= 10,6-os glicin pufferben készült, 4 ‘C hőmérsékletre hűtött oldatához 3,5 mg ditiotreitolt majd 1 ml jégecettel meghígítjük, és a kapott csapadékot centrifugálással (International Centrifiige, Model HN; 3000 fordulat/perc) eltávolítjuk. Az aktív anyagot tartalmazó felülúszót 0,45 μ-os cellulóz-acetát szűrőn (Sartorius) átengedjük, majd fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással tisztítjuk, amelyet LKB folyadékkromatográfiás rendszerhez kötött Vydac 218 TP oszlopon (0,45x25 cm) végzünk. Egyenként 5 mg fehéqét tartalmazó adagokat kromatografálunk, 0,1% trifluor-ecetsavas 2-propanolt alkalmazunk 10-50% lineáris gradiens szerint, 0,5 ml/perc áramlási sebességgel 70 percen át A kromatogramot a 6a. ábrán mutatjuk be. Az inzulin meghatározás alapján azonosított aktív anyag tartalmú

HU 205 145 B frakciót íbesűötjül^ jés azonos oszlopon ismételten kfötoatdgfafáIji±;tíaWomatografálást 0,1% trifluoreeetsav‘2-propanol 20-35% lineáris, gradiensével végezzük 0,5 mVperc áramlási sebességgel 110 percen át. A kromatogramot a 6b. ábrán mutatjuk be. Az aktív anyagot tartalmazó frakciót, amely mintegy 63,1 percnél jön le, összegyűjtjük és liofilizáljuk. Az A és B láncok fenti elegyéböl 1,4 mg nagy tisztaságú terméket riyeríink.A tisztítóit szintetikus anyag hidrolízist követei aminosav analízise az alábbi, mólarányokban kifejezettösszetételt mutatja, amely értékek jó egyezésben vannak az elméleti értékekkel (utóbbiak zárójelben):

^Α8Ρ4,1(4)^ΤΙΐΓ0,9(1)^^6Γ3,0(3)θ^1ιϊ7,0(7)θ^3,8(4) ^Alal,l(l) ^3,3 (4) ^1,40)^6,0(6)^3,8(4)^2,0(2) ^Hisl,0(l)^ATgo,9(i) · (A ciszteint nem határoztuk meg.)

7. példa, .

Dez-pentatpep!id-(B26-B30)-[Asp ^B1°, Tyr®²⁵a-karboxamid]-humán-inzulin aktivitásának meghatározása inzulin receptor kötődési vizsgálattal

A 2. példában ismertetett vizsgálatot végezzük el.

A 7, ábrán marha-inzulinnak és dez-pentatpeptid(B26-B30)*[Asp^{B 10}, Tyr^B25-a-karboxamid]-humáninzulinnafc ¹²⁵ J-inzulinnal való kompetícióját mutatjuk be patkánymáj-plazma membrán inzulin receptorjaihóz való kötődés vizsgálatában. A kötődés gátlását - a maximum százalékában kifejezve - a kompetitor koncentráció függvényében tüntetjük fel. A 7. ábrán szereplő adat-pontok három meghatározás átlagát jelentik olyan vizsgálatban, amelyet négy alkalommal ismételtünk meg a szintetikusan előállított vegyület három különféle készítményének alkalmazásával. Ezekben a vizsgálatokban a ¹²⁵J-inzulinnak kompetitor távollétében váló kötődése a bevitt radioaktivitás 9,1%-át tette ki, míg a nem-specifikus kötődés az öszszes kötődésnek 9,6%-a volt.

Amint az a 7. ábrából látható, a szintetikus vegyületnek az a koncentrációja, amelyben a fajlagosan kötött ¹²⁵J-inzulin 50%-át helyettesíti, több mint tízszer alacsonyabb, mint a természetes inzulin hasonló hatást kiváltó koncentrációja. Az előzőekben ismertetett számítások szerint a dez-pentapeptid-(B26-B30)[Asp⁵¹⁰, Tyr^-a-karboxamidJ-humán-inzulin aktivitása a marha inzulin aktivitásának mintegy 1166 ± 31,2%-a.

8. példa

Dez-pentapeptid-(B26-B30)-[Asp ^B1°, Tyr³²⁵-»· karboxamidj-humán-inzulin aktivitásának meghatározása lipogenezis vizsgálattal

A 3. példában leírt vizsgálatot végezzük el.

A 8. ábrán látható az 5. példa szerint előállított dezpentapeptid-(B26-B30)-[Asp ^B1°, Tyr^B25-a-karboxamid]-humán-inzulin és marha-inzulin izolált patkány adipocitában kiváltott [3-³H]-glükóz szerves extrahálható anyagokká (azaz lipidekké) való átalakulását stimuláló hatása. A maximum %-ában kifejezett stimuláló hatást az agonista koncentráció függvényében ábrázoljuk. Az adat-pontok három meghatározás átlagát jelentik, olyan kísérletben, amelyet négyszer ismételtünk meg a szintetikus úton előállított vegyület három különböző készítményét alkalmazva. A vizsgálatok5 bán a 0 és 100% stimulálás 11,4, illetve 78,8 nmól glükóz/mg sejt/óra értékekre vonatkozik.

A 8. ábrán bemutatott adatok azt mutatják, hogy a dez-pentapeptid-(B26-B30)-[Asp ^B1°, Tyr^-a-karboxamidl-humán-inzulin a lipogenezis stimulálása maximumának felét lényegesen alacsonyabb koncentrációban váltja ki, mint a természetes marha-inzulin. A dez-pentapeptid-(B26-B30)-[Asp^B1°, Tyi³²⁵-»karboxamidj-humán-inzulinnak a marha inzulinra vonatkoztatott relatív aktivitását 1352± 114% érték15 nek találtuk. A lipogenezis maximális stimulálása a két vegyület esetén azonos.

A fentiekből nyilvánvaló, hogy a dez-pentapeptid(B26-B30)-[Asp^{B 10}, Tyr³²⁵ -a-karboxamid]-humáninzulin,. amely in vitro körülmények között 11—1320 szór nagyobb aktivitású a természetes inzulinnál.

Az ASP®¹⁰ analóg előállításával azonos módon előállított és elkülönített dez-pentapeptid-(B26-B30)[Glu^B1°, Tyr^-a-karboxamidJ-humán-inzulin a természetes inzulinhoz viszonyítva hússzoros aktivitású25 nak bizonyult.

9. példa

Dez-pentapeptid-(B26-B30)-[Asp ^B1°, Tyr®²⁵-akarboxamid]-humán-inzulin radioimmunológiai vizs30 gálata

A 4. példában leírt vizsgálati módszert követjük.

A szintetikus úton előállított dez-pentapeptid(B26-B30)-[Asp^{B 10}, Tyr^B25-a-karboxamid]-humáninzulin a radioimmunológiai vizsgálatban közelítőleg azonos aktivitást mutat marha és sertés inzulinra. Ez az eredmény azt mutatja, hogy azok a szerkezeti változások, amelyek az inzulin receptorokhoz való erősebb kötődést eredményezik, és amelyek egyidejűleg magasabb in vitro inzulin-szerű aktivitást eredményeznek, nem okoznak a szintetikus úton előállított vegyületben a molekula immuiiogén meghatározóira jelentős hatást.

Az alábbiakban a példákban kapott eredményeket értékeljük.

Korábban Rtg-sugár elemzések kimutatták, hogy a B¹⁰ helyzetben lévő hisztidin az inzulin monomer felszínén található, és jelentős szerepe van a cink-inzulin hexamerek képződésében [lásd a Blöndell és mtsai, Adv. Prot. Chem., 26, 279-402 (1972) szakirodalmi helyen], A korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a B¹⁰-helyzetű hisztidinnek leucinra, lizinre vagy aszparaginra való kicserélése révén kapott szintetikus inzulin analógok csökkent biológiai aktivitással bírnak, aktivitásuk a természetes hormonra vonatkoztatva mintegy 14-45%. [Lásd a Schwarz és mtsai, J. Chem. Rés. (S), 220-221 (1977); J. Chem. Rés. (M), 24532469 (1977); Schwartz és mtsai., J. Prot. Chem., J. Prot. Chem,, 177-189 (1982); Bürke és mtsai., Int. J. Protein Rés., 23, 394-401 (1984) szakirodalmi helye60 ken], A vizsgálatokból az a következtetés vonható le,

HU 205 145 Β hogy a B¹⁰-helyzetben lévő egység hidrofil jellege viszonylag kevéssé fontos az inzulin biológiai aktivitásának szempontjából, és egy erősen bázikus aminosav maradéknak ebben a helyezetben való előfordulása, káros e tekintetben. Azt is feltételezték továbbá, hogy az a körülmény, hogy a fiziológiás állapothoz közeli pH-η aB¹⁰-helyzetű egység protonált vagy nem protonált állapotban is képes legyen jelen lenni, ami a hisztidin egységre önmagára jellemző, a nagy biológiai aktivitás szempontjából szükséges. [Lásd Bürke és munkatársai (fent) szakirodalmi helyen.] Azonban a [B10aszparaginsav]-humán-inzulint, amely fiziológiás pHn a B¹⁰-helyzetben negatív töltéssel búr, a példák tanúsága szerint in vitro néhányszor aktívabbnak találtuk a természetes inzulinnál.

A [B10-aszparaginsav]-humán-inzulin szuperaktivitása láthatóan az inzulin receptorokhoz való erősebb kötődéséből adódik. Feltételezzük, hogy az analógnak a receptorhoz való erősebb kötődése az analóg komformáciőjában bekövetkezett olyan változás következménye, amely alkalmasabbá teszi a receptorhoz való kötődésre, és ez a változás a B¹⁰-helyzetben lévő negatív töltést érintő intramolikuláris kölcsönhatások eredménye (például egy só hídé). Más lehetőség szerint az erősebb kötődés származhat a receptornak egy pozitív töltéssel bíró komplementer felületével való közvetlen kölcsönhatásból is. A fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárásnál, amint azt a 2. ábrán bemutatttuk, a [B10-aszparaginsav]-humán inzulin két különböző kromatográfiás körülmény megvalósítása esetén is szignifikánsan később eluálódott, mint a természetes inzulin. Ez a viselkedés azt jelzi, hogy a szintetikus analóg az apolárosabb molekula. A természetes inzulin, és a [BlO-aszparaginsav]humán-inzulin polaritása közötti nagy differencia nem tulajdonítható annak, hogy egy hidrofil maradékot egy másikkal helyettesítettünk. A polaritásban jelentkező különbség legésszerűbb magyarázatának azt tartjuk, hogy a polaritás-különbség egy komformációbeli változást tükröz, amely feltehetően az analógnak az inzulin receptorhoz való erősebb kötődését eredményezi.

A dez-pentapeptid-(B26-B30)-[Asp^B1°, Tyi⁸²⁵karboxamidj-humán-inzulin két módosulatot foglal magában, amelyek az inzulin molekulába külön bevíve a természetes hormonénál nagyobb aktivitással bíró analógok létrejöttéhez vezetnek. Ezek a módosulatok a következők: i) aB26-B30 szegmens eliminációja és a Phe B25 helyen Tyr-a-karboxamid helyettesítő és ii) a His BIO helyettesítése Asp-val. Ez az analóg, a dezpentapeptid-(B26-B30)-[Asp ^B1°, Tyr^-a-karboxamidl-humán-inzulin, az ezideig leírt leghatásosabb inzulin. Biológiai aktivitása nagyobb, mint a bármelyik módosulatot önmagában tartalmazó analógok aktivitásának összege. Ez a felismerés arra a feltételezésre vezet, hogy aB25ésB10 helyek az inzulin külön receptor-kötő területeinek konformációját nagy receptorkötő affinitással bíró helyekké modulálhatják. Valójában az inzulin-receptor komplex különböző szövetekben lévő nagy asszociációs konstansa (mintegy 10⁹ M'

!) feltehetőleg néhány kötődő faj összehangolt hatását teszi szükségessé. A B10-helyzetbeh:léyőhisztidin maradék nem tartozik azok közé a részek közé, amelyekről feltételezzük, hogy hozzájárul ahhoz, hogy a receptor felismerje az inzulint [Blundell és mtsai., Adv. Protein Chem., 26,279-482 (1972); Blundell és mtsai., Natúré (London), 257,197-203 (1975); Pulién és mtsai., Natúré (London), 259, 369-72 (1976)]. Azonban az [Asp^j-inzulin ([10-aszparagrasav-B] inzulin) megnövekedett aktivitása, valamint a [Leu^B10]-, [Asn⁸¹⁰]- és [Lys^B10]-iiízulinok csökketít aktivitása, Schwartz és mtsai., J. Chem. Rés., 220-21 (1977); Schwartz és mtsai., J. Protein Chem. 7,177-89 (1982); Bürke és mtsai., Int. J. Pepi. Prot. Rés., 25, 394-401 (1984)], azt mutatják, hogy az ebben a helyzetben történő helyettesítések mélyreható hatással bírnak a kapott molekulának az inzulin receptorral való kölcsönhatási képességére, és egy biológiai válasz elindítására. A hozzáférhető adatokból nem dönthető el egyértelműen, vajon a BIO hely része-e egy receptor-kötődési területnek, vagy a BIO helyen bekövetkező módosítás egy távoló kötődési területre van hatással. Ezen analógok igen nagy aktivitásának számbavételével számos modell feltételezhető. A B25 és B10 helyek lehetnek az inzulin külön receptor kötési helyeinek elemei, amelyekaB25 és B10 helyzetben lévő egységek módosításával külön változtathatók és a találmány szerinti, receptor kötődés iránt nagy affinitás! állapotú analógokhoz vezetnek. Ezen kívül a B25 és B10 egységek módosítása egymástól függetlenül és egymással összhangban kedvezően befolyásolhatja más, az inzulin fontos· receptor kötési területeit képező régiók konformációját.

Claims

1. Eljárás az © képletű szuperaktív humán-mzulinanalógelőállítására, azzal jellenezve, hogy az inzulinanalógismert módon előállított S-szulfonát formájú A és B láncát - előnyösen dítiotreitol - redukálószer jelenlétében egyesítjük. (Elsőbbsége: 1987.07.17.)

2. Eljárás a (Π) és (I© képletű, a B10 helyzetben aszparaginsavat vagy glutaminsavat tartalmazó dezpentapeptíd-^ő-BSOj-ITyr³²⁵-»- karboxamid]-humán-inzulin-analógok előállítására, azzal jellemezve, hogy az inzulin-analóg ismert módon előáUított S-szulfonát formájú A és B láncát - előnyösen dítiotreitol redukálószer jelenlétében egyesítjük. (Elsőbbsége: 1988.07.07.)

3. Eljárás diabétesz kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított [10-aszparaginsav-B]-humán-inzulin szuper aktív humán-inzulin-analógot gyógyászati célra alkalmas hordozó- és/vagy segédanyaggal összekeverjük, és gyógyászati készítménnyé alakítjuk. (Elsőbbsége: (1987.07.17.)

4. Eljárás diabétesz kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a 2. igénypont szerint előáUított dez-pentapeptid-(B26BSOHAsp⁸¹⁰, Tyr^B25-a-karboxamid]-humán-inzuün

HU 205 145 Β vagy dez-pentapeptid-(B26-B30)-[Glu^B1°, Tyr³²⁵-^karboxamid]-humán-inzulin szuperaktív humán-inzuin-analógot gyógyászati célra alkalmas hordozóés/vagy segédanyaggal összekeverjük, és gyógyászati készítménnyé alakítjuk. Elsőbbsége: 1988.07.07.)

5. A 3. igénypont szerinti eljárás intramuszkuláris adagolásra alkalmas készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy intramuszkulris készítmények előállítására szokásosan használt hordozó- és/vagy segédanyagokat alkalmazunk. Elsőbbsége: 1987.07.17.)

6. A 3. igénypont szerinti eljárás szubkután adagolásra alkalmas készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy szubkután adagolást! készítmények előállítására szokásosan alkalmazott hordozó- és/vagy segédanyagokat alkalmazunk. Elsőbbsége: 1987.07.17.)

7. A 3. igénypont szerinti eljárás intravénás adagolás céljára alkalmas készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy intravénás adagolású készítmények előállítására szokásosan használt hordozó- és/vagy segédanyagokat alkalmazunk. Elsőbbsége: 1987.07.17.)

8. A 3. igénypont szerinti eljárás beültethető szivattyúval adagolható készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy beültethető szivattyúval adagolható készítmények előállítására szokásosan használt hordozó- és/vagy segédanyagokat alkalmazunk. Elsőbbsége: 1987.07.17.)

9. A 3. igénypont szerinti eljárás orr-permet formájában adagolható készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy orr-permet formájában adagolható készítmények előállítására szokásosan használt hordozó- és/vagy segédanyagokat alkalmazunk. Elsőbbsége: 1987.07.17.)

10. A 4. igénypont szerinti eljárás intramuszkuláris adagolásra alkalmas készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy intramuszkuláris készítmények elállítására szokásosan használt hordozó- és/vagy segédanyagokat alkalmazunk. Elsőbbsége: 1988.07.07.)

11. A 4. igénypont szerinti eljárás szubkután adagolásra alkalmas készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy szubkután adagolású készítmények előállítására szokásosan alkalmazott hordozó- és/vagy segédanyagokat alkalmazunk. Elsőbbsége: 1988.07.07.)

12. A 4. igénypont szerinti eljárás intravénás adagolás céljára alkalmas készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy intravénás adagolású készítmények előállítására szokásosan használt hordozó- és/vagy segédanyagokat alkalmazunk. Elsőbbsége: 1988.07.17.)

13. A 4. igénypont szerinti eljárás beültethető szivattyúval adagolható készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy beültethető szivattyúval adagolható készítmények előállítására szokásosan használt hordozó- és/vagy segédanyagokat alkalmazunk. Elsőbbsége: 1988.07.07.)

14. A 4. igénypont szerinti eljárás orr-permet formájában adagolható készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy orr-permet formájában adagolható készítmények előállítására szokásosan használt hordozó- és/vagy segédanyagokat alkalmazunk. Elsőbbsége: 1988.07.07.)