HU211312A9 - Májspecifikus inzulinanalógok Az átmeneti oltalom az 1-9. igénypontokra vonatkozik. - Google Patents
Májspecifikus inzulinanalógok Az átmeneti oltalom az 1-9. igénypontokra vonatkozik. Download PDFInfo
- Publication number
- HU211312A9 HU211312A9 HU9500239P HU9500239P HU211312A9 HU 211312 A9 HU211312 A9 HU 211312A9 HU 9500239 P HU9500239 P HU 9500239P HU 9500239 P HU9500239 P HU 9500239P HU 211312 A9 HU211312 A9 HU 211312A9
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- insulin
- chain
- amino acids
- insulin analog
- trp
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical class N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 243
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 100
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 100
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 99
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 52
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 50
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 claims description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 37
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 26
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 21
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 10
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 8
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 6
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 6
- IYKLZBIWFXPUCS-VIFPVBQESA-N (2s)-2-(naphthalen-1-ylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(N[C@@H](C)C(O)=O)=CC=CC2=C1 IYKLZBIWFXPUCS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 3
- YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N Cys-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims description 2
- UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N 0.000 claims description 2
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 claims description 2
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 claims description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims 4
- OABOXRPGTFRBFZ-IMJSIDKUSA-N Cys-Cys Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O OABOXRPGTFRBFZ-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims 1
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 claims 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims 1
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 claims 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims 1
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 claims 1
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 claims 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 75
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 description 15
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 14
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 13
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 9
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000004132 lipogenesis Effects 0.000 description 9
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 7
- NVYVHAPFRUEAJN-UHFFFAOYSA-N anisole;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.COC1=CC=CC=C1 NVYVHAPFRUEAJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 7
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 7
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 6
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000032393 negative regulation of gluconeogenesis Effects 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 6
- GZCGUPFRVQAUEE-NKKIJKBOSA-N (2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxy-3-tritiohexanal Chemical compound O=C[C@H](O)[C@](O)([3H])[C@H](O)[C@H](O)CO GZCGUPFRVQAUEE-NKKIJKBOSA-N 0.000 description 5
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 5
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 5
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108700022737 rat Fat1 Proteins 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- DMBKPDOAQVGTST-GFCCVEGCSA-N (2r)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-3-phenylmethoxypropanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@@H](C(O)=O)COCC1=CC=CC=C1 DMBKPDOAQVGTST-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 4
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- WWECJGLXBSQKRF-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylformamide;methanol Chemical compound OC.CN(C)C=O WWECJGLXBSQKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- IOGXOCVLYRDXLW-UHFFFAOYSA-N tert-butyl nitrite Chemical compound CC(C)(C)ON=O IOGXOCVLYRDXLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012414 tert-butyl nitrite Substances 0.000 description 3
- HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(4-chlorophenyl)-2-(4-methylphenyl)sulfonylbutane-1,4-dione Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)C(C(=O)C=1C=CC(Cl)=CC=1)CC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HIXDQWDOVZUNNA-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5-hydroxy-7-methoxychromen-4-one Chemical compound C=1C(OC)=CC(O)=C(C(C=2)=O)C=1OC=2C1=CC=C(OC)C(OC)=C1 HIXDQWDOVZUNNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 2
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- FIWILGQIZHDAQG-UHFFFAOYSA-N NC1=C(C(=O)NCC2=CC=C(C=C2)OCC(F)(F)F)C=C(C(=N1)N)N1N=C(N=C1)C1(CC1)C(F)(F)F Chemical compound NC1=C(C(=O)NCC2=CC=C(C=C2)OCC(F)(F)F)C=C(C(=N1)N)N1N=C(N=C1)C1(CC1)C(F)(F)F FIWILGQIZHDAQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000993774 Ovis aries Insulin Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000009229 glucose formation Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 2
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N (2s)-2,6-diaminohexanoic acid;(2s)-2-hydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- CNBUSIJNWNXLQQ-NSHDSACASA-N (2s)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 CNBUSIJNWNXLQQ-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010444 Acidosis Diseases 0.000 description 1
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical class OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010049990 CD13 Antigens Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKCZZAZNMMVICF-DCAQKATOSA-N Gln-Leu-Glu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QKCZZAZNMMVICF-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010018473 Glycosuria Diseases 0.000 description 1
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010060378 Hyperinsulinaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010023388 Ketonuria Diseases 0.000 description 1
- 208000007976 Ketosis Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-M L-tyrosinate group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)[O-] OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-M 0.000 description 1
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 1
- FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-asparagine Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- MDXGYYOJGPFFJL-QMMMGPOBSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C MDXGYYOJGPFFJL-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010041954 Starvation Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N acetic acid 2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007950 acidosis Effects 0.000 description 1
- 208000026545 acidosis disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000010560 atom transfer radical polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 210000000028 corpus adiposum pararenale Anatomy 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- NLFBCYMMUAKCPC-KQQUZDAGSA-N ethyl (e)-3-[3-amino-2-cyano-1-[(e)-3-ethoxy-3-oxoprop-1-enyl]sulfanyl-3-oxoprop-1-enyl]sulfanylprop-2-enoate Chemical compound CCOC(=O)\C=C\SC(=C(C#N)C(N)=O)S\C=C\C(=O)OCC NLFBCYMMUAKCPC-KQQUZDAGSA-N 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004110 gluconeogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 230000035780 glucosuria Effects 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N hydrazine monohydrate Substances O.NN IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003451 hyperinsulinaemic effect Effects 0.000 description 1
- 201000008980 hyperinsulinism Diseases 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 125000001041 indolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 150000002614 leucines Chemical class 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001071 malnutrition Effects 0.000 description 1
- 235000000824 malnutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000006371 metabolic abnormality Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNTDJKLSENGQMG-UHFFFAOYSA-N methylsulfanylbenzene;trifluoromethanesulfonic acid Chemical compound CSC1=CC=CC=C1.OS(=O)(=O)C(F)(F)F HNTDJKLSENGQMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAXZWHGWYSJAEI-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylformamide;ethanol Chemical compound CCO.CN(C)C=O QAXZWHGWYSJAEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 naphthylalanine Chemical class 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000015380 nutritional deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 206010034674 peritonitis Diseases 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229940075930 picrate Drugs 0.000 description 1
- OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-M picrate anion Chemical compound [O-]C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012987 post-synthetic modification Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000022558 protein metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 125000002653 sulfanylmethyl group Chemical group [H]SC([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 150000003871 sulfonates Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- AZAKMLHUDVIDFN-UHFFFAOYSA-N tert-butyl nitrate Chemical compound CC(C)(C)O[N+]([O-])=O AZAKMLHUDVIDFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPQYKCJIWQFJMS-UHFFFAOYSA-L tetrathionate(2-) Chemical compound [O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O HPQYKCJIWQFJMS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N triflic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001665 trituration Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Description
A jelen találmány kidolgozásához kormánytámogatást vettünk igénybe, a #DK-12925 számú, Nemzeti Egészségügyi Intézet (National Institute of Health) által folyósított pénzügyi támogatás formájában. A kormánynak vannak bizonyos jogai a találmány vonatkozásában.
A jelen szabadalmi bejelentés az 1989. április 20-án bejelentett, azóta törölt 07/340 929 számú bejelentés folytatása.
A TALÁLMÁNY HÁTTERE
A találmány új inzulinanalógokra vonatkozik, valamint a vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények alkalmazására diabétesz gyógyításában.
Az inzulin egy olyan hormon, amely kulcsszerepet játszik a gerincesek növekedés- és anyagcsere-szabályozásában. Inzulin hiányában súlyos anyagcsere-rendellenességek lépnek fel, amelyek abból adódnak, hogy sok sejt képleten a glükózt és az aminosavakat normálisan hasznosítani. A glükózanyagcsere hiánya az emberi szervezetben diabetes mellitus - komplex krónikus anyagcsere rendellenesség - kialakulásához vezet, amelyben a szénhidrát, zsír és fehérje metabolizmus rendellenes. A diabetes mellitust - teljesen egyértelmű klinikai formájában - az inzulin vagy inzulinaktivitás abszolút vagy relatív hiányával jellemezhetjük, amelyhez glukosuria, ketonuria, növekedésmegállás és negatív nitrogénmérleg társul. Ezek az állapotok akut anyagcserezavar okozta acidózis miatt végül is halálhoz vezethetnek. A halál beállta a zsírsavak korlátozatlan oxidálásából vagy inanicióból (kiéhezettségből) következik, amely a ketontestek létrehozásához szükséges elegendő lipidtartalék hiányából származik. Az inanicio olyan állapot, amelyet feltűnő gyengeség, rendkívüli súlyveszteség, és a hosszan tartó, súlyos táplálékelégtelenségből fakadó metabolizmuscsökkenés jellemez. „Dorland's Illustrated Medical Dictionary 25. kiadás.
Az 1920-as években az inzulin felfedezése és tisztítása, továbbá az inzulin és a diabetes mellitus kapcsolata eredményezte a betegség befolyásolásának lehetőségét. Lásd például Bliss, „The Discovery of Insulirí' című publikációját, University of Chicago Press, Chicago, III. Today (1983). Ma az inzulint a diabéteszes betegeknek elsősorban gyógyászati céllal, a betegség kézben tartása érdekében adják. Az inzulin kb. 6000 dalton molekulatömegű polipeptid, amely két rövid peptidláncból, az A- és B-nevű láncból áll, amelyek invariáns diszulfidhidakkal kapcsolódnak egymáshoz. Majdnem az összes tanulmányozott inzulinban az Alánc, amely 21 aminosav hosszúságú belső diszulfidhidat is tartalmaz. A B-lánc 30 aminosav hosszúságú. Mint sok eukarióta protein, az inzulin is prekurzor formában képződik, amelyből poszt-szintetikus módosításokkal keletkezik az érett két polipeptid lánccal rendelkező aktív hormon.
Az inzulin közvetlen prekurzora az egyetlen polipeptidláncból álló proinzulin, amelyben az A- és B-lánc egy körülbelül 31 aminosavból álló, úgynevezett C-peptiden keresztül kapcsolódik össze úgy, hogy a kapcsolódási pontokon bázisos aminosavpárok kerülnek egymás mellé. A három peptid sorrendje a proinzulin molekulában: NH2-B-lánc-Arg-Arg-C-peptid-Lys-Arg-A-lánc-COOH. Az inzulin-mRNS transzlációs terméke a preproinzulin, amely egy olyan proinzulin, ami az NH2-terminusnál egy 24 aminosav hosszúságú, erősen hidrofób tulajdonságú szignálpeptidet tartalmaz, ami az olyan fehétjékrejellemző, amelyek vagy keresztüljutnak a sejtmembránokon vagy kötődnek azokhoz.
A preproinzulin a pankreász szétszórtan elhelyezkedő Langerhans-szigeteiben található béta-sejtekben szintetizálódik. A szignálpeptid eltávolítása a durva szemcsés endoplazmás retikulumban következik be és így helyes térszerkezetű oxidált proinzulin képződik, amely a Golgi készülékhez transzportálódik, hogy ott szekréciós granuluntokban csomagolódjon. A helyes térszerkezetű proinzulint diszulfid kötések stabilizálják. A szekréciós granulumok érési ideje alatt a helyes fémszerkezetű proinzulin molekulát specifikus proteázok elhasítják a bázikus aminosav párok között és így felszabadul az inzulin és a C-peptid.
Amint a fentiekben azt kifejtettük, a diabetes mellitus terápia során ellenőrzött mennyiségű inzulint adagolunk a diabéteszes betegnek. Az így adagolt inzulint az esetek többségében állati eredetű hasnyálmirigyből nyerjük, nevezetesen szarvasmarha és sertés hasnyálmirigyéből. A szarvasmarha- és sertésinzulinnak az a funkciója, hogy fenntartsa a hormonális homeosztázist ugyanolyan úton, mint a humán inzulin, kb. ugyanazzal a hatásossággal, de mivel ezek idegen proteinek, kiválthatnak valamilyen immunológiai reakciót, ami felhasználhatóságukat csökkenti. Jelenleg már a gyógykezelés során rekombináns DNS technikával előállított humán inzulint is adhatunk. A rekombináns DNS vagy más technikával előállított humán inzulin használata során nem valószínű, hogy olyan kedvezőtlen immunológiai problémákkal kerülünk szembe, mint ami az állati inzulin alkalmazását kíséri. Még ha hozzá is jutunk természetes humán inzulinhoz, akkor sem mindig elegendő csupán a hormon adagolása a diabéteszes betegeknek a normális metabolizmus helyreállításához. Ilyenképpen jobb hatással bíró alternatív inzulinokra vagy a terápia más eszközeire is szükség van a diabéteszes betegek gyógyításához.
A 074 558 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés szuperaktív humán inzulinanalógot ismertet, a [10-aszparaginsav-B] humán inzulint, amely felülmúlja a természetes humán inzulin aktivitását. Specifikusan a [10-aszparaginsav-B] humán inzulint 4-5-ször hatásosabbnak találták, mint a természetes inzulint. A 273 957 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés és a PCT/US88/02289 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés más szuperaktív inzulinanalógokat ismertet: a desz-pentapeptid (B26B30)-[AspB1°, TyrB25-oc-karboxamid] humán inzulint, a (B26-B30)-[Glu'°· TyrB25-a-karboxamid] humán inzulint, és a desz(B26-B30)-[XB'°, TyrB25-a-karboxamid] humán inzulint - ahol X a B-lánc 10. helyén lévő helyettesített aminosav. Ezek az inzulinanalógok kb. 1120-szor hatékonyabbak, mint a természetes inzulin. A
HU 211 312 A9 fent ismertetett inzulinanalógok mindegyike a természetes humán inzulin A- vagy B-láncában helyetesített aminosavakat tartalmaz, amelyek növelik a vegyület hatásosságát vagy a vegyület egyéb sajátosságait változtatják meg.
A természetes inzulin és az ismert inzulinanalógok inzulin szállítási útjainak egyike sem szimulálja pontosan az inzulin szekréciót a normál hasnyálmirigyből.
Normális esetben az inzulin a zsigeri vénás körbe lép, ezáltal a májat magasabb inzulin koncentrációnak teszi ki, majd ugyanígy a perifériás szövetet is. Standard subcutan inzulin adagolással a plazma glükóz koncentrációt normalizálhatjuk, de a glükóz reciklizációt, a protein és lipid termelést és hasznosítást nem. Továbbá a perifériás érszövetek is a normálisnál magasabb inzulin koncentrációnak vannak kitéve. Bár ezeknek a metabolikus abnormalitásoknak hosszú távú hatásai még vizsgálatra szorulnak, számottevő bizonyítékok vannak arra, hogy a perifériás hiperinzulinémia szignifikáns kockázati faktor lehet az ateroszklerózis kialakulásában.
A májspecifikus inzulinanalógok, vagy azok, amelyek sokkal aktívabbak a májban, mint a zsírszövetekben, számos előnyt mutatnak a jelenleg rendelkezésre álló inzulin terápiával szemben. Ilyen analógok alkalmazásával lehetséges, hogy előnyösebb felszívódást érjünk el a májban a perifériás subcutan adagolás alatt, ezáltal jobban szimuláljuk a máj és a perifériás szövetek közötti metabolikus egyensúlyt. Bár végeztek kísérleteket az inzulin intraperitoneális injektálásával szimulálva ezt az eloszlást, ennek a technikának azonban potenciális hátrányai vannak nevezetesen ay intraperitoniális hozzáférhetőség nehézsége és a peritonitis kockázata. A májspecifikus inzulinokkal is elérhetjük ugyanazt a hatást, mint az intraperitoniális inzulinnal, de a megnövekedett kockázati tényezők nélkül.
Találmányunk szerint új inzulinanalógokat szintetizáltunk, amelyeknél azt találtuk, hogy májspecifikusak. Ezek az inzulinanalógok egy vagy több helyettesített aminosavat tartalmaznak az A- és B-láncban. Nevezetesen triptofán, vagy más terjedelmes hidrofób oldalláncú aminosavakkal szubsztituáljuk az inzulin polipeptidet az A14 és az A19 helyeken, hogy előállítsuk a találmány szerinti májspecifikus inzulinanalógokat. Feltételezzük, hogy az A13, A15 és A16 helyeken található triptofán vagy más teijedelmes hidrofób oldalláncok szintén májspecifikus inzulinanalógokhoz vezetnek.
A találmány kezelésre szoruló betegek diabéteszének kezelésére alkalmas gyógyászati készítményekre is vonatkozik. A betegek kezelése során a találmány szerinti inzulinanalóg gyógyászatilag hatékony mennyiségét alkalmazzuk gyógyászatilag elfogadható hordozókkal összekeverve.
Továbbá a találmány a diabétesz kezelési módjára is vonatkozik, miszerint az inzulinterápiás igénylő diabéteszes betegeknek a találmány szerinti inzulinanalóg gyógyászatilag hatékony mennyiségét adagoljuk gyógyászatilag elfogadható hordozókkal összekeverve.
Az ábrák rövid ismertetése. Az
l.ábra egy kromatogram, amely a juh-[Trp14]-Alánc S-szulfonát Cellex-E oszlopról történő (200-350 ml elfolyó) elúcióját mutatja be. A
2A. ábra egy olyan kromatogram, amely a juh-B-lánc
S-szulfonát és a juh-[Trp,4]-A-lánc S-szulfonát keverék CM-cellulóz oszlopról történő elúcióját mutatja be a kezdeti kromatográfiás szétválasztásnál. A
2B. ábra egy fordított fázisú HPLC kromatogram, amely a 2A. ábrán (140-180 ml elfolyónál) mutatott csúcsban lévő anyag újra kromatografálását mutatja be. A
3. ábra a természetes inzulin és a [Trp,4-A]-inzulin patkányzsírsejtekben kiváltott lipogenézisstimulációjának összehasonlítását mutatja. A
4. ábra mutatja a FAO sejtekben végbemenő glukoneogenézis gátlást, ahol a glukóz szekréció gátlást az inzulin vagy [Trp14-A]-inzulin koncentráció függvényében ábrázoljuk.
A találmány inzulinanalógra vonatkozik, amely A-láncból - az A-lánc A1-A21 aminosavból - és B-láncból - a B-lánc Β1-B30 aminosavból - áll, ahol az A14 aminosav a következő aminosavak valamelyikével szubsztituált: triptofán, naftil-alanin, Na-dansil-oc, γ-diamino-vajsav, leucin, valin, fenil-alanin és más hidrofób aminosavak.
A találmány olyan inzulinanalógra is vonatkozik, amely A-láncból - az A-lánc A1-A21 aminosavból és B-láncból - a B-lánc B1-B30 aminosavból - áll, ahol triptofán, naftil-alapin, N^-dansil-a,γ-diaminovajsav, leucin, valin, fenil-alanin és más hidrofób aminosavak közül választott aminosav a következő aminosavak valamelyikének helyére van szubsztituálva: az A14 aminosav, az A15 aminosav, az A19 aminosav, a B16 aminosav és ezek kombinációi.
A találmány vonatkozik továbbá az I képletü
H Gly IIc ValGlu Gln-Cjs-Qs-Thr Ser Leii Cys-Ser S I
S
Lcu-Trp-GIn-Lcu-Glu-Asn-Tjr-Cys-Asn-OH
H-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Scr-His-Leu-Val-Glu-AlaS
I
S
Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr- | -Pro-I.ys-Thr-OH qj inzulinanalógra, a [Trpl4-A]-inzulinra.
Az inzulinanalóg kifejezés olyan proteinre vonatkozik, amelyben az A-lánc és B-lánc humán (és más fajta) inzulinszerkezettel bír, és mindegyik fél cisztein oldallánc ugyanabban a helyzetben foglal helyet, mint a természetes inzulinban. Ilyenképpen az inzulinanalógok megtartják a természetes inzulinokra jellemző diszulfid-hidas szerkezetet. A hasznos inzulinanalógok
HU 211 312 A9 különbözhetnek ugyan a természetes inzulinoktól a molekula egyik vagy mindkét láncában egy vagy több aminosav addíciója, deléciója, szubsztitúciója vagy módosítása tekintetében, de az inzulin hatásosságának legalább egy részét megtartják. Lásd pl. Katsoyannis, Treatment ofEarly Diabetes (1979), pp. 319-327, Plenum Publ. Corp.; Blondell, Adv. Prot. Chem. (1972),
26. kötet, 330-362. oldalak.
A találmány szerinti inzulinanalógoknál - amelyek a természetes inzulintól különböznek, mégpedig abban, hogy az A14 és A19 helyeken természetesen előforduló aminosavak triptofánnal vannak helyettesítve meglepő módon azt találtuk, hogy nagyobb hatásosságot mutatnak a májsejtekben, mint a zsírszövetekben. Továbbá azt találtuk, hogy azok az inzulinanalógok is, amelyek a természetes inzulinoktól abban különböznek, hogy az A13, A15 és A16 helyen előforduló természetes aminosavak naftil-analinnal, Ny-dansil-a/ydiamino-vajsavval, leucinnal, valinnal, fenil-alaninnal és más hidrofób aminosavakkal vannak helyettesítve, szintén nagyobb hatásosságot mutatnak májsejtekben, mint a zsírszövetekben.
Ezeknek az inzulinanalógoknak legjelentősebb sajátosságuk a májspecifikusság, ami által sokkal aktívabbak a májban, mint a zsírszövetben vagy a perifériás szövetben. A [Trpl4-A]-inzulin pl. zsírszövetben a természetes inzulin hatásosságának 60%-át mutatja (lipogenézis meghatározás), míg a májban (glukonergenézis gátlásban megadva) a természetes inzulin hatásosságának 90%-át mutatja. Megjegyezzük azonban, hogy míg a perifériás szövetekben az inzulin stimulálja a glükózhasznosítást (pl. zsírszövetekben), addig a májban az inzulin gátolja a de novo glukózszintézist (glukoneogenézis gátlás).
Úgy véljük, hogy az inzulinmolekukában az A14 aminosav más terjedelmes aminosavakkal - mint pl. naftil-alanin, hP-dansil-a, γ-diamino-vajsav - más hidrofóbb aminosavakkal - mint pl. leucin, valin vagy fenil-alanin - való helyettesítése szintén májspecifikus inzulinanalóghoz vezet.
Továbbá azt is feltételezzük, hogy az inzulin polipeptid A13, Al 5 vagy B16 pozícióiban egyszeres aminosav helyettesítések vagy az inzulinmolekula A14-15, A1314, A14-19 és A14-B16 pozícióiban az aminosavak dupla helyettesítése triptofánnal vagy más terjedelmes aminosavakkal - mint pl. naftil-alanin, bP-dansil-a/y-diamino-vajsav - vagy más hidrofób aminosavakkal - mint pl. leucin, valin vagy fenil-alanin - szintén májspecifikus inzulinokhoz vezet. A fenti inzulinanalógok B-láncból álló felének a B10 és B 25 helyeken történő további módosításait a bejelentő korábbi, 074 558 és 273 957 sz. USA-beli bejelentéseiben foglaltak szerint végezhetjük el, amelyekben foglalt kitanításokat a jelen kitanítás részeként kell tekinteni. Ezek a további helyettesítések szuperaktív inzulinokat eredményeznek, amelyekről májspecifikusságot tételezünk fel.
Az igényelt inzulinanalógok elŐállíthatók bármely, szakember számára ismert technika szerint. Pl. az inzulinanalógok A- és B-láncainak alkotóit az ismert peptidszintézis-technikák bármelyikének alkalmazásával szintetizálhatjuk, végezhetjük pl. szilárd fázisú peptidszintézis-technikával, és oldatban, pl. fragmenskondenzációval. Lásd pl. Erickson és Merrifield, The Proteins (1976), 2. kötet, 3. fejezet, Academic Press, New York; Blake és mts.-i Proc. Natl. Acad. Sci. (1983), 80. kötet, 1556-1559. oldalakon peptidszintézis-technikákat ismertető cikkeit. Néhány igényelt inzulinanalógot előállíthatunk oly módon is, hogy humán vagy juh B-láncot - amelyet épp pankreász vagy rekombináns inzulin redukálása vagy oxidatív szulfitolízise után elkülönítünk - kombinálunk módosított A-lánccal, amelyet peptidszintézis-technikával vagy rekombináns DNS módszerrel állítunk elő.
Az inzulin A- vagy B-láncának - az A- vagy B-lánc bármelyik helyen természetesen előforduló aminosavakkal szubsztituált - előállítására szolgáló rekombináns DNS módszerek alatt értjük, anélkül, hogy ezeket az alábbiakra korlátoznánk, az in vitro szintetizált DNS klónozását és expresszióját, amely kódolja a megfelelő A- vagy B-lánc aminosav-szekvenciáját. Vagy egy szervezetet, pl. baktériumot - amely humán inzulin Avagy B-láncot állít elő - késztethetünk arra, hogy módosított láncot állítson elő valamilyen in vitro helyspecifikus mutagenézis következtében. Lásd pl. Smith, Ann. Rév. Genrt. (1985), 19. kötet, 423-463. oldalak; Botstein és mts.-i Science (1985), 229. kötet, 11931201. oldalak.
Általában azt az inzulint, amely módosított A-láncot tartalmaz, úgy állíthatjuk elő, hogy ismert technikával nyert juhinzulin B-láncokat egyesítünk alkalmas technikával előállított módosított A-láncokkal. A B- és a módosított A-láncok előnyösen stabil S-szulfonált formában vannak, amelyeket ezután ismert eljárásokkal újra egyesíthetünk, hogy megkapjuk a teljes aktív inzulinanalógokat. Ismert rekombináns technikákra adnak kitanítást Katsoyannis USA-beli 3 420 810 sz. és Chance és mts.-i USA-beli 4 421 685 sz. szabadalmi leírásukban. A 4 421 685 sz. USA-beli szabadalmi leírás olyan egylépéses eljárást ismertet inzulin előállítására, amelyben az Sszulfonált A-láncot és az S-szulfonált B-láncot tiol redukáló anyag, mint pl. ditio-treitol vagy cisztein jelenlétében, vizes közegben kapcsoljuk össze. A rekombináció körülményei a következők: (1) kb. 10,5-es pH érték, (2) kb. 0,1-50 mg/1 teljes proteinkoncentráció, és (3) tiol redukáló anyag olyan koncentrációban, hogy kb. 0,4-2,5 SH-csoportot állít elő minden egyes S-S03-csoportra nézve, amely az elegyben lévő A- és B-lánc szulfonátokban jelen van. Az inzulinanalógok képződéséhez a reakció hőmérsékletét kb. 0-5 C-on tartjuk olyan környezetben, amely elegendő oxigénforrást biztosít az inzulin S-S kötéseinek képződéséhez.
Amint a rekombinációs reakció végbemegy, az inzulinanalógot szakember számára ismert technikák segítségével izolálhatjuk és meghatározhatjuk tisztaságát és aktivitását. Az inzulin és inzulinanalógok tisztítására szokásosan alkalmazott technikák lehetnek pl. a nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC), a gélszörés és az ioncserélő kromatográfia. A termék tisztaságát számos technikával meghatározhatjuk, többek közt HPLC-vel, polikakrilamid-gélelektroforézissel, aminosav-analízissel és aminosav-szekvenálással.
HU 211 312 A9
Bár az inzulinanalógok általában megtartanak valamilyen maradék inzulinaktivitást, mégis az ilyen analógok a természetes inzulinok hatásosságának rendszerint csak a töredékét mutatják. A humán, marha és sertés inzulinok hatásossága USP standardban kifejezve kb. 25-26 NE (nemzetközi egység) per mg protein. Standard inzulin hatásosság mérési módszerként említhetjük pl. (1) az inzulin radioreceptor analíziseket, amelyben az inzulin relatív hatásosságát úgy határozzuk meg, hogy vesszük az inzulinnak az inzulinanalógra vonatkoztatott azon arányát, amellyel szemben az a követelmény, hogy a sejtmembránokon jelenlévő inzulinreceptorokhoz specifikusan kötődő ,25I-inzulin legalább 50%-át lehasítsa, ez lehet pl. patkánymájplazma membránffakció, izolált patkányzsírsejtek vagy izolált patkánymájsejtek; (2) patkányzsírsejtekkel végrehajtott lipogenézis meghatározásokat, amelyekben az inzulin relatív hatásosságát úgy határozzuk meg, hogy vesszük az inzulinnak az inzulinanalógra vonatkoztatott azon arányát, amellyel szemben az a követelmény, hogy a [3-3H]-glukóz szerves oldószerrel extralálható anyaggá (pl. lipiddé) történő átalakításában a maximális átalakítás 50%-os értékét elérje; (3) izolált zsírsejtekben végzett glukózoxidációs-analíziseket, amelyekben az inzulinanalóg relatív hatásosságát úgy határozzuk meg, hogy vesszük az inzulinnak inzulinanalógra vonatkoztatott azon arányát, amellyel szemben az a követelmény, hogy a glukóz-1-[14C] [14CO2]-vé történő átalakításában a maximális átalakítás 50%-os értékét elérje; (4) inzulin radioimmunanalízist, amelyben az inzulinanalógok immunogenicitását határozhatjuk meg hatékonyság mérésével, mely szerint az inzulin vagy az inzulinanalóg verseng a 125I-inzulinnal a specifikus anti-inzulin antitestekhez való kötődésben; (5) glukoneogenézis-gátlást, amelyet jól elkülönített májtumor-sejtvonal egybefolyó monorétegén végzünk, amellyel a közegbe irányuló glukózszekréció-gátlást az inzulin vagy az inzulinanalóg függvényében határozzuk meg, ahol az analóg relatív hatásosságát az inzulinnak az analógra vonatkoztatott koncentráció azon arányával határozzuk meg, amellyel szemben az a követelmény, hogy a glukóztermelés-gátlás maximumának 50%-át adja; (6) más meghatározásokat, amelyek mérik az inzulin vagy inzulinanalóg sejtekhez való kötődését, pl. limfocitatenyészetek, amelyekről ismeretes, hogy specifikus inzulinreceptorokkal rendelkeznek.
A találmány szerinti inzulinanalógokat diabéteszes betegeknek beadható gyógyászati készítményekké alakíthatjuk. A gyógyászati készítmények a találmány szerinti inzulinanalógot a gyógyászatban elfogadható hordozókkal összekeverve olyan mennyiségben tartalmazzák, hogy az a diabéteszes betegeknél a hormonális homeosztázis elérésének elősegítésében gyógyászatilag hatékony legyen. Mint minden diabétesz kezelésére szolgáló készítmény esetében, jelen esetben is szükséges az egyes betegeknél a hormonális homeosztázis eléréséhez elegendő terápiás mennyiség meghatározása. Figyelembe veendő faktorok még a diabéteszes beteg állapotának súlyossága és a készítmény beadásának módja, végül a diabéteszes beteg partikuláris orvosi kezelése során a gyógyászati készítmény mennyiségének és a beadás módjának mérlegelése. A természetes inzulinokat a betegnek olyan terápiás dózisban adjuk, hogy a humán inzulin aktivitásának kb. 0,02-kb.
5-szörösét. nyújtsa testsúlykilogrammonként naponta. Lásd. pl. a 4 652 547 sz. USA-beli szabadalmat.
A gyógyászati készítményt, amely a találmány szerinti inzulinanalóg gyógyászatilag hatékony mennyiségét tartalmazza, adagolhatjuk parenterálisan az inzulinos kezelésre szoruló diabéteszes betegnek. A készítményt előnyösen intramusculárisan, subcutan vagy intravénásán adjuk. A készítményt orrba permetezhető formában is adagolhatjuk a betegnek,, vagy pl. hosszú időn keresztül kontrollált homeosztázis esetén a beadáshoz a készítmény egy implantálható adagoló pumpában helyezhetjük el. Ilyen implantálható készülékek - amelyek a gyógyszert kontrollált dózisban adagolják a betegnek hosszú időn keresztül - a szakterületen ismertek. A készítmény továbbá olyan gyógyászatilag elfogadható hordozókat is tartalmaz, amelyek nem lehetnek ártalmasak a beteg egészségére. Továbbá nem szabad, hogy a hordozó a készítmény hatékony komponensével, pl. a [Trp14-A]-inzulinnal vagy más inzulinanalóggal ellentétes hatást mutasson. Hatóanyagként az igényelt inzulinanalógok gyógyászatilag hatékony mennyiségét tartalmazó gyógyászati készítményekhez alkalmas hordozókat és egyéb adalékokat ismertetnek a 4 652 547 sz. USA-beli szabadalomban, amely inzulintartalmú készítményeket ismertet.
Példaként említjük a [Trp,4-A]-inzulin szintézisét, amelyet az S-szulfonált juh-B-lánc és a juhinzulin[Trp14-A]-A-lánc (továbbiakban XX) S-szulfonált formájának kölcsönhatásával valósítottunk meg. Az eljárást Katsoyannis és mts.-i írták le Biochemistry, 6: 2635-2642 (1976) cikkükben, és ezt követően Chance és mts.-i ismertették [Pept. Proc. Am. Pept. Symp. 7th, 721-728 (1981)]. Kulcslépésnek tekintjük az A-lánc analóg szintézisét, a védett heneicosa-peptid (továbbiakban XII) felépítését, amely az illető A-lánc teljes aminosav-szekvenciáját tartalmazza. A védett heneicosa-peptid felépítéséhez vagy szilárd fázisú metodikát, Merrifield és mts.-i J. Am. Chem. Soc., 85, 2149-2154 (1963) és Merrifield és mts.-i, Biochemistry, 21, 50205031 (1982) szerint, vagy a fragmenskondenzációs utat alkalmaztuk. Az utóbbi szintézisút magában foglalja a C-terminális pentapeptid (A17-A21 szekvencia) kapcsolását a mellette lévő pentapeptiddel (A,2-A16 szekvencia), így C-terminális dekapeptidhez (A,2-A21 szekvencia) jutunk. Az utóbbi vegyületet összekapcsoljuk a szomszédos tripeptiddel (A’-A11 szekvencia), így Cterminális tridekapeptidhez jutunk (A9-A21 szekvencia), amelyet viszont összekapcsolunk szomszédos tetrapeptiddel (A5-A8 szekvencia), így a C-terminális heptadekapeptidhez (A9-A21 szekvencia) jutunk. Az utolsó kapcsolási lépés foglalja magában a C-terminális heptadekapeptid kapcsolását az N-terminális tetrapeptiddel, így jutunk a védett heneicosa-peptidhez (továbbiakban XII vagy XIX). A különböző aminosavak szekunder funkciós csoportjainak (pl. Bzl a Ser, Glu, Asn-nél és Tyr és PMB a Cys-nél) megvédéséhez a
HU 211 312 A9 szokásos blokkoló csoportokat használtuk, kivéve a Trp indol csoportját, amelyet a Fujii és mts.-i által ismertetett Mts csoporttal védtünk Chem. Pharm, Bull. (Japan) 32, 2660-2665 (1984) cikke szerint. A blokkoló csoportok eltávolítását a védett heneicosa-peptidről vagy 1 mól/1 trifluorometán-szulfonsav-tioanizol trimetil-formamidos oldatával, amely még m-krezolt és EDT-t is tartalmaz Yajima és Fujii szerint, J. Am88. Chem. Soc., 103, 5867-5871 (1981) és Fujii és mts.-i fenti módszere szerint, felhasználva azokat a módosításokat, amelyeket Ogawa és mts.-i az utóbbi időben ismertettek, J. Protein Chem., 3, 327-348 (1984), vagy az alacsony/magas hidrogén-fluoridos eljárással Tóm és mts.-i szerint, J. Am. Chem. Soc., 105, 6442-6455 (1983), valamint a keletkező redukált termékek szulfitolízisével, amely a XX S-szulfonált láncanalóghoz vezet, végezzük.
A találmány további részleteit a következő példákon keresztül mutatjuk be anélkül, hogy a találmány tárgyát bármilyen szempontból ezekre korlátoznánk.
1. példa
Juh-[ Trp14-A ]-inzulinszintézis
A. A-lánc szintézise
Boc-Gln-Leu*-OMe (1)
H. Leu. OMe oldatához hozzáadunk 11,3 g sósavat tartalmazó 50 ml dimetil-formamidot 9,1 ml trietilaminnal együtt, ezt követően 17,6 g Boc-Gln*-ONp-t. 24 óra múlva az elegyet szűrjük és a szűrletet csökkentett nyomáson kis térfogatig betöményítjük, és 500 ml etil-acetáttal és 100 ml vízzel hígítjuk. A szerves fázist 1 mól/1 ammónium-hidroxid oldattal, vízzel, 0,5 mól/1 sósavval és vízzel mossuk, szárítjuk és szárazra töményítjük. A maradékot éterrel-petroléterrel morzsolva tömörítjük, és etil-acetát-éter elegyből kristályosítjuk: tömeg: 13,7 g (76,6%); op.: 126 ’C; [a]^ = -35,3’ (c = 1, metanol). Anal. számított: C17H3,N3O6: C, 54,7; H, 8,37; N. 11,3. Talált: C, 55,0; H, 8,26; N, 11,3.
Z(OMe)-Trp(Mts)-Gln-Leu*OMe (II)
Az I vegyület (3,73 g) TFA-anisollal készített oldatát 1,5 órán át szobahőmérsékleten tároljuk, és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot éterpetroléter (1:2, v/v) eleggyel eldörzsöljük és káliumhidroxid fölött vákuumban szárítjuk. Ennek az anyagnak 20 ml dimetil-formamiddal készített oldatát, amely
2,8 ml trietil-amint tartalmaz, 0 ’C-ra hűtjük, és ezt hozzáadjuk ahhoz az azidhoz, amelyet Z(OMe)-Trp(Mts)-NHNH2-ből készítettünk Fujii és mts.-i fenti módszere szerint, majd Ogawa és mts.-i fenti módszerét alkalmazzuk. Ebben a reakcióban az alábbi reagenseket alkalmaztuk: dimetil-formamid (20 ml), 6,3 mól/1 sósav dimetil-formamidban (3,5 ml) terc-butil-nitrát (1,5 ml) és trietil-amin (3,1 ml). Az elegyet 40 órán át 4 ’C-on tartjuk, majd etil-acetáttal (600 ml) és telített nátrium-klorid oldattal (100 ml) hígítjuk. A szerves fázist 10%-os citromsavval és telített nátrium-klorid oldattal mossuk, szárítjuk és szárazra pároljuk. Éterrel elmorzsoljuk, a maradékot szárítjuk és etanolból kristályosítjuk: m: 3,6 g (45%); op.: 171-173 ’C; [α]β =
-41,4’ (c= 1, DMF). Anal. számított: C41H51N501oS:
C, 61,1; H, 6,4; N, 8,7. Talált: C, 61,0; H, 6,5; N, 8,5.
Boc-Leu-Trp(Mts)-Gln-Leu*OMe (111)
A II vegyület (2,0 g) TFA-anizol-EDT (10 ml1 ml-0,3 ml) eleggyel készített oldatát 30 percig 0 ’-on és 30 percig szobahőmérsékleten tartjuk, és azután úgy járunk el, mint a II vegyület szintézisében. A képződő N“-nem védett peptidsó trietil-amint (0,6 ml) tartalmazó dimetiljformamidos (35 ml) 0 ’C-ra hűtött oldatához hozzáadunk 1,7 g Boc-Leu*ONp-t. 24 óra múlva az elegyet szobahőmérsékleten 600 ml etil-acetáttal hígítjuk, majd egymás után 1 mól/1 ammónium-hidroxiddal, telített nátrium-klorid oldattal, 0,5 mól/1 sósavval telített nátrium-klorid oldattal mossuk, szárítjuk és kis térfogatra koncentráljuk. A kicsapódott terméket gyűjtjük és etil-acetátból átkristályositjuk: m: 1,51 g (71%); op.: 188-190 ’C; [a]g = -20,6’ (c = l, DMF). Anal. számított; C43H62N6OI0S: C, 60,4; H, 7,3; N, 9,8. Talált: C, 60,1; H, 7,5; N, 9,8. Az aminosavanalízis 4 mólos MSA-s hidrolízis után az alábbi arányokat mutatta: Glu, oLeu20Trp08.
Boc-Ser(Bzl)-Leu-Trp(Mts)-Gln-Leu*OMe (IV)
A III vegyület (4,46 g) deblokkolását TFA-anizolEDT (15 ml-1,2 ml-0,8 ml) eleggyel és a képződő Nanem védett peptidsó elkülönítését a ΠΙ vegyület szintézisében leírtak szerint végezzük. Ennek az anyagnak trietil-amint (1,1 ml) tartalmazó dimetil-formamidos (60 ml) oldatához 0 ’C-on hozzáadunk 2,07 g BocSer(Bzl)*OH-ot és ezután hozzáadunk még 1,65 g N.N'-diciklohexil-karbodiimidet és 1,08 g 1-hidroxibenzo-triazolt. 24 órán át szobahőmérsékleten tároljuk, majd az urea mellékterméket kiszűrjük, a szűrletet 600 ml etil-acetáttal hígítjuk és 100 ml nátrium-kloriddal telítjük. A szerves fázist szokásosan mossuk, szárítjuk és kis térfogatra koncentráljuk. A kicsapódó terméket gyűjtjük, és etil-acetát-éter elegyből átkristályosítjuk: m: 4,58 g (85%); op.: 187-188 ’C; [a]g = -21,6’ (c = 1, DMF). Anal. számított: C53H73N7O,2S: C, 61,7; H, 7,1; N, 9,5. Talált: C, 61,4; H, 7,2; N, 9,3. Az aminosavanalízis 4 mólos MSA-s hidrolízis után az alábbi arányokat mutatta; Ser10Glu10Leu20Trp07.
Boc-Ser(Bzl)-Leu-Trp(Mts)-Gln-Leu-NHNHi (V)
AIV vegyület (4,2 g) hidrazin-hidrátot (1,0 ml) tartalmazó dimetil-formamid (35 ml) és etanol (10 ml) eleggyel készített oldatát szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk és azután 200 ml 50%-os vizes etanollal hígítjuk. A kicsapódó terméket gyűjtjük, és metanol-víz elegyből átkristályositjuk: m: 4,00 g (94%); op.: 203-205 ’C; (a]g = -6,l’ (c= 1, DMSO). Anal. számított: C52H73N90nS: C, 60,5; H, 7,1; N, 12,2. Talált: C, 60,9; H, 7,4; N, 12,0. A 4 mólos MSA-s hidrolízátum az alábbi arányokat mutatja: Ser09Glu10Leu20Trp0,7.
Boc-Tyr(Bzl)-Cys(PMB)-Asn*OBzl (VI)
7,39 g Boc-Cys(PMB)-Asn*OBzl - amelyet Otha és mts.-i, J. Protein Chem., 7,55-65 (1988) szerint készí6
HU 211 312 A9 tünk - TFA-anizol (15 ml-3 ml) eleggyel készített oldatát állni hagyjuk 0 ’C-on 30 percig szobahőmérsékleten
1.5 óráig, majd csökkentett nyomáson koncentráljuk. A maradékot éter és petróleum-éter eleggyel (1:1 v/v) eldörzsöljük és kálium-hidroxid felett vákuumban szárítjuk. Ennek az anyagnak trietil-amint (2,3 ml) tartalmazó dimetil-formamidos (60 ml) 0 'C-ra hütött oldatához hozzáadunk 7 g Boc-iyr(Bzl)*ONp-t. Az elegyet 24 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, majd 600 ml etil-acetáttal és 100 ml 1 mól/1 ammónium-hidroxiddal hígítjuk. A szerves fázist (1 mól/1 ammónium-hidroxiddal, 0,5 mól/1 sósavval és vízzel) mossuk, szárítjuk és kis térfogatra koncentráljuk. A kicsapódott terméket gyűjtjük és etilacetátból átkristályosítjuk: m: 8,7 g (84%); op.: 174175 °C; [oc]g = -18,6° (c=l, DMF). Anal. számított: C43H50N4O9S: C, 64,6; H, 6,30; N, 7,0. Talált: C, 64,0; H, 6,35; N, 7,0.
Boc-Asn-Tyr(Bzl)-Cys(PMB)-Asn*OBzl (Vll)
8,2 g VI vegyületet aktiváljuk TFA-anizollal (22 ml-2,2 ml) a fentiek szerint. A maradék éteres eldörzsölésével kapjuk az N“-nem védett peptidsó csapadékot, amelyet szűrünk és kálium-hidroxid felett vákuumban szárítunk. Ennek az anyagnak trietil-amint (1,8 ml) tartalmazó dimetil-formamidos (50 ml) 0 ’Cra hűtött oldatához hozzáadunk 3,9 g Boc-Asn*ONp-t. A reakcióelegyet 24 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, majd 200 ml metanollal hígítjuk és a kicsapódott terméket kiszűrjük (1 mól/1 ammónium-hidroxiddal, 0,5 mól/1 sósavval és vízzel) mossuk, szántjuk és dimetil-formamid-metanolból átkristályosítjuk: m: 6 g (64%); op.: 237-238 C; [a]g=-37,4° (c= 1, DMF). Anal. számított: C47H56N6O,,S: C, 61,8; H, 6,18; N,
9,2. Talált: C, 61,6; H, 6,30; N, 9,1.
Boc-Glu( OBzl )-Asn-Tyr(Bzl)-Cys( PMB )-Asn *OBzl (Vili)
A VII vegyület (5,5 g) aktiválását és az N“-nem védett peptidsó elkülönítését a VII vegyület szintézisét ismertető példában leírtak szerint végezzük. Ennek az anyagnak trietil-amint (0,85 ml) tartalmazó dimetilformamidos (50 ml) 0 ’C-os oldatához hozzáadunk
3,3 g Boc-Glu(OBzl)*ONp-t [amelyet Sandrin és mts.-i, Heh: Chim. Acta 46: 1637-1699 (1963) módszere szerint állítunk elő). A reakcióelegyet a VII vegyület szintézisében ismertetett módszer szerint dolgozzuk fel: m:
5.6 g (81%); op.: 206-207 ’C; [a]g = -41,4’ (c = 1, DMF). Anal. számított: C59H69N7O14S: C, 62,6; H, 6,14; N, 8,7. Talált: C, 62,3; H, 5,94; N, 8,5. 6 mól/1 sósavas hidrolizátumban az aminosav részarányok: Asp[ gGlu! 0Tyr, 0. ACys(PMB)-t nem határoztuk meg.
Boc-Ser( Bzl)-Leu-Trp( Mts)-Gln-Leu-Glu( OBzl )Asrt-Tyr(Bzl)-Cys-(PMB)-Asn*-OEzl (IX)
A Vin vegyület (2,3 g) aktiválását és az N“-nem védett peptidsó elkülönítését a VII vegyület szintézisét ismertető példában leírtak szerint végezzük. Ennek az anyagnak trietil-amint (0,42 ml) tartalmazó dimetil-formamidos (35 ml) 0 ’C-os oldatához hozzáadunk 2,98 g azidot, amelyet az V vegyületből állítottunk elő (Ogawa és mts.-i fenti módszere szerint). A reakcióelegyet 48 órán át 04 ’C-on tartjuk, majd etil-acetáttal (20 ml) és 5%-os citromsavval (100 ml) hígítjuk, majd a kicsapódott terméket kiszűrjük, vízzel és metanollal mossuk és dimetil-formamid-metanol elegyből átkristályosftjuk: m:
1,55 g (38%); op.: 245-246 ’C; [ocjg = -15,7’ (c= 1, DMSO). Anal. számított: Cl06H]3lN|4O23S2*2H2O: C, 61,5; H, 6,6; N, 9,5. Talált: C, 61,4; H, 6,5; N, 9,7.6 mól/1 sósavas hidrolizátumban az aminosav részarányok: Asp2oSerO 9GIu2 ,Leu2 |Tyrl o. A Trp-t és a Cys(PMB)-t nem határoztuk meg.
Bos-Gly- Val-Cys( PMB)-Ser(Bzl)-Leu-Trp(Mts)Gln-Leu-Glu(OBzl)-Asn-Tyr-(Bzl)-Cys(PMB)Asn*OBzl (X)
A IX vegyület (0,95 g) TFA-anizol-EDT-vel (5 ml-0,11 ml-0,08 ml) készített oldatát 30 percig 0 ‘C-on és 1,5 órán át szobahőmérsékleten tartjuk. A TFA fölösleget csökkentett nyomáson lepároljuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük. A keletkezett csapadékot szűrjük és kálium-hidroxid fölött vákuumban szárítjuk. Ennek az anyagnak trietil-amint (0,09 ml)tartalmazó dimetil-formamidos (25 ml) oldatához hozzáadunk 0,82 g azidot, amelyet Boc-Gly-Val-Cys(PMB)NHNH2-ből készítettünk Ogawa és mts.-i fenti módszere szerint. A reakcióban az alábbi reagenseket alkalmazzuk: dimetil-formamid (10 ml), 6,3 mól/1 sósav dimetil-formamidban (0,51 ml) terc-butil-nitrit (0,24 ml) és trietil-amin (0,49 ml). Az elegyet 40 órán át 4 ’-on tartjuk, majd etil-acetáttal (20 ml) és 5%-os citromsavval (60 ml) hígítjuk. A kicsapódott terméket gyűjtjük és dimetil-formamid-etanol elegyből átkristályosítjuk: m: 0,93 g (82%); op.: 267-268 ’C; [a]g = -17,4’ (c= 1, DMSO). Anal. számított: Ci24Hi56Ni7O27S3*3H2O: C, 60,4; H, 6,6; N, 9,7. Talált: C, 60,3; H, 6,4; N, 9,9. 6 mól/1 sósavas hidrolizátumban az aminosav részarányok: Aspi 9SerO9Glu2OGlyi oVall oLeu2|TyrO9. A Tip-t és a Cys(PMB)-t nem határoztuk meg.
Bos-Gln-Cys(PMB)-Cys(PMB)-Ala-Gly-ValCys( PMB)-Ser(Bzl)-Leu-Trp( Mts)-Gln-LeuGlu(OBzl)-Asn-Tyr(Bzl)-Cys(PMB)-Asn*OBzl (XI)
A X vegyület (0,82 g) aktiválását TFA-anizol-EDTvel (5 ml-0,5 ml-0,1 ml) és az N“-nem védett peptidsó elkülönítését a fentiek szerint végezzük. Ennek az anyagnak trietil-amint (0,1 ml) tartalmazó dimetil-formamidos (40 ml) oldatához hozzáadunk 1,06 g azidot, amelyet Boc-Gln-Cys(PMB)-Ala-NHNH2-ből állítottunk elő Ogawa és mts.-i fenti módszere szerint. A reakcióban az alábbi reagenseket alkalmazzuk: dimetil-formamid (20 ml), 6,3 mól/1 sósav dimetil-formamidban (0,43 ml) terc-butil-nitrit (0,21 ml) és trietil-amin (0,42 ml). A reakcióelegyet 48 órán át 4 ’C-on tartjuk, majd 200 ml metanollal hígítjuk és a kicsapódott heptadeka-peptid származékot gyűjtjük és dimetil-formamid-metanol elegyből átkristályosítjuk: m: 0,85 g; op.. 270 ’C; [a]f> = -21,4’ (c = 1, DMSO). A 6 mól/1 sósavas hidrolizátumban az aminosav részarányok a következők:
Asp20GSer09Glu3 |GlyjfQAla|t2VaIBi9Eeuii9Tyr()(7. ATrp-t és a Cys(PMB)-t nem határoztuk meg.
HU 211 312 A9
Z-Gly-Ile-Val-Glu(OBut)-Gln-Cys(PMB)Cys(PMB)-Ala-Gly-Val-Cys(PMB)-Ser(Bzl)-LeuTrp(Mts)-Gln-Leu-Glu(OBzl)-Asn-Tyr(Bzl)-Cys(PMB)-Asn*OBzl (XII)
A XI vegyület (0,6 g) aktiválását TFA-anizol-EDTvel (6 ml-0,6 ml-0,1 ml) és a keletkező termék elkülönítését a fentiek szerint végezzük. Ennek az anyagnak trietil-amint (0,06 ml) tartalmazó dimetil-formamidos (40 ml) oldatához hozzáadunk 0,49 g azidot, amelyet ZGly-Ile-Val-Glu(OBur)-NHNH2-ből állítottunk elő [Katsoyannis és mts.-i, J. Am. Chem. Soc., 88: 5622-5625 (1966) módszere szerint], A reakcióban az alábbi reagenseket alkalmazzuk: dimetil-formamid (20 ml), 6,3 mól/1 sósav dimetil-formamidban (0,25 ml) terc-butil-nitrit (0,11 ml) és trietil-amin (0,3 ml). A reakcióelegyet 48 órán át 4 ’C-on tartjuk, majd 200 ml metanollal hígítjuk és a kicsapódott védett henricosa-peptidet gyűjtjük és dimetil-formamid-metanol elegyből átkristályosítjuk, m: 0,53 g (76%); op.: 270 ’C; Az aminosavanalízis 6 mól/1 sósavas hidrolízis után a következő arányokat mutatja: Asp20Ser09Glu40Gly 2, Alá, ,2Val, 5Ile0 6Leu, ,8Tyr07. A Trp-t és a Cys(PMB)-t nem határoztuk meg.
B. S-Szulfonált [Trp]4]-A -lánc (XX) szintézise
A XII védett heneicosa-peptidet (200 mg) 0 ’C-on két órán 1 mól/1 trifluor-metán-szulfonsavval kezeljük TFA-ban (4,3 ml), amely tioanizolt (0,66 ml), mkrezolt (0,59 ml) és EDT-t (0,47 ml) tartalmaz. Ezután az oldatot -10 ’C-ra hűtjük, és erős keverés mellett cseppenként hozzáadunk koncentrált ammónium-hidroxidot (5 ml) tartalmazó 8 m guanidin-hidrokloridot (25 ml). Az eljárás időtartama alatt az elegy hőmérsékletét 5 ’C alatt tartjuk. A keletkező elegyet (pH = 5) éténél háromszor extraháljuk (3x50 ml) és a vizes fázishoz - amelynek a pH-ját ammónium-hidroxiddal 8,9-re állítottuk - hozzáadunk 1,2 g nátrium-szulfitot és 0,6 g nátrium-tetrationátot. Az elegyet szobahőmérsékleten 3,5 órán át keverjük, majd 3. sz. Spectrapor membráncsőbe helyezzük és 4 ’C-on 24 órát át négy váltás desztillált vízzel (mindegyik 4 1) dializáljuk. A dializátum liofilizálása során nyerjük a nyers S-szulfonált láncanalógot, amelyet 6 ml 0,015 mól/1 ammónium/hidrogén/karbonátban oldunk és Sephadex G-15 oszlopon (4,2x45 cm) kromatografálunk, az oszlopot 0,015 mól/1 ammónium-hidrogén-karbonáttal egyensúlyba hozzuk és eluáljuk. Az elfolyó anyag,, amely megfelel a fő csúcsnak, és amit ISCO spektrofotométerrel ellenőriztünk, liofilizált volt és juhinzulin[Trp14] A-lánc-S-szulfonátot kaptunk fehér por formában: m: 130,5 mg. Tisztítás céljából a kapott anyagot (71,3 mg) feloldjuk 0,1 mól/1 Tris-HCl pufferben, (pH = 7,0; 3 ml) és Cellex-E oszlopra (1,2x4,3 cm) visszük, melyet ugyanazzal a pufferrel hozzunk egyensúlyba. Az oszlopot Tris-Hcl pufferrel (pH = 7,0) és lineáris nátrium-klorid gradienssel eluáljuk, amint ezt Chu és mts.-i, Biochemistry, 26 696-6971 (1987) cikkükben korábban ismertették. A kromatográfiás görbét, amelyet ISCO spektrofotométerrel és konduktométerrel (Radiometer, Copenhagen) vettünk fel, az 1. ábra mutatja. A fő csúcsnak megfelelő kifolyó anyagot gyűjtjük, a fentiek szerint dializáljuk és liofilizáljuk: m: 35,4 mg.
A szintetikus láncanalóg aminosav analízisét két savhidrolizátumban végeztük; az egyiknél 6 mól/1 sósavat és a másiknál 4 mól/1 MSA-t alkalmaztunk (Trp meghatározásához) Simpson és mts.-i, J. Bioi. Chem., 251, 1936-1940 (1976) módszere szerint. Az aminosav-készítmény - mólarányban kifejezve - megegyezett az elméletileg várt értékkel. Elvégeztük szintetikus láncanalóg digerálását aminopeptidáz M-mel és a digerátum aminosav-analízisét, s az eredmények szintén a várt mólarányokat mutatták. A szintetikus anyagot teljes mértékben megemésztette az alkalmazott enzim, ami jelezte, hogy az aminosavalkotórészek sztereokémiái tisztaságukat a szintetikus eljárás ideje alatt megtartották.
C. Juh-[Trp]i-A]-inzulin szintézise és izolálása
A juh-[Trpl4-A]-inzulin szintézisét az S-szulfonált [Trp14-A]-juh-A-lánc (XX) és az S-szulfonált juh(amely ugyanaz, mint a szarvasmarha) B-lánc reagáltatásával végezzük ditiotreitol jelenlétében Chance és mts.-i fenti módszere szerint. A juh-B-lánc-S-szulfonát (10 mg) oldatot [amelyet Katsoyannis és mts.-i Biochemistry, 6, 2635-2642 (1976) cikkében ismertetett módszer szerint állítunk elő], [Trpl4-A]-A lánc S-szulfonátot (20 mg) és ditiotreitol (6,83 mg) 0,1 mól/1 glicin pufferrel (pH = 10,5, 6 ml) készített oldatát 4 ’C-on 24 órán át keverjük, majd az előzőekben ismertetett Katsoyannis és mts.-i, Biochemistry, 6, 2635-2642 (1976) módszere szerint járunk el. A keletkezett elegyből az inzulinanalóg elkülönítését és tisztítását kromatográfiával végezzük CM-cellulóz oszlopon (0,9x24 cm) acetát pufferrel (Na+, 0,024 m, pH = 3,3) és exponenciális nátrium-klorid árammal Katsoyannis és mts.-i fenti módszere szerint. A kromatográfiás görbét, amelyet ISCO spektrofotométerrel és konduktométerrel (Radiometer, Copenhagen) vettünk fel, a 2A. ábra mutatja.
1,3 mg [Trp14-A]-inzulint pikráton át hidrokloridként elkülönítünk a kifolyó anyagból (145-175 ml) Katsoyannis és mts.-i fenti módszere szerint. Az anyag végső tisztítását fordított fázisú HPLC-vel végezzük Vydac 218 TP oszlopon (0,45x25 cm), amely hozzá van kapcsolva egy LKB folyadékkromatográfiás rendszerhez. A kromatografálást 0,5 ml/min áramlási sebesség mellett végezzük 0,1% TFA-ban oldott 10-50% 2-propanol lineáris áramával 60 percig (2B. ábra). A fő csúcs alatt elfolyó anyag liofilizálásával a juh-[Trp14A]-inzulint nagy tisztasággal nyerjük.
mól/1 sósavas hidrolízis után a szintetikus anyag aminosavanalízise az elméletileg várt értékekkel jól megegyező készítményt adott mólarányban kifejezve.
2. példa
A [Trp]4-A]-inzulin hatóképessége és kötődési sajátosságai
Ebben a példában azokat az anyagokat használtuk fel és azokat az analitikai eljárásokat követtük, amelyek Kitagawa és mts.-i, [Biochemistry, 23
HU 211 312 A9
1405-1413 (1984)] publikációjában találhatók meg. A 125I-inzuIint a receptorkötési vizsgálatokhoz és a [3-3H]-glukózt a lipogenézishez a DuPont NEN kutatási termékeiből kaptuk. A 0,2 gm pórusméretű cellulóz-acetát membránszűrők a Sartorius termékei voltak. A GFC típusú üvegszálas szűrök Whatmantól voltak. A II típusú nyers Kollagenázt Worthington-tól szereztük be. A Filtron-X, Hidrofluor és Soluscint-0 szcintillációs folyadékot a National Diagnostics termékei voltak. A kristályos szarvasmarhainzulin a Sigmá-tól, és a szarvasmarha-szérumalbumintól mentes zsírsav a Boehringer-Mannheim Biochemicals-tól voltak.
A. Az inzulin receptoron való kötődésének meghatározása
A [Trp14-A]-inzulinnak a 125I-inzulin inzulinreceptorokhoz való specifikus kötődésére gyakorolt gátló hatását vizsgáljuk plazmamembránnal dúsított patkánymáj-frakciókban, izolált patkányzsírsejtekben és izolált patkánymájsejtekben. Az első két eljárást Bürke és mts.-i, Biochemistry' 19: 4547-4556, (1980) szerint végeztük.
Röviden: háromszoros 0,2 ml-es inkubálás 125Iinzulinnal, 3xl0_1° mól/1, az 1. példa szerint készített jelöletlen inzulinnal vagy [Trp14-A]-inzulinnal, és 0,1 mól/1 nátrium-foszfátban lévő plazmamembránnal (20-40 pg protein), pH = 7,4, amely 0,6% szarvasmarha-szérumalbumin V frakciót tartalmaz. 45 perces, 24 ’C-os inkubálás után az elegyeket 2,0 ml jégbe hűtött nátrium-foszfáttal hígítjuk, pH = 7,4, amely 0,1% szarvasmarha-szérumalbumin V frakciót tartalmaz, és cellulóz-acetát szűrőn azonnal szűrjük. A szűrleteket jégbe hűtött pufferrel kétszer mossuk, szárítjuk, majd radioaktivitást mérünk szcintillációs számlálóban Filtron-X felhasználásával. A relatív hatóképességet úgy kapjuk meg, hogy a jelöletlen inzulin és a [Trpl4-A]-inzulin azon koncentrációinak a hányadosát vesszük, amelyek 50%kal csökkentik a 125I-inzulinnak a receptorkészülékhez történő kapcsolódását. Ebben a vizsgálatban a [Trpl4-A]-inzulin hatóképessége a természetes hormonénak kb. 60%-a.
B. Lipogenézis-meghatározás
Ebben a vizsgálatban az inzulinanalógok [3-3H]glukóznak zsírráalakítási képességét vizsgáltuk a szarvasmarha-inzulinhoz hasonlítva.
200-300 g tömegű hím patkányok epidedimális és perirenális zsírpárnáiból vett zsírsejtjeit inkubáljuk 1,0 mg/ml kollagenázzal 60 percig, 37 ’C-on, majd gézen keresztül, ezután finom szövésű selymen keresztül szűrjük. A sejteket flotációs eljárással klinikai centrifugában kétszer mossuk, mielőtt szuszpendáláshoz felhasználjuk. Az inkubációs közeg Krebs-Ringer bikarbónáiból áll, amely az ajánlott kalciummennyiség felét, 0,5 mmol glukózt, és szarvasmarhaszérum albumintól mentes 3%-os zsírsavat tartalmaz, gázfázisként 95% O2-5% CO2-dal. A háromszoros lipogenézis inkubálás 1,0 ml zsírsejt-szuszpenzióból (20-40 mg szárazsejt-tömeg) és szarvasmarha-inzulinból vagy [Trpl4-A]-inzulinból áll, amelyeket az 1. példa szerint állítunk elő. A sejteket 45 percig preinkubáljuk 37 ’C-on, mielőtt a [3-3H]-glukózt hozzáadjuk. Az inkubálást 60 percig folytatjuk, és 0,2 ml 5 mól/1 sósav és 0,2 ml kukoricaolaj hozzáadásával állítjuk le, hogy elősegítsük a lipidextrakciót. A mintákat 10 ml Soluscint-O-val extraháljuk 30 percig szobahőmérsékleten, mielőtt a radioaktivitást detektáljuk szcintillációs számlálóval. Ezen körülmények között a [3-3H]-glukózt nem extraháljuk abba a szerves fázisba, amely a szcintillációs fluort tartalmazza, és így lényegében számolatlan marad. A 0 és 100%os lipogenézis stimulálást kb. 9,lxlO_I° mól inzulin (5,5 ng/ml) jelenlétében és hiányában mért radioaktivitásként határoztuk meg. A relatív hatóképességet úgy határozzuk meg, hogy vesszük a jelöletlen inzulin és a [Trp14-A]-inzulin azon koncentrációinak arányát, melyek a lipogenézist maximálisan 50%-kal stimulálják.
A 3. ábra mutatja a [3-3H]-glukóz stimulálását szervesen extrahálható anyaggá (pl. lipiddé) izolált patkányzsírsejtekben az 1. példa szerint előállított [Trp14A]-inzulinnal (= A =) és szarvasmarha-inzulinnal (- · -). A százalékban kifejezett maximális stimulációt az agonista koncentráció függvényében ábrázoljuk. Az adatpontok a háromszoros meghatározás jellemző mérési pontjait mutatják, amelyeket négy mérésből átlagoltunk. Mindkét inzulinnál ugyanazt a maximális stimulációértéket észleltük és a maximális stimuláció felét kb. kétszeres agonista koncentrációnál kaptuk. A szintetikus inzulin lipogenézisben való hatásossága (a természetes hormonéval összehasonlítva kb. 60%) ilyenképpen tükrözi annak viselkedését azokban a receptorkötődési meghatározásokban, amelyekben zsírsejteket alkalmaztunk.
C. Glukoneogenézis-gátlás meghatározása
Ezt a mérést jól elkülönített májtumor-sejtvonal egybefolyó monorétegén végeztük [Lauris és mts.-i Endocrinology 118: 2519-2524 (1986)], ahol a glukózterelést mértük a kereskedelemben kapható glukóz-oxidáz készülékkel. (Sigma kit no. 510-A, Sigma Technical Bulletin 510, 1983.) A közegbe irányuló glukózszekréció-gátlást az inzulin vagy inzulinanalóg függvényében határoztuk meg, és az analóg relatív hatásosságát az inzulin és az inzulinanalóg azon koncentrációinak arányával fejeztük ki, amelyeknél a glukóztermelés a maximális érték felére csökken. A sejtkultúra és a glukóz előállítását Lauris és mts.-i fenti módszerével végeztük.
A 4. ábra mutatja be a FAO sejtekben végbemenő glukoneogenézis-gátlást a maximális érték %-ában kifejezve, az inzulin (- · -) és a [Trpl4-A]-inzulin (= A =) koncentráció függvényében.
Mindkét inzulinnál ugyanazt a maximális glukoneogenézis-gátlás értéket észleltünk és a maximális gátlás 50%-os értékét kb. ugyanolyan agonista koncentrációnál kaptuk. A szintetikus inzulin glukoneogenézisgátlásban való hatásossága a természetes hormonéhoz viszonyítva kb. 90%.
Claims (14)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. A természetben előforduló inzulin egy analógja, melynek A-lánca tartalmazza az A1-A21 aminosavakat és B-lánca tartalmazza a B1-B30 aminosavakat, és amely analógban az A14-es aminosav a következő aminosavak valamelyikével van helyettesítve: triptofán, naftilalanin, hri-dansyl-a, γ-diaminovajsav, leucin, valin, alanin, izoleucin, prolin és metionin; és amely inzulinanalóg egyébként szerkezetileg oly mértékben hasonló a természetes inzulinhoz, hogy annak terápiás hatásával legalább részben rendelkezik.
- 2. A termésyetben előforduló inyulin egz analógja, melznek A lánca tartalmayya ay A1-A2 aminosavakat és B-lánca tartalmmay a B1-B30 aminosavakat, és amely analóg A láncában ay A 13-as vagy az A 14-es aminosav vagy mindkettő triptofánnal van helyettesítve, és amely inzulinalalóg egyébként szerkezetileg oly mértékben hasonló a természetes inzulinhoz, hogy annak terápiás hatásával legalább részben rendelkezik.
- 3. Inzulinanalóg, amely a következő szerkezeti képlettel jellemezhető:I H Gly lle Val Glu Gin Cys Cys Thr-Ser len Cys SerSI sLeu -T rp-Gln-Leu-Glu-Asn-T vr-C Vs-Asn- OH
- 4. Gyógyászati készítmény kezelésre szoruló beteg diabéteszének kezelésére, amely az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti inzulinanalóg terápiásán hatékony mennyiségét és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.
- 5. A 4. igénypont szerinti intramuszkuláris adagolásra alkalmasan formulázott készítmény.
- 6. A 4. igénypont szerinti szubkután adagolásra, alkalmasan formulázott készítmény.
- 7. A 4. igénypont szerinti intravénás adagolásra alkalmasan formázott készítmény.
- 8. A 4. igénypont szerinti beültethető adagoló pumpával történő adagolásra alkalmasan formulázott készítmény.
- 9. A 4. igénypont szerinti orrba permetezésre alkalmasan formulázott készítmény.
- 10. Eljárás kezelésre szoruló beteg diabéteszének kezelésére, azzal jellemezve, hogy a betegnek beadjuk az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti inzulinanalóg terápiásán hatékony mennyiségét, gyógyászatilag elfogadható hordozóval elkeverve.
- 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inzulinanalógot intramuszkulárisan adjuk be.
- 12. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inzulinanalógot szubkután adjuk be.
- 13. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inzulinanalógot intravénásán adjuk be.
- 14. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inzulinanalógot beültethető adagoló pumpa segítségével adjuk be.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9500239P HU211312A9 (hu) | 1995-06-16 | 1995-06-16 | Májspecifikus inzulinanalógok Az átmeneti oltalom az 1-9. igénypontokra vonatkozik. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9500239P HU211312A9 (hu) | 1995-06-16 | 1995-06-16 | Májspecifikus inzulinanalógok Az átmeneti oltalom az 1-9. igénypontokra vonatkozik. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU211312A9 true HU211312A9 (hu) | 1995-11-28 |
Family
ID=10986231
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9500239P HU211312A9 (hu) | 1995-06-16 | 1995-06-16 | Májspecifikus inzulinanalógok Az átmeneti oltalom az 1-9. igénypontokra vonatkozik. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| HU (1) | HU211312A9 (hu) |
-
1995
- 1995-06-16 HU HU9500239P patent/HU211312A9/hu unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0469084B1 (en) | Hepatospecific insulin analogues | |
| Schwartz et al. | A superactive insulin:[B10-aspartic acid] insulin (human). | |
| US4607023A (en) | Natriuretic | |
| RU2205836C2 (ru) | Усовершенствованный способ получения предшественника инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками | |
| US5698669A (en) | Tri-arginine insulins | |
| US20020160938A1 (en) | Covalently bridged insulin dimers | |
| US4992417A (en) | Superactive human insulin analogues | |
| FI98731C (fi) | Menetelmä superaktiivisten insuliinianalogien valmistamiseksi | |
| US4656158A (en) | Peptide, and production and use thereof | |
| Inouye et al. | Semisynthesis and properties of some insulin analogs | |
| REAGAN et al. | Isolation and biological characterization of fragments of human growth hormone produced by digestion with plasmin | |
| US5208217A (en) | Hepatospecific insulin analogues | |
| US5858975A (en) | Oxyntomodulin peptide having cardiotonic activity and insulin release-bromating activity | |
| US4981950A (en) | Vasoconstrictor peptide | |
| US4657891A (en) | Diuretic peptide, and production and use thereof | |
| US5563044A (en) | Process for the enzymatic preparation of GRF(1-44)NH2 | |
| HU211312A9 (hu) | Májspecifikus inzulinanalógok Az átmeneti oltalom az 1-9. igénypontokra vonatkozik. | |
| Ferderigos et al. | The effect of modifications of the A 5 and A 19 amino acid residues on the biological activity of insulin.[Leu 5-A] and [Phe 19-A] sheep insulins | |
| CA1338584C (en) | Superactive human insulin analogues | |
| US4923964A (en) | Human splenin | |
| IL111437A (en) | Insulin analogues | |
| Katsoyannis et al. | Insulin peptides. XVIII. Synthesis of a partially protected heneicosapeptide containing the C-terminal sequence of the B chain of insulin | |
| KNORR et al. | [B17-D-Leucine] Insulin and [B17-Norleucine] Insulin: synthesis and biological properties |